ISO 21528-2:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique
ISO 21528-2:2017 specifies a method for the enumeration of Enterobacteriaceae. It is applicable to - products intended for human consumption and the feeding of animals, and - environmental samples in the area of primary production, food production and food handling. This technique is intended to be used when the number of colonies sought is expected to be more than 100 per millilitre or per gram of the test sample. The most probable number (MPN) technique, as included in ISO 21528‑1, is generally used when the number sought is expected to be below 100 per millilitre or per gram of test sample.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement des Enterobacteriaceae — Partie 2: Technique par comptage des colonies
L'ISO 21528-2:2017 spécifie une méthode pour le dénombrement des Enterobacteriaceae. Elle est applicable: - aux produits destinés à l'alimentation humaine et animale, et - aux échantillons d'environnement pour la production au stade primaire, la production des aliments et la distribution des aliments. Cette technique est destinée à être utilisée lorsque le nombre de colonies recherchées est supposé être supérieur à 100 par millilitre ou par gramme d'échantillon pour essai. La technique du nombre le plus probable (NPP), incluse dans l'ISO 21528‑1, est généralement utilisée lorsque le nombre recherché est censé être inférieur à 100 par millilitre ou par gramme d'échantillon pour essai.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21528-2
Second edition
2017-06
Corrected version
2018-06
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the
detection and enumeration of
Enterobacteriaceae —
Part 2:
Colony-count technique
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le dénombrement des Enterobacteriaceae —
Partie 2: Technique par comptage des colonies
Reference number
ISO 21528-2:2017(E)
©
ISO 2017
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ISO 21528-2:2017(E)
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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Published in Switzerland
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ISO 21528-2:2017(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 Preparation of initial suspension and decimal dilutions . 2
4.2 Isolation and selection for confirmation . 2
4.3 Confirmation . 2
4.4 Calculation . 2
5 Diluent, culture media and reagent . 2
6 Equipment and consumables . 2
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample . 3
9 Procedure. 3
9.1 General . 3
9.2 Test portion, initial suspension and dilutions . 4
9.3 Inoculation and incubation . 4
9.4 Counting and selection of colonies for confirmation . 4
9.5 Subculturing selected colonies. 4
9.6 Biochemical confirmation tests . 5
9.6.1 Oxidase reaction . 5
9.6.2 Fermentation test . 5
9.6.3 Interpretation of biochemical tests . 5
10 Expression of results . 5
11 Performance characteristics of the method . 5
11.1 Interlaboratory study . 5
11.2 Repeatability limit . 5
11.3 Reproducibility limit . 6
12 Test report . 6
13 Quality assurance . 7
Annex A (normative) Culture media and reagents . 8
Annex B (informative) Method validation studies and performance characteristics .12
Bibliography .15
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ISO 21528-2:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO's adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 21528-2:2004), which has been
technically revised with the following main changes:
— the confirmation step has been changed by replacing glucose agar by glucose OF medium;
— precision data based on the results of an interlaboratory study using the method according to this
revised edition has been included in an informative annex.
A list of all the parts in the ISO 21528 series can be found on the ISO website.
This corrected version of ISO 21528-2:2017 incorporates the following corrections:
— in 6.4, a water bath capable of being maintained between 44 °C to 47 °C has been added to the list of
equipment;
— in 9.3.2, the temperature has been reduced from “47 °C to 50 °C” to “44 °C to 47 °C”.
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ISO 21528-2:2017(E)
Introduction
This document is intended to provide general guidance for the examination of products not dealt
with by existing International Standards and to be taken into account by organizations preparing
microbiological test methods for application to foods or animal feeding stuffs. Because of the large
variety of products within this field of application, these guidelines may not be appropriate in every
detail for certain products, and for some other products, it may be necessary to use different methods.
Nevertheless, it is hoped that in all cases, every attempt will be made to apply the guidelines provided
as far as possible and that deviations from them will only be made if absolutely necessary for technical
reasons.
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO 21528-2:2004,
are considered as minor changes (see ISO 17468).
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products,
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed, they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21528-2:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection and enumeration of Enterobacteriaceae —
Part 2:
Colony-count technique
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
detecting Enterobacteriaceae are only undertaken in properly equipped laboratories, under the
control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials. Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
1 Scope
This document specifies a method for the enumeration of Enterobacteriaceae. It is applicable to
— products intended for human consumption and the feeding of animals, and
— environmental samples in the area of primary production, food production and food handling.
This technique is intended to be used when the number of colonies sought is expected to be more than
100 per millilitre or per gram of the test sample.
The most probable number (MPN) technique, as included in ISO 21528-1, is generally used when the
number sought is expected to be below 100 per millilitre or per gram of test sample.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 18593, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal methods for sampling techniques
from surfaces using contact plates and swabs
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:/ /www.e lectropedia. org/
— ISO Online browsing platform: available at http:/ /www. iso. org/obp
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ISO 21528-2:2017(E)
3.1
Enterobacteriaceae
microorganism that forms characteristic colonies on violet red bile glucose agar and that ferment
glucose and show a negative oxidase reaction when the tests are carried out in accordance with the
methods specified in this document
3.2
count of Enterobacteriaceae
number of Enterobacteriaceae found per millilitre or per gram of the test sample or per unit area
swabbed, when the test is carried out according to the method specified in this document
4 Principle
4.1 Preparation of initial suspension and decimal dilutions
An initial suspension and decimal dilutions are prepared from the test sample.
4.2 Isolation and selection for confirmation
Violet red bile glucose (VRBG) agar is inoculated with a specified quantity of the test sample if the
product is liquid, or of the initial suspension in the case of other products. An overlay of the same
medium is added. Other plates are prepared under the same conditions, using decimal dilutions of the
test sample or of the initial suspension.
The dishes are incubated at 37 °C (or 30 °C) for 24 h.
NOTE The incubation temperature of 37 °C for enrichment and isolation/enumeration on the plating
medium is generally used when the detection and enumeration of Enterobacteriaceae is for a hygiene indicator.
Alternatively, a temperature of 30 °C can be chosen when the detection or enumeration of Enterobacteriaceae is
conducted for technological purposes and includes psychrotrophic Enterobacteriaceae. In this document, 37 °C
will be used throughout the text.
4.3 Confirmation
Colonies of presumptive Enterobacteriaceae are subcultured onto non-selective medium, and confirmed
by means of tests for the fermentation of glucose and the presence of oxidase.
4.4 Calculation
The number of Enterobacteriaceae per millilitre or gram of the test sample is calculated from the
number of confirmed typical colonies per dish.
5 Diluent, culture media and reagent
For current laboratory practice, see ISO 7218.
Composition of culture media and reagents and their preparation are described in Annex A.
For performance testing of culture media, see ISO 11133 and Annex A.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave), as specified in ISO 7218.
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ISO 21528-2:2017(E)
6.2 Incubator, capable of operating at 37 °C ± 1 °C (or 30 °C ± 1 °C).
6.3 Drying cabinet (ventilated by convection) or incubator, capable of operating between 25 °C
and 50 °C.
6.4 Water baths, one capable of being maintained between 47 °C to 50 °C and another capable of
being maintained between 44 °C to 47 °C.
6.5 Test tubes or flasks, of appropriate capacity.
6.6 Petri dishes, made of glass or plastic, with a diameter of approximately 90 mm and (optional)
large size (diameter approximately 140 mm).
6.7 Loops (of diameter approximately 3 mm) and wires, made of platinum/iridium or
nickel/chromium, and/or glass rods, or equivalent sterile disposable loops or inoculating needles.
6.8 Graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities 10 ml, 1 ml and 0,1 ml.
6.9 pH-meter, accurate to within ±0,1 pH unit at 25 °C.
6.10 Homogenizer, as specified in ISO 7218.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. See the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing with the
sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an agreement
on this subject.
Recommended sampling techniques are given in:
— ISO/TS 17728 for food and animal feed;
— ISO 13307 for primary production stage;
— ISO 17604 for carcasses;
— ISO 18593 for environmental samples.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative and the sample should not
have been damaged or changed during transport or storage.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the
product concerned. If there is no specific International Standard available, it is recommended that the
parties concerned come to an agreement on this subject.
9 Procedure
9.1 General
See ISO 7218.
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ISO 21528-2:2017(E)
9.2 Test portion, initial suspension and dilutions
See ISO 6887 (all parts).
Prepare a single decimal dilution series from the test sample if the product is liquid, or from the initial
suspension in the case of other products.
9.3 Inoculation and incubation
9.3.1 Take one sterile Petri dish (6.6). Using a sterile pipette (6.8), transfer to the dish 1 ml of the test
sample if the product is liquid, or 1 ml of the initial suspension in case of other products.
Repeat the procedure described with the further dilutions, if necessary, using a fresh sterile pipette for
each dilution.
If only the initial suspension is used, then inoculate two plates of this dilution (ISO 7218).
9.3.2 Add into each Petri dish approximately 15 ml of the violet red bile glucose (VRBG) agar (A.2)
which has been prepared then cooled to 44 °C to 47 °C in the water bath (6.4). The time elapsing between
the inoculation of the Petri dishes and the moment when the medium is poured into the dishes shall not
exceed 15 min.
Carefully mix the inoculum with the medium by horizontal movements and allow the medium to
solidify, with the Petri dishes standing on a cool surface.
9.3.3 After complete solidification of the mixture, add a covering layer of approximately 5 ml to 10 ml
of the violet red bile glucose (VRBG) agar (A.2), prepared then cooled as described in 9.3.2, to prevent
spreading growth and to achieve semi-anaerobic conditions. Allow to solidify as described above.
9.3.4 Invert the prepared dishes and incubate them at 37 °C (6.2) for 24 h ± 2 h.
9.4 Counting and selection of colonies for confirmation
Characteristic colonies are pink to red or purple (with or without precipitation haloes).
Select the dishes (see 9.3.4) containing less than 150 characteristic colonies; count these colonies.
Then choose at random five such colonies from each dish for subculturing (see 9.5) for the biochemical
confirmation tests (see 9.6). If there are less than five colonies on the plate, take all presumptive
colonies present.
Spreading colonies shall be considered as single colonie
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21528-2
Deuxième édition
2017-06
Version corrigée
2018-06
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le
dénombrement des
Enterobacteriaceae —
Partie 2:
Technique par comptage des colonies
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection and enumeration of Enterobacteriaceae —
Part 2: Colony-count technique
Numéro de référence
ISO 21528-2:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 21528-2:2017(F)
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en oeuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 21528-2:2017(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales . 2
4.2 Isolement et sélection pour confirmation . 2
4.3 Confirmation . 2
4.4 Calcul . 2
5 Diluants, milieux de culture et réactifs . 2
6 Matériel et consommables . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire. 4
9.1 Généralités . 4
9.2 Prise d'essai, suspension mère et dilutions . 4
9.3 Ensemencement et incubation . 4
9.4 Comptage et sélection des colonies pour confirmation . 4
9.5 Repiquage des colonies sélectionnées . 5
9.6 Essais de confirmation biochimiques. 5
9.6.1 Réaction à l'oxydase . 5
9.6.2 Essai de fermentation . 5
9.6.3 Interprétation des essais biochimiques . 5
10 Expression des résultats. 5
11 Caractéristiques de performance de la méthode . 6
11.1 Essai interlaboratoires . 6
11.2 Limite de répétabilité . 6
11.3 Limite de reproductibilité . 6
12 Rapport d’essai . 7
13 Assurance qualité . 7
Annexe A (normative) Milieux de culture et réactifs . 8
Annexe B (informative) Études de validation de la méthode et caractéristiques de performance.12
Bibliographie .15
© ISO 2017 – Tous droits réservés iii
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ISO 21528-2:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre noter des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/patents).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de
l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les
obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/foreword .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires
— Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’accord de
coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 21528-2:2004) qui a fait l'objet
d'une révision technique en appliquant les principales modifications suivantes:
— l’étape de confirmation a été modifiée en remplaçant la gélose au glucose par le milieu OF;
— les données de fidélité basées sur les résultats d’un essai interlaboratoires utilisant la méthode
selon la présente édition révisée ont été ajoutées dans une annexe informative.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 21528 est disponible sur le site Internet de l’ISO.
La présente version corrigée de l'ISO 21528-2:2017 inclut les corrections suivantes:
— en 6.4, un bain d’eau réglable entre 44 °C et 47 °C a été ajouté à la liste de matériel;
— en 9.3.2, la température a été réduite de «47 °C à 50 °C» à «44 °C à 47 °C».
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 21528-2:2017(F)
Introduction
Le présent document est destiné à fournir des directives générales pour l'examen des produits non
concernés par les Normes internationales existant actuellement et devant être prises en considération
par les organismes élaborant des méthodes d'essai microbiologiques applicables aux aliments et
aliments pour animaux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce domaine
d'application, il est possible que ces directives, dans tout leur détail, ne conviennent pas à certains
produits et que, pour certains autres produits, il soit nécessaire d'employer des méthodes différentes.
Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous les efforts seront faits pour appliquer, chaque
fois qu'il sera possible, les directives données et qu’il sera fait recours à des dérogations que si cela est
absolument nécessaire pour des raisons techniques.
Les principales modifications, énumérées dans l’avant-propos, introduites dans le présent document
par rapport à l’ISO 21528-2:2004, sont considérées comme mineures (voir l’ISO 17468).
L'harmonisation des méthodes d'essai ne peut être immédiate et, pour certains groupes de produits, des
Normes internationales et/ou nationales existent peut-être déjà, qui ne concordent pas avec la présente
méthode horizontale. Lorsque de telles normes seront en révision, il serait souhaitable de les modifier
de façon à se conformer au présent document si bien que, au final, les seules divergences restantes par
rapport à la présente méthode horizontale seront celles nécessaires pour des raisons techniques bien
établies.
© ISO 2017 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 21528-2:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement des
Enterobacteriaceae —
Partie 2:
Technique par comptage des colonies
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de recherche des Enterobacteriaceae ne soient réalisés que dans des laboratoires
équipés à cet effet, sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand soin
soit apporté à la mise au rebus de tous les éléments incubés. Il convient que les utilisateurs du
présent document connaissent bien les pratiques courantes de laboratoire. Le présent document
n’a pas pour but de traiter de tous les aspects de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son
utilisation. Il incombe à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en
matière d’hygiène et de sécurité.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour le dénombrement des Enterobacteriaceae. Elle est
applicable:
— aux produits destinés à l'alimentation humaine et animale, et
— aux échantillons d'environnement pour la production au stade primaire, la production des aliments
et la distribution des aliments.
Cette technique est destinée à être utilisée lorsque le nombre de colonies recherchées est supposé être
supérieur à 100 par millilitre ou par gramme d'échantillon pour essai.
La technique du nombre le plus probable (NPP), incluse dans l’ISO 21528-1, est généralement utilisée
lorsque le nombre recherché est censé être inférieur à 100 par millilitre ou par gramme d’échantillon
pour essai.
2 Références normatives
Les documents suivants sont référencés dans le texte de sorte qu’une partie ou la totalité de leur
contenu constitue les exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée
s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 18593, Microbiologie des aliments — Méthodes horizontales pour les techniques de prélèvement sur des
surfaces, au moyen de boîtes de contact et d’écouvillons
© ISO 2017 – Tous droits réservés 1
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ISO 21528-2:2017(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http: //www .iso .org/obp
3.1
Enterobacteriaceae
micro-organisme formant des colonies caractéristiques sur gélose au cristal violet, à la bile et au glucose,
fermentant le glucose et donnant une réaction oxydase négative lorsque les essais sont effectués selon
les méthodes spécifiées dans le présent document
3.2
dénombrement des Enterobacteriaceae
nombre d'Enterobacteriaceae par millilitre ou par gramme d'échantillon pour essai ou par unité de
surface prélevée, lorsque les essais sont effectués conformément au présent document
4 Principe
4.1 Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales
Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales à partir de l'échantillon pour essai.
4.2 Isolement et sélection pour confirmation
Ensemencement de la gélose à la bile, au cristal violet et au glucose (VRBG) avec une quantité déterminée
de l'échantillon pour essai si le produit est liquide ou avec une quantité déterminée de la suspension
mère dans le cas des autres produits. Ajout d’une seconde couche du même milieu. Dans les mêmes
conditions, préparation d'autres boîtes avec les dilutions décimales obtenues à partir de l'échantillon
pour essai ou de la suspension mère.
Incubation des boîtes à 37 °C (ou 30 °C) pendant 24 h.
NOTE La température d’incubation de 37 °C pour l’enrichissement et l’isolement/le dénombrement sur boîte
est généralement utilisée lorsque les Enterobacteriaceae sont recherchées et dénombrées en tant qu’indicateur
d’hygiène. Sinon, une température de 30 °C peut être choisie lorsque la détection ou le dénombrement des
Enterobacteriaceae est entrepris(e) dans le cadre d'un procédé technologique et comprend des Enterobacteriaceae
psychrotrophes. Dans le présent document, une température de 37 °C sera utilisée tout au long du texte.
4.3 Confirmation
Repiquage des colonies d'Enterobacteriaceae présumées sur milieu non sélectif et confirmation au
moyen d'essais de fermentation du glucose et de l’oxydase.
4.4 Calcul
À partir du nombre de colonies caractéristiques confirmés par boîte, calcul du nombre
d'Enterobacteriaceae par millilitre ou par gramme d'échantillon pour essai.
5 Diluants, milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l'ISO 7218.
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ISO 21528-2:2017(F)
La composition des milieux de culture et des réactifs et leur préparation sont décrites dans l’Annexe A.
Pour les essais de performance des milieux de culture, voir l’ISO 11133 et l’Annexe A.
6 Matériel et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
sont appropriées. Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218), et en particulier, ce
qui suit.
6.1 Appareil de stérilisation en chaleur sèche (four) et en chaleur humide (autoclave), tel que
spécifié dans l’ISO 7218.
6.2 Étuve, réglable à 37 °C ± 1 °C (ou 30 °C ± 1 °C).
6.3 Enceinte de séchage (ventilée par convection) ou étuve réglable entre 25 °C et 50 °C.
6.4 Bains d’eau, un réglable entre 47 °C et 50 °C et un autre réglable entre 44 °C et 47 °C.
6.5 Tubes à essai ou flacons, de capacité appropriée.
6.6 Boîtes de Petri, en verre ou en plastique, d’environ 90 mm de diamètre et (en option) de taille
supérieure (diamètre d’environ 140 mm).
6.7 Anses (de 3 mm de diamètre environ) et fils droits, en platine iridié ou en nickel-chrome, et/ou
baguettes de verre, ou anses ou aiguilles d’ensemencement stériles jetables.
6.8 Pipettes graduées ou pipettes automatiques, de capacités nominales de 10 ml, 1 ml et 0,1 ml.
6.9 pH mètre, précis à ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
6.10 Homogénéisateur, tel que spécifié dans l’ISO 7218.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage n'entre pas dans le cadre de la méthode spécifiée dans le présent document. Voir
la Norme internationale spécifique au produit concerné. S'il n'existe pas de Norme internationale
spécifique à l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées se
mettent d'accord à ce sujet.
Des techniques d’échantillonnage recommandées sont données dans:
— l’ISO/TS 17728 applicable aux aliments destinés à l’alimentation humaine et animale;
— l’ISO 13307 applicable au stade de production primaire;
— l’ISO 17604 applicable aux carcasses;
— l’ISO 18593 applicable aux échantillons d’environnement.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif et non endommagé ou modifié
pendant le transport ou le stockage.
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8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique au produit
concerné. S'il n'existe pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties
concernées se mettent d'accord à ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Voir l’ISO 7218.
9.2 Prise d'essai, suspension mère et dilutions
Voir l’ISO 6887 (toutes les parties).
Préparer une seule série de dilutions décimales à partir de l'échantillon pour essai si le produit est
liquide, ou à partir de la suspension mère dans le cas des autres produits.
9.3 Ensemencement et incubation
9.3.1 Prendre une boîte de Petri stérile (6.6). À l'aide d'une pipette stérile (6.8), transférer dans la
boîte 1 ml de l'échantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la suspension mère dans le cas
des autres produits.
Répéter l’opération décrite avec les dilutions successives, si nécessaire, à l'aide d'une nouvelle pipette
pour chaque dilution.
Si seule la suspension mère est utilisée, ensemencer deux boîtes de cette dilution (ISO 7218).
9.3.2 Ajouter dans chaque boîte de Petri environ 15 ml de la gélose à la bile, au cristal violet et au
glucose (VRBG) (A.2), préparée puis refroidie entre 44 °C et 47 °C dans le bain d'eau (6.4). Le temps qui
s'écoule entre l'ensemencement des boîtes de Petri et le moment ou le milieu est versé dans les boîtes ne
doit pas excéder 15 min.
Mélanger soigneusement l'inoculum et le milieu par des déplacements horizontaux des boîtes et laisser
le mélange se solidifier en posant les boîtes de Petri sur une surface fraîche horizontale.
9.3.3 Après solidification du mélange, ajouter une seconde couche d'environ 5 ml à 10 ml de gélose
à la bile, au cristal violet et au glucose (VRBG) (A.2), préparée puis refroidie comme décrit en 9.3.2,
pour empêcher l'étalement des colonies et obtenir des conditions semi-anaérobies. Laisser se solidifier
comme décrit ci-dessus.
9.3.4 Inverser les boîtes préparées et les incuber à 37 °C (6.2) pendant 24 h ± 2 h.
9.4 Comptage et sélection des colonies pour confirmation
Les colonies caractéristiques sont de couleur rose à rouge ou violette (avec ou sans halo de précipitation).
Choisir les boîtes (voir en 9.3.4) contenant moins de 150 colonies caractéristiques. Compter ces colonies
puis prélever au hasard cinq de ces colonies de chaque boîte en vue du repiquage (voir en 9.5) pour les
essais de confirmation biochimiques (voir en 9.6). Si moins de cinq colonies se trouvent dans la boîte,
prendre toutes les colonies présumées présentes.
Des colonies étalées peuvent être considérées comme une seule colonie. Si moins d'un quart de la boîte
est envahi, compter les colonies sur la partie non affectée de la boîte et calculer par extrapolation le
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nombre théorique de colonies correspondant à la boîte entière. Si plus d’un quart est envahi par des
colonies étalées, ne pas tenir compte du comptage.
Certaines Enterobacteriaceae peuvent causer une décoloration de leurs colonies ou du milieu. Par
conséquent, si aucune colonie caractéristique n'est présente, choisir cinq colonies blanchâtres pour
confirmation.
9.5 Repiquage des colonies sélectionnées
Ensemencer, en stries, les colonies sélectionnées (9.4) sur la surface du milieu gélosé non sélectif (A.3)
préalablement séché, de façon à permettre le développement de colonies bien isolées.
Incuber ces boîtes à 37 °C pendant 24 h ± 2 h.
Sélectionner une colonie bien isolée à partir de chacune des boîtes incubées en vue des essais de
confirmation biochimiques (voir en 9.6).
9.6 Essais de confirmation biochimiques
9.6.1 Réaction à l'oxydase
À l'aide d'une anse ou d'un fil en platine iridié ou d'un inoculateur en verre (6.7), prélever une fraction de
chaque colonie bien isolée (voir en 9.5) et la déposer en stries sur un morceau de papier filtre humecté
de réactif à l'oxydase (A.5) ou sur un disque ou une bandelette disponible dans le commerce. Il ne faut
pas utiliser d'anse ni de fil en nickel-chrome.
Considérer l'essai comme négatif lorsque la couleur du papier filtre ne devient pas bleu foncé-pourpre
dans les 10 s.
Pour les disques ou bandelettes prêt(e)s à l'emploi, se conformer aux instructions du fabricant.
9.6.2 Essai de fermentation
Repiquer par piqûre à l'aide d'un fil droit (6.7) les mêmes colonies que celles sélectionnées en 9.5 qui
ont donné un résultat négatif à l'essai de l'oxydase dans des tubes contenant le milieu OF glucosé (A.4).
Recouvrir la surface du milieu avec au moins 1 cm d’huile minérale stérile (A.6).
Incuber ces tubes à 37 °C pendant 24 h ± 2 h.
Si une couleur jaune se développe dans la totalité du contenu du tube, la réaction est considérée comme
positive.
9.6.3 Interprétation des essais biochimiques
Les colonies oxydase-négatives et glucose-positives sont confirmées comme étant des
Enterobacteriaceae.
10 Expression des résultats
Voir l’ISO 7218. Calculer et exprimer les résultats sous forme de nombre d’Enterobacteriaceae en UFC
par gramme, par millilitre, par centimètre carré ou par dispositif d’échantillonnage.
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ISO 21528-2:2017(F)
11 Caractéristiques de performance de la méthode
11.1 Essai interlaboratoires
Les résultats de l’essai interlaboratoires visant à déterminer la fidélité de la méthode sont récapitulés
dans l’Annexe B. Les limites de répétabilité et de reproductibilité ont été déterminées en utilisant cinq
types de produits alimentaires contaminés à différents niveaux. Les valeurs obtenues à partir de l’essai
interlaboratoires peuvent ne pas être applicables à des gammes de concentration et à des types de
produits alimentaires autres que ceux indiquées dans l’Annexe B.
NOTE Dans le présent document, le terme «type» est associé au terme «aliment» pour améliorer la lisibilité
du présent document. Cependant, le terme «aliment» peut être remplacé par «aliment pour animaux» et par les
autres secteurs de la chaîne alimentaire tels que mentionnés dans le domaine d’application du présent document.
11.2 Limite de répétabilité
La différence absolue entre deux résultats d’essai (log -transformés) individuels indépendants
10
(nombre d’UFC par gramme ou par millilitre), ou le rapport de la valeur maximale à la valeur minimale
des deux résultats d’essai sur l’échelle normale, obtenus avec la même méthode sur un matériau
identique soumis à essai dans le même laboratoire par le même opérateur utilisant le même équipement
dans le plus court intervalle de temps possible, ne dépassera la limite de répétabilité r que dans 5 % des
cas au plus.
Comme indication générale de la limite de répétabilité (r), les valeurs suivantes (extraites de la
moyenne des estimations de variation pour tous les niveaux par matrice soumise à essai lors de l’essai
interlaboratoires (voir l’Annexe B) peuvent être utilisées lorsque les échantillons sont soumis à essai:
r = 0,37 (exprimée sous la forme d’une différence entre les résultats d’essai log -transformés); ou
10
r = 2,33 (exprimée sous la forme d’un rapport entre les résultats d’essai)
4
EXEMPLE Un résultat d’essai de 10 000 ou de 1,0 × 10 ou log 4,0 UFC par gramme d’échantillon a été
10
observé dans un laboratoire en particulier. Sous des conditions de répétabilité, il convient que la différence entre
les résultats log -transformés ne soit pas supérieure à ± 0,37 log unité. Ainsi, il convient que le résultat d’un
10 10
deuxième essai portant sur le même échantillon soit compris entre 3,63 (4,0 - 0,37) et 4,37 (4,0 + 0,37 log unités.
10
Pour les résultats non log-transformés, il convient que le rapport entre le premier résultat d’essai et le
deuxième résultat d’essai portant sur le même échantillon ne dépasse pas 2,33. Ainsi, il convient que
le deuxième résultat d’essai soit compris entre 4 290 (= 10 000/2,33) et 23 300 (= 10 000 × 2,33) UFC
par gramme.
11.3 Limite de reproductibilité
La différence absolue entre deux résultats d’essai (log -transformés) individuels (nombre d’UFC par
10
gramme ou par millilitre), ou le rapport de la valeur maximale à la valeur minimale des deux résultats
d’essai sur l’échelle normale, obtenus avec la même méthode sur un matériau identique soumis à essai
dans différents laboratoires par différents opérateurs utilisant différents équipements, ne dépassera la
limite de reproductibilité R que dans 5 % des cas au plus.
Comme indication générale de la limite de reproductibilité (R), les valeurs suivantes (extraites de la
moyenne des estimations de variation pour tous les niveaux par matrice soumise à essai lors de l’essai
interlaboratoires (voir l’Annexe B) sont utilisées lorsque les échantillons de produits alimentaires sont
soumis à essai en général:
R = 0,87 (exprimée sous la forme d’u
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.