ISO 20122:2024

Vegetable oils - Determination of mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) and mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH) with online-coupled high performance liquid chromatography-gas chromatography-flame ionization detection (HPLC-GC-FID) analysis - Method for low limit of quantification

This document specifies a procedure for the determination of saturated and aromatic hydrocarbons (from C10 to C50) in vegetable fats and oils using the online-coupled high performance liquid chromatography-gas chromatography-flame ionization detection (HPLC-GC-FID). This document does not apply to other matrices. The method is applicable for the analysis of mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) and/or mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH). According to the results of the interlaboratory studies, the method has been proven suitable for MOSH mass concentrations above 3 mg/kg and MOAH mass concentrations above 2 mg/kg. In case of suspected interferences, the fossil origin of the MOSH and MOAH fraction can be verified by examination by GC⨯GC-MS. An alternative method for the epoxidation of the MOAH fraction (performic acid epoxidation) is proposed in Annex C. This alternative method provides comparable results to the ethanolic epoxidation of the MOAH fraction described in 8.6. This alternative method for epoxidation has proven to be efficient for samples with a high amount of interferences in the MOAH fraction (e.g. tropical oils).

Huiles végétales — Dosage des hydrocarbures saturés d’huile minérale (MOSH) et des hydrocarbures aromatiques d’huile minérale (MOAH) par analyse par chromatographie en phase liquide haute performance et chromatographie en phase gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne — Méthode pour une faible limite de quantification

Le présent document spécifie un mode opératoire pour le dosage des hydrocarbures saturés et aromatiques (de C10 à C50) dans les matières grasses et huiles végétales en utilisant la chromatographie en phase liquide haute performance et la chromatographie en phase gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne. Le présent document ne s’applique pas à d’autres matrices. La méthode s’applique à l’analyse des hydrocarbures saturés d’huile minérale (MOSH) et/ou des hydrocarbures aromatiques d’huile minérale (MOAH). D’après les résultats des études interlaboratoires, il a été démontré que la méthode est adaptée pour des concentrations massiques de MOSH supérieures à 3 mg/kg et des concentrations massiques de MOAH supérieures à 2 mg/kg. En cas de suspicion d’interférences, l’origine fossile des fractions MOSH et MOAH peut être vérifiée par un examen par chromatographie en phase gazeuse à deux dimensions, couplée à la spectrométrie de masse (CG⨯CG-SM). Une méthode alternative d’époxydation de la fraction MOAH (époxydation par l’acide performique) est proposée dans l’Annexe C. Cette méthode donne des résultats comparables à l’époxydation éthanolique de la fraction MOAH décrite en 8.6. Cette méthode alternative d’époxydation s’est avérée efficace pour les échantillons présentant de fortes interférences dans la fraction MOAH (par exemple, les huiles tropicales).

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 08-Apr-2024
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 09-Apr-2024
• Due Date: 20-Aug-2024
• Completion Date: 09-Apr-2024

Relations

• Consolidates: ISO 16750-3:2023 - Road vehicles - Environmental conditions and testing for electrical and electronic equipment - Part 3: Mechanical loads
• Effective Date: 25-Feb-2023

Overview

ISO 20122:2024 specifies a validated laboratory procedure for the determination of mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) and mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH) in vegetable fats and oils using online-coupled HPLC-GC-FID (high performance liquid chromatography - gas chromatography - flame ionization detection). The method targets hydrocarbons in the boiling range equivalent to n-alkanes from C10 to C50 and is designed to achieve a low limit of quantification (LOQ) for routine and regulatory testing of vegetable oil matrices.

Key topics and technical requirements

• Scope and applicability: Applies only to vegetable fats and oils (not other matrices). Demonstrated suitability for MOSH concentrations > 3 mg/kg and MOAH concentrations > 2 mg/kg based on interlaboratory studies.
• Analytical principle: Saponification of the sample, extraction of the unsaponifiable fraction, clean-up and fractionation by online HPLC-GC, solvent vapour exit to remove most solvent, and quantification by GC-FID with internal standards.
• Sample preparation steps: Includes hexane/ethanol partitioning, saponification, removal of biogenic n-alkanes (aluminium oxide treatment), clean-up before epoxidation, and epoxidation of the MOAH fraction to remove interfering olefins (ethanolic epoxidation described in Clause 8.6).
• Alternative epoxidation: Performic acid epoxidation (Annex C) is offered as an alternative for samples with strong MOAH interferences (e.g., tropical oils) and provides comparable results.
• Verification and system checks: System suitability tests, blank runs and quality control procedures are specified. In case of suspected non-fossil interferences or ambiguity, GC×GC-MS can be used to verify the fossil origin of MOSH/MOAH.
• Limitations and notes: Epoxidation can induce degradation of MOAH with three or more aromatic rings; riding peaks from biogenic hydrocarbons and natural terpenes must be accounted for in quantification.

Practical applications and intended users

• Food and feed safety laboratories performing routine monitoring of vegetable oils for mineral oil contamination.
• Quality control teams in edible oil production and refining.
• Regulatory and standards bodies requiring traceable MOSH/MOAH measurements for compliance and surveillance.
• Research laboratories studying migration of mineral oils into food contact materials or conducting method development and validation. Benefits include improved sensitivity (low LOQ), harmonized sample processing for diverse oil types, and robust procedures for handling interferences common in vegetable oil matrices.

Related standards and references

• ISO 661 - Preparation of test sample for animal and vegetable fats and oils (normative reference cited).
• EN 16995:2017 - referenced as a baseline; ISO 20122:2024 includes additional steps and system suitability specifications to achieve lower LOQs.
• GC×GC-MS techniques are recommended for confirmatory analysis when interference or origin needs verification.

Keywords: ISO 20122:2024, vegetable oils, MOSH, MOAH, HPLC-GC-FID, low limit of quantification, epoxidation, performic acid, saponification, GC×GC-MS.

Standards Content (Sample)

International
Standard
ISO 20122
First edition
Vegetable oils — Determination of
2024-04
mineral oil saturated hydrocarbons
(MOSH) and mineral oil aromatic
hydrocarbons (MOAH) with
online-coupled high performance
liquid chromatography-gas
chromatography-flame ionization
detection (HPLC-GC-FID) analysis
— Method for low limit of
quantification
Reference number
© ISO 2024
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
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CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: [phone]
Email: [e-mail]
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 3
6 Apparatus . 6
7 Sample . 7
7.1 Sampling .7
7.2 Preparation of the final sample for liquid and solid fats .7
8 Procedures . 8
8.1 General .8
8.2 Hexane/ethanol distribution for removal of interfering substances .8
8.3 Saponification . .8
8.4 Removal of biogenic n-alkanes with aluminium oxide for determination of the MOSH
fraction .9
8.5 Clean-up before epoxidation to separate polar substances .9
8.6 Ethanolic epoxidation of the MOAH fraction to oxidize unsaturated non-aromatic
compounds .9
8.7 HPLC-GC separation .10
8.7.1 HPLC conditions .10
8.7.2 GC configuration .10
8.7.3 Solvent vapour exit configuration .11
8.7.4 Peak identification .11
8.7.5 System suitability test . 12
8.8 Blank run . 13
8.9 Quality control . 13
9 Result of the determination .13
9.1 Testing the chromatograms for sufficient epoxidation and other relevant parameters. 13
9.2 Calculation .14
10 Precision of the method .15
10.1 Repeatability limit . 15
10.2 Reproducibility limit . 15
11 Test report .15
Annex A (informative) Graphics and chromatograms. 17
Annex B (informative) Precision data .28
Annex C (informative) Alternative method for the epoxidation of the MOAH fraction (performic
acid epoxidation) . 41
Bibliography .42

iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34 Food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils, in collaboration with the European Committee for Standardization
(CEN) Technical Committee CEN/TC 307, Oilseeds, vegetable and animal fats and oils and their by-products —
Methods of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO
and CEN (Vienna Agreement).
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.

iv
Introduction
In order to achieve a low limit of quantification (LOQ), the method contains additional and partially modified
processing steps, specifications for the uniform processing of defined product groups and additional
requirements for system suitability compared to EN 16995:2017.
The method has been tested in an interlaboratory study via the analysis of both naturally contaminated and
spiked vegetable oil samples, ranging from 1 mg/kg to 75 mg/kg for MOSH, and from 1 mg/kg to 7 mg/kg
for MOAH.
v
International Standard ISO 20122:2024(en)
Vegetable oils — Determination of mineral oil saturated
hydrocarbons (MOSH) and mineral oil aromatic hydrocarbons
(MOAH) with online-coupled high performance liquid
chromatography-gas chromatography-flame ionization
detection (HPLC-GC-FID) analysis — Method for low limit of
quantification
1 Scope
This document specifies a procedure for the determination of saturated and aromatic hydrocarbons (from
C10 to C50) in vegetable fats and oils using the online-coupled high performance liquid chromatography-gas
[4][5][6]
chromatography-flame ionization detection (HPLC-GC-FID). This document does not apply to other
matrices.
The method is applicable for the analysis of mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) and/or mineral oil
aromatic hydrocarbons (MOAH).
According to the results of the interlaboratory studies, the method has been proven suitable for MOSH mass
concentrations above 3 mg/kg and MOAH mass concentrations above 2 mg/kg.
In case of suspected interferences, the fossil origin of the MOSH and MOAH fraction can be verified by
examination by GC⨯GC-MS.
An alternative method for the epoxidation of the MOAH fraction (performic acid epoxidation) is proposed
in Annex C. This alternative method provides comparable results to the ethanolic epoxidation of the MOAH
fraction described in 8.6. This alternative method for epoxidation has proven to be efficient for samples with
[14]
a high amount of interferences in the MOAH fraction (e.g. tropical oils).
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/

3.1
mineral oil saturated hydrocarbons
MOSH
paraffinic (open-chain, usually branched) and naphthenic (cyclic, alkylated) hydrocarbons in the boiling
range of n-alkanes with a chain length of 10 to 50 carbon atoms, which are obtained from mineral oil by this
method by means of online-coupled high performance liquid chromatography-gas chromatography-flame
ionization detection (HPLC-GC-FID)
3.2
mineral oil aromatic hydrocarbons
MOAH
aromatic mainly alkylated hydrocarbons from mineral oil in the boiling range of n-alkanes with a chain
length of 10 to 50 carbon atoms, determined by means of online-coupled high performance liquid
chromatography-gas chromatography-flame ionization detection (HPLC-GC-FID)
3.3
unresolved complex mixture
UCM
complex mixture of saturated or aromatic hydrocarbons not resolved by gas chromatography such as
branched paraffins, alkylated naphthenes and alkylated aromatics, that produces a hump when analysed by
gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID)
3.4
polyolefin oligomeric saturated hydrocarbons
POSH
synthetic hydrocarbons from oligomers of polyolefins, such as polyethylene, polypropylene and
polybutylenes
Note 1 to entry: Food contact uses comprise plastic bags, containers or films, heat sealable layers and other lamination
as well as adhesives and plasticizers.
Note 2 to entry: POSH can be distinguished from mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) by their chromatographic
[5]
pattern, but it is difficult to differentiate and chromatographically separate them from the MOSH if both are present.
3.5
resin oligomeric saturated hydrocarbons
ROSH
synthetic saturated hydrocarbons (oligomers from monoterpenes, cyclopentadienes and other C5- or C9-
monomeres) that are ingredients of hot-melt adhesives and can migrate into the sample mostly via gas phase
transfer or via direct contact
3.6
resin oligomeric aromatic hydrocarbons
ROAH
synthetic aromatic hydrocarbons that are ingredients of hot-melt adhesives and can migrate into the sample
mostly via gas phase transfer or by direct contact
3.7
poly-alpha-olefins
PAO
synthetic iso-paraffins with short and long side chains, used as lubricants or in adhesives and hotmelts
Note 1 to entry: When analysed by gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID), they are recognized by
[5]
series of rather narrow humps of unresolved branched hydrocarbons with regular distance between them.
4 Principle
The sample is saponified and from the unsaponifiable residue, purified fractions are obtained following
additional steps. These fractions are separated on a silica gel column of the HPLC-GC-FID system into MOSH

and MOAH fractions; each is transferred separately to the GC by online coupling. Most of the solvent is
removed via a solvent vapour exit between the uncoated pre-column and the GC separation column.
In order to meet the requirements of the various interfering accompanying substances occurring in the
samples, specific sample preparation procedures are described for different product groups. However,
epoxidation is a purification step that is necessary for the quantification of MOAH for all vegetable oil
samples. This purification step allows the elimination of olefins such as squalene, which elute within the
MOAH fraction and interfere with quantification. Depending on the sample, this reaction can induce the
epoxidation of a part of the MOAH or incomplete removal of the interfering olefins.
The signal area for mineral oil is calculated by subtracting riding peaks from the total area. The riding peaks
can be caused by n-alkanes (naturally occurring hydrocarbons), terpenes, sterenes, squalene and their
isomerization products as well as other substances. MOSH and MOAH are quantitated by internal standard
added before analysis. Verification standards are added for monitoring proper HPLC fractionation and GC
transfer conditions.
NOTE Epoxidation step can induce degradation of MOAH with three or more aromatic rings.
5 Reagents
WARNING — Reference is drawn to regulations that specify the handling of hazardous substances.
Technical, organizational and personal safety measures shall be followed.
All materials shall be tested for their influence in a blank run. It is recommended to heat all glassware in an
oven according to the instructions. All other materials that come into direct contact with the sample should
also be heated and should not be made of polyethylene or polypropylene.
Unless otherwise stated:
— analytical pure reagents shall be used;
— water shall be either distilled or of corresponding purity;
— a solution is understood to be an aqueous solution.
1)
5.1 Silica gel 60 , extra pure, for column chromatography, with a particle size between 60 μm and
200 μm (70 to 230 mesh) stored in a glass bottle (protection against contamination). The silica gel is heated
in an oven at 400 °C for at least 16 h and cooled in a clean desiccator (without ground grease).
5.2 Sodium sulfate, anhydrous, analytical grade, purity ≥ 99 %.
In case of contamination, heat the sodium sulfate in an oven at 400 °C for at least 16 h and allow to cool down
in a clean desiccator (without ground grease).
5.3 n-Hexane, free of hydrocarbons in the boiling range of the n-alkanes C10 to C50 and other impurities
such as hexane oxidation products.
Check the purity of the n-hexane as follows:
— mix 30 ml n-hexane with 25 μl of the internal standard solution (5.17) and two drops of bis(2-ethylhexyl)
maleate (5.26);
— evaporate using an evaporator unit;
— dissolve the residue in 0,2 ml n-hexane;
— inject 50 μl into the HPLC-GC-FID system for analysis.
1) Silica gel is available from Merck, reference 7754 or 7734. It is an example of a suitable product available commercially.
This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of
this product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

The hump signal (excluding any sharp single peaks of the solvent blank) should not exceed one-tenth of the LOQ.
NOTE Hydrocarbons in the boiling range under investigation interfere with the specific detection of mineral
oil constituents in gas chromatography of the MOSH and MOAH fractions, while polar compounds such as hexane
oxidation products interfere with the separation of long-chain n-alkanes in column chromatography on alumina.
5.4 Dichloromethane (DCM), purity ≥ 99 %.
Test the purity as for n-hexane (5.3) with 30 ml DCM.
5.5 Toluene.
5.6 Perylene (PER), purity > 99 %.
5.7 5-alpha-cholestane (CHO), purity ≥ 97 %.
5.8 n-Undecane (C11), purity ≥ 99 %.
5.9 n-Tridecane (C13), purity ≥ 99 %.
5.10 Tri-tert-butylbenzene (TBB), purity ≥ 97 %.
5.11 Bicyclohexyl (CYCY), purity ≥ 99 %.
5.12 1-Methyl naphthalene (1-MN), purity ≥ 95 %.
5.13 2-Methyl naphthalene (2-MN), purity ≥ 97 %.
5.14 Pentyl benzene (PB), purity ≥ 99 %.
5.15 Stock solution, mass concentrations, ρ = 5 mg/ml, 10 mg/ml or 20 mg/ml. Weigh, for example, 50 mg
of C13 (5.9), 100 mg each of C11 (5.8), TBB (5.10), CYCY (5.11), 1-MN (5.12), 2-MN (5.13) and PB (5.14) as well
as 200 mg CHO (5.7) and PER (5.6) to the nearest 1 mg and fill up to the mark in a 10 ml volumetric flask
with toluene (5.5). Store at room temperature to keep the solutions stable. Dissolve any crystals formed
during storage by gentle heating.
The verification of the start of the MOAH fraction, based on TBB, can result in losses of higher alkylated
benzenes and naphthalenes, if present in some samples (i.e. cosmetics) and when the chromatographic
performance of the column is limited. In such cases, di(2-ethylhexyl) benzene (DEHB) can be used in addition
[10]
as verification standard and the fractionation shall be adapted.
2)
5.16 Internal standard solution 1 (ISTD1) , mass concentrations ρ = 150 μg/ml (C13), 300 μg/ml (C11,
CYCY, PB, 1-MN, 2-MN and TBB) and 600 μg/ml (CHO and PER). Transfer 300 μl stock solution (5.15) into a
10 ml volumetric flask and fill up to the mark with toluene (5.5).
5.17 Internal standard solution 2 (ISTD2), mass concentrations ρ = 30 μg/ml (C13), 60 μg/ml (C11, TBB,
CYCY, 1-MN, 2-MN and PB) and 120 μg/ml (PER and CHO) Dilute ISTD1 solution (5.16) by a factor of 5, e.g. fill
up 1 000 μl ISTD1 solution (5.16) to 5 ml with n-hexane.
5.18 Aluminium oxide 90, alkaline, for column chromatography, 0,063 mm to 0,2 mm, activated. Heat the
alumina before use for at least 16 h at 500 °C in an oven and cool down to room temperature in a cleaned
desiccator (without ground grease).
2) This standard mixture is available from, for example, Restek Corp., Cat.# 31070. It is an example of a suitable product
commercially available. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute
an endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

5.19 meta-chloroperbenzoic acid (mCPBA), stated quantities based on a purity of about ≤ 77 %;
Commercially available mCPBA contains varying amounts of mCPBA, meta-chlorobenzoic acid and water.
For purification of the reagent, remove contaminating hydrocarbons, e.g. finely suspend 5 g mCPBA with
200 ml n-hexane in a polyethylene terephthalate (PET) beaker in an ultrasonic bath and filter by using a
vacuum frit. Let the purified mCPBA dry in a fume cupboard. Do not store in glass containers, as mCPBA
decomposes on glass surfaces. Commercially available mCPBA still contains meta-chlorobenzoic acid and
residual moisture to make handling in the laboratory safe. Pure mCPBA, on the other hand, is explosive, so
isolation of mCPBA as a pure substance, which goes beyond the cleaning described here, is not recommended.
Washing with a solvent mixture of 200 ml n-hexane and 20 ml DCM can remove further impurities, but also
leads to significant higher losses (yields only 75 % of the initial mCPBA with a content of about 74 g to 84 g
mCPBA per 100 g starting material in the purified product).
To determine the mCPBA content of the reagent, weigh about 0,2 g mCPBA into a PET beaker, add 50 ml
distilled water and mix thoroughly. Add 5 ml concentrated acetic acid and 10 ml sodium iodide solution (10 g
sodium iodide in 100 ml water). Then pre-titrate with 0,1 N sodium thiosulfate solution from dark red to
light yellow. Add a few drops of starch indicator solution and titrate from dark blue to colourless at the end
point (consumption usually below 20 ml).
Calculate the content w (mCPBA) in per cent by mass as shown by Formula (1):
NV××86,29×100
w= (1)
E
where
N is the normality of the sodium thiosulfate solution;
V is the total volume of consumed sodium thiosulfate solution in l;
E is the mass of the reagent in g.
5.20 mCPBA solution in ethanol, ρ = 100 mg/ml, e.g. dissolve 1 g mCPBA (5.19) in 10 ml ethanol (5.28).
Prepare the solution fresh every working day.
5.21 Sodium thiosulfate, anhydrous, purity > 90,0 %.
5.22 Sodium hydrogen carbonate (or sodium carbonate), anhydrous, purity > 90,0 %.
5.23 Solution for deactivation of the excess of mCPBA: Sodium thiosulfate and sodium carbonate
solution, ρ = 50 g/l, e.g. dissolve 5 g of sodium thiosulfate and 5 g of sodium hydrogen carbonate (or sodium
carbonate) in 100 ml distilled water and mix thoroughly.
5.24 Alumina column with silica gel cover. Place a filter (6.4) in a glass column (6.3). Add and compress
10 g of alumina (5.18), 3 g of silica gel (5.1) and 1 g of sodium sulfate (5.2).
5.25 Clean-up column. Place a filter (6.4) in an empty SPE glass cartridge (volume 6 ml), add 3 g of silica
gel (5.1), compress and cover with 1 g of sodium sulfate (5.2).
5.26 bis (2-ethylhexyl) maleate, purity 90 %. Check the purity in a blank run.
Bis (2-ethylhexyl) maleate may be replaced by bis(2-ethylhexyl) sebacate in order to limit the risk of
epoxidation process disturbance.
5.27 Standard solution of the n-alkanes with chain lengths of 10 to 50 in the same mass concentration
for checking for discrimination against low- or high-boiling substances, ρ = 1 μg/ml. Store this solution
at room temperature, otherwise C50 can crystallize.

5.28 Ethanol, absolute.
Test the purity as for n-hexane (5.3) with 30 ml ethanol.
5.29 Mixture of ethanol and n-hexane, volume fraction φ = 50 %, e.g. mix 50 ml of ethanol (5.28) with
50 ml of n-hexane (5.3).
5.30 Elution mixture of n-hexane and DCM, e.g. mix 30 ml DCM (5.4) with 70 ml n-hexane (5.3). Due to
the volatility of DCM, the solution shall be freshly prepared.
5.31 Potassium hydroxide solution, e.g. 50 g potassium hydroxide in 100 ml distilled water, w = 33 g/100 g.
6 Apparatus
In order to achieve a sufficiently low blank level, the following process has proven to be effective: glassware
(except volumetric flasks) should be heated in an oven at 430 °C for 4 h or overnight at 400 °C and kept in
desiccators or other containers for use. In addition, it is recommended to:
— perform multiple determinations in different series and not directly one after another;
— not use grease for ground joints;
— not use hand cream;
— handle samples with gloves, only;
— use glassware where possible;
— check nitrogen for purity, when drying in a stream of nitrogen;
— rinse volumetric flasks, glass pipettes and other required glassware with n-hexane before use.
6.1 Analytical balance, readability 0,000 1 g, weighing accuracy 0,001 g.
6.2 Centrifuge and centrifuge tubes.
6.3 Glass column, without stopcock, 15 cm to 20 cm long and 15 mm to 20 mm inner diameter.
6.4 Filter for glass column, extracted or heated, filter made of quartz wool/glass fibre.
6.5 Glass vial, 40 ml, with polytetrafluoroethylene (PTFE) sealed screw cap.
6.6 Rotary evaporator, with vacuum and water bath at 35 °C.
Comparable devices can also be used. Take care to prevent contamination. If necessary, clean the system
thoroughly between determinations.
3)
6.7 HPLC column, e.g. LiChrospher Si 60 or Allure Silica , 5 µm material, 2 × 250 mm or comparable.
4)
6.8 Uncoated GC guard column, fused silica or metal capillary, e.g. HydroGuard® MXT® ,
10 m × 0,53 mm or comparable.
3) LiChrospher Si 60 and Allure Silica are examples of suitable products available commercially. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
4) HydroGuard® MXT® is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

NOTE The capillaries in 6.8 to 6.12 have proven to be suitable, but can be adapted to the system to meet the
requirements and yield comparable results.
6.9 GC separation column, fused silica or metal capillary, programmed temperature stable up to at
least 370 °C: 100 % dimethylpolysiloxane or 95 % dimethyl and 5 % phenyl methylpolysiloxane as stationary
phase, length 15 m, internal diameter (ID) 0,32 mm or 0,25 mm and film thickness 0,10 μm to 0,25 μm.
6.10 Fused silica or metal capillary, deactivated, for transfer the HPLC fractions from the valve to the
T-connector of the GC, 1 m long, 0,1 mm ID.
6.11 Capillary, deactivated, from the T-connector between pre- and separation column to the vapour exit.
6.12 Restriction capillary at the vapour exit, deactivated, 1 m long, ID 0,05 mm.
6.13 Syringe, 100 μl, suitable for injection of 5 to 100 µl in liquid chromatography.
6.14 Pasteur pipette made of glass.
NOTE The use of plastic pipette tips and polyethylene foil leads to increased blank levels.
6.15 Online-coupled HPLC-GC-FID system, consisting of an HPLC instrument capable of running a binary
gradient, injection valve, HPLC column (6.7), ultraviolet light (UV) detector (detection wavelength: 230 nm),
switching valves for column backflush and fraction transfer into GC, GC with solvent vapour exit (SVE),
pneumatic control and evaluation system. In addition, an automatic control system is recommended.
6.16 Test tube shaker with temperature control and agitation (e.g. 500 r/min or comparable).
7 Sample
7.1 Sampling
Sampling is not part of this method. The sample may only be stored in glass bottles, aluminium or other
materials that do not release hydrocarbons. Packaging made of paper, polyethylene or polypropylene is
5)
unsuitable. Containers made of PET or foil bags made of a high-performance polyamide such as RILSAN
may be used in some cases. Attention shall also be paid to the closure and sealing materials of the containers.
The use of hand cream should be avoided when handling samples. The sampling shall be checked by blank
runs using n-hexane instead of a sample.
A recommended sampling method is given in ISO 5555.
7.2 Preparation of the final sample for liquid and solid fats
Prepare the test sample in accordance with ISO 661.
Special treatments of the test sample (e.g. filtering, melting) shall be mentioned.
5) RILSAN is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

8 Procedures
8.1 General
Depending on the type of fats and oils, the samples shall be prepared differently. The specific cases A to C
are as follows:
— A: Prepare oils and fats with unknown or high content of biogenic, long-chain alkanes and unsaturated
[7]
compounds such as olive oil, rapeseed oil, sunflower oil and comparable samples according to 8.2
(ethanol-hexane distribution). Using two separate 10 ml fractions of the extract, run 8.3 (saponification)
on the first fraction for the determination of the MOSH content according to 8.4 (Alox column), and run
8.3 (saponification) on the second fraction for the determination of the MOAH content according to 8.5
(clean-up) and 8.6 (epoxidation).
— B: Prepare oils and fats with low biogenic, long-chain alkanes and disturbing unsaturated compounds
such as coconut fat, linseed oil, palm oil and comparable samples without aluminium oxide column
according to 8.2 (ethanol-hexane distribution), 8.3 (saponification), 8.5 (clean-up) and 8.6 (epoxidation).
Determine the MOSH and MOAH fractions from the solution obtained.
— C: For automated application of the alumina column, prepare oils and fats according to 8.2 (ethanol-
hexane distribution), 8.3 (saponification), 8.5 (clean-up) and 8.6 (epoxidation). Inject into the HPLC-GC-
FID system. After separation of the MOSH, which are passed to an integrated online Alox column, the
MOAH fraction can be determined in the same run using a two-channel system.
Every laboratory using automated procedures shall carry out tests to ensure that the results obtained with
the automated procedures do not deviate from results obtained with the manual procedure.
Unknown samples or mix oils samples may be analysed first without Alox cleanup. If the presence of
interfering long-chain n-alkanes significantly impact the hump and do not allow a proper integration, the
extract shall be re-injected using the alumina column to reduce interferences (e.g. for online Alox clean
up, the same sample extract used to determine MOAH is used for the subsequent separation of long-chain
n-alkanes with the aluminium oxide column for the determination of MOSH).
NOTE Only the manual purification method for MOSH fraction was validated during the collaborative study.
8.2 Hexane/ethanol distribution for removal of interfering substances
Weigh 3 g of the sample for oils and fats into a 40 ml centrifuge tube with screw cap. Add 30 ml of the
mixture of n-hexane (5.3) and ethanol (5.29) and 20 μl ISTD1 (5.16) or 100 μl ISTD2 (5.17), and homogenize.
Use 10 ml of this solution for the further procedure (see 8.3).
NOTE In case of oils and fats, no phase separation will be observed. Nevertheless, this step ensures a complete
saponification of oils and fats. If necessary, other quantities of internal standard can be added.
8.3 Saponification
Transfer an aliquot of 10 ml (see 8.2) into another sample tube and add 3 ml potassium hydroxide solution
(5.31). Saponify the solution for 30 min at 60 °C in a water bath while shaking until the solution becomes
clear. Cool down, add 5 ml n-hexane (5.3) and 5 ml mixture of ethanol and water (a volume fraction of 1:1),
shake the mixture again, transfer the lower phase after phase separation into a new vial and extract again
with an additional 5 ml of n-hexane. Combine both n-hexane extracts.
Depending on the sample preparation method, continue using the solution to separate biogenic, long-chain
n-alkanes with aluminium oxide (according to 8.4) or for epoxidation (according to 8.5 and 8.6).
NOTE The addition of ethanol after saponification enables a better phase separation and avoids foaming.

8.4 Removal of biogenic n-alkanes with aluminium oxide for determination of the MOSH
fraction
Pre-clean the alumina column (5.24) with 20 ml of n-hexane in order to remove interfering substances (see
text on interfering substances below). Transfer the solution from 8.3 to the alumina column and elute the
hydrocarbons with 25 ml n-hexane (5.3). Collect the hydrocarbons beginning with the sample transfer.
Evaporate the solvent under vacuum (≥260 mbar) at 35 °C after adding two drops of bis (2-ethylhexyl)
maleate (5.26).
Dissolve the residue in about 1 ml n-hexane, centrifuge if necessary and fill into a vial. Inject 60 μl to 90 μl of
the solution for analysis with the HPLC-GC-FID system to determine the MOSH fraction.
The MOAH remain on the alumina column and shall not be determined from this eluate. It is recommended
to remove interfering substances from the alumina by pre-rinsing the column with 20 ml n-hexane. However,
clean alumina does not need to be pre-rinsed.
Removal of biogenic n-alkanes can also remove paraffinic waxes at the same time if present in the sample. In
these cases, analysis shall be carried out according to procedure B.
NOTE Paraffinic waxes are characterized by n-alkanes with no odd carbon predominance of their chain lengths,
while naturally occurring n-alkanes in edible oils present an odd carbon predominance. As an example, main n-alkanes
in sunflower oils are C27, C29 and C31 alkanes.
8.5 Clean-up before epoxidation to separate polar substances
Transfer the combined upper phases from the saponification step (see 8.3) to a clean-up column (5.25) and
collect the eluting hydrocarbons: start collecting the eluent immediately after transferring the upper phase
from the saponification step to the clean-up column. Complete the elution of hydrocarbons from the column
with additional 15 ml solvent mixture of n-hexane and DCM (volume fraction of 7 + 3) (5.30). Use the eluate
for epoxidation (according to 8.6).
It is recommended to remove interfering substances from the clean-up column by pre-rinsing the column
with n-hexane. However, clean glassware and reagents do not need to be pre-rinsed.
8.6 Ethanolic epoxidation of the MOAH fraction to oxidize unsaturated non-aromatic
compounds
NOTE For further information, see References [11] and [13].
After adding two drops of bis (2-ethylhexyl) maleate (5.26) as a keeper, concentrate the solution of 8.5 at
35 °C under vacuum, retaining all internal standards, and adjust to a volume of 1 ml with n-hexane.
In this step, any DCM should be completely removed to ensure reliable fractionation in the HPLC-GC-FID system.
Add 1 ml ethanolic mCPBA solution (5.20) to the obtained extract and place the sample on a shaker (6.16) for
20 min at 40 °C at, for example, 500 r/min. Then add 500 µl ethanol (5.28) and 2 ml solution for deactivation
of the excess of mCPBA (5.23) and shake the sample vial for about 1 min at about 750 r/min to deactivate any
excess of mCPBA. Transfer the upper hexane phase to a fresh sample vial and dry the hexane solution with
a spatula tip of sodium sulfate (5.2). Inject 90 µl of the dried solution into the HPLC-GC-FID system for the
determination of MOAH.
It is optional to use a more concentrated final volume of, for example, 300 µl and a corresponding injection
volume as long as the enrichment is improved and the internal standards are retained during evaporation.
For sample preparation according to procedures A and B, this solution is used directly for the determination
of MOAH. In automated sample preparation according to procedure C, this solution is used for the subsequent
separation of long-chain n-alkanes with the aluminium oxide column (5.24) for the additional determination
of MOSH.
Continuous intense shaking of the reaction solution for epoxidation, at the specified reaction temperature, is
necessary to ensure sufficient and reproducible removal of interfering substances.

8.7 HPLC-GC separation
8.7.1 HPLC conditions
Pre-rinse the HPLC system with eluent A: n-hexane (5.3) and eluent B: DCM (5.4) and check system suitability
by injection of n-hexane. Table 1 shows an example of the gradient programme.
Table 1 — Gradient programme for the separation of MOSH and MOAH on a silica gel column with
backflush after 6 min and reconditioning after 15 min
Time Hexane DCM Flow
min % % µl/min
0,0 100 0 300
1,5 65 35 300
5,9 65 35 300
6,0 0 100 500 (backflush)
15,0 0 100 500 (reconditioning)
15,3 100 0 500
25,0 100 0 500
25,2 100 0 300
30,0 100 0 300
0,0 100 0 300
After 6,0 min, the flow direction of the column is reversed to remove remaining matrix components of the
sample from the column by backflush. This step significantly increases the lifetime of the HPLC column. For
operation with an automated online alumina column, it has proven to be best to start the gradient about
0,1 min later.
Figure A.1 shows a typical HPLC-UV chromatogram with the UV signal and in addition the pressure curve.
From 5,5 min onwards, a strong increase in the baseline can be seen due to DCM. Perylene from the ISTD
mix elutes at 5,6 min. Backflush should decrease the baseline signal to the initial level. The fractionation of
the MOSH fraction from 2 min to 3,5 min and the MOAH fraction from 5,7 min to 6,2 min can be detected by
slight baseline changes. If necessary, the change in pressure can also be monitored for this purpose; here,
attention should also be paid to a possible pressure increase, which indicates a blockage in the system. The
times given can vary slightly depending on the system and columns used and should be checked regularly by
injecting a diluted ISTD solution.
The capillaries from the fraction transfer switching valve are combined with the carrier gas supply in a
T-connector and directed into the pre-column in the GC oven.
8.7.2 GC configuration
Install the columns in the gas chromatograph and check the function of the system by injecting solvent. The
baseline should be straight with as little positive drift as possible. If the drift is too high (see 8.7.5), heat the
column or, if the stationary phase of the GC separation column is suitable for this procedure, rinse it with
solvent or replace the column. In case of a negative drift, check the connections of the columns for tightness.
Heat columns which are used for the first time (e.g. 4 h in the oven at a temperature gradient up to least
350 °C with a stream of carrier gas and maintain the final temperature for at least 30 min).
The following working conditions proved to be suitable for the analysis and may be adapted to the
requirements of the HPLC-GC-FID system:
— Pre-column uncoated, deactivated, 7 m to 10 m ⨯ 0,53 mm (6.8).
— Separation column: 100 % dimethyl polysiloxane, low bleeding (15 m long, 0,25 mm i.d., 0,1 μm to
0,25 μm film thickness) (6.9).

— Oven temperature: Initial temperature 60 °C, 8 min isothermal, programmed with 15 °C/min to 120 °C,
further on with 25 °C/min to 370 °C, hold for 6 min.
— Carrier gas: hydrogen, inlet pressure for MOSH 70 kPa, after closing the solvent vapour exit 150 kPa until
the MOAH fraction is ready for GC separation, inlet pressure for MOAH 65 kPa, after closing the solvent
vapour exit 150 kPa for both channels.
NOTE 1 In two-channel systems, the first fraction can be kept at a lower pressure, e.g. 30 kPa on the pre-
column, until the second fraction is ready for separation. Finetuning of the pressure values can be necessary for
each individual system.
— Detector temperature: 380 °C. (Very high detector temperatures can lead to a shortened lifetime of the
temperature sensor. If lower oven and detector temperatures are used, a higher baseline drift can occur
at the end of the chromatograms or the FID nozzle shall be cleaned more often. In addition, check for
discrimination of high boiling n-alkanes.)
— Fraction vo
...

International
Standard
ISO 20122
First edition
Vegetable oils — Determination of
2024-04
mineral oil saturated hydrocarbons
(MOSH) and mineral oil aromatic
Corrected version
hydrocarbons (MOAH) with
2024-11
online-coupled high performance
liquid chromatography-gas
chromatography-flame ionization
detection (HPLC-GC-FID) analysis
— Method for low limit of
quantification
Huiles végétales — Dosage des hydrocarbures saturés d’huile
minérale (MOSH) et des hydrocarbures aromatiques d’huile
minérale (MOAH) par analyse par chromatographie en phase
liquide haute performance et chromatographie en phase gazeuse
couplées à un détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en
ligne — Méthode pour une faible limite de quantification
Reference number
© ISO 2024
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
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CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: [phone]
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 3
6 Apparatus . 6
7 Sample . 7
7.1 Sampling .7
7.2 Preparation of the final sample for liquid and solid fats .7
8 Procedures . 8
8.1 General .8
8.2 Hexane/ethanol distribution for removal of interfering substances .8
8.3 Saponification . .8
8.4 Removal of biogenic n-alkanes with aluminium oxide for determination of the MOSH
fraction .9
8.5 Clean-up before epoxidation to separate polar substances .9
8.6 Ethanolic epoxidation of the MOAH fraction to oxidize unsaturated non-aromatic
compounds .9
8.7 HPLC-GC separation .10
8.7.1 HPLC conditions .10
8.7.2 GC configuration .10
8.7.3 Solvent vapour exit configuration .11
8.7.4 Peak identification .11
8.7.5 System suitability test . 12
8.8 Blank run . 13
8.9 Quality control . 13
9 Result of the determination .13
9.1 Testing the chromatograms for sufficient epoxidation and other relevant parameters. 13
9.2 Calculation .14
10 Precision of the method .15
10.1 Repeatability limit . 15
10.2 Reproducibility limit . 15
11 Test report .15
Annex A (informative) Graphics and chromatograms. 17
Annex B (informative) Precision data .28
Annex C (informative) Alternative method for the epoxidation of the MOAH fraction (performic
acid epoxidation) . 41
Bibliography .42

iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34 Food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils, in collaboration with the European Committee for Standardization
(CEN) Technical Committee CEN/TC 307, Oilseeds, vegetable and animal fats and oils and their by-products —
Methods of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO
and CEN (Vienna Agreement).
This corrected version of ISO 20122:2024 incorporates the following corrections:
— in 8.7.1, “the MOAH fraction from 5,7 min” has been corrected to “the MOAH fraction from 4,7 min”.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.

iv
Introduction
In order to achieve a low limit of quantification (LOQ), the method contains additional and partially modified
processing steps, specifications for the uniform processing of defined product groups and additional
requirements for system suitability compared to EN 16995:2017.
The method has been tested in an interlaboratory study via the analysis of both naturally contaminated and
spiked vegetable oil samples, ranging from 1 mg/kg to 75 mg/kg for MOSH, and from 1 mg/kg to 7 mg/kg
for MOAH.
v
International Standard ISO 20122:2024(en)
Vegetable oils — Determination of mineral oil saturated
hydrocarbons (MOSH) and mineral oil aromatic hydrocarbons
(MOAH) with online-coupled high performance liquid
chromatography-gas chromatography-flame ionization
detection (HPLC-GC-FID) analysis — Method for low limit of
quantification
1 Scope
This document specifies a procedure for the determination of saturated and aromatic hydrocarbons (from
C10 to C50) in vegetable fats and oils using the online-coupled high performance liquid chromatography-gas
[4][5][6]
chromatography-flame ionization detection (HPLC-GC-FID). This document does not apply to other
matrices.
The method is applicable for the analysis of mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) and/or mineral oil
aromatic hydrocarbons (MOAH).
According to the results of the interlaboratory studies, the method has been proven suitable for MOSH mass
concentrations above 3 mg/kg and MOAH mass concentrations above 2 mg/kg.
In case of suspected interferences, the fossil origin of the MOSH and MOAH fraction can be verified by
examination by GC⨯GC-MS.
An alternative method for the epoxidation of the MOAH fraction (performic acid epoxidation) is proposed
in Annex C. This alternative method provides comparable results to the ethanolic epoxidation of the MOAH
fraction described in 8.6. This alternative method for epoxidation has proven to be efficient for samples with
[14]
a high amount of interferences in the MOAH fraction (e.g. tropical oils).
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/

3.1
mineral oil saturated hydrocarbons
MOSH
paraffinic (open-chain, usually branched) and naphthenic (cyclic, alkylated) hydrocarbons in the boiling
range of n-alkanes with a chain length of 10 to 50 carbon atoms, which are obtained from mineral oil by this
method by means of online-coupled high performance liquid chromatography-gas chromatography-flame
ionization detection (HPLC-GC-FID)
3.2
mineral oil aromatic hydrocarbons
MOAH
aromatic mainly alkylated hydrocarbons from mineral oil in the boiling range of n-alkanes with a chain
length of 10 to 50 carbon atoms, determined by means of online-coupled high performance liquid
chromatography-gas chromatography-flame ionization detection (HPLC-GC-FID)
3.3
unresolved complex mixture
UCM
complex mixture of saturated or aromatic hydrocarbons not resolved by gas chromatography such as
branched paraffins, alkylated naphthenes and alkylated aromatics, that produces a hump when analysed by
gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID)
3.4
polyolefin oligomeric saturated hydrocarbons
POSH
synthetic hydrocarbons from oligomers of polyolefins, such as polyethylene, polypropylene and
polybutylenes
Note 1 to entry: Food contact uses comprise plastic bags, containers or films, heat sealable layers and other lamination
as well as adhesives and plasticizers.
Note 2 to entry: POSH can be distinguished from mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) by their chromatographic
[5]
pattern, but it is difficult to differentiate and chromatographically separate them from the MOSH if both are present.
3.5
resin oligomeric saturated hydrocarbons
ROSH
synthetic saturated hydrocarbons (oligomers from monoterpenes, cyclopentadienes and other C5- or C9-
monomeres) that are ingredients of hot-melt adhesives and can migrate into the sample mostly via gas phase
transfer or via direct contact
3.6
resin oligomeric aromatic hydrocarbons
ROAH
synthetic aromatic hydrocarbons that are ingredients of hot-melt adhesives and can migrate into the sample
mostly via gas phase transfer or by direct contact
3.7
poly-alpha-olefins
PAO
synthetic iso-paraffins with short and long side chains, used as lubricants or in adhesives and hotmelts
Note 1 to entry: When analysed by gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID), they are recognized by
[5]
series of rather narrow humps of unresolved branched hydrocarbons with regular distance between them.
4 Principle
The sample is saponified and from the unsaponifiable residue, purified fractions are obtained following
additional steps. These fractions are separated on a silica gel column of the HPLC-GC-FID system into MOSH

and MOAH fractions; each is transferred separately to the GC by online coupling. Most of the solvent is
removed via a solvent vapour exit between the uncoated pre-column and the GC separation column.
In order to meet the requirements of the various interfering accompanying substances occurring in the
samples, specific sample preparation procedures are described for different product groups. However,
epoxidation is a purification step that is necessary for the quantification of MOAH for all vegetable oil
samples. This purification step allows the elimination of olefins such as squalene, which elute within the
MOAH fraction and interfere with quantification. Depending on the sample, this reaction can induce the
epoxidation of a part of the MOAH or incomplete removal of the interfering olefins.
The signal area for mineral oil is calculated by subtracting riding peaks from the total area. The riding peaks
can be caused by n-alkanes (naturally occurring hydrocarbons), terpenes, sterenes, squalene and their
isomerization products as well as other substances. MOSH and MOAH are quantitated by internal standard
added before analysis. Verification standards are added for monitoring proper HPLC fractionation and GC
transfer conditions.
NOTE Epoxidation step can induce degradation of MOAH with three or more aromatic rings.
5 Reagents
WARNING — Reference is drawn to regulations that specify the handling of hazardous substances.
Technical, organizational and personal safety measures shall be followed.
All materials shall be tested for their influence in a blank run. It is recommended to heat all glassware in an
oven according to the instructions. All other materials that come into direct contact with the sample should
also be heated and should not be made of polyethylene or polypropylene.
Unless otherwise stated:
— analytical pure reagents shall be used;
— water shall be either distilled or of corresponding purity;
— a solution is understood to be an aqueous solution.
1)
5.1 Silica gel 60 , extra pure, for column chromatography, with a particle size between 60 μm and
200 μm (70 to 230 mesh) stored in a glass bottle (protection against contamination). The silica gel is heated
in an oven at 400 °C for at least 16 h and cooled in a clean desiccator (without ground grease).
5.2 Sodium sulfate, anhydrous, analytical grade, purity ≥ 99 %.
In case of contamination, heat the sodium sulfate in an oven at 400 °C for at least 16 h and allow to cool down
in a clean desiccator (without ground grease).
5.3 n-Hexane, free of hydrocarbons in the boiling range of the n-alkanes C10 to C50 and other impurities
such as hexane oxidation products.
Check the purity of the n-hexane as follows:
— mix 30 ml n-hexane with 25 μl of the internal standard solution (5.17) and two drops of bis(2-ethylhexyl)
maleate (5.26);
— evaporate using an evaporator unit;
— dissolve the residue in 0,2 ml n-hexane;
— inject 50 μl into the HPLC-GC-FID system for analysis.
1) Silica gel is available from Merck, reference 7754 or 7734. It is an example of a suitable product available commercially.
This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of
this product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

The hump signal (excluding any sharp single peaks of the solvent blank) should not exceed one-tenth of the LOQ.
NOTE Hydrocarbons in the boiling range under investigation interfere with the specific detection of mineral
oil constituents in gas chromatography of the MOSH and MOAH fractions, while polar compounds such as hexane
oxidation products interfere with the separation of long-chain n-alkanes in column chromatography on alumina.
5.4 Dichloromethane (DCM), purity ≥ 99 %.
Test the purity as for n-hexane (5.3) with 30 ml DCM.
5.5 Toluene.
5.6 Perylene (PER), purity > 99 %.
5.7 5-alpha-cholestane (CHO), purity ≥ 97 %.
5.8 n-Undecane (C11), purity ≥ 99 %.
5.9 n-Tridecane (C13), purity ≥ 99 %.
5.10 Tri-tert-butylbenzene (TBB), purity ≥ 97 %.
5.11 Bicyclohexyl (CYCY), purity ≥ 99 %.
5.12 1-Methyl naphthalene (1-MN), purity ≥ 95 %.
5.13 2-Methyl naphthalene (2-MN), purity ≥ 97 %.
5.14 Pentyl benzene (PB), purity ≥ 99 %.
5.15 Stock solution, mass concentrations, ρ = 5 mg/ml, 10 mg/ml or 20 mg/ml. Weigh, for example, 50 mg
of C13 (5.9), 100 mg each of C11 (5.8), TBB (5.10), CYCY (5.11), 1-MN (5.12), 2-MN (5.13) and PB (5.14) as well
as 200 mg CHO (5.7) and PER (5.6) to the nearest 1 mg and fill up to the mark in a 10 ml volumetric flask
with toluene (5.5). Store at room temperature to keep the solutions stable. Dissolve any crystals formed
during storage by gentle heating.
The verification of the start of the MOAH fraction, based on TBB, can result in losses of higher alkylated
benzenes and naphthalenes, if present in some samples (i.e. cosmetics) and when the chromatographic
performance of the column is limited. In such cases, di(2-ethylhexyl) benzene (DEHB) can be used in addition
[10]
as verification standard and the fractionation shall be adapted.
2)
5.16 Internal standard solution 1 (ISTD1) , mass concentrations ρ = 150 μg/ml (C13), 300 μg/ml (C11,
CYCY, PB, 1-MN, 2-MN and TBB) and 600 μg/ml (CHO and PER). Transfer 300 μl stock solution (5.15) into a
10 ml volumetric flask and fill up to the mark with toluene (5.5).
5.17 Internal standard solution 2 (ISTD2), mass concentrations ρ = 30 μg/ml (C13), 60 μg/ml (C11, TBB,
CYCY, 1-MN, 2-MN and PB) and 120 μg/ml (PER and CHO) Dilute ISTD1 solution (5.16) by a factor of 5, e.g. fill
up 1 000 μl ISTD1 solution (5.16) to 5 ml with n-hexane.
5.18 Aluminium oxide 90, alkaline, for column chromatography, 0,063 mm to 0,2 mm, activated. Heat the
alumina before use for at least 16 h at 500 °C in an oven and cool down to room temperature in a cleaned
desiccator (without ground grease).
2) This standard mixture is available from, for example, Restek Corp., Cat.# 31070. It is an example of a suitable product
commercially available. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute
an endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

5.19 meta-chloroperbenzoic acid (mCPBA), stated quantities based on a purity of about ≤ 77 %;
Commercially available mCPBA contains varying amounts of mCPBA, meta-chlorobenzoic acid and water.
For purification of the reagent, remove contaminating hydrocarbons, e.g. finely suspend 5 g mCPBA with
200 ml n-hexane in a polyethylene terephthalate (PET) beaker in an ultrasonic bath and filter by using a
vacuum frit. Let the purified mCPBA dry in a fume cupboard. Do not store in glass containers, as mCPBA
decomposes on glass surfaces. Commercially available mCPBA still contains meta-chlorobenzoic acid and
residual moisture to make handling in the laboratory safe. Pure mCPBA, on the other hand, is explosive, so
isolation of mCPBA as a pure substance, which goes beyond the cleaning described here, is not recommended.
Washing with a solvent mixture of 200 ml n-hexane and 20 ml DCM can remove further impurities, but also
leads to significant higher losses (yields only 75 % of the initial mCPBA with a content of about 74 g to 84 g
mCPBA per 100 g starting material in the purified product).
To determine the mCPBA content of the reagent, weigh about 0,2 g mCPBA into a PET beaker, add 50 ml
distilled water and mix thoroughly. Add 5 ml concentrated acetic acid and 10 ml sodium iodide solution (10 g
sodium iodide in 100 ml water). Then pre-titrate with 0,1 N sodium thiosulfate solution from dark red to
light yellow. Add a few drops of starch indicator solution and titrate from dark blue to colourless at the end
point (consumption usually below 20 ml).
Calculate the content w (mCPBA) in per cent by mass as shown by Formula (1):
NV××86,29×100
w= (1)
E
where
N is the normality of the sodium thiosulfate solution;
V is the total volume of consumed sodium thiosulfate solution in l;
E is the mass of the reagent in g.
5.20 mCPBA solution in ethanol, ρ = 100 mg/ml, e.g. dissolve 1 g mCPBA (5.19) in 10 ml ethanol (5.28).
Prepare the solution fresh every working day.
5.21 Sodium thiosulfate, anhydrous, purity > 90,0 %.
5.22 Sodium hydrogen carbonate (or sodium carbonate), anhydrous, purity > 90,0 %.
5.23 Solution for deactivation of the excess of mCPBA: Sodium thiosulfate and sodium carbonate
solution, ρ = 50 g/l, e.g. dissolve 5 g of sodium thiosulfate and 5 g of sodium hydrogen carbonate (or sodium
carbonate) in 100 ml distilled water and mix thoroughly.
5.24 Alumina column with silica gel cover. Place a filter (6.4) in a glass column (6.3). Add and compress
10 g of alumina (5.18), 3 g of silica gel (5.1) and 1 g of sodium sulfate (5.2).
5.25 Clean-up column. Place a filter (6.4) in an empty SPE glass cartridge (volume 6 ml), add 3 g of silica
gel (5.1), compress and cover with 1 g of sodium sulfate (5.2).
5.26 bis (2-ethylhexyl) maleate, purity 90 %. Check the purity in a blank run.
Bis (2-ethylhexyl) maleate may be replaced by bis(2-ethylhexyl) sebacate in order to limit the risk of
epoxidation process disturbance.
5.27 Standard solution of the n-alkanes with chain lengths of 10 to 50 in the same mass concentration
for checking for discrimination against low- or high-boiling substances, ρ = 1 μg/ml. Store this solution
at room temperature, otherwise C50 can crystallize.

5.28 Ethanol, absolute.
Test the purity as for n-hexane (5.3) with 30 ml ethanol.
5.29 Mixture of ethanol and n-hexane, volume fraction φ = 50 %, e.g. mix 50 ml of ethanol (5.28) with
50 ml of n-hexane (5.3).
5.30 Elution mixture of n-hexane and DCM, e.g. mix 30 ml DCM (5.4) with 70 ml n-hexane (5.3). Due to
the volatility of DCM, the solution shall be freshly prepared.
5.31 Potassium hydroxide solution, e.g. 50 g potassium hydroxide in 100 ml distilled water, w = 33 g/100 g.
6 Apparatus
In order to achieve a sufficiently low blank level, the following process has proven to be effective: glassware
(except volumetric flasks) should be heated in an oven at 430 °C for 4 h or overnight at 400 °C and kept in
desiccators or other containers for use. In addition, it is recommended to:
— perform multiple determinations in different series and not directly one after another;
— not use grease for ground joints;
— not use hand cream;
— handle samples with gloves, only;
— use glassware where possible;
— check nitrogen for purity, when drying in a stream of nitrogen;
— rinse volumetric flasks, glass pipettes and other required glassware with n-hexane before use.
6.1 Analytical balance, readability 0,000 1 g, weighing accuracy 0,001 g.
6.2 Centrifuge and centrifuge tubes.
6.3 Glass column, without stopcock, 15 cm to 20 cm long and 15 mm to 20 mm inner diameter.
6.4 Filter for glass column, extracted or heated, filter made of quartz wool/glass fibre.
6.5 Glass vial, 40 ml, with polytetrafluoroethylene (PTFE) sealed screw cap.
6.6 Rotary evaporator, with vacuum and water bath at 35 °C.
Comparable devices can also be used. Take care to prevent contamination. If necessary, clean the system
thoroughly between determinations.
3)
6.7 HPLC column, e.g. LiChrospher Si 60 or Allure Silica , 5 µm material, 2 × 250 mm or comparable.
4)
6.8 Uncoated GC guard column, fused silica or metal capillary, e.g. HydroGuard® MXT® ,
10 m × 0,53 mm or comparable.
3) LiChrospher Si 60 and Allure Silica are examples of suitable products available commercially. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
4) HydroGuard® MXT® is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

NOTE The capillaries in 6.8 to 6.12 have proven to be suitable, but can be adapted to the system to meet the
requirements and yield comparable results.
6.9 GC separation column, fused silica or metal capillary, programmed temperature stable up to at
least 370 °C: 100 % dimethylpolysiloxane or 95 % dimethyl and 5 % phenyl methylpolysiloxane as stationary
phase, length 15 m, internal diameter (ID) 0,32 mm or 0,25 mm and film thickness 0,10 μm to 0,25 μm.
6.10 Fused silica or metal capillary, deactivated, for transfer the HPLC fractions from the valve to the
T-connector of the GC, 1 m long, 0,1 mm ID.
6.11 Capillary, deactivated, from the T-connector between pre- and separation column to the vapour exit.
6.12 Restriction capillary at the vapour exit, deactivated, 1 m long, ID 0,05 mm.
6.13 Syringe, 100 μl, suitable for injection of 5 to 100 µl in liquid chromatography.
6.14 Pasteur pipette made of glass.
NOTE The use of plastic pipette tips and polyethylene foil leads to increased blank levels.
6.15 Online-coupled HPLC-GC-FID system, consisting of an HPLC instrument capable of running a binary
gradient, injection valve, HPLC column (6.7), ultraviolet light (UV) detector (detection wavelength: 230 nm),
switching valves for column backflush and fraction transfer into GC, GC with solvent vapour exit (SVE),
pneumatic control and evaluation system. In addition, an automatic control system is recommended.
6.16 Test tube shaker with temperature control and agitation (e.g. 500 r/min or comparable).
7 Sample
7.1 Sampling
Sampling is not part of this method. The sample may only be stored in glass bottles, aluminium or other
materials that do not release hydrocarbons. Packaging made of paper, polyethylene or polypropylene is
5)
unsuitable. Containers made of PET or foil bags made of a high-performance polyamide such as RILSAN
may be used in some cases. Attention shall also be paid to the closure and sealing materials of the containers.
The use of hand cream should be avoided when handling samples. The sampling shall be checked by blank
runs using n-hexane instead of a sample.
A recommended sampling method is given in ISO 5555.
7.2 Preparation of the final sample for liquid and solid fats
Prepare the test sample in accordance with ISO 661.
Special treatments of the test sample (e.g. filtering, melting) shall be mentioned.
5) RILSAN is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

8 Procedures
8.1 General
Depending on the type of fats and oils, the samples shall be prepared differently. The specific cases A to C
are as follows:
— A: Prepare oils and fats with unknown or high content of biogenic, long-chain alkanes and unsaturated
[7]
compounds such as olive oil, rapeseed oil, sunflower oil and comparable samples according to 8.2
(ethanol-hexane distribution). Using two separate 10 ml fractions of the extract, run 8.3 (saponification)
on the first fraction for the determination of the MOSH content according to 8.4 (Alox column), and run
8.3 (saponification) on the second fraction for the determination of the MOAH content according to 8.5
(clean-up) and 8.6 (epoxidation).
— B: Prepare oils and fats with low biogenic, long-chain alkanes and disturbing unsaturated compounds
such as coconut fat, linseed oil, palm oil and comparable samples without aluminium oxide column
according to 8.2 (ethanol-hexane distribution), 8.3 (saponification), 8.5 (clean-up) and 8.6 (epoxidation).
Determine the MOSH and MOAH fractions from the solution obtained.
— C: For automated application of the alumina column, prepare oils and fats according to 8.2 (ethanol-
hexane distribution), 8.3 (saponification), 8.5 (clean-up) and 8.6 (epoxidation). Inject into the HPLC-GC-
FID system. After separation of the MOSH, which are passed to an integrated online Alox column, the
MOAH fraction can be determined in the same run using a two-channel system.
Every laboratory using automated procedures shall carry out tests to ensure that the results obtained with
the automated procedures do not deviate from results obtained with the manual procedure.
Unknown samples or mix oils samples may be analysed first without Alox cleanup. If the presence of
interfering long-chain n-alkanes significantly impact the hump and do not allow a proper integration, the
extract shall be re-injected using the alumina column to reduce interferences (e.g. for online Alox clean
up, the same sample extract used to determine MOAH is used for the subsequent separation of long-chain
n-alkanes with the aluminium oxide column for the determination of MOSH).
NOTE Only the manual purification method for MOSH fraction was validated during the collaborative study.
8.2 Hexane/ethanol distribution for removal of interfering substances
Weigh 3 g of the sample for oils and fats into a 40 ml centrifuge tube with screw cap. Add 30 ml of the
mixture of n-hexane (5.3) and ethanol (5.29) and 20 μl ISTD1 (5.16) or 100 μl ISTD2 (5.17), and homogenize.
Use 10 ml of this solution for the further procedure (see 8.3).
NOTE In case of oils and fats, no phase separation will be observed. Nevertheless, this step ensures a complete
saponification of oils and fats. If necessary, other quantities of internal standard can be added.
8.3 Saponification
Transfer an aliquot of 10 ml (see 8.2) into another sample tube and add 3 ml potassium hydroxide solution
(5.31). Saponify the solution for 30 min at 60 °C in a water bath while shaking until the solution becomes
clear. Cool down, add 5 ml n-hexane (5.3) and 5 ml mixture of ethanol and water (a volume fraction of 1:1),
shake the mixture again, transfer the lower phase after phase separation into a new vial and extract again
with an additional 5 ml of n-hexane. Combine both n-hexane extracts.
Depending on the sample preparation method, continue using the solution to separate biogenic, long-chain
n-alkanes with aluminium oxide (according to 8.4) or for epoxidation (according to 8.5 and 8.6).
NOTE The addition of ethanol after saponification enables a better phase separation and avoids foaming.

8.4 Removal of biogenic n-alkanes with aluminium oxide for determination of the MOSH
fraction
Pre-clean the alumina column (5.24) with 20 ml of n-hexane in order to remove interfering substances (see
text on interfering substances below). Transfer the solution from 8.3 to the alumina column and elute the
hydrocarbons with 25 ml n-hexane (5.3). Collect the hydrocarbons beginning with the sample transfer.
Evaporate the solvent under vacuum (≥260 mbar) at 35 °C after adding two drops of bis (2-ethylhexyl)
maleate (5.26).
Dissolve the residue in about 1 ml n-hexane, centrifuge if necessary and fill into a vial. Inject 60 μl to 90 μl of
the solution for analysis with the HPLC-GC-FID system to determine the MOSH fraction.
The MOAH remain on the alumina column and shall not be determined from this eluate. It is recommended
to remove interfering substances from the alumina by pre-rinsing the column with 20 ml n-hexane. However,
clean alumina does not need to be pre-rinsed.
Removal of biogenic n-alkanes can also remove paraffinic waxes at the same time if present in the sample. In
these cases, analysis shall be carried out according to procedure B.
NOTE Paraffinic waxes are characterized by n-alkanes with no odd carbon predominance of their chain lengths,
while naturally occurring n-alkanes in edible oils present an odd carbon predominance. As an example, main n-alkanes
in sunflower oils are C27, C29 and C31 alkanes.
8.5 Clean-up before epoxidation to separate polar substances
Transfer the combined upper phases from the saponification step (see 8.3) to a clean-up column (5.25) and
collect the eluting hydrocarbons: start collecting the eluent immediately after transferring the upper phase
from the saponification step to the clean-up column. Complete the elution of hydrocarbons from the column
with additional 15 ml solvent mixture of n-hexane and DCM (volume fraction of 7 + 3) (5.30). Use the eluate
for epoxidation (according to 8.6).
It is recommended to remove interfering substances from the clean-up column by pre-rinsing the column
with n-hexane. However, clean glassware and reagents do not need to be pre-rinsed.
8.6 Ethanolic epoxidation of the MOAH fraction to oxidize unsaturated non-aromatic
compounds
NOTE For further information, see References [11] and [13].
After adding two drops of bis (2-ethylhexyl) maleate (5.26) as a keeper, concentrate the solution of 8.5 at
35 °C under vacuum, retaining all internal standards, and adjust to a volume of 1 ml with n-hexane.
In this step, any DCM should be completely removed to ensure reliable fractionation in the HPLC-GC-FID system.
Add 1 ml ethanolic mCPBA solution (5.20) to the obtained extract and place the sample on a shaker (6.16) for
20 min at 40 °C at, for example, 500 r/min. Then add 500 µl ethanol (5.28) and 2 ml solution for deactivation
of the excess of mCPBA (5.23) and shake the sample vial for about 1 min at about 750 r/min to deactivate any
excess of mCPBA. Transfer the upper hexane phase to a fresh sample vial and dry the hexane solution with
a spatula tip of sodium sulfate (5.2). Inject 90 µl of the dried solution into the HPLC-GC-FID system for the
determination of MOAH.
It is optional to use a more concentrated final volume of, for example, 300 µl and a corresponding injection
volume as long as the enrichment is improved and the internal standards are retained during evaporation.
For sample preparation according to procedures A and B, this solution is used directly for the determination
of MOAH. In automated sample preparation according to procedure C, this solution is used for the subsequent
separation of long-chain n-alkanes with the aluminium oxide column (5.24) for the additional determination
of MOSH.
Continuous intense shaking of the reaction solution for epoxidation, at the specified reaction temperature, is
necessary to ensure sufficient and reproducible removal of interfering substances.

8.7 HPLC-GC separation
8.7.1 HPLC conditions
Pre-rinse the HPLC system with eluent A: n-hexane (5.3) and eluent B: DCM (5.4) and check system suitability
by injection of n-hexane. Table 1 shows an example of the gradient programme.
Table 1 — Gradient programme for the separation of MOSH and MOAH on a silica gel column with
backflush after 6 min and reconditioning after 15 min
Time Hexane DCM Flow
min % % µl/min
0,0 100 0 300
1,5 65 35 300
5,9 65 35 300
6,0 0 100 500 (backflush)
15,0 0 100 500 (reconditioning)
15,3 100 0 500
25,0 100 0 500
25,2 100 0 300
30,0 100 0 300
0,0 100 0 300
After 6,0 min, the flow direction of the column is reversed to remove remaining matrix components of the
sample from the column by backflush. This step significantly increases the lifetime of the HPLC column. For
operation with an automated online alumina column, it has proven to be best to start the gradient about
0,1 min later.
Figure A.1 shows a typical HPLC-UV chromatogram with the UV signal and in addition the pressure curve.
From 5,5 min onwards, a strong increase in the baseline can be seen due to DCM. Perylene from the ISTD
mix elutes at 5,6 min. Backflush should decrease the baseline signal to the initial level. The fractionation of
the MOSH fraction from 2 min to 3,5 min and the MOAH fraction from 4,7 min to 6,2 min can be detected by
slight baseline changes. If necessary, the change in pressure can also be monitored for this purpose; here,
attention should also be paid to a possible pressure increase, which indicates a blockage in the system. The
times given can vary slightly depending on the system and columns used and should be checked regularly by
injecting a diluted ISTD solution.
The capillaries from the fraction transfer switching valve are combined with the carrier gas supply in a
T-connector and directed into the pre-column in the GC oven.
8.7.2 GC configuration
Install the columns in the gas chromatograph and check the function of the system by injecting solvent. The
baseline should be straight with as little positive drift as possible. If the drift is too high (see 8.7.5), heat the
column or, if the stationary phase of the GC separation column is suitable for this procedure, rinse it with
solvent or replace the column. In case of a negative drift, check the connections of the columns for tightness.
Heat columns which are used for the first time (e.g. 4 h in the oven at a temperature gradient up to least
350 °C with a stream of carrier gas and maintain the final temperature for at least 30 min).
The following working conditions proved to be suitable for the analysis and may be adapted to the
requirements of the HPLC-GC-FID system:
— Pre-column uncoated, deactivated, 7 m to 10 m ⨯ 0,53 mm (6.8).
— Separation column: 100 % dimethyl polysiloxane, low bleeding (15 m long, 0,25 mm i.d., 0,1 μm to
0,25 μm film thickness) (6.9).

— Oven temperature: Initial temperature 60 °C, 8 min isothermal, programmed with 15 °C/min to 120 °C,
further on with 25 °C/min to 370 °C, hold for 6 min.
— Carrier gas: hydrogen, inlet pressure for MOSH 70 kPa, after closing the solvent vapour exit 150 kPa until
the MOAH fraction is ready for GC separation, inlet pressure for MOAH 65 kPa, after closing the solvent
vapour exit 150 kPa for both channels.
NOTE 1 In two-channel systems, the first frac
...

Norme
internationale
ISO 20122
Première édition
Huiles végétales — Dosage
2024-04
des hydrocarbures saturés
d’huile minérale (MOSH) et des
hydrocarbures aromatiques d’huile
minérale (MOAH) par analyse
par chromatographie en phase
liquide haute performance et
chromatographie en phase gazeuse
couplées à un détecteur à ionisation
de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne
— Méthode pour une faible limite
de quantification
Vegetable oils — Determination of mineral oil saturated
hydrocarbons (MOSH) and mineral oil aromatic hydrocarbons
(MOAH) with online-coupled high performance liquid
chromatography-gas chromatography-flame ionization detection
(HPLC-GC-FID) analysis — Method for low limit of quantification
Numéro de référence
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Réactifs . 3
6 Appareillage . 6
7 Échantillon . 8
7.1 Échantillonnage .8
7.2 Préparation de l’échantillon final pour les corps gras liquides et solides .8
8 Modes opératoires . . 8
8.1 Généralités .8
8.2 Extraction à l’hexane/éthanol pour l’élimination des substances interférentes.9
8.3 Saponification . .9
8.4 Élimination des n-alcanes biogènes avec de l’oxyde d’aluminium pour le dosage de la
fraction MOSH .9
8.5 Purification avant époxydation pour séparer les substances polaires .10
8.6 Époxydation éthanolique de la fraction MOAH pour oxyder les composés
non aromatiques insaturés .10
8.7 Interface CLHP-CG .10
8.7.1 Conditions opératoires de CLHP .10
8.7.2 Configuration du CG .11
8.7.3 Configuration de la sortie de vapeur de solvant . 12
8.7.4 Identification des pics . 12
8.7.5 Essai d’aptitude à l’emploi du système . 13
8.8 Essai à blanc .14
8.9 Contrôle qualité .14
9 Résultat du dosage .15
9.1 Contrôle des chromatogrammes pour déterminer le degré d’époxydation et d’autres
paramètres pertinents . 15
9.2 Calcul . 15
10 Fidélité de la méthode . 16
10.1 Limite de répétabilité .16
10.2 Limite de reproductibilité .17
11 Rapport d’essai . 17
Annexe A (informative) Graphiques et chromatogrammes .18
Annexe B (informative) Données de fidélité .29
Annexe C (informative) Méthode alternative pour l’époxydation de la fraction MOAH
(époxydation par l’acide performique) .42
Bibliographie .43

iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 307,
Oléagineux, corps gras d’origines végétale et animale et leurs co-produits - Méthodes d’échantillonnage et
d’analyse, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique
entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

iv
Introduction
Pour obtenir une faible limite de quantification (LQ), la présente méthode inclut des étapes de traitement
supplémentaires et partiellement modifiées, des spécifications pour le traitement uniforme de groupes de
produits définis et des exigences supplémentaires relatives à l’aptitude à l’emploi du système au regard de
l’EN 16995:2017.
Cette méthode a été soumise à essai dans le cadre d’une étude interlaboratoires en procédant à l’analyse
d’échantillons d’huiles végétales naturellement contaminés et dopés, à des teneurs comprises entre 1 mg/kg
et 75 mg/kg pour les MOSH et entre 1 mg/kg et 7 mg/kg pour les MOAH.

v
Norme internationale ISO 20122:2024(fr)
Huiles végétales — Dosage des hydrocarbures saturés d’huile
minérale (MOSH) et des hydrocarbures aromatiques d’huile
minérale (MOAH) par analyse par chromatographie en phase
liquide haute performance et chromatographie en phase
gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme
(CLHP-CG-FID) en ligne — Méthode pour une faible limite de
quantification
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie un mode opératoire pour le dosage des hydrocarbures saturés et aromatiques
(de C10 à C50) dans les matières grasses et huiles végétales en utilisant la chromatographie en phase liquide
haute performance et la chromatographie en phase gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme
[4][5][6]
(CLHP-CG-FID) en ligne . Le présent document ne s’applique pas à d’autres matrices.
La méthode s’applique à l’analyse des hydrocarbures saturés d’huile minérale (MOSH) et/ou des
hydrocarbures aromatiques d’huile minérale (MOAH).
D’après les résultats des études interlaboratoires, il a été démontré que la méthode est adaptée pour des
concentrations massiques de MOSH supérieures à 3 mg/kg et des concentrations massiques de MOAH
supérieures à 2 mg/kg.
En cas de suspicion d’interférences, l’origine fossile des fractions MOSH et MOAH peut être vérifiée
par un examen par chromatographie en phase gazeuse à deux dimensions, couplée à la spectrométrie
de masse (CG⨯CG-SM).
Une méthode alternative d’époxydation de la fraction MOAH (époxydation par l’acide performique) est proposée
dans l’Annexe C. Cette méthode donne des résultats comparables à l’époxydation éthanolique de la fraction
MOAH décrite en 8.6. Cette méthode alternative d’époxydation s’est avérée efficace pour les échantillons
[14]
présentant de fortes interférences dans la fraction MOAH (par exemple, les huiles tropicales) .
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/

3.1
hydrocarbures saturés d’huile minérale
MOSH
hydrocarbures paraffiniques (chaîne ouverte, généralement ramifiée) et naphténiques (cycliques, alkylés)
provenant d’huiles minérales et situés dans l’intervalle d’ébullition des n-alcanes avec une chaîne carbonée
constituée de 10 à 50 atomes de carbone, obtenus par chromatographie en phase liquide haute performance
et chromatographie en phase gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne
en appliquant la présente méthode
3.2
hydrocarbures aromatiques d’huile minérale
MOAH
hydrocarbures aromatiques principalement alkylés provenant d’huiles minérales et situés dans l’intervalle
d’ébullition des n-alcanes avec une chaîne carbonée constituée de 10 à 50 atomes de carbone, obtenus par
chromatographie en phase liquide haute performance et chromatographie en phase gazeuse couplées à un
détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne
3.3
mélange complexe non résolu
UCM
mélange complexe d’hydrocarbures saturés ou aromatiques non résolus par chromatographie en phase
gazeuse, comme les paraffines ramifiées, les naphtènes alkylés et les aromatiques alkylés, qui forme une
enveloppe lorsqu’il est analysé par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation
de flamme (CG-FID)
3.4
hydrocarbures saturés d’oligomères de polyoléfines
POSH
hydrocarbures synthétiques provenant d’oligomères de polyoléfines, tels que le polyéthylène,
le polypropylène et les polybutylènes
Note 1 à l'article: Les produits destinés à entrer en contact avec les aliments dans lesquels ils sont présents comprennent
les sacs, les récipients ou les films en plastique, les feuilles thermoscellables et autres films de lamination, ainsi que les
adhésifs et les plastifiants.
Note 2 à l'article: Les POSH peuvent être distingués des hydrocarbures saturés d’huile minérale (MOSH) par leur profil
chromatographique, mais il est difficile de les différencier et de les isoler par chromatographie s’ils sont tous deux
[5]
présents .
3.5
hydrocarbures saturés d’oligomères de résine
ROSH
hydrocarbures saturés synthétiques (oligomères de monoterpènes, cyclopentadiènes et autres
monomères C5 ou C9) qui entrent dans la composition des adhésifs thermofusibles et peuvent migrer dans
l’échantillon principalement par transfert en phase gazeuse ou par contact direct
3.6
hydrocarbures aromatiques d’oligomères de résine
ROAH
hydrocarbures aromatiques synthétiques qui entrent dans la composition des adhésifs thermofusibles
et peuvent migrer dans l’échantillon principalement par transfert en phase gazeuse ou par contact direct
3.7
poly-alpha-oléfines
PAO
isoparaffines synthétiques à chaînes latérales courtes ou longues, utilisées comme lubrifiants ou dans
les adhésifs et les colles thermofusibles
Note 1 à l'article: Lorsqu’ils sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation
de flamme (CG-FID), ils sont reconnaissables à des séries d’enveloppes plutôt étroites d’hydrocarbures ramifiés non
[5]
résolus, régulièrement espacées entre elles .

4 Principe
L’échantillon est saponifié. Le résidu insaponifiable est ensuite utilisé pour obtenir des fractions purifiées en
suivant d’autres étapes. Ces fractions sont séparées en fractions MOSH et MOAH sur une colonne de gel de
silice du système de CLHP-CG-FID; chacune d’elles est transférée individuellement vers le chromatographe
en phase gazeuse (CG) couplé en ligne. La majeure partie du solvant est éliminée par une sortie de vapeur de
solvant située entre la précolonne exempte de phase stationnaire et la colonne de séparation de la CG.
Afin de satisfaire aux exigences liées aux diverses substances secondaires interférentes présentes
dans les échantillons, des modes opératoires spécifiques de préparation des échantillons sont décrits
pour les différents groupes de produits. L’époxydation est une étape de purification nécessaire pour la
quantification des MOAH pour tous les échantillons d’huiles végétales. Cette étape de purification permet
l’élimination des oléfines, telles que le squalène, qui sont éluées dans la fraction MOAH et interfèrent avec
la quantification. Selon l’échantillon, cette réaction peut induire l’époxydation d’une partie des MOAH
ou l’élimination incomplète des oléfines interférentes.
L’aire du signal pour l’huile minérale est calculée en soustrayant les pics en chevauchement de l’aire totale.
Le chevauchement des pics peut être causé par les n-alcanes (hydrocarbures naturels), les terpènes,
les stérènes, le squalène et leurs produits d’isomérisation, entre autres substances. Les MOSH et les MOAH
sont quantifiés au moyen d’un étalon interne ajouté avant analyse. Des étalons de vérification sont ajoutés
pour surveiller les conditions appropriées de fractionnement par CLHP et de transfert au CG.
NOTE L’étape d’époxydation peut induire une dégradation des MOAH avec trois noyaux aromatiques ou plus.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — Il est fait référence aux règlements qui régissent la manipulation des substances
dangereuses. Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et humain doivent
être suivies.
Tous les matériaux doivent être soumis à un essai à blanc afin de déterminer leur influence. Il est
recommandé de chauffer toute la verrerie dans un four conformément aux instructions. Il convient que tous
les autres matériaux entrant en contact direct avec l’échantillon soient également chauffés et ne soient pas
en polyéthylène ou en polypropylène.
Sauf indication contraire:
— des réactifs analytiques purs doivent être utilisés;
— l’eau doit être distillée ou de pureté correspondante;
— le terme «solution» désigne une solution aqueuse.
1)
5.1 Gel de silice 60 extra pur, pour chromatographie sur colonne avec une taille de particules de 60 μm
à 200 μm (70 mesh à 230 mesh), conservé en bouteille de verre pour éviter la contamination. Le gel de silice
est chauffé dans une étuve à 400 °C pendant au moins 16 h et refroidi dans un dessiccateur propre (sans
graisse).
5.2 Sulfate de sodium anhydre, de qualité analytique et de pureté ≥ 99 %.
En cas de contamination, chauffer le sulfate de sodium dans une étuve à 400 °C pendant au moins 16 h et
laisser refroidir dans un dessiccateur propre (sans graisse).
1) Ce gel de silice est disponible auprès de Merck, sous la référence 7754 ou 7734. Ceci est un exemple de produit
approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs
du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.

5.3 n-Hexane, exempt d’hydrocarbures dans l’intervalle d’ébullition des n-alcanes C10 à C50 et d’autres
impuretés telles que les produits d’oxydation de l’hexane.
Vérifier la pureté du n-hexane comme suit:
— mélanger 30 ml de n-hexane avec 25 μl de solution étalon interne (5.17) et deux gouttes de maléate (5.26);
— faire s’évaporer à l’aide d’une unité d’évaporation;
— dissoudre le résidu dans 0,2 ml de n-hexane;
— injecter 50 μl dans le système de CLHP-CG-FID pour analyse.
Il convient que l’aire de l’enveloppe mesurée (à l’exclusion de tout pic fin isolé) ne dépasse pas un dixième du
signal obtenu à la LQ.
NOTE Les hydrocarbures dans l’intervalle d’ébullition étudié interfèrent avec la détection spécifique des
constituants des huiles minérales au cours de la chromatographie en phase gazeuse des fractions MOSH et MOAH,
tandis que les composés polaires, tels que les produits d’oxydation de l’hexane, interfèrent avec la séparation
des n-alcanes à longue chaîne au cours de la chromatographie sur colonne d’alumine.
5.4 Dichlorométhane (DCM) d’une pureté ≥ 99 %.
Contrôler la pureté en suivant le même mode opératoire que pour le n-hexane (5.3) avec 30 ml de DCM.
5.5 Toluène.
5.6 Pérylène (PER) d’une pureté > 99 %.
5.7 5-alpha-Cholestane (CHO), d’une pureté ≥ 97 %.
5.8 n-Undécane (C11), d’une pureté ≥ 99 %.
5.9 n-Tridécane (C13), d’une pureté ≥ 99 %.
5.10 Tri-tert-butylbenzène (TBB), d’une pureté ≥ 97 %.
5.11 Bicyclohexyle (CYCY), d’une pureté ≥ 99 %.
5.12 1-Méthylnaphtalène (1-MN), d’une pureté ≥ 95 %.
5.13 2-Méthylnaphtalène (2-MN), d’une pureté ≥ 97 %.
5.14 Pentylbenzène (PB), d’une pureté ≥ 99 %.
5.15 Solution mère, concentrations massiques, ρ = 5 mg/ml, 10 mg/ml ou 20 mg/ml. Par exemple, peser
à 1 mg près 50 mg de C13 (5.9), respectivement 100 mg de C11 (5.8), TBB (5.10), CYCY (5.11), 1-MN (5.12),
2-MN (5.13) et PB (5.14) ainsi que 200 mg de CHO (5.7) et de PER (5.6), puis compléter jusqu’au trait dans
une fiole jaugée de 10 ml avec du toluène (5.5). Conserver ces solutions à température ambiante pour les
maintenir stables. Dissoudre les cristaux éventuellement formés pendant la période de conservation en
réchauffant doucement la solution.
La vérification du début de la fraction MOAH basée sur le TBB peut entraîner des pertes de benzènes
et de naphtalènes fortement alkylés lorsqu’ils sont présents dans les échantillons (c’est-à-dire dans
les cosmétiques) et lorsque les performances chromatographiques de la colonne sont limitées. Dans ce
cas, le di(2-éthylhexyle) benzène (DEHB) peut être utilisé en complément comme étalon de vérification et
[10]
le fractionnement doit être adapté .

2)
5.16 Solution étalon interne 1 (EI1) , concentrations massiques ρ = 150 μg/ml (C13), 300 μg/ml
(C11, CYCY, PB, 1-MN, 2-MN et TBB) et 600 μg/ml (CHO et PER). Transférer 300 μl de solution mère (5.15)
dans une fiole jaugée de 10 ml et compléter jusqu’au trait avec du toluène (5.5).
5.17 Solution étalon interne 2 (EI2), de concentrations massiques ρ = 30 μg/ml (C13), 60 μg/ml (C11, TBB,
CYCY, 1-MN, 2-MN et PB) et 120 μg/ml (PER et CHO): diluer la solution EI1 (5.16) d’un facteur 5; par exemple,
compléter 1 000 μl de solution EI1 (5.16) à 5 ml avec du n-hexane.
5.18 Oxyde d’aluminium 90, alcalin, pour chromatographie sur colonne, de 0,063 mm à 0,2 mm,
activé. Chauffer l’alumine avant utilisation pendant au moins 16 h à 500 °C dans une étuve et la refroidir
à température ambiante dans un dessiccateur nettoyé (sans graisse broyée).
5.19 Acide méta-chloroperbenzoïque (mCPBA), dont les quantités déclarées sont basées sur une
pureté ≤ 77 % environ;
Le mCPBA disponible sur le marché contient différentes quantités de mCPBA, d’acide méta-chlorobenzoïque
et d’eau. Pour la purification du réactif, éliminer les hydrocarbures contaminants: par exemple,
mettre soigneusement en suspension 5 g de mCPBA avec 200 ml de n-hexane dans un bécher en polyéthylène
téréphtalate (PET) placé dans un bain à ultrasons et filtrer sur verre fritté sous vide. Laisser sécher le
mCPBA purifié dans une hotte de laboratoire. Ne pas stocker dans des récipients en verre, car le mCPBA se
décompose sur les surfaces en verre. Le mCPBA disponible sur le marché contient toujours de l’acide méta-
chlorobenzoïque et de l’humidité résiduelle de sorte à garantir la sécurité de la manipulation en laboratoire.
En revanche, le mCPBA pur est explosif. Par conséquent, il n’est pas recommandé d’isoler le mCPBA en tant
que substance pure, ce qui va au-delà du cadre de la purification décrite ici. L’élution avec un mélange de
solvants composé de 200 ml de n-hexane et de 20 ml de DCM peut permettre d’éliminer d’autres impuretés,
mais conduit également à des pertes plus importantes (elle ne permet d’obtenir que 75 % du mCPBA initial,
avec une teneur d’environ 74 g à 84 g de mCPBA pour 100 g de matière première dans le produit purifié).
Pour le dosage de la teneur en mCPBA du réactif, peser environ 0,2 g de mCPBA dans un bécher en PET,
ajouter 50 ml d’eau distillée et bien mélanger. Ajouter 5 ml d’acide acétique concentré et 10 ml de solution
d’iodure de sodium (10 g d’iodure de sodium dans 100 ml d’eau). Procéder ensuite à un prétitrage de rouge
foncé à jaune clair avec la solution de thiosulfate de sodium de normalité 0,1 N. Ajouter quelques gouttes
de solution d’indicateur à l’amidon et titrer de bleu foncé à incolore au point d’équivalence (consommation
généralement inférieure à 20 ml).
Calculer la teneur w (mCPBA) en pourcentage en masse comme indiqué par la Formule (1):
NV××86,29×100
w= (1)
E
où
N est la normalité de la solution de thiosulfate de sodium;
V est le volume total de la solution de thiosulfate de sodium consommée, en l;
E est la masse du réactif, en g.
5.20 Solution de mCPBA dans l’éthanol, ρ = 100 mg/ml: par exemple, dissoudre 1 g de mCPBA (5.19) dans
10 ml d’éthanol (5.28). Préparer une nouvelle solution pour chaque jour de travail.
5.21 Thiosulfate de sodium, anhydre, d’une pureté > 90,0 %.
2) Ce mélange étalon est disponible auprès, par exemple, de Restek Corp., réf. 31070. Ceci est un exemple de produit
approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs
du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.

5.22 Carbonate de sodium hydrogéné (ou carbonate de sodium), anhydre, d’une pureté > 90,0 %.
5.23 Solution de désactivation de l’excédent de mCPBA: solution de thiosulfate de sodium et de carbonate
de sodium, ρ = 50 g/l: par exemple, dissoudre 5 g de thiosulfate de sodium et 5 g de carbonate de sodium
hydrogéné (ou de carbonate de sodium) dans 100 ml d’eau distillée et bien mélanger.
5.24 Colonne d’alumine et de gel de silice. Placer un filtre (6.4) dans une colonne en verre (6.3). Ajouter et
comprimer 10 g d’alumine (5.18), 3 g de gel de silice (5.1) et 1 g de sulfate de sodium (5.2).
5.25 Colonne de purification. Placer un filtre (6.4) dans une cartouche vide d’extraction en phase solide
en verre (d’un volume de 6 ml), ajouter 3 g de gel de silice (5.1), comprimer et recouvrir avec 1 g de sulfate de
sodium (5.2).
5.26 bis (2-éthylhexyle) maléate, d’une pureté de 90 %. Contrôler la pureté par un essai à blanc.
Le bis (2-éthylhexyle) maléate peut être remplacé par du bis(2-éthylhexyle) sébacate afin de limiter le risque
de perturbation du procédé d’époxydation.
5.27 Solution étalon de n-alcanes avec des longueurs de chaîne de 10 à 50 atomes de carbone dans
la même concentration massique, pour contrôler la discrimination des substances à faible ou à haut
point d’ébullition, ρ = 1 μg/ml. Conserver cette solution à température ambiante, faute de quoi le C50 risque
de cristalliser.
5.28 Éthanol, absolu.
Contrôler la pureté comme pour le n-hexane (5.3) avec 30 ml d’éthanol.
5.29 Mélange d’éthanol et de n-hexane, de fraction volumique φ = 50 %: par exemple, mélanger 50 ml
d’éthanol (5.28) avec 50 ml de n-hexane (5.3).
5.30 Mélange d’élution de n-hexane et de DCM: par exemple, mélanger 30 ml de DCM (5.4) avec 70 ml de
n-hexane (5.3). En raison de la volatilité du DCM, la solution doit être fraîchement préparée.
5.31 Solution d’hydroxyde de potassium: par exemple, 50 g d’hydroxyde de potassium dans 100 ml d’eau
distillée, w = 33 g/100 g.
6 Appareillage
La méthode suivante s’est avérée efficace pour obtenir un niveau de blanc suffisamment bas: il convient que
la verrerie (à l’exception des fioles jaugées) soit chauffée dans un four à 430 °C pendant 4 h ou pendant la
nuit à 400 °C, puis conservée dans des dessiccateurs ou d’autres contenants avant d’être utilisée. Il est par
ailleurs recommandé:
— d’effectuer plusieurs dosages dans différentes séries sans les faire se succéder directement;
— de ne pas utiliser de graisse pour les joints rodés;
— de ne pas utiliser de crème pour les mains;
— de ne manipuler les échantillons qu’avec des gants;
— d’utiliser de la verrerie si possible;
— de vérifier la pureté de l’azote en cas de séchage à l’azote;
— de rincer au préalable les fioles jaugées, les pipettes en verre et toute autre verrerie requise avec
du n-hexane.
6.1 Balance analytique, d’une précision d’affichage de 0,000 1 g, et d’une exactitude de pesée de 0,001 g.
6.2 Centrifugeuse et tubes à centrifuger.
6.3 Colonne en verre, sans robinet, de 15 cm à 20 cm de long et de 15 mm à 20 mm de diamètre intérieur.
6.4 Filtre pour colonne de verre, extrait ou chauffé, filtre en laine de quartz/fibre de verre.
6.5 Flacon en verre, 40 ml, avec bouchon à vis hermétique en polytétrafluoroéthylène (PTFE).
6.6 Évaporateur rotatif, sous vide et avec bain-marie à 35 °C.
Il est également possible d’utiliser des dispositifs similaires. Veiller à éviter toute contamination.
Si nécessaire, nettoyer méticuleusement le système entre les dosages.
3)
6.7 Colonne de CLHP, par exemple LiChrospher Si 60 ou Allure Silica , matériau 5 µm, 2 x 250 mm
ou comparable.
6.8 Précolonne de CG exempte de phase stationnaire, capillaire en silice fondue ou en métal,
4)
par exemple HydroGuard® MXT® , 10 m × 0,53 mm ou comparable.
NOTE Les capillaires de 6.8 à 6.12 se sont avérés appropriés et peuvent être adaptés au système pour répondre
aux exigences et obtenir des résultats comparables.
6.9 Colonne de séparation de CG, capillaire en silice fondue ou en métal, température programmée stable
jusqu’à au moins 370 °C: phase stationnaire de 100 % de diméthyl-polysiloxane ou de 95 % diméthyl et 5 %
diphényl-méthylpolysiloxane; longueur: 15 m; diamètre intérieur (DI): 0,32 mm ou 0,25 mm; épaisseur du
film: 0,10 µm à 0,25 µm.
6.10 Capillaire en silice fondue ou en métal, désactivé, pour le transfert des fractions obtenues par CLHP
de la vanne au connecteur en T du CG; longueur: 1 m; DI: 0,1 mm.
6.11 Capillaire désactivé, du connecteur en T à la sortie de vapeur entre la précolonne et la colonne
de séparation.
6.12 Capillaire de restriction à la sortie de vapeur, désactivé; longueur: 1 m; DI: 0,05 mm.
6.13 Seringue de 100 μl, adaptée à l’injection de 5 µl à 100 µl pour la chromatographie en phase liquide.
6.14 Pipette Pasteur en verre.
NOTE L’utilisation d’embouts de pipette en plastique et de film de polyéthylène entraîne une augmentation
des niveaux de blanc.
6.15 Système de CLHP-CG-FID en ligne, composé d’un équipement de CLHP capable de réaliser un
gradient binaire, d’une vanne d’injection, d’une colonne de CLHP (6.7), d’un détecteur UV (longueur d’onde de
détection: 230 nm), de vannes de transfert pour le rinçage à circulation inversée de la colonne et le transfert
de fraction dans le CG, dudit CG avec sortie de vapeur de solvant et d’un système de commande pneumatique
et d’évaluation. Un système de commande automatique est également recommandé.
3) LiChrospher Si 60 et Allure Silica sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve
l’emploi des produits ainsi désignés.
4) HydroGuard® MXT® est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée
par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de
l’ISO à l’égard de ce produit.

6.16 Agitateur de tube à essai avec contrôle de la température et agitation (par exemple, 500 r/min ou
comparable).
7 Échantillon
7.1 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la présente méthode. L’échantillon ne peut être conservé que dans des
flacons en verre, en aluminium ou dans d’autres matériaux non susceptibles de libérer des hydrocarbures.
Les conditionnements en papier, polyéthylène ou polypropylène ne sont pas adaptés. Dans certains cas, des
5)
récipients en PET ou des sachets fabriqués à partir d’un polyamide haute performance tel que le RILSAN
peuvent être utilisés. Une attention particulière doit également être portée aux fermetures et aux matériaux
d’étanchéité des récipients. Il convient d’éviter l’utilisation de crème pour les mains lors de la manipulation
des échantillons. L’échantillonnage doit être vérifié par des essais à blanc en utilisant du n-hexane au lieu
d’un échantillon.
Une méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 5555.
7.2 Préparation de l’échantillon final pour les corps gras liquides et solides
Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’ISO 661.
Les traitements spéciaux de l’échantillon pour essai (tels que la filtration et la fusion) doivent être
mentionnés.
8 Modes opératoires
8.1 Généralités
Selon le type de corps gras, les échantillons doivent être préparés différemment. Les cas spécifiques A à C
sont indiqués ci-dessous:
— A: préparer les corps gras ayant une teneur inconnue ou élevée en alcanes biogènes à longue chaîne
[7]
et en composés insaturés , comme l’huile d’olive, l’huile de colza et l’huile de tournesol, ainsi que
des échantillons comparables conformément à 8.2 (distribution de l’hexane/l’éthanol). En utilisant
deux fractions distinctes de 10 ml d’extrait, appliquer le mode opératoire décrit en 8.3 (saponification)
sur la première fraction pour le dosage de la teneur en MOSH conformément à 8.4 (colonne d’oxyde
d’aluminium), puis répéter ce mode opératoire de saponification (8.3) sur la deuxième fraction pour le
dosage de la teneur en MOAH conformément à 8.5 (purification) et 8.6 (époxydation).
— B: préparer les corps gras contenant peu d’alcanes biogènes à longue chaîne et de composés insaturés
perturbateurs, tels que la graisse de coco, l’huile de lin et l’huile de palme, ainsi que des échantillons
comparables sans utiliser la purification sur colonne d’alumine, conformément à 8.2 (extraction à
l’hexane/éthanol), 8.3 (saponification), 8.5 (purification) et 8.6 (époxydation). Doser les fractions MOSH
et MOAH à partir de la solution obtenue.
— C: pour l’utilisation automatisée de la colonne d’alumine, préparer les corps gras conformément
à 8.2 (extraction à l’hexane/éthanol), 8.3 (saponification), 8.5 (purification) et 8.6 (époxydation).
Injecter dans le système de CLHP-CG-FID. Après séparation des MOSH, qui sont transférés dans
une colonne d’oxyde d’aluminium intégrée en ligne, la fraction MOAH peut être dosée au cours du même
cycle à l’aide d’un système à deux canaux.
Tout laboratoire ayant recours à des procédés automatisés doit effectuer des essais pour s’assurer que les
résultats obtenus avec ces procédés automatisés ne diffèrent pas des résultats obtenus avec un procédé manuel.
5) RILSAN est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de
commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard
de ce produit.
Les échantillons inconnus ou les échantillons de mélanges d’huiles peuvent être soumis à une première analyse
sans purification à l’oxyde d’aluminium. Si la présence de n-alcanes à longue chaîne interférents a un impact
significatif sur l’enveloppe et ne permet pas une intégration correcte, l’extrait doit être réinjecté en utilisant
la colonne d’alumine pour réduire les interférences (par exemple, pour la purification à l’oxyde d’aluminium
en ligne, le même extrait d’échantillon que celui utilisé pour doser les MOAH est repris pour la séparation
ultérieure des n-alcanes à longue chaîne avec la colonne d’oxyde d’aluminium pour le dosage des MOSH).
NOTE Seule la méthode de purification manuelle pour la fraction MOSH a été validée au cours de l’étude
comparative interlaboratoires.
8.2 Extraction à l’hexane/éthanol pour l’élimination des substances interférentes
Peser 3 g de l’échantillon de corps gras dans un tube à centrifuger de 40 ml avec bouchon à vis. Ajouter 30 ml
du mélange de n-hexane (5.3) et d’éthanol (5.29) et 20 μl d’EI1 (5.16) ou 100 μl d’EI2 (5.17), homogénéiser.
Utiliser 10 ml de la solution obtenue pour la suite du mode opératoire (8.3).
NOTE Dans le cas des corps gras, aucune séparation de phase ne se produit. Néanmoins, cette étape assure
une saponification complète des corps gras. Si nécessaire, d’autres quantités d’étalon interne peuvent être ajoutées.
8.3 Saponification
Transférer une partie aliquote de 10 ml (8.2) dans un autre tube de prélèvement et ajouter 3 ml de solution
d’hydroxyde de potassium (5.31). Saponifier la solution pendant 30 min à 60 °C dans un bain-marie tout
en agitant jusqu’à ce qu’elle devienne limpide. Refroidir, ajouter 5 ml de n-hexane (5.3) et 5 ml de mélange
d’éthanol et d’eau (une fraction volumique de 1:1), agiter à nouveau le mélange. Après séparation des phases,
transférer la phase inférieure dans un nouveau flacon et procéder à une nouvelle extraction avec 5 ml
supplémentaires de n-hexane. Combiner les deux extraits de n-hexane.
Selon la méthode de préparation de l’échantillon, poursuivre en utilisant la solution pour la séparation des
n-alcanes biogènes à longue chaîne avec de l’oxyde d’aluminium (conformément à 8.4) ou pour l’époxydation
(conformément à 8.5 et 8.6).
NOTE L’ajout d’éthanol après la saponification permet une meilleure séparation des phases et évite la formation
d’une émulsion.
8.4 Élimination des n-alcanes biogènes avec de l’oxyde d’aluminium pour le dosage de la
fraction MOSH
Procéder à un nettoyage préliminaire de la colonne d’alumine (5.24) avec 20 ml de n-hexane afin d’éliminer
les substances interférentes (voir le texte portant sur les substances interférentes ci-après). Transférer la
solution de 8.3 dans la colonne d’alumine et éluer les hydrocarbures avec 25 ml de n-hexane (5.3). Collecter
les hydrocarbures dès le transfert de l’échantillon dans la colonne. Évaporer le solvant sous vide (≥260 mbar)
à 35 °C après avoir ajouté deux gouttes de bis (2-éthylhexyle) maléate (5.26).
Dissoudre le résidu dans environ 1 ml de n-hexane, centrifuger si nécessaire et verser dans un flacon. Injecter
60 μl à 90 μl de solution pour analyse avec le système de CLHP-CG-FID afin de doser la fraction MOSH.
Les MOAH restent sur la colonne d’alumine et ne doivent pas être dosés à partir de cet éluat.
Il est recommandé d’éliminer les substances interférentes de l’alumine en rinçant préalablement la colonne avec
20 ml de n-hexane. En revanche, il n’est pas nécessaire de procéder à un rinçage préalable de l’alumine propre.
L’élimination des n-alcanes biogènes peut également permettre d’éliminer en même temps les cires
paraffiniques éventuellement présentes dans l’échantillon. Dans ces cas, l’analyse doit être effectuée
conformément au mode opératoire B.
NOTE Les cires paraffiniques sont caractérisées par des n-alcanes sans prédominance d’éléments ayant un nombre
impair d’atomes de carbone, tandis que les n-alcanes naturellement présents dans les huiles alimentaires présentent
un nombre d’atomes impair prédominant. À titre d’exemple, les principaux n-alcanes des huiles de tournesol sont les
alcanes C27, C29 et C31.
8.5 Purification avant époxydation pour séparer les substances polaires
Transférer les phases supérieures combinées de l’étape de saponification (8.3) dans une colonne de
purification (5.25) et recueillir les hydrocarbures élués: commencer à recueillir l’éluant immédiatement après
avoir transféré la phase supérieure de l’étape de saponification dans la colonne de purification. Procéder à
l’élution complète des hydrocarbures de la colonne avec un mélange supplémentaire de 15 ml de n-hexane et
de DCM (fraction volumique de 7 + 3) (5.30). Utiliser l’éluat pour l’époxydation (conformément à 8.6).
Il est recommandé d’éliminer les substances interférentes de la
...

Norme
internationale
ISO 20122
Première édition
Huiles végétales — Dosage
2024-04
des hydrocarbures saturés
d’huile minérale (MOSH) et des
Version corrigée
hydrocarbures aromatiques d’huile
2024-11
minérale (MOAH) par analyse
par chromatographie en phase
liquide haute performance et
chromatographie en phase gazeuse
couplées à un détecteur à ionisation
de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne
— Méthode pour une faible limite
de quantification
Vegetable oils — Determination of mineral oil saturated
hydrocarbons (MOSH) and mineral oil aromatic hydrocarbons
(MOAH) with online-coupled high performance liquid
chromatography-gas chromatography-flame ionization detection
(HPLC-GC-FID) analysis — Method for low limit of quantification
Numéro de référence
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Réactifs . 3
6 Appareillage . 6
7 Échantillon . 8
7.1 Échantillonnage .8
7.2 Préparation de l’échantillon final pour les corps gras liquides et solides .8
8 Modes opératoires . . 8
8.1 Généralités .8
8.2 Extraction à l’hexane/éthanol pour l’élimination des substances interférentes.9
8.3 Saponification . .9
8.4 Élimination des n-alcanes biogènes avec de l’oxyde d’aluminium pour le dosage de la
fraction MOSH .9
8.5 Purification avant époxydation pour séparer les substances polaires .10
8.6 Époxydation éthanolique de la fraction MOAH pour oxyder les composés
non aromatiques insaturés .10
8.7 Interface CLHP-CG .10
8.7.1 Conditions opératoires de CLHP .10
8.7.2 Configuration du CG .11
8.7.3 Configuration de la sortie de vapeur de solvant . 12
8.7.4 Identification des pics . 12
8.7.5 Essai d’aptitude à l’emploi du système . 13
8.8 Essai à blanc .14
8.9 Contrôle qualité .14
9 Résultat du dosage .15
9.1 Contrôle des chromatogrammes pour déterminer le degré d’époxydation et d’autres
paramètres pertinents . 15
9.2 Calcul . 15
10 Fidélité de la méthode . 16
10.1 Limite de répétabilité .16
10.2 Limite de reproductibilité .17
11 Rapport d’essai . 17
Annexe A (informative) Graphiques et chromatogrammes .18
Annexe B (informative) Données de fidélité .29
Annexe C (informative) Méthode alternative pour l’époxydation de la fraction MOAH
(époxydation par l’acide performique) .42
Bibliographie .43

iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 307,
Oléagineux, corps gras d’origines végétale et animale et leurs co-produits - Méthodes d’échantillonnage et
d’analyse, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique
entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
La présente version corrigée de l’ISO 20122:2024 inclut les corrections suivantes:
— dans 8.7.1, «de la fraction MOAH de 5,7 min» a été corrigée en «de la fraction MOAH de 4,7 min».
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

iv
Introduction
Pour obtenir une faible limite de quantification (LQ), la présente méthode inclut des étapes de traitement
supplémentaires et partiellement modifiées, des spécifications pour le traitement uniforme de groupes de
produits définis et des exigences supplémentaires relatives à l’aptitude à l’emploi du système au regard de
l’EN 16995:2017.
Cette méthode a été soumise à essai dans le cadre d’une étude interlaboratoires en procédant à l’analyse
d’échantillons d’huiles végétales naturellement contaminés et dopés, à des teneurs comprises entre 1 mg/kg
et 75 mg/kg pour les MOSH et entre 1 mg/kg et 7 mg/kg pour les MOAH.

v
Norme internationale ISO 20122:2024(fr)
Huiles végétales — Dosage des hydrocarbures saturés d’huile
minérale (MOSH) et des hydrocarbures aromatiques d’huile
minérale (MOAH) par analyse par chromatographie en phase
liquide haute performance et chromatographie en phase
gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme
(CLHP-CG-FID) en ligne — Méthode pour une faible limite de
quantification
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie un mode opératoire pour le dosage des hydrocarbures saturés et aromatiques
(de C10 à C50) dans les matières grasses et huiles végétales en utilisant la chromatographie en phase liquide
haute performance et la chromatographie en phase gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme
[4][5][6]
(CLHP-CG-FID) en ligne . Le présent document ne s’applique pas à d’autres matrices.
La méthode s’applique à l’analyse des hydrocarbures saturés d’huile minérale (MOSH) et/ou des
hydrocarbures aromatiques d’huile minérale (MOAH).
D’après les résultats des études interlaboratoires, il a été démontré que la méthode est adaptée pour des
concentrations massiques de MOSH supérieures à 3 mg/kg et des concentrations massiques de MOAH
supérieures à 2 mg/kg.
En cas de suspicion d’interférences, l’origine fossile des fractions MOSH et MOAH peut être vérifiée
par un examen par chromatographie en phase gazeuse à deux dimensions, couplée à la spectrométrie
de masse (CG⨯CG-SM).
Une méthode alternative d’époxydation de la fraction MOAH (époxydation par l’acide performique) est proposée
dans l’Annexe C. Cette méthode donne des résultats comparables à l’époxydation éthanolique de la fraction
MOAH décrite en 8.6. Cette méthode alternative d’époxydation s’est avérée efficace pour les échantillons
[14]
présentant de fortes interférences dans la fraction MOAH (par exemple, les huiles tropicales) .
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/

3.1
hydrocarbures saturés d’huile minérale
MOSH
hydrocarbures paraffiniques (chaîne ouverte, généralement ramifiée) et naphténiques (cycliques, alkylés)
provenant d’huiles minérales et situés dans l’intervalle d’ébullition des n-alcanes avec une chaîne carbonée
constituée de 10 à 50 atomes de carbone, obtenus par chromatographie en phase liquide haute performance
et chromatographie en phase gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne
en appliquant la présente méthode
3.2
hydrocarbures aromatiques d’huile minérale
MOAH
hydrocarbures aromatiques principalement alkylés provenant d’huiles minérales et situés dans l’intervalle
d’ébullition des n-alcanes avec une chaîne carbonée constituée de 10 à 50 atomes de carbone, obtenus par
chromatographie en phase liquide haute performance et chromatographie en phase gazeuse couplées à un
détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne
3.3
mélange complexe non résolu
UCM
mélange complexe d’hydrocarbures saturés ou aromatiques non résolus par chromatographie en phase
gazeuse, comme les paraffines ramifiées, les naphtènes alkylés et les aromatiques alkylés, qui forme une
enveloppe lorsqu’il est analysé par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation
de flamme (CG-FID)
3.4
hydrocarbures saturés d’oligomères de polyoléfines
POSH
hydrocarbures synthétiques provenant d’oligomères de polyoléfines, tels que le polyéthylène,
le polypropylène et les polybutylènes
Note 1 à l'article: Les produits destinés à entrer en contact avec les aliments dans lesquels ils sont présents comprennent
les sacs, les récipients ou les films en plastique, les feuilles thermoscellables et autres films de lamination, ainsi que les
adhésifs et les plastifiants.
Note 2 à l'article: Les POSH peuvent être distingués des hydrocarbures saturés d’huile minérale (MOSH) par leur profil
chromatographique, mais il est difficile de les différencier et de les isoler par chromatographie s’ils sont tous deux
[5]
présents .
3.5
hydrocarbures saturés d’oligomères de résine
ROSH
hydrocarbures saturés synthétiques (oligomères de monoterpènes, cyclopentadiènes et autres
monomères C5 ou C9) qui entrent dans la composition des adhésifs thermofusibles et peuvent migrer dans
l’échantillon principalement par transfert en phase gazeuse ou par contact direct
3.6
hydrocarbures aromatiques d’oligomères de résine
ROAH
hydrocarbures aromatiques synthétiques qui entrent dans la composition des adhésifs thermofusibles
et peuvent migrer dans l’échantillon principalement par transfert en phase gazeuse ou par contact direct
3.7
poly-alpha-oléfines
PAO
isoparaffines synthétiques à chaînes latérales courtes ou longues, utilisées comme lubrifiants ou dans
les adhésifs et les colles thermofusibles
Note 1 à l'article: Lorsqu’ils sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation
de flamme (CG-FID), ils sont reconnaissables à des séries d’enveloppes plutôt étroites d’hydrocarbures ramifiés non
[5]
résolus, régulièrement espacées entre elles .

4 Principe
L’échantillon est saponifié. Le résidu insaponifiable est ensuite utilisé pour obtenir des fractions purifiées en
suivant d’autres étapes. Ces fractions sont séparées en fractions MOSH et MOAH sur une colonne de gel de
silice du système de CLHP-CG-FID; chacune d’elles est transférée individuellement vers le chromatographe
en phase gazeuse (CG) couplé en ligne. La majeure partie du solvant est éliminée par une sortie de vapeur de
solvant située entre la précolonne exempte de phase stationnaire et la colonne de séparation de la CG.
Afin de satisfaire aux exigences liées aux diverses substances secondaires interférentes présentes
dans les échantillons, des modes opératoires spécifiques de préparation des échantillons sont décrits
pour les différents groupes de produits. L’époxydation est une étape de purification nécessaire pour la
quantification des MOAH pour tous les échantillons d’huiles végétales. Cette étape de purification permet
l’élimination des oléfines, telles que le squalène, qui sont éluées dans la fraction MOAH et interfèrent avec
la quantification. Selon l’échantillon, cette réaction peut induire l’époxydation d’une partie des MOAH
ou l’élimination incomplète des oléfines interférentes.
L’aire du signal pour l’huile minérale est calculée en soustrayant les pics en chevauchement de l’aire totale.
Le chevauchement des pics peut être causé par les n-alcanes (hydrocarbures naturels), les terpènes,
les stérènes, le squalène et leurs produits d’isomérisation, entre autres substances. Les MOSH et les MOAH
sont quantifiés au moyen d’un étalon interne ajouté avant analyse. Des étalons de vérification sont ajoutés
pour surveiller les conditions appropriées de fractionnement par CLHP et de transfert au CG.
NOTE L’étape d’époxydation peut induire une dégradation des MOAH avec trois noyaux aromatiques ou plus.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — Il est fait référence aux règlements qui régissent la manipulation des substances
dangereuses. Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et humain doivent
être suivies.
Tous les matériaux doivent être soumis à un essai à blanc afin de déterminer leur influence. Il est
recommandé de chauffer toute la verrerie dans un four conformément aux instructions. Il convient que tous
les autres matériaux entrant en contact direct avec l’échantillon soient également chauffés et ne soient pas
en polyéthylène ou en polypropylène.
Sauf indication contraire:
— des réactifs analytiques purs doivent être utilisés;
— l’eau doit être distillée ou de pureté correspondante;
— le terme «solution» désigne une solution aqueuse.
1)
5.1 Gel de silice 60 extra pur, pour chromatographie sur colonne avec une taille de particules de 60 μm
à 200 μm (70 mesh à 230 mesh), conservé en bouteille de verre pour éviter la contamination. Le gel de silice
est chauffé dans une étuve à 400 °C pendant au moins 16 h et refroidi dans un dessiccateur propre (sans
graisse).
5.2 Sulfate de sodium anhydre, de qualité analytique et de pureté ≥ 99 %.
En cas de contamination, chauffer le sulfate de sodium dans une étuve à 400 °C pendant au moins 16 h et
laisser refroidir dans un dessiccateur propre (sans graisse).
1) Ce gel de silice est disponible auprès de Merck, sous la référence 7754 ou 7734. Ceci est un exemple de produit
approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs
du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.

5.3 n-Hexane, exempt d’hydrocarbures dans l’intervalle d’ébullition des n-alcanes C10 à C50 et d’autres
impuretés telles que les produits d’oxydation de l’hexane.
Vérifier la pureté du n-hexane comme suit:
— mélanger 30 ml de n-hexane avec 25 μl de solution étalon interne (5.17) et deux gouttes de maléate (5.26);
— faire s’évaporer à l’aide d’une unité d’évaporation;
— dissoudre le résidu dans 0,2 ml de n-hexane;
— injecter 50 μl dans le système de CLHP-CG-FID pour analyse.
Il convient que l’aire de l’enveloppe mesurée (à l’exclusion de tout pic fin isolé) ne dépasse pas un dixième du
signal obtenu à la LQ.
NOTE Les hydrocarbures dans l’intervalle d’ébullition étudié interfèrent avec la détection spécifique des
constituants des huiles minérales au cours de la chromatographie en phase gazeuse des fractions MOSH et MOAH,
tandis que les composés polaires, tels que les produits d’oxydation de l’hexane, interfèrent avec la séparation
des n-alcanes à longue chaîne au cours de la chromatographie sur colonne d’alumine.
5.4 Dichlorométhane (DCM) d’une pureté ≥ 99 %.
Contrôler la pureté en suivant le même mode opératoire que pour le n-hexane (5.3) avec 30 ml de DCM.
5.5 Toluène.
5.6 Pérylène (PER) d’une pureté > 99 %.
5.7 5-alpha-Cholestane (CHO), d’une pureté ≥ 97 %.
5.8 n-Undécane (C11), d’une pureté ≥ 99 %.
5.9 n-Tridécane (C13), d’une pureté ≥ 99 %.
5.10 Tri-tert-butylbenzène (TBB), d’une pureté ≥ 97 %.
5.11 Bicyclohexyle (CYCY), d’une pureté ≥ 99 %.
5.12 1-Méthylnaphtalène (1-MN), d’une pureté ≥ 95 %.
5.13 2-Méthylnaphtalène (2-MN), d’une pureté ≥ 97 %.
5.14 Pentylbenzène (PB), d’une pureté ≥ 99 %.
5.15 Solution mère, concentrations massiques, ρ = 5 mg/ml, 10 mg/ml ou 20 mg/ml. Par exemple, peser
à 1 mg près 50 mg de C13 (5.9), respectivement 100 mg de C11 (5.8), TBB (5.10), CYCY (5.11), 1-MN (5.12),
2-MN (5.13) et PB (5.14) ainsi que 200 mg de CHO (5.7) et de PER (5.6), puis compléter jusqu’au trait dans
une fiole jaugée de 10 ml avec du toluène (5.5). Conserver ces solutions à température ambiante pour les
maintenir stables. Dissoudre les cristaux éventuellement formés pendant la période de conservation en
réchauffant doucement la solution.
La vérification du début de la fraction MOAH basée sur le TBB peut entraîner des pertes de benzènes
et de naphtalènes fortement alkylés lorsqu’ils sont présents dans les échantillons (c’est-à-dire dans
les cosmétiques) et lorsque les performances chromatographiques de la colonne sont limitées. Dans ce
cas, le di(2-éthylhexyle) benzène (DEHB) peut être utilisé en complément comme étalon de vérification et
[10]
le fractionnement doit être adapté .

2)
5.16 Solution étalon interne 1 (EI1) , concentrations massiques ρ = 150 μg/ml (C13), 300 μg/ml
(C11, CYCY, PB, 1-MN, 2-MN et TBB) et 600 μg/ml (CHO et PER). Transférer 300 μl de solution mère (5.15)
dans une fiole jaugée de 10 ml et compléter jusqu’au trait avec du toluène (5.5).
5.17 Solution étalon interne 2 (EI2), de concentrations massiques ρ = 30 μg/ml (C13), 60 μg/ml (C11, TBB,
CYCY, 1-MN, 2-MN et PB) et 120 μg/ml (PER et CHO): diluer la solution EI1 (5.16) d’un facteur 5; par exemple,
compléter 1 000 μl de solution EI1 (5.16) à 5 ml avec du n-hexane.
5.18 Oxyde d’aluminium 90, alcalin, pour chromatographie sur colonne, de 0,063 mm à 0,2 mm,
activé. Chauffer l’alumine avant utilisation pendant au moins 16 h à 500 °C dans une étuve et la refroidir
à température ambiante dans un dessiccateur nettoyé (sans graisse broyée).
5.19 Acide méta-chloroperbenzoïque (mCPBA), dont les quantités déclarées sont basées sur une
pureté ≤ 77 % environ;
Le mCPBA disponible sur le marché contient différentes quantités de mCPBA, d’acide méta-chlorobenzoïque
et d’eau. Pour la purification du réactif, éliminer les hydrocarbures contaminants: par exemple,
mettre soigneusement en suspension 5 g de mCPBA avec 200 ml de n-hexane dans un bécher en polyéthylène
téréphtalate (PET) placé dans un bain à ultrasons et filtrer sur verre fritté sous vide. Laisser sécher le
mCPBA purifié dans une hotte de laboratoire. Ne pas stocker dans des récipients en verre, car le mCPBA se
décompose sur les surfaces en verre. Le mCPBA disponible sur le marché contient toujours de l’acide méta-
chlorobenzoïque et de l’humidité résiduelle de sorte à garantir la sécurité de la manipulation en laboratoire.
En revanche, le mCPBA pur est explosif. Par conséquent, il n’est pas recommandé d’isoler le mCPBA en tant
que substance pure, ce qui va au-delà du cadre de la purification décrite ici. L’élution avec un mélange de
solvants composé de 200 ml de n-hexane et de 20 ml de DCM peut permettre d’éliminer d’autres impuretés,
mais conduit également à des pertes plus importantes (elle ne permet d’obtenir que 75 % du mCPBA initial,
avec une teneur d’environ 74 g à 84 g de mCPBA pour 100 g de matière première dans le produit purifié).
Pour le dosage de la teneur en mCPBA du réactif, peser environ 0,2 g de mCPBA dans un bécher en PET,
ajouter 50 ml d’eau distillée et bien mélanger. Ajouter 5 ml d’acide acétique concentré et 10 ml de solution
d’iodure de sodium (10 g d’iodure de sodium dans 100 ml d’eau). Procéder ensuite à un prétitrage de rouge
foncé à jaune clair avec la solution de thiosulfate de sodium de normalité 0,1 N. Ajouter quelques gouttes
de solution d’indicateur à l’amidon et titrer de bleu foncé à incolore au point d’équivalence (consommation
généralement inférieure à 20 ml).
Calculer la teneur w (mCPBA) en pourcentage en masse comme indiqué par la Formule (1):
NV××86,29×100
w= (1)
E
où
N est la normalité de la solution de thiosulfate de sodium;
V est le volume total de la solution de thiosulfate de sodium consommée, en l;
E est la masse du réactif, en g.
5.20 Solution de mCPBA dans l’éthanol, ρ = 100 mg/ml: par exemple, dissoudre 1 g de mCPBA (5.19) dans
10 ml d’éthanol (5.28). Préparer une nouvelle solution pour chaque jour de travail.
5.21 Thiosulfate de sodium, anhydre, d’une pureté > 90,0 %.
2) Ce mélange étalon est disponible auprès, par exemple, de Restek Corp., réf. 31070. Ceci est un exemple de produit
approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs
du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.

5.22 Carbonate de sodium hydrogéné (ou carbonate de sodium), anhydre, d’une pureté > 90,0 %.
5.23 Solution de désactivation de l’excédent de mCPBA: solution de thiosulfate de sodium et de carbonate
de sodium, ρ = 50 g/l: par exemple, dissoudre 5 g de thiosulfate de sodium et 5 g de carbonate de sodium
hydrogéné (ou de carbonate de sodium) dans 100 ml d’eau distillée et bien mélanger.
5.24 Colonne d’alumine et de gel de silice. Placer un filtre (6.4) dans une colonne en verre (6.3). Ajouter et
comprimer 10 g d’alumine (5.18), 3 g de gel de silice (5.1) et 1 g de sulfate de sodium (5.2).
5.25 Colonne de purification. Placer un filtre (6.4) dans une cartouche vide d’extraction en phase solide
en verre (d’un volume de 6 ml), ajouter 3 g de gel de silice (5.1), comprimer et recouvrir avec 1 g de sulfate de
sodium (5.2).
5.26 bis (2-éthylhexyle) maléate, d’une pureté de 90 %. Contrôler la pureté par un essai à blanc.
Le bis (2-éthylhexyle) maléate peut être remplacé par du bis(2-éthylhexyle) sébacate afin de limiter le risque
de perturbation du procédé d’époxydation.
5.27 Solution étalon de n-alcanes avec des longueurs de chaîne de 10 à 50 atomes de carbone dans
la même concentration massique, pour contrôler la discrimination des substances à faible ou à haut
point d’ébullition, ρ = 1 μg/ml. Conserver cette solution à température ambiante, faute de quoi le C50 risque
de cristalliser.
5.28 Éthanol, absolu.
Contrôler la pureté comme pour le n-hexane (5.3) avec 30 ml d’éthanol.
5.29 Mélange d’éthanol et de n-hexane, de fraction volumique φ = 50 %: par exemple, mélanger 50 ml
d’éthanol (5.28) avec 50 ml de n-hexane (5.3).
5.30 Mélange d’élution de n-hexane et de DCM: par exemple, mélanger 30 ml de DCM (5.4) avec 70 ml de
n-hexane (5.3). En raison de la volatilité du DCM, la solution doit être fraîchement préparée.
5.31 Solution d’hydroxyde de potassium: par exemple, 50 g d’hydroxyde de potassium dans 100 ml d’eau
distillée, w = 33 g/100 g.
6 Appareillage
La méthode suivante s’est avérée efficace pour obtenir un niveau de blanc suffisamment bas: il convient que
la verrerie (à l’exception des fioles jaugées) soit chauffée dans un four à 430 °C pendant 4 h ou pendant la
nuit à 400 °C, puis conservée dans des dessiccateurs ou d’autres contenants avant d’être utilisée. Il est par
ailleurs recommandé:
— d’effectuer plusieurs dosages dans différentes séries sans les faire se succéder directement;
— de ne pas utiliser de graisse pour les joints rodés;
— de ne pas utiliser de crème pour les mains;
— de ne manipuler les échantillons qu’avec des gants;
— d’utiliser de la verrerie si possible;
— de vérifier la pureté de l’azote en cas de séchage à l’azote;
— de rincer au préalable les fioles jaugées, les pipettes en verre et toute autre verrerie requise avec
du n-hexane.
6.1 Balance analytique, d’une précision d’affichage de 0,000 1 g, et d’une exactitude de pesée de 0,001 g.
6.2 Centrifugeuse et tubes à centrifuger.
6.3 Colonne en verre, sans robinet, de 15 cm à 20 cm de long et de 15 mm à 20 mm de diamètre intérieur.
6.4 Filtre pour colonne de verre, extrait ou chauffé, filtre en laine de quartz/fibre de verre.
6.5 Flacon en verre, 40 ml, avec bouchon à vis hermétique en polytétrafluoroéthylène (PTFE).
6.6 Évaporateur rotatif, sous vide et avec bain-marie à 35 °C.
Il est également possible d’utiliser des dispositifs similaires. Veiller à éviter toute contamination.
Si nécessaire, nettoyer méticuleusement le système entre les dosages.
3)
6.7 Colonne de CLHP, par exemple LiChrospher Si 60 ou Allure Silica , matériau 5 µm, 2 x 250 mm
ou comparable.
6.8 Précolonne de CG exempte de phase stationnaire, capillaire en silice fondue ou en métal,
4)
par exemple HydroGuard® MXT® , 10 m × 0,53 mm ou comparable.
NOTE Les capillaires de 6.8 à 6.12 se sont avérés appropriés et peuvent être adaptés au système pour répondre
aux exigences et obtenir des résultats comparables.
6.9 Colonne de séparation de CG, capillaire en silice fondue ou en métal, température programmée stable
jusqu’à au moins 370 °C: phase stationnaire de 100 % de diméthyl-polysiloxane ou de 95 % diméthyl et 5 %
diphényl-méthylpolysiloxane; longueur: 15 m; diamètre intérieur (DI): 0,32 mm ou 0,25 mm; épaisseur du
film: 0,10 µm à 0,25 µm.
6.10 Capillaire en silice fondue ou en métal, désactivé, pour le transfert des fractions obtenues par CLHP
de la vanne au connecteur en T du CG; longueur: 1 m; DI: 0,1 mm.
6.11 Capillaire désactivé, du connecteur en T à la sortie de vapeur entre la précolonne et la colonne
de séparation.
6.12 Capillaire de restriction à la sortie de vapeur, désactivé; longueur: 1 m; DI: 0,05 mm.
6.13 Seringue de 100 μl, adaptée à l’injection de 5 µl à 100 µl pour la chromatographie en phase liquide.
6.14 Pipette Pasteur en verre.
NOTE L’utilisation d’embouts de pipette en plastique et de film de polyéthylène entraîne une augmentation
des niveaux de blanc.
6.15 Système de CLHP-CG-FID en ligne, composé d’un équipement de CLHP capable de réaliser un
gradient binaire, d’une vanne d’injection, d’une colonne de CLHP (6.7), d’un détecteur UV (longueur d’onde de
détection: 230 nm), de vannes de transfert pour le rinçage à circulation inversée de la colonne et le transfert
de fraction dans le CG, dudit CG avec sortie de vapeur de solvant et d’un système de commande pneumatique
et d’évaluation. Un système de commande automatique est également recommandé.
3) LiChrospher Si 60 et Allure Silica sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve
l’emploi des produits ainsi désignés.
4) HydroGuard® MXT® est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée
par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de
l’ISO à l’égard de ce produit.

6.16 Agitateur de tube à essai avec contrôle de la température et agitation (par exemple, 500 r/min ou
comparable).
7 Échantillon
7.1 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la présente méthode. L’échantillon ne peut être conservé que dans des
flacons en verre, en aluminium ou dans d’autres matériaux non susceptibles de libérer des hydrocarbures.
Les conditionnements en papier, polyéthylène ou polypropylène ne sont pas adaptés. Dans certains cas, des
5)
récipients en PET ou des sachets fabriqués à partir d’un polyamide haute performance tel que le RILSAN
peuvent être utilisés. Une attention particulière doit également être portée aux fermetures et aux matériaux
d’étanchéité des récipients. Il convient d’éviter l’utilisation de crème pour les mains lors de la manipulation
des échantillons. L’échantillonnage doit être vérifié par des essais à blanc en utilisant du n-hexane au lieu
d’un échantillon.
Une méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 5555.
7.2 Préparation de l’échantillon final pour les corps gras liquides et solides
Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’ISO 661.
Les traitements spéciaux de l’échantillon pour essai (tels que la filtration et la fusion) doivent être
mentionnés.
8 Modes opératoires
8.1 Généralités
Selon le type de corps gras, les échantillons doivent être préparés différemment. Les cas spécifiques A à C
sont indiqués ci-dessous:
— A: préparer les corps gras ayant une teneur inconnue ou élevée en alcanes biogènes à longue chaîne
[7]
et en composés insaturés , comme l’huile d’olive, l’huile de colza et l’huile de tournesol, ainsi que
des échantillons comparables conformément à 8.2 (distribution de l’hexane/l’éthanol). En utilisant
deux fractions distinctes de 10 ml d’extrait, appliquer le mode opératoire décrit en 8.3 (saponification)
sur la première fraction pour le dosage de la teneur en MOSH conformément à 8.4 (colonne d’oxyde
d’aluminium), puis répéter ce mode opératoire de saponification (8.3) sur la deuxième fraction pour le
dosage de la teneur en MOAH conformément à 8.5 (purification) et 8.6 (époxydation).
— B: préparer les corps gras contenant peu d’alcanes biogènes à longue chaîne et de composés insaturés
perturbateurs, tels que la graisse de coco, l’huile de lin et l’huile de palme, ainsi que des échantillons
comparables sans utiliser la purification sur colonne d’alumine, conformément à 8.2 (extraction à
l’hexane/éthanol), 8.3 (saponification), 8.5 (purification) et 8.6 (époxydation). Doser les fractions MOSH
et MOAH à partir de la solution obtenue.
— C: pour l’utilisation automatisée de la colonne d’alumine, préparer les corps gras conformément
à 8.2 (extraction à l’hexane/éthanol), 8.3 (saponification), 8.5 (purification) et 8.6 (époxydation).
Injecter dans le système de CLHP-CG-FID. Après séparation des MOSH, qui sont transférés dans
une colonne d’oxyde d’aluminium intégrée en ligne, la fraction MOAH peut être dosée au cours du même
cycle à l’aide d’un système à deux canaux.
Tout laboratoire ayant recours à des procédés automatisés doit effectuer des essais pour s’assurer que les
résultats obtenus avec ces procédés automatisés ne diffèrent pas des résultats obtenus avec un procédé manuel.
5) RILSAN est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de
commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard
de ce produit.
Les échantillons inconnus ou les échantillons de mélanges d’huiles peuvent être soumis à une première analyse
sans purification à l’oxyde d’aluminium. Si la présence de n-alcanes à longue chaîne interférents a un impact
significatif sur l’enveloppe et ne permet pas une intégration correcte, l’extrait doit être réinjecté en utilisant
la colonne d’alumine pour réduire les interférences (par exemple, pour la purification à l’oxyde d’aluminium
en ligne, le même extrait d’échantillon que celui utilisé pour doser les MOAH est repris pour la séparation
ultérieure des n-alcanes à longue chaîne avec la colonne d’oxyde d’aluminium pour le dosage des MOSH).
NOTE Seule la méthode de purification manuelle pour la fraction MOSH a été validée au cours de l’étude
comparative interlaboratoires.
8.2 Extraction à l’hexane/éthanol pour l’élimination des substances interférentes
Peser 3 g de l’échantillon de corps gras dans un tube à centrifuger de 40 ml avec bouchon à vis. Ajouter 30 ml
du mélange de n-hexane (5.3) et d’éthanol (5.29) et 20 μl d’EI1 (5.16) ou 100 μl d’EI2 (5.17), homogénéiser.
Utiliser 10 ml de la solution obtenue pour la suite du mode opératoire (8.3).
NOTE Dans le cas des corps gras, aucune séparation de phase ne se produit. Néanmoins, cette étape assure
une saponification complète des corps gras. Si nécessaire, d’autres quantités d’étalon interne peuvent être ajoutées.
8.3 Saponification
Transférer une partie aliquote de 10 ml (8.2) dans un autre tube de prélèvement et ajouter 3 ml de solution
d’hydroxyde de potassium (5.31). Saponifier la solution pendant 30 min à 60 °C dans un bain-marie tout
en agitant jusqu’à ce qu’elle devienne limpide. Refroidir, ajouter 5 ml de n-hexane (5.3) et 5 ml de mélange
d’éthanol et d’eau (une fraction volumique de 1:1), agiter à nouveau le mélange. Après séparation des phases,
transférer la phase inférieure dans un nouveau flacon et procéder à une nouvelle extraction avec 5 ml
supplémentaires de n-hexane. Combiner les deux extraits de n-hexane.
Selon la méthode de préparation de l’échantillon, poursuivre en utilisant la solution pour la séparation des
n-alcanes biogènes à longue chaîne avec de l’oxyde d’aluminium (conformément à 8.4) ou pour l’époxydation
(conformément à 8.5 et 8.6).
NOTE L’ajout d’éthanol après la saponification permet une meilleure séparation des phases et évite la formation
d’une émulsion.
8.4 Élimination des n-alcanes biogènes avec de l’oxyde d’aluminium pour le dosage de la
fraction MOSH
Procéder à un nettoyage préliminaire de la colonne d’alumine (5.24) avec 20 ml de n-hexane afin d’éliminer
les substances interférentes (voir le texte portant sur les substances interférentes ci-après). Transférer la
solution de 8.3 dans la colonne d’alumine et éluer les hydrocarbures avec 25 ml de n-hexane (5.3). Collecter
les hydrocarbures dès le transfert de l’échantillon dans la colonne. Évaporer le solvant sous vide (≥260 mbar)
à 35 °C après avoir ajouté deux gouttes de bis (2-éthylhexyle) maléate (5.26).
Dissoudre le résidu dans environ 1 ml de n-hexane, centrifuger si nécessaire et verser dans un flacon. Injecter
60 μl à 90 μl de solution pour analyse avec le système de CLHP-CG-FID afin de doser la fraction MOSH.
Les MOAH restent sur la colonne d’alumine et ne doivent pas être dosés à partir de cet éluat.
Il est recommandé d’éliminer les substances interférentes de l’alumine en rinçant préalablement la colonne avec
20 ml de n-hexane. En revanche, il n’est pas nécessaire de procéder à un rinçage préalable de l’alumine propre.
L’élimination des n-alcanes biogènes peut également permettre d’éliminer en même temps les cires
paraffiniques éventuellement présentes dans l’échantillon. Dans ces cas, l’analyse doit être effectuée
conformément au mode opératoire B.
NOTE Les cires paraffiniques sont caractérisées par des n-alcanes sans prédominance d’éléments ayant un nombre
impair d’atomes de carbone, tandis que les n-alcanes naturellement présents dans les huiles alimentaires présentent
un nombre d’atomes impair prédominant. À titre d’exemple, les principaux n-alcanes des huiles de tournesol sont les
alcanes C27, C29 et C31.
8.5 Purification avant époxydation pour séparer les substances polaires
Transférer les phases supérieures combinées de l’étape de saponification (8.3) dans une colonne de
purification (5.25) et recueillir les hydrocarbures élués: commencer à recueillir l’éluant immédiatement après
avoir transféré la phase supérieure de l’étape de saponification dans la colonne de purification. Procéder à
l’élution complète des hydrocarbures de la colonne avec un mélan
...

ISO/TC 34/SC 11
Date :  2024-02
ISO ISO 20122:2024(Ffr)
ISO/TC 34/SC 11
Secrétariat :  BSIPremière édition
2024-04
Date: 2024-04-04
Huiles végétales — Dosage des hydrocarbures saturés d’huile
minérale (MOSH) et des hydrocarbures aromatiques d’huile
minérale (MOAH) par analyse par chromatographie en phase
liquide haute performance et chromatographie en phase gazeuse
couplées à un détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en
ligne — Méthode pour une faible limite de quantification
Vegetable oils — Determination of mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) and mineral oil aromatic
hydrocarbons (MOAH) with online-coupled high performance liquid chromatography-gas
chromatography-flame ionization detection (HPLC-GC-FID) analysis — Method for low limit of
quantification
ICS : 67.200.10
NORME INTERNATIONALE ISO 20122:2024(fr)

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œuvreoeuvre, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par
aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un
Intranetintranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut être demandée à l’ISO à l’adresse ci--après ou
au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Case postaleCP 401 • • Ch. de Blandonnet 8
CH--1214 Vernier, GenèveGeneva
Tél. : Phone: + 41 22 749 01 11
E-mail: [e-mail]
Web Website: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos . v
Introduction . vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
5 Réactifs . 3
6 Appareillage . 6
7 Échantillon . 8
7.1 Échantillonnage . 8
7.2 Préparation de l’échantillon final pour les corps gras liquides et solides . 8
8 Modes opératoires . 8
8.1 Généralités . 8
8.2 Extraction à l’hexane/éthanol pour l’élimination des substances interférentes . 9
8.3 Saponification . 9
8.4 Élimination des n-alcanes biogènes avec de l’oxyde d’aluminium pour le dosage de la fraction MOSH . 9
8.5 Purification avant époxydation pour séparer les substances polaires . 10
8.6 Époxydation éthanolique de la fraction MOAH pour oxyder les composés non aromatiques insaturés
8.7 Interface CLHP-CG . 11
8.7.1 Conditions opératoires de CLHP . 11
8.7.2 Configuration du CG . 11
8.7.3 Configuration de la sortie de vapeur de solvant . 12
8.7.4 Identification des pics . 12
8.7.5 Essai d’aptitude à l’emploi du système . 14
8.8 Essai à blanc . 15
8.9 Contrôle qualité . 15
9 Résultat du dosage. 15
9.1 Contrôle des chromatogrammes pour déterminer le degré d’époxydation et d’autres paramètres
pertinents . 15
9.2 Calcul . 16
10 Fidélité de la méthode . 17
10.1 Limite de répétabilité . 17
10.2 Limite de reproductibilité . 17
11 Rapport d’essai . 17
Annex A (informative) Graphiques et chromatogrammes . 19
Annex B (informative) Données de fidélité . 28
iii
Annex C (informative) Méthode alternative pour l’époxydation de la fraction MOAH (époxydation par l’acide
performique) . 41
C.1 Mode opératoire . 41
C.2 Données de validation . 41
Bibliographie . 43

iv
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont décrites
dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents critères
d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été rédigé
conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de propriétébrevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO
n’avait pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application.
Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des
informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à
l’adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou
partie de tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions spécifiques
de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux
principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce
(OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 307,
Oléagineux, corps gras d’origines végétale et animale et leurs co-produits - Méthodes d’échantillonnage et
d’analyse, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique
entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

v
Introduction
Pour obtenir une faible limite de quantification (LQ), la présente méthode inclut des étapes de traitement
supplémentaires et partiellement modifiées, des spécifications pour le traitement uniforme de groupes de
produits définis et des exigences supplémentaires relatives à l’aptitude à l’emploi du système au regard de
l’EN 16995:2017.
Cette méthode a été soumise à essai dans le cadre d’une étude interlaboratoires en procédant à l’analyse
d’échantillons d’huiles végétales naturellement contaminés et dopés, à des teneurs comprises entre 1 mg/kg
et 75 mg/kg pour les MOSH et entre 1 mg/kg et 7 mg/kg pour les MOAH.
vi
Huiles végétales — Dosage des hydrocarbures saturés d’huile
minérale (MOSH) et des hydrocarbures aromatiques d’huile minérale
(MOAH) par analyse par chromatographie en phase liquide haute
performance et chromatographie en phase gazeuse couplées à un
détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne — Méthode
pour une faible limite de quantification
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie un mode opératoire pour le dosage des hydrocarbures saturés et aromatiques
(de C10 à C50) dans les matières grasses et huiles végétales en utilisant la chromatographie en phase liquide
haute performance et la chromatographie en phase gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme
[4][5][6]
(CLHP-CG-FID) en ligne . Le présent document ne s’applique pas à d’autres matrices.
La méthode s’applique à l’analyse des hydrocarbures saturés d’huile minérale (MOSH) et/ou des
hydrocarbures aromatiques d’huile minérale (MOAH).
D’après les résultats des études interlaboratoires, il a été démontré que la méthode est adaptée pour des
concentrations massiques de MOSH supérieures à 3 mg/kg et des concentrations massiques de MOAH
supérieures à 2 mg/kg.
En cas de suspicion d’interférences, l’origine fossile des fractions MOSH et MOAH peut être vérifiée
par un examen par chromatographie en phase gazeuse à deux dimensions, couplée à la spectrométrie
de masse (CG⨯CG-SM).
Une méthode alternative d’époxydation de la fraction MOAH (époxydation par l’acide performique)
est proposée dans l’Annexe C. Cette méthode donne des résultats comparables à l’époxydation éthanolique de
la fraction MOAH décrite en 8.6. Cette méthode alternative d’époxydation s’est avérée efficace pour
les échantillons présentant de fortes interférences dans la fraction MOAH (par exemple, les huiles
[14]
tropicales) .
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur contenu,
des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https://www.electropedia.org/
3.1
hydrocarbures saturés d’huile minérale
MOSH
hydrocarbures paraffiniques (chaîne ouverte, généralement ramifiée) et naphténiques (cycliques, alkylés)
provenant d’huiles minérales et situés dans l’intervalle d’ébullition des n-alcanes avec une chaîne carbonée
constituée de 10 à 50 atomes de carbone, obtenus par chromatographie en phase liquide haute performance
et chromatographie en phase gazeuse couplées à un détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne
en appliquant la présente méthode
3.2
hydrocarbures aromatiques d’huile minérale
MOAH
hydrocarbures aromatiques principalement alkylés provenant d’huiles minérales et situés dans l’intervalle
d’ébullition des n-alcanes avec une chaîne carbonée constituée de 10 à 50 atomes de carbone, obtenus par
chromatographie en phase liquide haute performance et chromatographie en phase gazeuse couplées à un
détecteur à ionisation de flamme (CLHP-CG-FID) en ligne
3.3
mélange complexe non résolu
UCM
mélange complexe d’hydrocarbures saturés ou aromatiques non résolus par chromatographie en phase
gazeuse, comme les paraffines ramifiées, les naphtènes alkylés et les aromatiques alkylés, qui forme une
enveloppe lorsqu’il est analysé par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de
flamme (CG-FID)
3.4
hydrocarbures saturés d’oligomères de polyoléfines
POSH
hydrocarbures synthétiques provenant d’oligomères de polyoléfines, tels que le polyéthylène,
le polypropylène et les polybutylènes
Note 1 à l'article: Les produits destinés à entrer en contact avec les aliments dans lesquels ils sont présents comprennent
les sacs, les récipients ou les films en plastique, les feuilles thermoscellables et autres films de lamination, ainsi que les
adhésifs et les plastifiants.
Note 2 à l'article: Les POSH peuvent être distingués des hydrocarbures saturés d’huile minérale (MOSH) par leur profil
chromatographique, mais il est difficile de les différencier et de les isoler par chromatographie s’ils sont tous deux
[5]
présents .
3.5
hydrocarbures saturés d’oligomères de résine
ROSH
hydrocarbures saturés synthétiques (oligomères de monoterpènes, cyclopentadiènes et autres
monomères C5 ou C9) qui entrent dans la composition des adhésifs thermofusibles et peuvent migrer dans
l’échantillon principalement par transfert en phase gazeuse ou par contact direct
3.6
hydrocarbures aromatiques d’oligomères de résine
ROAH
hydrocarbures aromatiques synthétiques qui entrent dans la composition des adhésifs thermofusibles
et peuvent migrer dans l’échantillon principalement par transfert en phase gazeuse ou par contact direct
3.7
poly-alpha-oléfines
PAO
isoparaffines synthétiques à chaînes latérales courtes ou longues, utilisées comme lubrifiants ou dans
les adhésifs et les colles thermofusibles
Note 1 à l'article: Lorsqu’ils sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de
flamme (CG-FID), ils sont reconnaissables à des séries d’enveloppes plutôt étroites d’hydrocarbures ramifiés non résolus,
[5]
régulièrement espacées entre elles .
4 Principe
L’échantillon est saponifié. Le résidu insaponifiable est ensuite utilisé pour obtenir des fractions purifiées en
suivant d’autres étapes. Ces fractions sont séparées en fractions MOSH et MOAH sur une colonne de gel de
silice du système de CLHP-CG-FID; chacune d’elles est transférée individuellement vers le chromatographe en
phase gazeuse (CG) couplé en ligne. La majeure partie du solvant est éliminée par une sortie de vapeur de
solvant située entre la précolonne exempte de phase stationnaire et la colonne de séparation de la CG.
Afin de satisfaire aux exigences liées aux diverses substances secondaires interférentes présentes dans les
échantillons, des modes opératoires spécifiques de préparation des échantillons sont décrits pour
les différents groupes de produits. L’époxydation est une étape de purification nécessaire pour la
quantification des MOAH pour tous les échantillons d’huiles végétales. Cette étape de purification permet
l’élimination des oléfines, telles que le squalène, qui sont éluées dans la fraction MOAH et interfèrent avec la
quantification. Selon l’échantillon, cette réaction peut induire l’époxydation d’une partie des MOAH
ou l’élimination incomplète des oléfines interférentes.
L’aire du signal pour l’huile minérale est calculée en soustrayant les pics en chevauchement de l’aire totale. Le
chevauchement des pics peut être causé par les n-alcanes (hydrocarbures naturels), les terpènes, les stérènes,
le squalène et leurs produits d’isomérisation, entre autres substances. Les MOSH et les MOAH sont quantifiés
au moyen d’un étalon interne ajouté avant analyse. Des étalons de vérification sont ajoutés pour surveiller les
conditions appropriées de fractionnement par CLHP et de transfert au CG.
NOTE L’étape d’époxydation peut induire une dégradation des MOAH avec trois noyaux aromatiques ou plus.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — Il est fait référence aux règlements qui régissent la manipulation des substances
dangereuses. Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et humain doivent être
suivies.
Tous les matériaux doivent être soumis à un essai à blanc afin de déterminer leur influence. Il est recommandé
de chauffer toute la verrerie dans un four conformément aux instructions. Il convient que tous les autres
matériaux entrant en contact direct avec l’échantillon soient également chauffés et ne soient pas en
polyéthylène ou en polypropylène.
Sauf indication contraire:
— des réactifs analytiques purs doivent être utilisés;
— l’eau doit être distillée ou de pureté correspondante;
— le terme «solution» désigne une solution aqueuse.
5.1 Gel de silice 60 extra pur, pour chromatographie sur colonne avec une taille de particules de 60 μm à
200 μm (70 mesh à 230 mesh), conservé en bouteille de verre pour éviter la contamination. Le gel de silice est
chauffé dans une étuve à 400 °C pendant au moins 16 h et refroidi dans un dessiccateur propre (sans graisse).
5.2 Sulfate de sodium anhydre, de qualité analytique et de pureté ≥ 99 %.
En cas de contamination, chauffer le sulfate de sodium dans une étuve à 400 °C pendant au moins 16 h et
laisser refroidir dans un dessiccateur propre (sans graisse).
5.3 n-Hexane, exempt d’hydrocarbures dans l’intervalle d’ébullition des n-alcanes C10 à C50 et d’autres
impuretés telles que les produits d’oxydation de l’hexane.
Vérifier la pureté du n-hexane comme suit:
— mélanger 30 ml de n-hexane avec 25 μl de solution étalon interne (5.17) et deux gouttes de maléate (5.26);
— faire s’évaporer à l’aide d’une unité d’évaporation;
— dissoudre le résidu dans 0,2 ml de n-hexane;
— injecter 50 μl dans le système de CLHP-CG-FID pour analyse.
Il convient que l’aire de l’enveloppe mesurée (à l’exclusion de tout pic fin isolé) ne dépasse pas un dixième du
signal obtenu à la LQ.
NOTE Les hydrocarbures dans l’intervalle d’ébullition étudié interfèrent avec la détection spécifique des
constituants des huiles minérales au cours de la chromatographie en phase gazeuse des fractions MOSH et MOAH, tandis
que les composés polaires, tels que les produits d’oxydation de l’hexane, interfèrent avec la séparation des n-alcanes à
longue chaîne au cours de la chromatographie sur colonne d’alumine.
5.4 Dichlorométhane (DCM) d’une pureté ≥ 99 %.
Contrôler la pureté en suivant le même mode opératoire que pour le n-hexane (5.3) avec 30 ml de DCM.
5.5 Toluène.
5.6 Pérylène (PER) d’une pureté > 99 %.
5.7 5-alpha-Cholestane (CHO), d’une pureté ≥ 97 %.
5.8 n-Undécane (C11), d’une pureté ≥ 99 %.
5.9 n-Tridécane (C13), d’une pureté ≥ 99 %.
5.10 Tri-tert-butylbenzène (TBB), d’une pureté ≥ 97 %.
5.11 Bicyclohexyle (CYCY), d’une pureté ≥ 99 %.
5.12 1-Méthylnaphtalène (1-MN), d’une pureté ≥ 95 %.
5.13 2-Méthylnaphtalène (2-MN), d’une pureté ≥ 97 %.
5.14 Pentylbenzène (PB), d’une pureté ≥ 99 %.
5.15 Solution mère, concentrations massiques, ρ = 5 mg/ml, 10 mg/ml ou 20 mg/ml. Par exemple, peser
à 1 mg près 50 mg de C13 (5.9), respectivement 100 mg de C11 (5.8), TBB (5.10), CYCY (5.11), 1-MN (5.12),
2-MN (5.13) et PB (5.14) ainsi que 200 mg de CHO (5.7) et de PER (5.6), puis compléter jusqu’au trait dans
une fiole jaugée de 10 ml avec du toluène (5.5). Conserver ces solutions à température ambiante pour les
maintenir stables. Dissoudre les cristaux éventuellement formés pendant la période de conservation en
réchauffant doucement la solution.
La vérification du début de la fraction MOAH basée sur le TBB peut entraîner des pertes de benzènes
et de naphtalènes fortement alkylés lorsqu’ils sont présents dans les échantillons (c’est-à-dire dans
les cosmétiques) et lorsque les performances chromatographiques de la colonne sont limitées. Dans ce cas, le
di(2-éthylhexyle) benzène (DEHB) peut être utilisé en complément comme étalon de vérification et
[10]
le fractionnement doit être adapté .
5.16 Solution étalon interne 1 (EI1), concentrations massiques ρ = 150 μg/ml (C13), 300 μg/ml
(C11, CYCY, PB, 1-MN, 2-MN et TBB) et 600 μg/ml (CHO et PER). Transférer 300 μl de solution mère (5.15)
dans une fiole jaugée de 10 ml et compléter jusqu’au trait avec du toluène (5.5).
5.17 Solution étalon interne 2 (EI2), de concentrations massiques ρ = 30 μg/ml (C13), 60 μg/ml (C11, TBB,
CYCY, 1-MN, 2-MN et PB) et 120 μg/ml (PER et CHO): diluer la solution EI1 (5.16) d’un facteur 5; par exemple,
compléter 1 000 μl de solution EI1 (5.16) à 5 ml avec du n-hexane.
5.18 Oxyde d’aluminium 90, alcalin, pour chromatographie sur colonne, de 0,063 mm à 0,2 mm, activé.
Chauffer l’alumine avant utilisation pendant au moins 16 h à 500 °C dans une étuve et la refroidir
à température ambiante dans un dessiccateur nettoyé (sans graisse broyée).
5.19 Acide méta-chloroperbenzoïque (mCPBA), dont les quantités déclarées sont basées sur une
pureté ≤ 77 % environ;
Le mCPBA disponible sur le marché contient différentes quantités de mCPBA, d’acide méta-chlorobenzoïque
et d’eau. Pour la purification du réactif, éliminer les hydrocarbures contaminants: par exemple,
mettre soigneusement en suspension 5 g de mCPBA avec 200 ml de n-hexane dans un bécher en polyéthylène
téréphtalate (PET) placé dans un bain à ultrasons et filtrer sur verre fritté sous vide. Laisser sécher le mCPBA
purifié dans une hotte de laboratoire. Ne pas stocker dans des récipients en verre, car le mCPBA se décompose
sur les surfaces en verre. Le mCPBA disponible sur le marché contient toujours de l’acide méta-
chlorobenzoïque et de l’humidité résiduelle de sorte à garantir la sécurité de la manipulation en laboratoire.
En revanche, le mCPBA pur est explosif. Par conséquent, il n’est pas recommandé d’isoler le mCPBA en tant
que substance pure, ce qui va au-delà du cadre de la purification décrite ici. L’élution avec un mélange de
solvants composé de 200 ml de n-hexane et de 20 ml de DCM peut permettre d’éliminer d’autres impuretés,
mais conduit également à des pertes plus importantes (elle ne permet d’obtenir que 75 % du mCPBA initial,
avec une teneur d’environ 74 g à 84 g de mCPBA pour 100 g de matière première dans le produit purifié).
Pour le dosage de la teneur en mCPBA du réactif, peser environ 0,2 g de mCPBA dans un bécher en PET, ajouter
50 ml d’eau distillée et bien mélanger. Ajouter 5 ml d’acide acétique concentré et 10 ml de solution d’iodure
de sodium (10 g d’iodure de sodium dans 100 ml d’eau). Procéder ensuite à un prétitrage de rouge foncé à
jaune clair avec la solution de thiosulfate de sodium de normalité 0,1 N. Ajouter quelques gouttes de solution
d’indicateur à l’amidon et titrer de bleu foncé à incolore au point d’équivalence (consommation généralement
inférieure à 20 ml).
Calculer la teneur w (mCPBA) en pourcentage en masse comme indiqué par la Formule (1):
𝑁𝑁 × 𝑉𝑉 × 86,29 × 100
𝑤𝑤 = (1)
𝐸𝐸
où
N est la normalité de la solution de thiosulfate de sodium;
V est le volume total de la solution de thiosulfate de sodium consommée, en l;
E est la masse du réactif, en g.
5.20 Solution de mCPBA dans l’éthanol, ρ = 100 mg/ml: par exemple, dissoudre 1 g de mCPBA (5.19) dans
10 ml d’éthanol (5.28). Préparer une nouvelle solution pour chaque jour de travail.
5.21 Thiosulfate de sodium, anhydre, d’une pureté > 90,0 %.
5.22 Carbonate de sodium hydrogéné (ou carbonate de sodium), anhydre, d’une pureté > 90,0 %.
5.23 Solution de désactivation de l’excédent de mCPBA: solution de thiosulfate de sodium et de carbonate
de sodium, ρ = 50 g/l: par exemple, dissoudre 5 g de thiosulfate de sodium et 5 g de carbonate de sodium
hydrogéné (ou de carbonate de sodium) dans 100 ml d’eau distillée et bien mélanger.
5.24 Colonne d’alumine et de gel de silice. Placer un filtre (6.4) dans une colonne en verre (6.3), ajouter).
Ajouter et comprimer 10 g d’alumine (5.18), 3 g de gel de silice (5.1) et 1 g de sulfate de sodium (5.2).
5.25 Colonne de purification. Placer un filtre (6.4) dans une cartouche vide d’extraction en phase solide en
verre (d’un volume de 6 ml), ajouter 3 g de gel de silice (5.1), comprimer et recouvrir avec 1 g de sulfate de
sodium (5.2).
5.26 bis (2-éthylhexyle) maléate, d’une pureté de 90 %. Contrôler la pureté par un essai à blanc.
Le bis (2-éthylhexyle) maléate peut être remplacé par du bis(2-éthylhexyle) sébacate afin de limiter le risque
de perturbation du procédé d’époxydation.
5.27 Solution étalon de n-alcanes avec des longueurs de chaîne de 10 à 50 atomes de carbone dans la
même concentration massique, pour contrôler la discrimination des substances à faible ou à haut
point d’ébullition, ρ = 1 μg/ml. Conserver cette solution à température ambiante, faute de quoi le C50 risque
de cristalliser.
5.28 Éthanol, absolu.
Contrôler la pureté comme pour le n-hexane (5.3) avec 30 ml d’éthanol.
5.29 Mélange d’éthanol et de n-hexane, de fraction volumique φ = 50 %: par exemple, mélanger 50 ml
).
d’éthanol (5.28) avec 50 ml de n-hexane (5.3
5.30 Mélange d’élution de n-hexane et de DCM: par exemple, mélanger 30 ml de DCM (5.4) avec 70 ml de
n-hexane (5.3). En raison de la volatilité du DCM, la solution doit être fraîchement préparée.
5.31 Solution d’hydroxyde de potassium: par exemple, 50 g d’hydroxyde de potassium dans 100 ml d’eau
distillée, w = 33 g/100 g.
6 Appareillage
La méthode suivante s’est avérée efficace pour obtenir un niveau de blanc suffisamment bas: il convient que
la verrerie (à l’exception des fioles jaugées) soit chauffée dans un four à 430 °C pendant 4 h ou pendant la nuit
à 400 °C, puis conservée dans des dessiccateurs ou d’autres contenants avant d’être utilisée. Il est par ailleurs
recommandé:
— d’effectuer plusieurs dosages dans différentes séries sans les faire se succéder directement;
— de ne pas utiliser de graisse pour les joints rodés;
— de ne pas utiliser de crème pour les mains;
— de ne manipuler les échantillons qu’avec des gants;
— d’utiliser de la verrerie si possible;
— de vérifier la pureté de l’azote en cas de séchage à l’azote;
— de rincer au préalable les fioles jaugées, les pipettes en verre et toute autre verrerie requise avec du n-
hexane.
6.1 Balance analytique, d’une précision d’affichage de 0,000 1 g, et d’une exactitude de pesée de 0,001 g.
6.2 Centrifugeuse et tubes à centrifuger.
6.3 Colonne en verre, sans robinet, de 15 cm à 20 cm de long et de 15 mm à 20 mm de diamètre intérieur.
6.4 Filtre pour colonne de verre, extrait ou chauffé, filtre en laine de quartz/fibre de verre.
6.5 Flacon en verre, 40 ml, avec bouchon à vis hermétique en polytétrafluoroéthylène (PTFE).
6.6 Évaporateur rotatif, sous vide et avec bain-marie à 35 °C.
Il est également possible d’utiliser des dispositifs similaires. Veiller à éviter toute contamination. Si nécessaire,
nettoyer méticuleusement le système entre les dosages.
6.7 Colonne de CLHP, par exemple LiChrospher Si 60 ou Allure Silica, matériau 5 µm, 2 x 250 mm
ou comparable.
6.8 Précolonne de CG exempte de phase stationnaire, capillaire en silice fondue ou en métal,
par exemple HydroGuard® MXT®, 10 m × 0,53 mm ou comparable.
NOTE Les capillaires de 6.8 à 6.12 se sont avérés appropriés et peuvent être adaptés au système pour répondre aux
exigences et obtenir des résultats comparables.
6.9 Colonne de séparation de CG, capillaire en silice fondue ou en métal, température programmée stable
jusqu’à au moins 370 °C: phase stationnaire de 100 % de diméthyl-polysiloxane ou de 95 % diméthyl et 5 %
diphényl-méthylpolysiloxane; longueur: 15 m; diamètre intérieur (DI): 0,32 mm ou 0,25 mm; épaisseur du
film: 0,10 µm à 0,25 µm.
6.10 Capillaire en silice fondue ou en métal, désactivé, pour le transfert des fractions obtenues par CLHP
de la vanne au connecteur en T du CG; longueur: 1 m; DI: 0,1 mm.
6.11 Capillaire désactivé, du connecteur en T à la sortie de vapeur entre la précolonne et la colonne
de séparation.
6.12 Capillaire de restriction à la sortie de vapeur, désactivé; longueur: 1 m; DI: 0,05 mm.
6.13 Seringue de 100 μl, adaptée à l’injection de 5 µl à 100 µl pour la chromatographie en phase liquide.
6.14 Pipette Pasteur en verre.
NOTE L’utilisation d’embouts de pipette en plastique et de film de polyéthylène entraîne une augmentation
des niveaux de blanc.
6.15 Système de CLHP-CG-FID en ligne, composé d’un équipement de CLHP capable de réaliser un gradient
binaire, d’une vanne d’injection, d’une colonne de CLHP (6.7), d’un détecteur UV (longueur d’onde de
détection: 230 nm), de vannes de transfert pour le rinçage à circulation inversée de la colonne et le transfert
de fraction dans le CG, dudit CG avec sortie de vapeur de solvant et d’un système de commande pneumatique
et d’évaluation. Un système de commande automatique est également recommandé.
6.16 Agitateur de tube à essai avec contrôle de la température et agitation (par exemple, 500 trr/min
ou comparable).
7 Échantillon
7.1 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la présente méthode. L’échantillon ne peut être conservé que dans des
flacons en verre, en aluminium ou dans d’autres matériaux non susceptibles de libérer des hydrocarbures. Les
conditionnements en papier, polyéthylène ou polypropylène ne sont pas adaptés. Dans certains cas, des
récipients en PET ou des sachets fabriqués à partir d’un polyamide haute performance tel que le RILSAN
peuvent être utilisés. Une attention particulière doit également être portée aux fermetures et aux matériaux
d’étanchéité des récipients. Il convient d’éviter l’utilisation de crème pour les mains lors de la manipulation
des échantillons. L’échantillonnage doit être vérifié par des essais à blanc en utilisant du n-hexane au lieu d’un
échantillon.
Une méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 5555.
7.2 Préparation de l’échantillon final pour les corps gras liquides et solides
Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’ISO 661.
Les traitements spéciaux de l’échantillon pour essai (tels que la filtration et la fusion) doivent être mentionnés.
8 Modes opératoires
8.1 Généralités
Selon le type de corps gras, les échantillons doivent être préparés différemment. Les cas spécifiques A à C sont
indiqués ci-dessous:
— A: préparer les corps gras ayant une teneur inconnue ou élevée en alcanes biogènes à longue chaîne et en
[7]
composés insaturés , comme l’huile d’olive, l’huile de colza et l’huile de tournesol, ainsi que des
échantillons comparables conformément à 8.2 (distribution de l’hexane/l’éthanol). En utilisant
deux fractions distinctes de 10 ml d’extrait, appliquer le mode opératoire décrit en 8.3 (saponification) sur
la première fraction pour le dosage de la teneur en MOSH conformément à 8.4 (colonne d’oxyde
d’aluminium), puis répéter ce mode opératoire de saponification (8.3) sur la deuxième fraction pour le
dosage de la teneur en MOAH conformément à 8.5 (purification) et 8.6 (époxydation).
— B: préparer les corps gras contenant peu d’alcanes biogènes à longue chaîne et de composés insaturés
perturbateurs, tels que la graisse de coco, l’huile de lin et l’huile de palme, ainsi que des échantillons
comparables sans utiliser la purification sur colonne d’alumine, conformément à 8.2 (extraction à
l’hexane/éthanol), 8.3 (saponification), 8.5 (purification) et 8.6 (époxydation). Doser les fractions MOSH
et MOAH à partir de la solution obtenue.
— C: pour l’utilisation automatisée de la colonne d’alumine, préparer les corps gras conformément
à 8.2 (extraction à l’hexane/éthanol), 8.3 (saponification), 8.5 (purification) et 8.6 (époxydation).
Injecter dans le système de CLHP-CG-FID. Après séparation des MOSH, qui sont transférés dans
une colonne d’oxyde d’aluminium intégrée en ligne, la fraction MOAH peut être dosée au cours du même
cycle à l’aide d’un système à deux canaux.
Tout laboratoire ayant recours à des procédés automatisés doit effectuer des essais pour s’assurer que les
résultats obtenus avec ces procédés automatisés ne diffèrent pas des résultats obtenus avec un procédé
manuel.
Les échantillons inconnus ou les échantillons de mélanges d’huiles peuvent être soumis à une première
analyse sans purification à l’oxyde d’aluminium. Si la présence de n-alcanes à longue chaîne interférents a un
impact significatif sur l’enveloppe et ne permet pas une intégration correcte, l’extrait doit être réinjecté en
utilisant la colonne d’alumine pour réduire les interférences (par exemple, pour la purification à l’oxyde
d’aluminium en ligne, le même extrait d’échantillon que celui utilisé pour doser les MOAH est repris pour la
séparation ultérieure des n-alcanes à longue chaîne avec la colonne d’oxyde d’aluminium pour le dosage des
MOSH).
NOTE Seule la méthode de purification manuelle pour la fraction MOSH a été validée au cours de l’étude comparative
interlaboratoires.
8.2 Extraction à l’hexane/éthanol pour l’élimination des substances interférentes
Peser 3 g de l’échantillon de corps gras dans un tube à centrifuger de 40 ml avec bouchon à vis. Ajouter 30 ml
du mélange de n-hexane (5.3) et d’éthanol (5.29) et 20 μl d’EI1 (5.16) ou 100 μl d’EI2 (5.17), homogénéiser.
Utiliser 10 ml de la solution obtenue pour la suite du mode opératoire (8.3).
NOTE Dans le cas des corps gras, aucune séparation de phase ne se produit. Néanmoins, cette étape assure
une saponification complète des corps gras. Si nécessaire, d’autres quantités d’étalon interne peuvent être ajoutées.
8.3 Saponification
Transférer une partie aliquote de 10 ml (8.2) dans un autre tube de prélèvement et ajouter 3 ml de solution
d’hydroxyde de potassium (5.31). Saponifier la solution pendant 30 min à 60 °C dans un bain-marie tout en
agitant jusqu’à ce qu’elle devienne limpide. Refroidir, ajouter 5 ml de n-hexane (5.3) et 5 ml de mélange
d’éthanol et d’eau (une fraction volumique de 1:1), agiter à nouveau le mélange. Après séparation des phases,
transférer la phase inférieure dans un nouveau flacon et procéder à une nouvelle extraction avec 5 ml
supplémentaires de n-hexane. Combiner les deux extraits de n-hexane.
Selon la méthode de préparation de l’échantillon, poursuivre en utilisant la solution pour la séparation des n-
alcanes biogènes à longue chaîne avec de l’oxyde d’aluminium (conformément à 8.4) ou pour l’époxydation
(conformément à 8.5 et 8.6).
NOTE L’ajout d’éthanol après la saponification permet une meilleure séparation des phases et évite la formation
d’une émulsion.
8.4 Élimination des n-alcanes biogènes avec de l’oxyde d’aluminium pour le dosage de la
fraction MOSH
Procéder à un nettoyage préliminaire de la colonne d’alumine (5.24) avec 20 ml de n-hexane afin d’éliminer
les substances interférentes (voir le texte portant sur les substances interférentes ci-après). Transférer la
solution de 8.3 dans la colonne d’alumine et éluer les hydrocarbures avec 25 ml de n-hexane (5.3). Collecter
les hydrocarbures dès le transfert de l’échantillon dans la colonne. Évaporer le solvant sous vide (≥260 mbar)
à 35 °C après avoir ajouté deux gouttes de bis (2-éthylhexyle) maléate (5.26).
Dissoudre le résidu dans environ 1 ml de n-hexane, centrifuger si nécessaire et verser dans un flacon. Injecter
60 μl à 90 μl de solution pour analyse avec le système de CLHP-CG-FID afin de doser la fraction MOSH.
Les MOAH restent sur la colonne d’alumine et ne doivent pas être dosés à partir de cet éluat.
Il est recommandé d’éliminer les substances interférentes de l’alumine en rinçant préalablement la colonne
avec 20 ml de n-hexane. En revanche, il n’est pas nécessaire de procéder à un rinçage préalable de l’alumine
propre.
L’élimination des n-alcanes biogènes peut également permettre d’éliminer en même temps les cires
paraffiniques éventuellement présentes dans l’échantillon. Dans ces cas, l’analyse doit être effectuée
conformément au mode opératoire B.
NOTE Les cires paraffiniques sont caractérisées par des n-alcanes sans prédominance d’éléments ayant un nombre
impair d’atomes de carbone, tandis que les n-alcanes naturellement présents dans les huiles alimentaires présentent un
nombre d’atomes impair prédominant. À titre d’exemple, les principaux n-alcanes des huiles de tournesol sont les
alcanes C27, C29 et C31.
8.5 Purification avant époxydation pour séparer les substances polaires
Transférer les phases supérieures combinées de l’étape de saponification (8.3) dans une colonne de
purification (5.25) et recueillir les hydrocarbures élués: commencer à recueillir l’éluant immédiatement après
avoir transféré la phase supérieure de l’étape de saponification dans la colonne de purification. Procéder à
l’élution complète des hydrocarbures de la colonne avec un mélange supplémentaire de 15 ml de n-hexane et
de DCM (fraction volumique de 7 + 3) (5.30). Utiliser l’éluat pour l’époxydation (conformément à 8.6).
Il est recommandé d’éliminer les substances interférentes de la colonne de purification en rinçant
préalablement la colonne avec du n-hexane. Toutefois, il n’est pas nécessaire de procéder à un rinçage
préalable de la verrerie et des réactifs propres.
8.6 Époxydation éthanolique de la fraction MOAH pour oxyder les composés
non aromatiques insaturés
NOTE Pour plus d’informations, voir les Références [11] et [13].
Après l’ajout de deux gouttes de maléate de bis (2-éthylhexyle) (5.26) comme rétenteur, concentrer la solution
de 8.5 à 35 °C sous vide, en retenant tous les étalons internes, et compléter à un volume de 1 ml avec du n-
hexane.
À cette étape, il convient d’éliminer complètement le DCM pour garantir un fractionnement fiable dans
le système de CLHP-CG-FID.
Ajouter 1 ml de solution éthanolique de mCPBA (5.20) à l’extrait obtenu et placer l’échantillon sur un
agitateur (6.16) pendant 20 min à 40 °C, par exemple à 500 trr/min. Ajouter ensuite 500 µl d’éthanol (5.28)
et 2 ml de solution de désactivation de l’excédent de mCPBA (5.23), puis agiter le flacon pendant environ 1 min
à environ 750 trr/min pour désactiver le mCPBA en excès. Transférer la phase supérieure d’hexane dans un
nouveau flacon et sécher la solution d’hexane avec une pointe de spatule de sulfate de sodium (5.2). Injecter
90 µl de la solution séchée dans le système de CLHP-CG-FID pour le dosage des MOAH.
Facultativement, il est possible d’utiliser un volume final plus concentré, par exemple 300 µl, et un volume
d’injection correspondant, sous réserve que l’enrichissement soit amélioré et que les étalons internes soient
conservés lors de l’évaporation.
Pour la préparation des échantillons selon les modes opératoires A et B, cette solution est utilisée directement
pour le dosage des MOAH. Dans la préparation automatisée des échantillons conformément au mode
...