ISO 7899-1:1998
(Main)Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci — Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) for surface and waste water
Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci — Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) for surface and waste water
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des entérocoques intestinaux — Partie 1: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour les eaux de surface et résiduaires
La présente partie de ISO 7899 spécifie une méthode miniaturisée pour la recherche et le dénombrement des entérocoques intestinaux majeurs dans les eaux de surface et résiduaires par ensemencement en milieu liquide. La présente méthode est applicable à tous les types d'eaux de surface et résiduaires, plus particulièrement celles riches en matières en suspension. La présente méthode n'est pas applicable à l'eau potable ou tout autre type d'eau dont la valeur guide est inférieure à 15 pour 100 ml.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 7899-1
Second edition
1998-11-15
Water quality — Detection and enumeration
of intestinal enterococci in surface and
waste water —
Part 1:
Miniaturized method (Most Probable Number)
by inoculation in liquid medium
Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des entérocoques
intestinaux dans les eaux de surface et résiduaires —
Partie 1: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) par
ensemencement en milieu liquide
A
Reference number
ISO 7899-1:1998(E)
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ISO 7899-1:1998(E)
Contents
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Definitions .1
4 Principle.2
5 Apparatus .2
6 Sampling.2
7 Culture media and diluents.3
8 Procedure .4
9 Expression of results .6
10 Test report .7
11 Performance data.7
Annex A (informative) Example of software for statistical analysis of MPNs .8
Annex B (informative) Example of software for computation of MPNs .11
Annex C (informative) Synthetic sea salt.13
(informative)
Annex D Performance characteristics of the method.14
Annex E (normative) Quality criteria for manufacturing of the medium in microtitre plates .15
Annex F (normative) Preparation of calibration microtitre plates.17
Annex G (informative) Bibliography .19
© ISO 1998
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
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Printed in Switzerland
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ISO ISO 7899-1:1998(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 7899-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 4, Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 7899-1:1984), which has been technically revised.
ISO 7899 consists of the following parts, under the general title Water quality — Detection and enumeration of
intestinal enterococci in surface and waste water:
� Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid medium
� Part 2: Method by membrane filtration
Annexes E and F form an integral part of this part of ISO 7899. Annexes A, B, C, D and G are for information only.
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ISO 7899-1:1998(E) ISO
Introduction
The aim of this part of ISO 7899 is to enumerate the major intestinal enterococci, namely E. faecalis, E. faecium,
E. durans and E. hirae, which occur frequently in faeces of humans and homeothermic animals. Other faecal
Enterococcus species, namely E. avium, E. cecorum, E. columbae and E. gallinarum, and Streptococcus
bovis/equinus strains may occasionally be included, but they occur rarely in the environmental samples. Their
recovery tends to be low. Enterococcus casseliflavus and E. mundtii are non-faecal species which, when present in
water samples (e.g. because of influence of plant material and some industrial effluents), are enumerated as faecal
enterococci. These species and other rare non-faecal species tend to produce yellow pigment on a non-selective
medium. The possible interference of non-faecal Enterococcus species should therefore be considered in the
interpretation of results.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO ISO 7899-1:1998(E)
Water quality — Detection and enumeration of intestinal
enterococci in surface and waste water —
Part 1:
Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid
medium
1 Scope
This part of ISO 7899 specifies a miniaturized method for the detection and enumeration of major intestinal
enterococci in surface and waste water by inoculation in a liquid medium. The method is applicable to all types of
surface and waste waters, particularly those rich in suspended matter.
This method is not suitable for drinking water and any other type of water for which the guideline count is less than
15 per 100 ml.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this part of
ISO 7899. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision, and
parties to agreements based on this part of ISO 7899 are encouraged to investigate the possibility of applying the
most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain registers of currently valid
International Standards.
ISO 3951:1989, Sampling procedures and charts for inspection by variables for percent nonconforming.
ISO 5667-1:1980, Water quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.
ISO 5667-2:1991, Water quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.
ISO 5667-3:1994, Water quality — Sampling — Part 3: Guidance on the preservation and handling of samples.
ISO 8199:1988, Water quality — General guide to the enumeration of microorganisms by culture.
ISO/IEC Guide 2:1996, Standardization and related activities — Vocabulary.
3 Definitions
For the purposes of this part of ISO 7899, the definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following definition apply.
3.1
intestinal enterococci
microorganisms capable of aerobic growth at 44 °C and of hydrolysing the 4-methylumbelliferyl-b-D-glucoside
(MUD), in the presence of thallium acetate, nalidixic acid and 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC), in the liquid
medium specified
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ISO 7899-1:1998(E)
4 Principle
The diluted sample is inoculated in a row of microtitre plate wells containing dehydrated culture medium.
The microtitre plates are examined under ultraviolet light at 366 nm in the dark after an incubation period of between
36 h and 72 h at 44 °C æ 0,5 °C. The presence of enterococci is indicated by fluorescence resulting from the
hydrolysis of MUD. The results are given as Most Probable Number (MPN) per 100 ml.
5 Apparatus
With the exception of equipment supplied sterile, the glassware shall be sterilized in accordance with the
instructions given in ISO 8199.
Usual microbiological laboratory equipment, and in particular:
5.1 Apparatus for sterilization by dry heat (oven) or by steam (autoclave).
5.2 Thermostatic incubator, regulated at 44 °C æ 0,5 °C.
5.3 Tunnel drier or vertical laminar air flow cabinet (preferably class II).
5.4 UV observation chamber (Wood’s Lamp 366 nm).
WARNING — UV light can cause irritation of skin and eyes. Use protective gloves and glasses.
5.5 Portable refractometer (optional).
5.6 pH meter, with an accuracy of æ 0,1.
16 mm x 160 mm and 20 mm x 200 mm with similar capacity.
5.7 Test tubes, , or flasks
5.8 Adjustable or pre-set 8-channel multipipette, or any system suitable for measuring and distributing 200 μl
per well.
5.9 Sterile tips for multipipette.
5.10 Equipment for membrane filtration, in accordance with ISO 8199, including membrane filters with a
nominal pore size of 0,2 μm, for sterilization of liquid media.
5.11 Sterile microtitre plates, 96-well, 350 μl, flat-bottomed, nonfluorescent.
5.12 Sterile adhesive cover strips for sealing microtitre plates.
5.13 Sterile Petri dishes, 90 mm in diameter.
6 Sampling
Take the samples and deliver them to the laboratory in accordance with ISO 8199 and ISO 5667-1, ISO 5667-2 and
ISO 5667-3.
2
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7 Culture media and diluents
7.1 General instructions
To ensure reproducible results, prepare culture medium and diluents, using either constituents of uniform quality
and chemicals of recognized analytical or a dehydrated diluent or complete medium prepared following the
manufacturer’s instructions. Prepare them with distilled or demineralized water, free from substances capable of
inhibiting or promoting growth under the test conditions. If the media are not used immediately, preserve them in the
dark at (5 æ 3) °C, for up to one month in conditions avoiding any alterations to their composition.
NOTE The use of chemicals of other grades is permissible providing they are shown to be of equivalent performance in the
test.
7.2 Diluent
7.2.1 Special Diluent (SD)
1)
Synthetic sea salt 22,5 g
Bromophenol blue solution (optional) 10 ml
Demineralized or distilled water (7.2.2) 1000 ml
Sterilize in the autoclave (5.1) at 121 °C æ 3 °C for 15 min to 20 min.
The bromophenol blue solution is prepared by adding 0,04 g in 100 ml of 50 % ethanol. It is used only to colour the
SD blue and avoid confusing it with demineralized or distilled water.
7.2.2 Demineralized or distilled water
Water used for dilution shall be demineralized or distilled water free from substances inhibiting growth under the test
conditions.
Sterilize in the autoclave (5.1) before use at 121 °C æ 3 °C for 15 min to 20 min.
7.3 Culture medium: MUD/SF medium
7.3.1 Composition
7.3.1.1 Solution A
Tryptose 40 g
KH PO 10 g
2 4
D(+)-galactose 2 g
® 2)
Polyoxyethylenesorbitan monooleate (Tween 80 ) 1,5 ml
Demineralized or distilled water (7.2.2) 900 ml
®
Add tryptose, KH PO , galactose and Tween 80 to 900 ml of water, whilst maintaining gentle heat and magnetic
2 4
stirring, then bring to the boil until completely dissolved. Allow to cool.
1) A typical analysis of a commercially available and suitable synthetic sea salt is given in annex C. Pure NaCl solutions are
not suitable, as they lead to marked inhibition.
®
2) Tween 80 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this part of ISO 7899 and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
3
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ISO 7899-1:1998(E)
7.3.1.2 Solution B
NaHCO 4 g
3
Nalidixic acid 250 mg
Demineralized or distilled water (7.2.2) 50 ml
Add both chemicals to 50 ml of water, whilst maintaining gentle heat and magnetic stirring. Allow to cool.
7.3.1.3 Solution C
Thallium(I) acetate 2 g
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride 0,1 g
Demineralized or distilled water (7.2.2) 50 ml
Add both chemicals to 50 ml of water, whilst maintaining gentle heat and magnetic stirring. Allow to cool.
7.3.1.4 Solution D
MUD (4-methylumbelliferyl-b-D-glucoside) 150 mg
N,N-dimethylformamide 2 ml
WARNING — Thallium acetate and N,N-dimethylformamide are toxic. Use in a chemicals fume hood.
7.3.2 Preparation
Mix together solutions A+B+C+D.
Adjust the pH to 7,5 æ 0,2.
Sterilize by filtration through a membrane of average pore size 0,2 μm (5.10).
Distribute in 96-well microtitre plates (5.11) with a volume of 100 μl of media in each well (minimum capacity 350 μl)
and dehydrate immediately in a tunnel drier or laminar air-flow cabinet (5.3).
The manufacturing of the medium shall meet the quality criteria given in annex E.
8 Procedure
8.1 Choice of dilutions
The number of dilutions to inoculate varies according to the presumed level of contamination of the water to be
tested. Table 1 gives some examples.
Table 1
Measurement limits
Origin of sample No. of dilutions No. of wells /dilution
bacteria / 100 ml
64 wells to 1/2
4
Bathing water 2 15 to 3,5x10
32 wells to 1/20
24 wells to 1/2
4 24 wells to 1/20
6
Other surface water 40 to 3,2x10
24 wells to 1/200
24 wells to 1/2 000
16 wells to 1/2
8
Waste water and treatment plants 6 60 to 6,7x10
Up to 16 wells to 1/200 000
4
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8.2 Preparation of dilutions
NOTE These procedures should be performed in a biological safety cabinet, as aerosols may be created by diluting and
pipetting.
8.2.1 Fresh and brackish (waste) water [salinity < 30 g/kg, measured with refractometer (5.5) or equivalent
method]
Prepare the relevant number of sterile tubes (5.7) in a rack, according to the number of selected dilutions; add 9 ml
of the special diluent (7.2.1) to each tube.
Vigorously stir the sample (see clause 6) in order to obtain a homogeneous distribution of the microorganisms and,
using a sterile pipette, immediately transfer 9 ml of this homogenized sample to the first tube containing 9 ml of
diluent (7.2.1) (1/2 dilution).
Using a fresh pipette, transfer 1 ml of this dilution (homogenized) to the second tube (1/20 dilution).
From the second tube (dilution 1/20 carefully homogenized) proceed, if necessary, to another 1/10 dilution giving
the dilution 1/200.
Continue as above until all the dilutions have been prepared.
8.2.2 Sea water (salinity > 30 g/kg)
Prepare the relevant number of sterile tubes (5.7) in a rack, according to the number of selected dilutions, add 9 ml
of demineralized or distilled water (7.2.2) to the first tube and 9 ml of the special diluent (7.2.1) to the other tubes.
Vigorously stir the sample (see clause 6) in order to obtain a homogeneous distribution of the microorganisms and,
using a sterile pipette, immediately transfer 9 ml of this homogenized sample to the first tube containing 9 ml water
(7.2.2) (1/2 dilution).
Using a fresh sterile pipette, transfer 1 ml of this dilution (homogenized) to the second tube (1/20 dilution).
From the second tube (dilution 1/20 carefully homogenized) proceed, if necessary, to another 1/10 dilution giving
the following dilution (1/200).
Continue as above until all the dilutions have been prepared.
8.3 Inoculation and incubation of microtitre plates
8.3.1 Inoculation
Transfer the contents of the first tube of dilution to an empty, sterile Petri dish, of minimum diameter 90 mm.
Using a multichannel pipette (5.8) with 8 sterile tips (5.9), distribute 200 μl into each well of a microtitre plate (5.11)
corresponding to this first dilution.
For subsequent dilutions (1/20, 1/200, etc.) operate in an identical manner, changing the Petri dish and the row of 8
sterile tips between each dilution.
Alternatively, any other suitable system (5.8) may be used to distribute 200 μl of each dilution per well in
accordance with table 1.
CAUTION — Beware of contamination via overflow from one well to another.
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ISO
ISO 7899-1:1998(E)
8.3.2 Incubation
Once the microtitre plate is inoculated, cover with the disposable sterile adhesive tape (5.12) provided for this
purpose.
Incubate the microtitre plate (5.2) at 44 °C æ 0,5 °C for a minimum of 36 h and a maximum of 72 h.
NOTE The microtitre plates should be handled with care, without tilting.
8.4 Reading of results
Place each microtitre plate, including adhesive, in the UV observation chamber (5.4).
Consider all wells in which a blue fluorescence is observed as being positive.
NOTE The reading may be carried out any time after 36 h, as the fluorescence does not alter with time.
9 Expression of results
9.1 Determination of characteristic number
For each chosen dilution, note the number of positive (+) wells.
EXAMPLE 1 : Bathing water
1/2 32 + out of 64
1/20 5 + out of 32
Record 32/5 as characteristic number
EXAMPLE 2 : Other surface water
1/2 24 + out of 24
1/20 18 + out of 24
1/200 5 + out of 24
1/2 000 1 + out of 24
Record 18/5/1 as characteristic number
EXAMPLE 3 : Waste water
1/2 16 + out of 16
1/20 16 + out of 16
1/200 12 + out of 16
1/2 000 5 + out o
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 7899-1
Deuxième édition
1998-11-15
Qualité de l’eau — Recherche et
dénombrement des entérocoques
intestinaux dans les eaux de surface et
résiduaires —
Partie 1:
Méthode miniaturisée (nombre le plus
probable) par ensemencement en milieu
liquide
Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci in
surface and waste water —
Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid
medium
A
Numéro de référence
ISO 7899-1:1998(F)
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ISO 7899-1:1998(F)
Sommaire
Page
Domaine d’application.
1 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 2
5 Appareillage. 2
6 Échantillonnage . 3
7 Milieu de culture et diluant . 3
8 Mode opératoire. 5
9 Expression des résultats. 6
10 Rapport d’essai. 7
11 Données de performance . 7
Annexe A (informative) Exemple de logiciel pour une analyse
statistique des NPP . 8
Annexe B (informative) Exemple de logiciel en BASIC pour le
calcul des NPP . 11
Annexe C (informative) Sel de mer synthétique. 13
Annexe D (informative) Caractéristiques de performance de
la méthode . 14
Annexe E (normative) Critères de qualité pour la fabrication
du milieu en microplaques . 15
Annexe F (normative) Procédure de préparation de microplaques
d’étalonnage . 17
Annexe G (informative) Bibliographie . 19
© ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet iso@iso.ch
Imprimé en Suisse
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ISO ISO 7899-1:1998(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 7899-1 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 4, Méthodes microbiolo-
giques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 7899-1:1984), dont elle constitue une révision technique.
L’ISO 7899 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre
général Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des entérocoques
intestinaux dans les eaux de surface et résiduaires:
— Partie 1: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) par
ensemencement en milieu liquide
— Partie 2: Méthode par filtration sur membrane
Les annexes E et F font partie intégrante de la présente partie de
l'ISO 7899. Les annexes A, B, C, D et G sont données uniquement à titre
d'information.
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ISO 7899-1:1998(F) ISO
Introduction
Le but de cette partie de l’ISO 7899 est de mettre en évidence les
principaux entérocoques intestinaux, à savoir E. faecalis, E. faecium,
E. durans et E. hirae, fréquemment rencontrés dans les excréments de
l’homme et des animaux homéothermes. D’autres souches de
streptocoques fécaux, à savoir E. avium, E. cecorum, E. columbae et
E. gallinarum ainsi que Streptococcus bovis/equinus peuvent à l’occasion
être comptées, mais elles ne s’observent que rarement dans les
échantillons de l’environnement. Leur récupération tend à être faible.
Enterococcus casseliflavus et E. mundtii sont des espèces non fécales qui,
présentes dans des échantillons d’eau (à cause de matériel végétal ou
d’effluents industriels), pourront être dénombrés comme entérocoques
fécaux. Ces espèces et d’autres espèces rares non fécales tendent à
produire un pigment jaune sur un milieu non sélectif. La possible
interférence des espèces non fécales d’Enterococcus devrait par
conséquent être prise en compte dans l’interprétation des résultats.
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NORME INTERNATIONALE ISO ISO 7899-1:1998(F)
Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des entérocoques
intestinaux dans les eaux de surface et résiduaires —
Partie 1:
Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) par ensemencement
en milieu liquide
1 Domaine d’application
La présente partie de ISO 7899 spécifie une méthode miniaturisée pour la recherche et le dénombrement des
entérocoques intestinaux majeurs dans les eaux de surface et résiduaires par ensemencement en milieu liquide. La
présente méthode est applicable à tous les types d’eaux de surface et résiduaires, plus particulièrement celles
riches en matières en suspension.
La présente méthode n’est pas applicable à l’eau potable ou tout autre type d’eau dont la valeur guide est inférieure
à 15 pour 100 ml.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de l'ISO 7899. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de l'ISO 7899 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 3951:1989, Règles et tables d’échantillonnage pour les contrôles par mesures des pourcentages de non
conformes.
ISO 5667-1:1980, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 1: Guide général pour l’établissement des
programmes d’échantillonnage.
ISO 5667-2:1991, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques
d’échantillonnage.
ISO 5667-3:1994, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 3: Guide général pour la conservation et la
manipulation des échantillons.
ISO 8199:1988, Qualité de l’eau — Guide général pour le dénombrement des micro-organismes sur milieu de
culture.
ISO/CEI Guide 2:1996, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général.
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ISO 7899-1:1998(F)
3 Définitions
Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 7899, les définitions données dans le Guide 2 ISO/CEI ainsi que la
définition suivante s’appliquent.
3.1
entérocoques intestinaux
micro-organismes capables de croître en aérobiose à 44 °C et d’hydrolyser le 4-méthylumbelliferyl-b-D-glucoside
(MUD) en présence d’acétate de thallium, d’acide nalidixique et de chlorure 2,3,5-triphényl-tétrazolium (TTC) dans
le milieu liquide spécifié
4 Principe
L’échantillon dilué est ensemencé dans une série de puits d’une microplaque contenant le milieu de culture
déshydraté.
Les microplaques sont examinées sous rayonnement ultraviolet à 366 nm dans l’obscurité après une période
d’incubation de 36 h minimum et 72 h maximum à 44 °C – 0,5 °C. La présence d’entérocoques est indiquée par une
fluorescence résultant de l’hydrolyse du MUD. Les résultats sont donnés en nombre le plus probable (NPP) par
100 ml.
5 Appareillage
À l’exclusion du matériel livré stérile, la verrerie doit être stérilisée conformément aux instructions données dans
l’ISO 8199.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Appareillage pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave).
5.2 Étuve thermostatée, réglée à 44 °C æ 0,5 °C.
5.3 Tunnel de séchage ou hotte à flux laminaire vertical (de préférence de classe II).
5.4 Chambre d’observation UV (lampe de Wood, 366 nm).
AVERTISSEMENT — La lumière UV cause une irritation des yeux et de la peau. Utiliser des lunettes et
gants de protection.
5.5 Réfractomètre portable (optionnel).
5.6 pH-mètre, ayant une précision de æ 0,1.
5.7 Tubes à essai, de dimensions 16 mm × 160 mm et 20 mm × 200 mm, ou fioles de capacités similaires.
5.8 Multipipette à 8 canaux, réglable ou préréglée, ou tout système convenable pour mesurer et distribuer 200 μl
par puits.
5.9 Cônes stériles pour multipipette.
5.10 Matériel pour filtration sur membrane, conformément à l’ISO 8199, y compris filtres à membrane ayant une
porosité nominale de 0,2 μm, pour la stérilisation de liquides.
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ISO 7899-1:1998(F)
5.11 Microplaques stériles, à 96 puits de 350 μl, à fond plat, non fluorescentes.
5.12 Bandes adhésives stériles pour la fermeture des microplaques.
5.13 Boîtes de Petri stériles, de diamètre 90 mm.
6 Échantillonnage
Prélever les échantillons et les livrer au laboratoire conformément à l’ISO 8199 ainsi qu’à l’ISO 5667-1, l’ISO 5667-2
et l’ISO 5667-3.
7 Milieu de culture et diluant
7.1 Prescriptions générales
Pour garantir des résultats reproductibles, préparer le milieu de culture et les diluants à l’aide soit de constituants de
qualité uniforme et de produits chimiques de qualité analytique reconnue, soit d’un diluant déshydraté ou d’un milieu
complet déshydraté, préparés conformément aux instructions du fabricant. Les préparer avec de l’eau
déminéralisée ou distillée exempte de substances pouvant inhiber la croissance dans les conditions de l’essai. Si
les milieux ne sont pas utilisés immédiatement, les conserver dans l’obscurité à (5 æ 3) °C pour une période
inférieure à 1 mois et dans des conditions évitant toute modification de leur composition.
NOTE L’utilisation de produits chimiques d’autres qualités est permise, sous reserve de demontrer qu’ils ont une
performance équivalente pour l’essai.
7.2 Diluants
7.2.1 Diluant spécial (DS)
Composition:
1)
Sel marin synthétique 22,5 g
Solution de bleu de bromophénol (optionnel) 10 ml
Eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) 1000 ml
Stériliser à l’autoclave (5.1) à 121 °C æ 3 °C pendant 15 min à 20 min.
La solution de bleu de bromophénol est préparée en ajoutant 0,04 g dans 100 ml d’éthanol à 50 %. Elle est utilisée
pour colorer le DS en bleu et éviter de le confondre avec l’eau déminéralisée ou distillée.
7.2.2 Eau déminéralisée ou distillée, exempte de substances inhibant la croissance dans les conditions de
l’essai.
Stériliser à l’autoclave (5.1) à 121 °C æ 3 °C pendant 20 min.
1) Une analyse type d’un sel de mer synthétique convenable et disponible dans le commerce est donnée dans l’annexe C.
Des solutions de NaCl pur ne conviennent pas, car elles entraînent une inhibition prononcée.
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7.3 Milieu de culture: milieu MUD/SF
7.3.1 Composition
7.3.1.1 Solution A
Tryptose 40 g
KH PO 10 g
2 4
D(1)-galactose 2 g
®
2)
Polyoxyéthylènesorbitane monooléate (Tween 80 ) 1,5 ml
Eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) 900 ml
®
À 900 ml d’eau, ajouter tryptose, KH PO , galactose et Tween 80, tout en maintenant un chauffage doux et une
2 4
agitation magnétique, puis porter à ébullition jusqu’à dissolution complète. Laisser refroidir.
7.3.1.2 Solution B
NaHCO 4 g
3
Acide nalidixique 250 mg
Eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) 50 ml
Ajouter les deux composants à 50 ml d’eau, tout en maintenant un chauffage doux et une agitation magnétique.
Laisser refroidir.
7.3.1.3 Solution C
Acétate de thallium (I)2 g
Chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium 0,1 g
Eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) 50 ml
Ajouter les deux composants à 50 ml d’eau distillée, tout en maintenant un chauffage doux et une agitation
magnétique. Laisser refroidir.
7.3.1.4 Solution D
MUD (4-méthylumbelliféryl-b-D-glucoside) 150 mg
N,N-diméthylformamide 2 ml
AVERTISSEMENT — L’acétate de thallium et le N,N-diméthylformamide sont toxiques. Utiliser sous une
hotte d’aspiration de vapeurs chimiques.
7.3.2 Préparation
Mélanger les solutions A1B1C1D.
Ajuster le pH à 7,5 æ 0,2.
Stériliser par filtration sur membrane de porosité moyenne de 0,2 μm (5.10).
Répartir en microplaques de 96 puits (5.11) à raison de 100 μl de milieu par puits (capacité minimale de 350 μl) et
déshydrater immédiatement sous tunnel de séchage ou hotte à flux laminaire (5.3).
La fabrication du milieu doit respecter les critères de qualité donnés à l’annexe E.
®
2) Tween 80 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs de la présente partie de l’ISO 7899 et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du
produit ainsi désigné.
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8 Mode opératoire
8.1 Choix des dilutions
Le nombre de dilutions à ensemencer varie en fonction du niveau de contamination présumé de l’eau à analyser.
Le tableau 1 donne quelques exemples.
Tableau 1
Plage de mesure,
Origine de l’échantillon Nombre de dilutions Nombre de puits/dilution
bactéries par 100 ml
64 puits au 1/2
4
Eaux de baignade 2 15 à 3,5 × 10
32 puits au 1/20
24 puits au 1/2
24 puits au 1/20
6
Autres eaux de surface 4 40 à 3,2 × 10
24 puits au 1/200
24 puits au 1/2 000
Eaux résiduaires et stations 16 puits au 1/2
8
6 60 à 6,7 × 10
d’épuration jusqu’à 16 puits au 1/200 000
8.2 Préparation des dilutions
NOTE Il est recommandé d’utiliser ces modes opératoires dans un poste de sécurité biologique, la dilution et le pipettage
pouvant produire des aérosols.
8.2.1 Eaux douces et eaux saumâtres (usées) [salinité , 30 g/kg, mesurée à l’aide d’un réfractomètre (5.5) ou
de méthodes équivalentes]
Préparer, sur un portoir, le nombre de tubes stériles (5.7) correspondant au nombre de dilutions choisies. Introduire
dans chacun d’eux 9 ml de diluant spécial (7.2.1).
Agiter vigoureusement l’échantillon (voir l’article 6) afin d’obtenir une répartition homogène des micro-organismes et
transférer immédiatement, à l’aide d’une pipette stérile, 9 ml de cet échantillon homogénéisé dans le premier des
tubes contenant 9 ml de diluant (7.2.1) (dilution 1/2).
Avec une nouvelle pipette, transférer 1 ml de cette dilution (homogénéisée) dans le deuxième tube (dilution 1/20).
À partir du deuxième tube (dilution 1/20 soigneusement homogénéisée), procéder, si nécessaire, à une autre
dilution à 1/10 afin d’obtenir la dilution suivante (1/200).
Continuer ainsi jusqu’à ce que toutes les dilutions aient été préparées.
8.2.2 Eaux de mer (salinité > 30 g/kg)
Préparer, sur un portoir, le nombre de tubes stériles (5.7) correspondant au nombre de dilutions choisies. Introduire
dans le premier tube 9 ml d’eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) et dans les suivants 9 ml de diluant spécial (7.2.1).
Agiter vigoureusement l’échantillon (voir l’article 6) afin d’obtenir une répartition homogène des micro-organismes et
transférer immédiatement, à l’aide d’une pipette stérile, 9 ml de cet échantillon homogénéisé dans le premier des
tubes contenant 9 ml de diluant (7.2.2) (dilution 1/2).
Avec une nouvelle pipette stérile, transférer 1 ml de cette dilution (homogénéisée) dans le deuxième tube (dilution
1/20).
À partir du deuxième tube (dilution 1/20 soigneusement homogénéisée), procéder, si nécessaire, à une autre
dilution au 1/10 afin d’obtenir la dilution suivante (1/200).
Continuer ainsi jusqu’à ce que toutes les dilutions aient été préparées.
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8.3 Ensemencement et incubation des microplaques
8.3.1 Ensemencement
Transférer le contenu du premier tube de dilution dans une boîte de Petri vide, stérile, de diamètre d’au moins
90 mm.
À l’aide de la pipette multicanaux (5.8) munie de huit cônes stériles (5.9), répartir 200 μl dans chacun des puits de
la microplaque (5.11) correspondant à cette première dilution.
Pour chacune des dilutions suivantes (1/20, 1/200, etc.), opérer de manière identique en changeant la boîte de Petri
et la rangée de huit cônes stériles entre chaque dilution.
De façon équivalente, tout autre système convenable (5.8) peut être utilisé pour répartir 200 μl de chaque dilution
par puits, selon le tableau 1.
ATTENTION — Éviter les contaminations par débordement d’un puits à l’autre.
8.3.2 Incubation
Une fois la microplaque ensemencée, la recouvrir d’une bande adhésive stérile (5.12) à usage unique, prévue à cet
effet.
Incuber la microplaque à l’étuve (5.2) à 44 °C æ 0,5 °C pendant au minimum 36 h et au maximum 72 h.
NOTE Il convient de manipuler les microplaques avec précaution, sans les pencher.
8.4 Lecture des résultats
Placer chaque microplaque, recouverte d’une bande adhésive, dans la chambre d’observation UV (5.4).
Considérer comme positifs les puits dans lesquels on observe une fluorescence bleue.
NOTE La fluorescence n’évoluant pas avec le temps, la lecture peut être effectuée à tout moment après 36 h.
9 Expression des résultats
9.1 Détermination du nombre caractéristique
Pour chacune des dilutions choisies, noter le nombre de puits positifs (+).
Lorsque trois dilutions ou plus ont été ensemencées, un nombre caractéristique de 3 chiffres, le dernier étant 0 si
possible, doit être consigné conformément à l’ISO 8199.
EXEMPLE 1: Eau de baignade
1/2 32 (1) sur 64
1/20 5 (1) sur 32
Consigner 32/5 comme étant le nombre caractéristique.
EXEMPLE 2: Autres eaux de surface
1/2 24 (1) sur 24
1/20 18 (1) sur 24
1/200 5 (1) su
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.