ISO 9308-3:1998

Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) for the detection and enumeration of E. coli in surface and waste water

Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes — Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour la recherche et le dénombrement des E. coli dans les eaux de surface et résiduaires

La présente partie de l'ISO 9308 spécifie une méthode miniaturisée pour la recherche et le dénombrement d'Escherichia coli (E. coli) dans les eaux de surface et résiduaires par ensemencement en milieu liquide. La présente méthode est applicable à tous les types d'eaux de surface et résiduaires, plus particulièrement celles riches en matières en suspension. La présente méthode n'est pas applicable à l'eau potable ou tout autre type d'eau dont la valeur guide est inférieure à 15 pour 100 ml. La présente méthode ne convient pas à la recherche et au dénombrement de bactéries coliformes autres que les E. coli.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 04-Nov-1998
• ICS: 07.100.20 - Microbiology of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 4 - Microbiological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 4 - Microbiological methods
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 05-Aug-2021

Relations

• Consolidates: ISO 5024:1976 - Petroleum liquids and gases — Measurement — Standard reference conditions
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9308-3
First edition
1998-11-15
Water quality — Detection and enumeration
of Escherichia coli and coliform bacteria
in surface and waste water —
Part 3:
Miniaturized method (Most Probable Number)
by inoculation in liquid medium
Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des Escherichia coli
et des bactéries coliformes dans les eaux de surface et résiduaires —
Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour
ensemencement en milieu liquide
A
Reference number
ISO 9308-3:1998(E)

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ISO 9308-3:1998(E)
Contents Page
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions .2
4 Principle.2
5 Apparatus .2
6 Sampling.3
7 Culture media and diluent.3
8 Procedure .4
9 Expression of results .6
10 Test report .7
11 Performance data.7
Annex A (informative) Example of software for statistical analysis of MPNs .8
Annex B (informative) Example of software for computation of MPN .12
Annex C (informative) Synthetic sea salt.14
(informative)
Annex D Performance characteristics of the method.16
Annex E (normative) Quality criteria for manufacturing of the medium in microtitre plates .17
Annex F (normative) Preparation of calibration microtitre plates.18
Bibliography.20
©  ISO 1998
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Switzerland
Internet [e-mail]
Printed in Switzerland
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ISO 9308-3:1998(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 9308-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 4, Microbiological methods.
ISO 9308 consists of the following parts, under the general title Water quality — Detection and enumeration of
Escherichia coli and coliform bacteria in surface and waste water:
 Part 1: Membrane filtration method
 Part 2: Liquid enrichment method
 Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid media
Annexes E and F form a normative part of this part of ISO 9308. Annexes A to D are for information only.
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Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli
and coliform bacteria in surface and waste water —
Part 3:
Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid
medium
1 Scope
This part of ISO 9308 specifies a miniaturized method for the detection and enumeration of Escherichia coli (E. coli)
in surface and waste water by inoculation in a liquid medium. The method is applicable to all types of surface and
waste waters, particularly those rich in suspended matter.
This method is not suitable for drinking water and any other type of water for which the guideline is less than 15
counts per 100 ml.
This method is not appropriate for enumeration and detection of coliform bacteria other than E. coli.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 3951, Sampling procedures and charts for inspection by variables for percent nonconforming.
ISO 5667-1, Water quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.
ISO 5667-2, Water quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.
ISO 5667-3, Water quality — Sampling — Part 3: Guidance on the preservation and handling of samples.
ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of microorganisms by culture.
ISO/IEC Guide 2, Standardization and related activities — Vocabulary.
1

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3 Terms and definitions
For the purposes of this part of ISO 9308, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following
apply.
3.1
Escherichia coli
E. coli
b-D-glucuronidase-positive microorganism growing at an incubation temperature of 44 °C in the specified liquid
medium containing 4-methylumbelliferyl-b-D-glucuronide (MUG)
4 Principle
The diluted sample is inoculated in a row of microtitre plate wells containing dehydrated culture medium.
The microtitre plates are examined under ultraviolet light at 366 nm in the dark after an incubation period of 36 h
minimum and 72 h maximum at 44 °C – 0,5 °C. The presence of E. coli is indicated by a blue fluorescence resulting
from hydrolysis of MUG. The results are given as most probable number (MPN) per 100 ml.
5 Apparatus
With the exception of equipment supplied sterile, the glassware shall be sterilized in accordance with the
instructions given in ISO 8199.
Usual microbiological laboratory equipment, and in particular:
5.1  Apparatus for sterilization by dry heat (oven) or steam (autoclave).
5.2  Thermostatic incubator regulated at 44 °C – 0,5 °C.
5.3  Tunnel drier or vertical laminar air flow cabinet (preferably class II).
5.4  UV observation chamber (Wood's Lamp, 366 nm).
WARNING: UV light causes irritation of eyes and skin. Use protective glasses and gloves.
5.5  Portable refractometer (optional).
5.6  pH meter with an accuracy of – 0,1
5.7  Test tubes of dimensions 16 mm · 160 mm and 20 mm · 200 mm, or flasks with similar capacity.
5.8  8-channel multipipette, adjustable or preset, or any other system suitable for measuring and distributing
200 μl per well.
5.9  Sterile tips for multipipette.
5.10  Equipment for membrane filtration in accordance with ISO 8199, including membrane filters with a nominal
pore size of 0,2 μm, for sterilization of liquid media.
5.11  Sterile microtitre plates, 96-well, 350 μl, flat bottomed, nonfluorescent.
Sterile adhesive covering strips for sealing microtitre plates.
5.12
, 90 mm in diameter.
5.13 Sterile Petri dishes
2

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6 Sampling
Take the samples and deliver them to the laboratory in accordance with ISO 8199 and ISO 5667-1, ISO 5667-2 and
ISO 5667-3.
7 Culture media and diluent
7.1 General instructions
To ensure reproducible results, prepare culture medium and diluents, using either constituents of uniform quality
and chemicals of recognized analytical grade, or a dehydrated diluent or complete medium prepared following the
manufacturer's instructions. Prepare them with demineralized or distilled water free from substances capable of
inhibiting growth under the test conditions. If the media are not used immediately, preserve them in the dark at
(5 – 3) °C for up to one month in conditions avoiding any alterations to their composition.
NOTE The use of chemicals of other grades is permissible providing they are shown to be of equivalent performance in the
test.
7.2 Diluents
7.2.1  Special diluent (SD)
1)
Synthetic sea salt 22,5 g
Bromophenol blue solution (optional) 10 ml
Demineralized or distilled water (7.2.2) 1000 ml
Sterilize in the autoclave (5.1) at 121 °C – 3 °C for 15 min to 20 min.
The bromophenol blue solution is prepared by adding 0,04 g in 100 ml of 50 % ethanol. It is only used to colour the
SD blue and avoid confusing it with demineralized or distilled water.
7.2.2  Demineralized or distilled water, free from substances inhibiting growth under the test conditions.
Sterilize in the autoclave (5.1) at 121 °C – 3 °C for 15 min to 20 min.
7.3 Culture medium: MUG/EC medium
Composition
Tryptone 40 g
Salicin 1 g

Triton X 100®  1 g
MUG (4-methylumbelliferyl-b-D-glucuronide) 100 mg
Demineralized or distilled water (7.2.2) 1000 ml

1)
  A typical analysis of a commercially available and suitable synthetic sea salt is given in annex C. Other diluents, such as
distilled water, can be used for E. coli enumeration, unless intestinal enterococci are to be enumerated from the same dilution
tubes.
3

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2)
Successively add tryptone, salicin and Triton to one litre of water, whilst maintaining a gentle heat and magnetic
stirring, then bring to the boil until completely dissolved. Allow to cool and add the fluorogenic constituent MUG,
dissolved in 2 ml of N,N-dimethylformamide.
WARNING: N,N-dimethylformamide is toxic and can cause cancer. Harmful by inhalation, in contact with
skin and if swallowed. Use in a chemicals fume hood.
Adjust the pH to 6,9 – 0,2.
Sterilize by filtration with membranes of average pore size 0,2 μm (5.10).
Distribute in 96-well microtitre plates (5.11) with a volume of 100 μl of media in each well (minimum capacity 350 μl)
and dehydrate immediately in a tunnel drier or laminar air flow cabinet (5.3).
The manufacturing of the medium shall meet the quality criteria given in annex E.
8 Procedure
8.1 Choice of dilutions
The number of dilutions to inoculate varies according to the presumed level of contamination of the water to be
tested. Table 1 gives examples.
Table 1
Measurement limits,
Origin of sample No. of dilutions No. of wells/dilution
bacteria/100 ml
Bathing water 2 64 wells to 1/2
4
15 to 3,5 · 10
32 wells to 1/20
Fresh surface water 4 24 wells to 1/2
24 wells to 1/20
6
40 to 3,2 · 10
24 wells to 1/200
24 wells to 1/2 000
Waste water and 6 16 wells to 1/2
8
treatment plants Up to 16 wells to 60 to 6,7 · 10
1/200 000
8.2 Preparation of dilutions
NOTE These procedures should be performed in a biological safety cabinet, as aerosols may be created by the diluting
and pipetting.
8.2.1 Fresh and brackish (waste) water (salinity , 30 g/kg, measured with a refractometer (5.5) or equivalent
method)
Prepare the relevant number of sterile tubes (5.7) in a rack, according to the number of selected dilutions; add 9 ml
of the special diluent (7.2.1) to each tube.
Vigorously stir the sample (clause 6) in order to obtain a homogeneous distribution of the microorganisms and using
a sterile pipette, immediately transfer 9 ml of this homogenized sample to the first tube containing 9 ml of diluent
(1/2 dilution).

2)
  Triton X 100 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this part of ISO 9308 and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be
used if they can be shown to lead to the same results.
4

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Using a fresh pipette, transfer 1 ml of this dilution (homogenized) to the second tube (1/20 dilution).
From the second tube (dilution 1/20 carefully homogenized) proceed, if necessary to another 1/10 dilution giving the
dilution 1/200.
Continue as above until all the dilutions have been prepared.
8.2.2 Sea water (salinity > 30 g/kg)
Prepare the relevant number of sterile tubes in a rack, according to the number of selected dilutions; add 9 ml of
demineralized or distilled water (7.2.2) to the first tube and 9 ml of the special diluent (7.2.1) to the following tubes.
Vigorously stir the sample (clause 6) in order to obtain a homogeneous distribution of the microorganisms and using
a sterile pipette, immediately transfer 9 ml of this homogenized sample to the first tube containing 9 ml of diluent
(7.2.2) (1/2 dilution).
Using a fresh sterile pipette, transfer 1 ml of this dilution (homogenized) to the second tube (1/20 dilution).
From the second tube (dilution 1/20 carefully homogenized) proceed, if necessary to another 1/10 dilution, giving
the dilution 1/200.
Continue as above until all the dilutions have been prepared.
8.3 Inoculation and incubation of microtitre plates
8.3.1 Inoculation
Transfer the contents of the first tube of dilution to an empty, sterile Petri dish of diameter 90 mm.
Using a multichannel pipette (5.8) with eight sterile tips (5.9), distribute 200 μl into each well of microtitre plate (5.11)
corresponding to this first dilution.
For subsequent dilutions (1/20, 1/200, etc.) operate in an identical manner, changing the Petri dish and the row of
eight sterile tips between each dilution.
Alternatively, any other suitable system (5.8) may be used to distribute 200 μl of each dilution per well according to
Table 1.
CAUTION: Beware of contamination via overflow from one well to another.
8.3.2 Incubation
Once the microtitre plate is inoculated, cover with the disposable sterile adhesive tape (5.12) provided for this
purpose.
Incubate the microtitre plate in an incubator (5.2) at 44 °C – 0,5 °C for a minimum of 36 h and a maximum of 72 h.
NOTE The microtitre plates should be handled with care, without tilting.

8.4 Reading of results
Place each microtitre plate, with the adhesive on, in the UV observation chamber (5.4).
Consider all wells in which a blue fluorescence is observed as being positive.
NOTE The reading may be carried out any time after 36 h, as the fluorescence does not alter with time.
5

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ISO 9308-3:1998(E)
9 Expression of results
9.1 Determination of characteristic number
For each chosen dilution note the number of positive (+) wells.
EXAMPLE 1: Bathing water
1/2 32 + out of 64
1/20 5 + out of 32
Record 32/5 as characteristic number
EXAMPLE 2: Surface water
1/2 24 + out of 24
1/20 18 + out of 24
1/200 5 + out of 24
1/2 000 1 + out of 24
Record 18/5/1 as characteristic number
EXAMPLE 3 : Waste water
1/2 16 + out of 16
1/20 16 + out of 16
1/200 12 + out of 16
1/2 000 5 + out of 16
1/20 000 0 + out of 16
1/200
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 9308-3
Première édition
1998-11-15
Qualité de l’eau — Recherche
et dénombrement des Escherichia coli
et des bactéries coliformes dans les eaux
de surface et résiduaires —
Partie 3:
Méthode miniaturisée (nombre le plus
probable) pour ensemencement en milieu
liquide
Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli
and coliform bacteria in surface and waste water —
Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation
in liquid medium
A
Numéro de référence
ISO 9308-3:1998(F)

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ISO 9308-3:1998(F)
Sommaire Page
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
Principe .
4 2
5 Appareillage . 2
6 Échantillonnage . 3
7 Milieu de culture et diluant . 3
8 Mode opératoire . 4
9 Expression des résultats . 6
10 Rapport d’essai . 7
11 Données de performance . 7
Annexe A (informative) Exemple de logiciel pour une analyse statistique des NPP . 8
Annexe B (informative) Exemple de logiciel en BASIC pour le calcul des NPP . 12
Annexe C (informative) Sel de mer synthétique . 14
(informative) Caractéristiques de performance de la méthode .
Annexe D 16
Annexe E (normative) Critères de qualité pour la fabrication du milieu en microplaques . 17
Annexe F (normative) Procédure de préparation de microplaques d’étalonnage . 18
Bibliographie . 21
©  ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet [e-mail]
Imprimé en Suisse
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ISO ISO 9308-3:1998(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 9308-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-
comité SC 4, Méthodes microbiologiques.
L’ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau — Recherche et
dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes dans les eaux de surface et résiduaires:
— Partie 1: Méthode par filtration sur membrane
— Partie 2: Méthode par enrichissement en milieu liquide
— Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) par ensemencement en milieu liquide
Les annexes E et F font partie intégrante de la présente partie de l’ISO 9308. Les annexes A à D sont données
uniquement à titre d’information.
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NORME INTERNATIONALE  ISO ISO 9308-3:1998(F)
Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des
Escherichia coli et des bactéries coliformes dans les eaux
de surface et résiduaires —
Partie 3:
Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour ensemencement
en milieu liquide
1  Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 9308 spécifie une méthode miniaturisée pour la recherche et le dénombrement
d’Escherichia coli (E. coli) dans les eaux de surface et résiduaires par ensemencement en milieu liquide. La
présente méthode est applicable à tous les types d’eaux de surface et résiduaires, plus particulièrement celles
riches en matières en suspension.
La présente méthode n’est pas applicable à l’eau potable ou tout autre type d’eau dont la valeur guide est inférieure
à 15 pour 100 ml.
La présente méthode ne convient pas à la recherche et au dénombrement de bactéries coliformes autres que les
E. coli.
2  Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente partie de l’ISO 9308. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente partie de l’ISO 9308 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l’ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 3951, Règles et tables d’échantillonnage pour les contrôles par mesures des pourcentages de non conformes.
ISO 5667-1, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 1: Guide général pour l’établissement des programmes
d’échantillonnage.
ISO 5667-2, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques d’échantillonnage.
ISO 5667-3, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 3: Guide général pour la conservation et la manipulation
des échantillons.
ISO 8199, Qualité de l’eau — Guide général pour le dénombrement des micro-organismes sur milieu de culture.
ISO/CEI Guide 2, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général.
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3  Termes et définitions
Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 9308, les termes et définitions donnés dans le Guide 2 ISO/CEI ainsi
que le terme et la définition suivants s’appliquent.
3.1
Escherichia coli
E. coli
micro-organisme qui est b-D-glucuronidase positif à une température d’incubation de 44 °C dans le milieu liquide
spécifié contenant du 4-méthylumbelliféryl- -D-glucuronide (MUG)
b
4  Principe
L’échantillon dilué est ensemencé dans une série de puits d’une microplaque contenant le milieu de culture
déshydraté.
Les microplaques sont examinées sous rayonnement ultraviolet à 366 nm dans l’obscurité après une période
d’incubation de 36 h minimum et 72 h maximum à 44 °C æ 0,5 °C. La présence d’E. coli est indiquée par une
fluorescence bleue résultant de l’hydrolyse du MUG. Les résultats sont donnés en nombre le plus probable (NPP)
par 100 ml.
5  Appareillage
À l’exclusion du matériel livré stérile, la verrerie doit être stérilisée conformément aux instructions données dans
l’ISO 8199.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
(four) (autoclave).
5.1  Appareillage pour la stérilisation en chaleur sèche ou en chaleur humide
5.2  Étuve thermostatée, réglée à 44 °C æ 0,5 °C.
5.3  Tunnel de séchage ou hotte à flux laminaire vertical (de préférence de classe II).
5.4  Chambre d’observation UV (lampe de Wood, 366 nm).
AVERTISSEMENT — La lumière UV cause une irritation des yeux et de la peau. Utiliser des lunettes et
gants de protection.
5.5 Réfractomètre portable (optionnel).
5.6  pH-mètre, ayant une précision de æ 0,1.
5.7  Tubes à essai, de dimensions 16 mm · 160 mm et 20 mm · 200 mm, ou fioles de capacités similaires.
5.8  Multipipette à 8 canaux, réglable ou préréglée, ou tout système convenable pour mesurer et distribuer 200 μl
par puits.
5.9  Cônes stériles pour multipipette.
2

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5.10  Matériel pour filtration sur membrane, conformément à l’ISO 8199, y compris filtres à membrane ayant
une porosité nominale de 0,2 μm, pour la stérilisation de liquides.
5.11  Microplaques steriles, à 96 puits de 350 μl, à fond plat, non fluorescentes.
5.12  Bandes adhésives stériles pour la fermeture des microplaques.
5.13  Boîtes de Petri stériles, de diamètre 90 mm.
6  Échantillonnage
Prélever les échantillons et les livrer au laboratoire conformément à l’ISO 8199 ainsi qu’à l’ISO 5667-1, l’ISO 5667-2
et l’ISO 5667-3.
7  Milieu de culture et diluant
7.1  Prescriptions générales
Pour garantir des résultats reproductibles, préparer le milieu de culture et les diluants à l’aide soit de constituants de
qualité uniforme et de produits chimiques de qualité analytique reconnue, soit d’un diluant déshydraté ou d’un milieu
complet déshydraté, préparés conformément aux instructions du fabricant. Les préparer avec de l’eau déminé-
ralisée ou distillée exempte de substances pouvant inhiber la croissance dans les conditions de l’essai. Si les
milieux ne sont pas utilisés immédiatement, les conserver dans l’obscurité à (5 æ 3) °C pour une période inférieure à
1 mois et dans des conditions évitant toute modification de leur composition.
NOTE  L’utilisation de produits chimiques d’autres qualités est permise, sous réserve de démontrer qu’ils ont une
performance équivalente pour l’essai.
7.2  Diluants
7.2.1  Diluant Spécial (DS)
1)
Sel marin synthétique 22,5 g
Solution de bleu de bromophénol (optionnel) 10 ml
Eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) 1 000 ml
Stériliser à l’autoclave (5.1) à 121 °C æ 3 °C pendant 15 min à 20 min.
La solution de bleu de bromophénol est préparée en ajoutant 0,04 g dans 100 ml d’éthanol à 50 %. Elle est utilisée
pour colorer le DS en bleu et éviter de le confondre avec l’eau déminéralisée ou distillée.
7.2.2  Eau déminéralisée ou distillée, exempte de substances inhibant la croissance dans les conditions de
l’essai.
Stériliser à l’autoclave (5.1) à 121 °C æ 3 °C pendant 20 min.

1) Une analyse type d’un sel de mer synthétique convenable et disponible dans le commerce est donnée dans l’annexe C.
D’autres diluants, tels que l’eau distillée, peuvent être utilisés pour le dénombrement d’E. coli, sauf si des entérocoques
intestinaux doivent être dénombrés à partir des mêmes tubes de dilution.
3

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ISO 9308-3:1998(F)
7.3  Milieu de culture: milieu MUG/EC
Composition:
Tryptone 40 g
Salicine 1 g
�
Triton X 100  1 g
MUG (4-méthylumbelliféryl-b-D-glucuronide) 100 mg
Eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) 1 000 ml
2)
Ajouter à 1 litre d’eau successivement la tryptone, la salicine et le Triton , tout en maintenant un chauffage doux et
une agitation magnétique, puis porter à ébullition jusqu’à dissolution complète. Laisser refroidir et ajouter la solution
de MUG, dissous dans 2 ml de N,N-diméthylformamide.
AVERTISSEMENT — Le N,N-diméthylformamide est toxique et peut provoquer le cancer. Il est dangereux
de l’inhaler, de le mettre en contact avec la peau, de l’avaler. Utiliser impérativement sous une hotte
d’aspiration de vapeurs chimiques.
Ajuster le pH à 6,9 æ 0,2.
Stériliser par filtration sur membrane de porosité moyenne de 0,2 μm (5.10).
Répartir en microplaques de 96 puits (5.11) à raison de 100 μl de milieu par puits (capacité minimale de 350 μl) et
déshydrater immédiatement sous tunnel de séchage ou hotte à flux laminaire (5.3).
La fabrication du milieu doit respecter les critères de qualité donnés à l’annexe E.
8  Mode opératoire
8.1  Choix des dilutions
Le nombre de dilutions à ensemencer varie en fonction du niveau de contamination présumé de l’eau à analyser.
Le Tableau 1 montre quelques exemples.
Tableau 1
Origine de Nombre de Plage de mesure,
Nombre de dilutions
l’échantillon puits/dilution bactéries par 100 ml
Eaux de baignade 2 64 puits au 1/2
4
15 à 3,5 · 10
32 puits au 1/20
Eaux douces 4 24 puits au 1/2
superficielles 24 puits au 1/20
6
40 à 3,2 · 10
24 puits au 1/200
24 puits au 1/2 000
Eaux résiduaires 6 16 puits au 1/2 jusqu’à
8
60 à 6,7 · 10
et stations d’épuration 16 puits au 1/200 000

2) Le Triton X 100 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs de la présente partie de l’ISO 9308 et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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8.2  Préparation des dilutions
NOTE  Il est recommandé d’utiliser ces modes opératoires dans un poste de sécurité biologique, la dilution et le pipettage
pouvant produire des aérosols.
8.2.1  Eaux douces et eaux saumâtres (usées) [salinité , 30 g/kg, mesurée à l’aide d’un réfractomètre (5.5) ou
de méthodes équivalentes]
Préparer, sur un portoir, le nombre de tubes stériles (5.7) correspondant au nombre de dilutions choisies. Introduire
dans chacun d’eux 9 ml de diluant spécial (7.2.1).
Agiter vigoureusement l’échantillon (voir l’article 6) afin d’obtenir une répartition homogène des micro-organismes et
transférer immédiatement, à l’aide d’une pipette stérile, 9 ml de cet échantillon homogénéisé dans le premier des
tubes contenant 9 ml de diluant (dilution 1/2).
Avec une nouvelle pipette, transférer 1 ml de cette dilution (homogénéisée) dans le deuxième tube (dilution 1/20).
À partir du deuxième tube (dilution 1/20 soigneusement homogénéisée), procéder, si nécessaire, à une autre
dilution à 1/10 afin d’obtenir la dilution suivante (1/200).
Continuer ainsi jusqu’à ce que toutes les dilutions aient été préparées.
(salinité 30 g/kg)
8.2.2  Eaux de mer >
Préparer, sur un portoir, le nombre de tubes stériles (5.7) correspondant au nombre de dilutions choisies. Introduire
dans le premier tube 9 ml d’eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) et dans les suivants 9 ml de diluant spécial (7.2.1).
Agiter vigoureusement l’échantillon (voir l’article 6) afin d’obtenir une répartition homogène des micro-organismes et
transférer immédiatement, à l’aide d’une pipette stérile, 9 ml de cet échantillon homogénéisé dans le premier des
tubes contenant 9 ml de diluant (7.2.2) (dilution 1/2).
Avec une nouvelle pipette stérile, transférer 1 ml de cette dilution (homogénéisée) dans le deuxième tube (dilution
1/20).
À partir du deuxième tube (dilution 1/20 soigneusement homogénéisée), procéder, si nécessaire, à une autre
dilution à 1/10 afin d’obtenir la dilution suivante (1/200).
Continuer ainsi jusqu’à ce que toutes les dilutions aient été préparées.
8.3  Ensemencement et incubation des microplaques
8.3.1  Ensemencement
Transférer le contenu du premier tube de dilution dans une boîte de Petri vide, stérile, de diamètre 90 mm.
À l’aide de la pipette multicanaux (5.8) munie de huit cônes stériles (5.9), répartir 200 μl dans chacun des puits de
la microplaque (5.11) correspondant à cette première dilution.
Pour chacune des dilutions suivantes (1/20, 1/200, etc.), opérer de manière identique en changeant la boîte de Petri
et la rangée de huit cônes stériles entre chaque dilution.
De façon équivalente, tout autre système convenable (5.8) peut être utilisé pour répartir 200 μl de chaque dilution
par puits, selon le Tableau 1.
ATTENTION — Éviter les contaminations par débordement d’un puits à l’autre.
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8.3.2  Incubation
Une fois la microplaque ensemencée, la recouvrir d’une bande adhésive stérile (5.12) à usage unique, prévue à cet
effet.
Incuber la microplaque à l’étuve (5.2) à 44 °C æ 0,5 °C pendant au minimum 36 h et au maximum 72 h.
NOTE  Il convient de manipuler les microplaques avec précaution, sans les pencher.
8.4  Lecture des résultats
Placer chaque microplaque, recouverte d’une bande adhésive, dans la chambre d’observation UV (5.4).
Considérer comme positifs les puits dans lesquels on observe une fluorescence bleue.
NOTE  La fluorescence n’évoluant pas avec le temps, la lecture peut être effectuée à tout moment après 36 h.
9  Expression des résultats
9.1  Détermination du nombre caractéristique
Pour chacune des dilutions choisies, noter le nombre de puits positifs (+).
Lorsque trois dilutions ou plus ont été ensemencées, un nombre caractéristique de 3 chiffres, le dernier étant 0 si
possible, doi
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