ISO 22579:2020

Infant formula and adult nutritionals -- Determination of fructans -- High performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) after enzymatic treatment

This document specifies a method for the determination of inulin-type fructans (including oligofructose, fructooligosaccharides) in infant formula and adult nutritionals (both powder and liquid) containing 0,03 g/100 g to 5,0 g/100 g of fructans in the product as prepared ready for consumption. The method has been validated in a multi laboratory study[1] with reconstituted standard reference material (SRM), infant/adult nutritional formula at a level of 0,204 g/100 g, adult nutritionals ready-to-feed (RTF) at levels of 1,28 g/100 g and 2,67 g/100 g, infant formula RTF at a level of 0,300 g/100 g, reconstituted follow-up formula at levels of 0,209 g/100 g to 0,275 g/100 g, reconstituted infant formula at levels from 0,030 8 g/100 g to 0,264 g/100 g. During the single laboratory validation study[2], spike-recovery experiments were performed up to 5 g/100 g in reconstituted infant formula powders (milk-based, partially hydrolysed milk-based and soy-based), adult nutritional RTF and reconstituted adult nutritional powders.

Préparations pour nourrissons et produits nutritionnels pour adultes -- Dosage des fructanes -- Chromatographie échangeuse d'anions haute performance couplée à la détection par ampérométrie pulsée (CEAHP-DAP) après traitement enzymatique

Le présent document spécifie une méthode de dosage des fructanes de type inuline (tels que l'oligofructose, les fructo-oligosaccharides) dans les formules pour nourrissons et les produits nutritionnels pour adultes (en poudre ou liquides) contenant 0,03 g/100 g ŕ 5,0 g/100 g de fructanes dans le produit préparé sous une forme pręte ŕ la consommation. La méthode a été validée lors d'une étude interlaboratoires[1] avec un matériau de référence standard (SRM) reconstitué de type préparation nutritionnelle pour nourrissons/adultes ŕ une concentration de 0,204 g/100 g, produits nutritionnels pręts ŕ l'emploi (RTF) pour adultes ŕ des concentrations de 1,28 g/100 g et 2,67 g/100 g, préparation RTF pour nourrissons ŕ une concentration de 0,300 g/100 g, préparation de suite reconstituée ŕ des concentrations de 0,209 g/100 g ŕ 0,275 g/100 g, préparation reconstituée pour nourrissons ŕ des concentrations de 8 g/100 g ŕ 0,264 g/100 g. Pendant l'étude de validation intralaboratoire[2], des essais de recouvrement ont été menés jusqu'ŕ 5 g/100 g dans les préparations en poudre reconstituées pour nourrissons (ŕ base de lait, de lait partiellement hydrolysé et de soja), le produit nutritionnel RTF et les produits nutritionnels reconstitués pour adultes.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 09-Sep-2020
• ICS: 67.050 - General methods of tests and analysis for food products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 5060 - Close of voting Proof returned by Secretariat
• Start Date: 17-Aug-2020
• Completion Date: 17-Aug-2020

Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22579
IDF 241
First edition
2020-09
Infant formula and adult
nutritionals — Determination of
fructans — High performance anion
exchange chromatography with pulsed
amperometric detection (HPAEC-PAD)
after enzymatic treatment
Préparations pour nourrissons et produits nutritionnels pour
adultes — Dosage des fructanes — Chromatographie échangeuse
d'anions haute performance couplée à la détection par ampérométrie
pulsée (CEAHP-DAP) après traitement enzymatique
Reference numbers
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)
ISO and IDF 2020
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO and IDF 2020

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office International Dairy Federation
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B
CH-1214 Vernier, Geneva B-1030 Brussels
Phone: [phone] Phone: [phone]
Fax: [phone]
Email: [e-mail] Email: [e-mail]
Website: www.iso.org Website: www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii © ISO and IDF 2020 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Chemicals and reagents ................................................................................................................................................................................ 2

5.1 List of chemicals and reagents .................................................................................................................................................. 2

5.2 Preparation of reagents ................................................................................................................................................................... 3

5.3 Preparation of mobile phases using column A (6.13.1) or equivalent.................................................... 5

5.4 Preparation of mobile phases using columns B (6.13.2) or equivalent ................................................. 5

5.5 Preparation of standard solutions ......................................................................................................................................... 6

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 6

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 8

7.1 Sample preparation ............................................................................................................................................................................ 8

7.1.1 Powdered or concentrated products on a ready-to feed (RTF) basis and

powder products inhomogeneous at the subgram level ............................................................... 8

7.1.2 Reconstituted products as prepared in 7.1.1 or products sold as RTF ............................. 8

7.1.3 Homogeneous powdered products without prior reconstitution ........................................ 8

7.1.4 Dilution..................................................................................................................................................................................... 8

7.1.5 Hydrolysis of sucrose and α-glucans .............................................................................................................. 8

7.1.6 Carrez clarification (optional, use in case of difficulties passing sample

through SPE) ...................................................................................................................................................................... 8

7.1.7 Removal of monosaccharides ............................................................................................................................... 9

7.1.8 Hydrolysis of fructans .................. ......................................................................................................................... ....... 9

7.2 Chromatographic conditions using column A (6.13.1) ........................................................................................ 9

7.3 Chromatographic conditions using columns B (6.13.2) ...................................................................................10

7.4 System suitability test ....................................................................................................................................................................11

7.5 Calibration ...............................................................................................................................................................................................11

8 Calculation ...............................................................................................................................................................................................................11

9 Reporting ...................................................................................................................................................................................................................13

10 Precision data .......................................................................................................................................................................................................13

10.1 General ........................................................................................................................................................................................................13

10.2 Repeatability ..........................................................................................................................................................................................13

10.3 Reproducibility ....................................................................................................................................................................................13

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................14

Annex A (informative) Example chromatograms and calibration curves ...................................................................15

Annex B (informative) Precision data ..............................................................................................................................................................18

Annex C (informative) Check test enzyme mixture of sucrase, β-amylase, pullulanase and

maltase.........................................................................................................................................................................................................................19

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................22

© ISO and IDF 2020 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national

standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally

carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which

a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.

International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part

in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all

matters of electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee

SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with

AOAC INTERNATIONAL, and in collaboration with the European Committee for Standardization

(CEN) Technical Committee CEN/TC 302, Milk and milk products — Methods of sampling and analysis, in

accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).

It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC INTERNATIONAL. The method

described in this document is equivalent to the AOAC Official Method 2016.14: Fructans in Infant

Formula and Adult Nutrition.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO and IDF 2020 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)

IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the

interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National

Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national

interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and

governments/food control authorities.

ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis

and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International

Standards using the logos and reference numbers of both organizations.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Composition and

ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is

being published jointly by ISO and IDF.

The work was carried out by the IDF-ISO Action Team on C41 of the Standing Committee on Analytical

Methods for Composition under the aegis of its project leader Mr S. Austin (CH).
© ISO and IDF 2020 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 241:2020(E)
Infant formula and adult nutritionals — Determination
of fructans — High performance anion exchange
chromatography with pulsed amperometric detection
(HPAEC-PAD) after enzymatic treatment

WARNING — The method described in this document employs corrosive (sodium hydroxide,

acetic acid) and toxic (sodium azide) chemicals. Refer to the materials safety data sheets and

take appropriate additional safety precautions for handling and waste disposal.
1 Scope

This document specifies a method for the determination of inulin-type fructans (including oligofructose,

fructooligosaccharides) in infant formula and adult nutritionals (both powder and liquid) containing

0,03 g/100 g to 5,0 g/100 g of fructans in the product as prepared ready for consumption.

[1]

The method has been validated in a multi laboratory study with reconstituted standard reference

material (SRM), infant/adult nutritional formula at a level of 0,204 g/100 g, adult nutritionals ready-

to-feed (RTF) at levels of 1,28 g/100 g and 2,67 g/100 g, infant formula RTF at a level of 0,300 g/100 g,

reconstituted follow-up formula at levels of 0,209 g/100 g to 0,275 g/100 g, reconstituted infant formula

[2]

at levels from 0,030 8 g/100 g to 0,264 g/100 g. During the single laboratory validation study , spike-

recovery experiments were performed up to 5 g/100 g in reconstituted infant formula powders (milk-

based, partially hydrolysed milk-based and soy-based), adult nutritional RTF and reconstituted adult

nutritional powders.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
adult nutritional

nutritionally complete, specially formulated food, consumed in liquid form, which may constitute the

sole source of nourishment, made from any combination of milk, soy, rice, whey, hydrolysed protein,

starch and amino acids, with or without intact protein
3.2
infant formula

breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of

infants during the first months of life up to the introduction of appropriate complementary feeding

[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
© ISO and IDF 2020 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)
3.3
follow-up formula

food intended for use as a liquid part of the weaning diet for an infant from the age of six months, and

for young children up to the age of three years
Note 1 to entry: Follow-up formula includes child formula and toddler formula.
[SOURCE: Codex Standard 156-1987]
4 Principle

Samples are reconstituted in water (if required) and further diluted until the concentration of fructans

in solution is such that after hydrolysis the fructose and glucose concentration will be within the

range covered by the standard curve. The diluted sample is treated with a mixture of a highly specific

sucrase and α-glucanases to hydrolyse sucrose and α-glucooligosaccharides to their constituent

monosaccharides. The sample is passed through a solid phase extraction (SPE) column packed with

graphitized carbon. Salts and monosaccharides pass through and are washed away, while the fructans

are retained. Fructans are released from the column using an acetonitrile solution. The released

fructans are hydrolysed with a fructanase mixture, and the released glucose and fructose are analysed

by high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-

PAD). The fructan content is calculated by summing the glucose and 0,9 times the fructose contents

measured. In some matrices, a blank correction may be necessary and can be applied.

5 Chemicals and reagents
5.1 List of chemicals and reagents

Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified. Solvents shall be of quality

for HPLC analysis, unless otherwise specified.
5.1.1 Deionized water, purified with resistivity ≥ 18 MΩ.
5.1.2 Maleic acid, purity ≥ 99,0 %.
5.1.3 Acetonitrile.
5.1.4 Acetic acid, glacial 100 %, anhydrous.
5.1.5 Potassium hexacyanoferrate(II)trihydrate, optional.
5.1.6 Zinc acetate, optional.
5.1.7 Trifluoroacetic acid (TFA).
5.1.8 Hydrochloric acid, substance concentration c = 1 mol/l.

5.1.9 Sodium acetate anhydrous, purity ≥ 99,0 %, only when using columns B (6.13.2) for HPAEC-PAD.

5.1.10 Sodium hydroxide solution, a mass fraction of 50 %.
5.1.11 Sodium hydroxide pellets.
5.1.12 Sodium chloride.
2 © ISO and IDF 2020 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)
5.1.13 Sodium azide, optional.
5.1.14 D-(-)-fructose, purity ≥ 99,0 % (dry weight basis).
5.1.15 D-(+)-glucose, purity ≥ 99,5 % (dry weight basis).
5.1.16 N,N′-diacetylchitobiose, purity > 90 %.

5.1.17 Mixture of highly purified sucrase, β-amylase, pullulanase and maltase, from Fructan Assay

Kit K-FRUC (Megazyme International Ireland Ltd or equivalent). 200 µl of enzyme mixture working

solution (5.2.10) should be able to completely hydrolyse 2 mg of sucrose under the conditions described

in the method (90 min at 40 °C) without hydrolysing any fructans.

5.1.18 Mixture of highly purified recombinant exo- and endo-inulinases and recombinant endo-

levanase, from Fructan Assay Kit K-FRUC (Megazyme International Ireland Ltd or equivalent). 100 µl

of enzyme mixture working solution (5.2.11) should be able to hydrolyse 70 µg of fructans under the

conditions described in the method (40 min at 40 °C).
5.2 Preparation of reagents
5.2.1 Sodium hydroxide solution, c = 2 mol/l.

Dissolve 40 g ± 1 g of sodium hydroxide pellets in 250 ml of deionized water in a 500 ml volumetric

flask. After cooling down to room temperature, make up to the mark with deionized water and mix

well. This solution is stable for six months at room temperature.
5.2.2 Sodium maleate buffer solution, c = 0,100 mol/l, pH = 6,5.

Into a large beaker (>500 ml), weigh 5,8 g of maleic acid and dissolve with 450 ml of deionized water

using a magnetic stirrer. Adjust to pH = 6,5 with sodium hydroxide solution (5.2.1). Transfer the solution

to a 500 ml volumetric flask and make up to the mark with deionized water. This solution is stable for

three months at 4 °C.
5.2.3 Sodium acetate buffer solution, c = 0,100 mol/l, pH = 4,5.

Into a large beaker (>500 ml) containing 450 ml of deionized water, pipette 2,9 ml of glacial acetic acid.

Adjust to pH = 4,5 with sodium hydroxide solution (5.2.1). Transfer the solution to a 500 ml volumetric

flask and make up to the mark with deionized water. This solution is stable for three months at 4 °C.

5.2.4 N,N′diacetylchitobiose internal standard solution, mass concentration ρ = 600 µg/ml.

Into a 25 ml volumetric flask, weigh 15 mg of N,N′diacetylchitobiose and make up to the mark with

deionized water. This solution is stable for one year at −20 °C.
5.2.5 Glucose stock solution, ρ = 5 mg/ml.

Into a 25 ml volumetric flask, weigh 125 mg of glucose and make up to the mark with deionized water.

This solution is stable for one year at −20 °C.

1) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience

of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the product named. Equivalent

products may be used if they can be shown to lead to the same results.
© ISO and IDF 2020 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)
5.2.6 Fructose stock solution, ρ = 10 mg/ml.

Into a 25 ml volumetric flask, weigh 250 mg of fructose and make up to the mark with deionized water.

This solution is stable for one year at −20 °C.
5.2.7 Carrez I solution

Dissolve 10,6 g of potassium hexacyanoferrate(II)trihydrate in 100 ml of deionized water and store in a

brown bottle. This solution is stable for six months at room temperature (optional reagent).

5.2.8 Carrez II solution

In a 100 ml volumetric flask, dissolve 22,0 g of zinc acetate in 90 ml of deionized water and add 2,9 ml

of glacial acetic acid. Make up to the mark with deionized water and homogenize. This solution is stable

for six months at room temperature (optional reagent).
5.2.9 Sodium azide solution, ρ = 5 g/l.
Dissolve 1 g of sodium azide in 200 ml of deionized water (optional reagent).
5.2.10 Mixture of sucrase, β-amylase, pullulanase and maltase solution.

Dissolve the contents of the bottle containing freeze-dried powdered sucrase, β-amylase, pullulanase

and maltase in 22,0 ml of sodium maleate buffer solution (5.2.2). Mix well and divide into aliquots of

2 ml each and store frozen at −20 °C in polypropylene tubes until use. This solution is stable for five

years at −20 °C.

IMPORTANT — For the development and validation of this method, a commercially available

pre-prepared enzyme mixture from Megazyme (5.1.17) was used. When enzymes from

another source are used, the buffer composition (type, concentration and pH) may need to be

adapted to the recommendations of the supplier. It is also imperative to ensure the enzyme

mixture employed will completely hydrolyse any sucrose in the product without hydrolysing

the fructan. This can be checked by performing an analysis with sucrose as an analyte and

with a pure fructan as an analyte. No fructan should be measured when sucrose is analysed,

and more than 90 % recovery should be achieved when a fructan of known purity is analysed

(recommended to check using both long-chain inulin and short-chain fructooligosaccharides).

An alternative test for checking the suitability and performance of the enzyme mixture is

described in Annex C.
5.2.11 Fructanase solution (exo-/endo-inulinases and endo-levanase).

Dissolve the contents of the bottle containing freeze-dried powdered exo- and endo-inulinases and

endo-levanase in 22,0 ml of sodium acetate buffer solution (5.2.3). Mix well and divide into aliquots

of 2 ml each and store frozen at −20 °C in polypropylene tubes until use. This solution is stable for five

years at −20 °C.

IMPORTANT — For the development and validation of this method, a commercially available

pre-prepared enzyme mixture from Megazyme (5.1.18) was used. When enzymes from another

source are used, buffer composition (type, concentration and pH) may need to be adapted to the

recommendations of the supplier. It is also imperative to ensure the enzyme mixture employed

will completely hydrolyse the fructan without hydrolysing any other glucose or fructose

containing oligo- or polysaccharide that may be present after treatment with the sucrase

mixture above. This can be checked by performing an analysis with a pure fructan as an analyte.

More than 90 % recovery should be achieved when a fructan of known purity is measured.

2) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience

of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the product named. Equivalent

products may be used if they can be shown to lead to the same results.
4 © ISO and IDF 2020 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)

5.2.12 Wash solution for graphitized carbon solid phase extraction (SPE) column, TFA 0,1 % in

acetonitrile, a volume fraction of 80 %.

Into a 100 ml volumetric flask, add 80 ml of acetonitrile and 100 μl of TFA. Make up to the mark with

deionized water. This solution is stable for six months at room temperature.
5.2.13 Sodium chloride solution, c = 1 mol/l, for graphitized carbon SPE column.

Into a 100 ml volumetric flask, weigh 5,8 g of sodium chloride and dissolve with 90 ml of deionized water.

Make up to the mark with deionized water. This solution is stable for six months at room temperature.

5.2.14 Elute solution for graphitized carbon SPE column, TFA 0,05 % in acetonitrile, a volume

fraction of 25 %.

Into a 100 ml volumetric flask, add 25 ml of acetonitrile and 50 μl of TFA. Make up to the mark with

deionized water. This solution is stable for six months at room temperature.
5.3 Preparation of mobile phases using column A (6.13.1) or equivalent
If using columns B (6.13.2), skip this clause and go directly to 5.4.

5.3.1 Eluent A for column A (6.13.1), sodium hydroxide solution, c = 0,600 mol/l.

Into an eluent bottle, introduce 970 ml of deionized water and degas with helium for 20 min. Add

31,2 ml of sodium hydroxide solution (5.1.10) (using a single-use plastic pipette). Degas with helium for

20 min and protect the eluent from exposure to carbon dioxide until, and during, use by suitable means

(e.g. by keeping under a blanket of helium). This solution is stable for one week at room temperature.

5.3.2 Eluent B for column A (6.13.1), deionised water with resistivity ≥ 18 MΩ.

Into an eluent bottle, introduce 2 000 ml of deionized water (5.1.1) and degas with helium for 20 min.

Protect the eluent from exposure to carbon dioxide until, and during, use by suitable means (e.g. by

keeping under a blanket of helium). This is solution is stable for four days at room temperature.

5.3.3 Eluent C for column A (6.13.1), sodium hydroxide solution, c = 0,030 mol/l.

Into an eluent bottle, introduce 1 000 ml of deionized water and degas with helium for 20 min. Add

1,6 ml of sodium hydroxide solution (5.1.10) (using a single-use plastic pipette). Degas with helium for

20 min and protect the eluent from exposure to carbon dioxide until, and during, use by suitable means

(e.g. by keeping under a blanket of helium). This solution is stable for one week at room temperature.

5.3.4 Post-column addition reagent, sodium hydroxide, c = 0,300 mol/l.

Into an eluent bottle, introduce 985 ml of deionized water and add 15,6 ml of sodium hydroxide solution

(5.1.10) (using a single-use plastic pipette). Swirl the solution gently to mix. Degas with helium for

20 min. This solution is stable for one month at room temperature. Degas on the day of use.

5.4 Preparation of mobile phases using columns B (6.13.2) or equivalent
If using column A (6.13.1), skip this clause.

5.4.1 Eluent A for columns B (6.13.2), sodium hydroxide solution, c = 0,200 mol/l.

Weigh 1 923 g ± 2 g of deionized water into an eluent bottle and degas with helium for 20 min. Add

20 ml of sodium hydroxide solution (5.1.10) (using a single-use plastic pipette). Degas with helium for

20 min and protect the eluent from exposure to carbon dioxide until, and during, use by suitable means

(e.g. by keeping under a blanket of helium). This solution is stable for one week at room temperature.

© ISO and IDF 2020 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 22579:2020(E)
IDF 241:2020(E)
5.4.2 Eluent B for columns B (6.13.2), deionized water with resistivity ≥ 18 MΩ.

Fill a 2 l eluent bottle with 2 000 ml of deionized water. Degas with helium for 20 min and protect the

eluent from exposure to carbon dioxide until, and during, use by suitable means (e.g. by keeping under

a blanket of helium). This solution is stable for four days.

Optionally, 5 g/l sodium azide solution (5.2.9) can be added to a final concentration of 0,125 g/l to mobile

phase B. This extends the shelf life of eluent to about two weeks and can improve chromatographic

resolution around chitobiose in case of problems.
5.4.3 Eluent C for columns B (6.13.2), sodium acetate solution, c = 1 mol/l.

Into a 1 000 ml volumetric flask, weigh 82,0 g of anhydrous sodium acetate (5.1.9) and dissolve with

800 ml of deionized water by mixing. Make up to the mark with deionized water and filter on a 0,20 µm

nylon membrane filter into an eluent bottle. Degas with helium for 20 min and protect the eluent from

exposure to carbon dioxide until, and during, use by suitable means (e.g. by keeping under a blanket of

helium). This solution is stable for one week at room te
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 22579
FIL 241
Première édition
2020-09
Préparations pour nourrissons
et produits nutritionnels pour
adultes — Dosage des fructanes
— Chromatographie échangeuse
d'anions haute performance couplée
à la détection par ampérométrie
pulsée (CEAHP-DAP) après traitement
enzymatique
Infant formula and adult nutritionals — Determination of fructans
— High performance anion exchange chromatography with pulsed
amperometric detection (HPAEC-PAD) after enzymatic treatment
Numéros de référence
ISO 22579:2020(F)
FIL 241:2020(F)
ISO et FIL 2020
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22579:2020(F)
FIL 241:2020(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2020

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B
CH-1214 Vernier, Genève B-1030 Brussels
Tél.: [phone] Tél.: + 32 2 325 67 40
Fax: + 32 2 325 67 41
E-mail: [e-mail] E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org Web: www.fil-idf.org
Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22579:2020(F)
FIL 241:2020(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Produits chimiques et réactifs ............................................................................................................................................................... 2

5.1 Liste des produits chimiques et réactifs ........................................................................................................................... 2

5.2 Préparation des réactifs .................................................................................................................................................................. 3

5.3 Préparation des phases mobiles à l’aide de la colonne A (6.13.1) ou d’une colonne

équivalente ................................................................................................................................................................................................. 5

5.4 Préparation des phases mobiles à l’aide des colonnes B (6.13.2) ou de colonnes

équivalentes ............................................................................................................................................................................................... 6

5.5 Préparation des solutions étalons .......................................................................................................................................... 7

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 7

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 8

7.1 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 8

7.1.1 Produits en poudre ou concentrés prêts à l’emploi (RTF) et produits en

poudre non homogènes au niveau du sous-gramme ........................................................................ 8

7.1.2 Produits reconstitués préparés comme en 7.1.1 ou produits

commercialisés sous une forme RTF .............................................................................................................. 8

7.1.3 Produits en poudre homogènes sans reconstitution préalable .............................................. 9

7.1.4 Dilution..................................................................................................................................................................................... 9

7.1.5 Hydrolyse du saccharose et des α-glucanes ............................................................................................. 9

7.1.6 Clarification de Carrez (en option, utiliser en cas de difficultés à faire

passer l’échantillon à travers la SPE) ............................................................................................................. 9

7.1.7 Élimination des monosaccharides .................................................................................................................... 9

7.1.8 Hydrolyse des fructanes .........................................................................................................................................10

7.2 Conditions chromatographiques en cas d’utilisation de la colonne A (6.13.1) ............................10

7.3 Conditions chromatographiques en cas d’utilisation de colonnes B (6.13.2) ...............................11

7.4 Essai d’applicabilité du système ...........................................................................................................................................11

7.5 Étalonnage ...............................................................................................................................................................................................12

8 Calcul .............................................................................................................................................................................................................................12

9 Compte-rendu .......................................................................................................................................................................................................13

10 Données de fidélité .........................................................................................................................................................................................14

10.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................14

10.2 Répétabilité .............................................................................................................................................................................................14

10.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................................................................14

11 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................15

Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes et de courbes d’étalonnage ................................16

Annexe B (informative) Données de fidélité ..............................................................................................................................................19

Annexe C (informative) Essai de contrôle du mélange d’enzymes sucrase, β-amylase,

pullulanase et maltase.................................................................................................................................................................................20

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................23

© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22579:2020(F)
FIL 241:2020(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 5, Lait et produit laitiers, et par la Fédération internationale du lait (FIL), en collaboration

avec l’AOAC INTERNATIONAL, et en collaboration avec le comité technique CEN/TC 302, Lait et

produits laitiers — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, du Comité européen de normalisation (CEN)

conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Il est publié

conjointement par l’ISO et la FIL, et séparément, par l’AOAC INTERNATIONAL. La méthode décrite

dans le présent document est l’équivalent de la méthode officielle de l’AOAC 2016.14: Fructanes dans les

préparations pour nourrissons et les produits nutritionnels pour adultes.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 22579:2020(F)
FIL 241:2020(F)

La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente

les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont

organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de

groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers,

des universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.

L’ISO et la FIL collaborent étroitement à toutes les activités de normalisation concernant les méthodes

d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient

conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux

organismes.

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Le présent document a été élaboré par le comité permanent de la FIL chargé des méthodes d’analyse de la

composition et par le comité technique de l’ISO, l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait

et produits laitiers. Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL.

L’ensemble des travaux a été confié à l’équipe d’action mixte ISO/FIL C41 du comité permanent chargé

des Méthodes d’analyse de la composition, sous la conduite de son chef de projet, M. S. Austin (CH).

© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 22579:2020(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 241:2020(F)
Préparations pour nourrissons et produits nutritionnels
pour adultes — Dosage des fructanes — Chromatographie
échangeuse d'anions haute performance couplée à la
détection par ampérométrie pulsée (CEAHP-DAP) après
traitement enzymatique

AVERTISSEMENT — La méthode décrite dans le présent document utilise des produits chimiques

corrosifs (hydroxyde de sodium, acide acétique) et toxiques (azoture de sodium). Consulter les

fiches de données de sécurité et prendre les mesures de sécurité supplémentaires applicables à

la manipulation et la mise au rebut des déchets.
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode de dosage des fructanes de type inuline (tels que

l’oligofructose, les fructo-oligosaccharides) dans les formules pour nourrissons et les produits

nutritionnels pour adultes (en poudre ou liquides) contenant 0,03 g/100 g à 5,0 g/100 g de fructanes

dans le produit préparé sous une forme prête à la consommation.
[1]

La méthode a été validée lors d’une étude interlaboratoires avec un matériau de référence standard

(SRM) reconstitué de type préparation nutritionnelle pour nourrissons/adultes à une concentration

de 0,204 g/100 g, produits nutritionnels prêts à l’emploi (RTF) pour adultes à des concentrations de

1,28 g/100 g et 2,67 g/100 g, préparation RTF pour nourrissons à une concentration de 0,300 g/100 g,

préparation de suite reconstituée à des concentrations de 0,209 g/100 g à 0,275 g/100 g, préparation

reconstituée pour nourrissons à des concentrations de 8 g/100 g à 0,264 g/100 g. Pendant l’étude de

[2]

validation intralaboratoire , des essais de recouvrement ont été menés jusqu’à 5 g/100 g dans les

préparations en poudre reconstituées pour nourrissons (à base de lait, de lait partiellement hydrolysé

et de soja), le produit nutritionnel RTF et les produits nutritionnels reconstitués pour adultes.

2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
produit nutritionnel pour adultes

aliment spécialement formulé, complet sur le plan nutritionnel, consommé sous forme liquide, qui

peut constituer la seule source d’alimentation, fabriqué à partir d’un mélange de lait, de soja, de riz, de

lactosérum, de protéine hydrolysée, d’amidon et d’acides aminés, avec ou sans protéine intacte

© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 22579:2020(F)
FIL 241:2020(F)
3.2
préparation pour nourrissons

substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire à lui seul les besoins nutritionnels

des nourrissons pendant les premiers mois de leur vie, jusqu’à l’introduction d’une alimentation

complémentaire appropriée
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
3.3
préparation de suite

aliment destiné à constituer la partie liquide d’un régime de sevrage pour nourrissons dès six mois et

pour enfants en bas âge jusqu’à trois ans

Note 1 à l'article: à l’article La préparation de suite comprend la préparation pour enfants et enfants en bas âge.

[SOURCE: Codex Standard 156-1987]
4 Principe

Les échantillons sont reconstitués dans de l’eau (si nécessaire) puis dilués jusqu’à ce que la concentration

en fructanes dans la solution soit telle qu’après hydrolyse, la concentration en fructose et en glucose se

situe dans la plage couverte par la courbe d’étalonnage. L’échantillon dilué est traité avec un mélange

de sucrase et d’α-glucanases hautement spécifique pour hydrolyser le saccharose et les α-gluco-

oligosaccharides en leurs monosaccharides constitutifs. L’échantillon est passé au travers d’une colonne

d’extraction en phase solide (SPE) garnie de carbone graphitisé. Les sels et les monosaccharides passent

à travers et sont emportés, tandis que les fructanes sont retenus. Les fructanes sont détachés de la

colonne à l’aide d’une solution d’acétonitrile. Les fructanes détachés sont hydrolysés avec un mélange

de fructanase, et le glucose et le fructose détachés sont analysés par chromatographie échangeuse

d’anions haute performance couplée à la détection par ampérométrie pulsée (CEAHP-DAP). La teneur

en fructane est calculée en additionnant la teneur en glucose et 0,9 fois la teneur en fructose mesurées.

Dans certaines matrices, une correction du blanc peut être nécessaire et peut être appliquée.

5 Produits chimiques et réactifs
5.1 Liste des produits chimiques et réactifs

Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue. Sauf

indication contraire, les solvants doivent être de qualité CLHP.
5.1.1 Eau déionisée, purifiée, ayant une résistivité ≥ 18 MΩ.
5.1.2 Acide maléique, pureté ≥ 99,0 %.
5.1.3 Acétonitrile.
5.1.4 Acide acétique, glacial, 100 %, anhydre.
5.1.5 Hexacyanoferrate(II) de potassium trihydraté, en option.
5.1.6 Acétate de zinc, en option.
5.1.7 Acide trifluoroacétique (TFA).
5.1.8 Acide chlorhydrique, concentration c = 1 mol/l.
2 © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22579:2020(F)
FIL 241:2020(F)

5.1.9 Acétate de sodium anhydre, pureté ≥ 99,0 %, uniquement en cas d’utilisation de colonnes B

(6.13.2) pour la CEAHP-DAP.
5.1.10 Solution d’hydroxyde de sodium, 50 % (fraction massique).
5.1.11 Granulés d’hydroxyde de sodium.
5.1.12 Chlorure de sodium.
5.1.13 Azoture de sodium, en option.
5.1.14 D-(-)-fructose, pureté ≥ 99,0 % (masse sèche).
5.1.15 D-(+)-glucose, pureté ≥ 99,5 % (masse sèche).
5.1.16 N,N’-diacétylchitobiose, pureté > 90 %.

5.1.17 Mélange de sucrase, β-amylase, pullulanase et maltase hautement purifiées, issu du kit de

dosage du fuctane K-FRUC (Megazyme International Ireland Ltd ou équivalent). Il convient que 200 µl

de solution travail à base de mélange d’enzymes (5.2.10) permettent d’hydrolyser 2 mg de saccharose

dans les conditions décrites dans la méthode (90 min à 40 °C) sans hydrolyser les fructanes.

5.1.18 Mélange d’exo- et endo-inulinases hautement purifiées et d’endo-lévanase recombinante,

issu du kit de dosage du fuctane K-FRUC (Megazyme International Ireland Ltd ou équivalent). Il convient

que 100 µl de solution travail à base de mélange d’enzymes (5.2.11) permettent d’hydrolyser 70 µg de

fructanes dans les conditions décrites dans la méthode (40 min à 40 °C).
5.2 Préparation des réactifs
5.2.1 Solution d’hydroxyde de sodium, c = 2 mol/l.

Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 40 g ± 1 g de granulés d’hydroxyde de sodium dans 250 ml

d’eau déionisée. Après refroidissement à température ambiante, compléter jusqu’au trait avec de l’eau

déionisée et bien mélanger. Cette solution est stable pendant six mois à température ambiante.

5.2.2 Solution tampon de maléate de sodium, c = 0,100 mol/l, pH = 6,5.

Dans un grand bécher (> 500 ml), peser 5,8 g d’acide maléique et dissoudre dans 450 ml d’eau déionisée

à l’aide d’un agitateur magnétique. Ajuster à pH = 6,5 avec la solution d’hydroxyde de sodium (5.2.1).

Transférer la solution dans une fiole jaugée de 500 ml et compléter jusqu’au trait avec de l’eau déionisée.

Cette solution est stable pendant trois mois à 4 °C.
5.2.3 Solution tampon d’acétate de sodium, c = 0,100 mol/l, pH = 4,5.

Dans un grand bécher (> 500 ml) contenant 450 ml d’eau déionisée, introduire à la pipette 2,9 ml d’acide

acétique glacial. Ajuster à pH = 4,5 avec la solution d’hydroxyde de sodium (5.2.1). Transférer la solution

dans une fiole jaugée de 500 ml et compléter jusqu’au trait avec de l’eau déionisée. Cette solution est

stable pendant trois mois à 4 °C.

1) Ceci est un exemple d’un produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par

souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement

de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils

conduisent aux mêmes résultats.
© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22579:2020(F)
FIL 241:2020(F)

5.2.4 Solution étalon interne de N,N’diacétylchitobiose, concentration ρ = 600 µg/ml.

Dans une fiole jaugée de 25 ml, peser 15 mg de N,N′diacétylchitobiose et compléter jusqu’au trait avec

de l’eau déionisée. Cette solution est stable pendant un an à ‒20 °C.
5.2.5 Solution mère de glucose, ρ = 5 mg/ml.

Dans une fiole jaugée de 25 ml, peser 125 mg de glucose et compléter jusqu’au trait avec de l’eau

déionisée. Cette solution est stable pendant un an à ‒20 °C.
5.2.6 Solution mère de fructose, ρ = 10 mg/ml.

Dans une fiole jaugée de 25 ml, peser 250 mg de fructose et compléter jusqu’au trait avec de l’eau

déionisée. Cette solution est stable pendant un an à ‒20 °C.
5.2.7 Solution de Carrez I

Dissoudre 10,6 g d’hexacyanoferrate(II) de potassium trihydraté dans 100 ml d’eau déionisée et

conserver dans un flacon ambré. Cette solution est stable pendant six mois à température ambiante

(réactif en option).
5.2.8 Solution de Carrez II

Dans une fiole jaugée de 100 ml, dissoudre 22,0 g d’acétate de zinc dans 90 ml d’eau déionisée et ajouter

2,9 ml d’acide acétique glacial. Compléter jusqu’au trait avec de l’eau déionisée et homogénéiser. Cette

solution est stable pendant six mois à température ambiante (réactif en option).
5.2.9 Solution d’azoture de sodium, ρ = 5 g/l.

Dissoudre 1 g d’azoture de sodium dans 200 ml d’eau déionisée (réactif en option).

5.2.10 Mélange de solution de sucrase, β-amylase, pullulanase et maltase

Dissoudre le contenu du flacon contenant le mélange en poudre lyophilisé de sucrase, β-amylase,

pullulanase et maltase dans 22,0 ml de solution tampon de maléate de sodium (5.2.2). Bien mélanger et

diviser en aliquotes de 2 ml chacune. Conserver au congélateur à ‒20 °C dans des tubes en polypropylène

jusqu’à utilisation. Cette solution est stable pendant cinq ans à ‒20 °C.

IMPORTANT — Pour la mise au point et la validation de cette méthode, un mélange d’enzymes prêt

à l’emploi disponible dans le commerce auprès de Megazyme (5.1.17) a été utilisé. Lorsque des

enzymes d’une autre provenance sont utilisées, il peut être nécessaire d’adapter la composition

du tampon (type, concentration et pH) en fonction des recommandations du fournisseur. Il est

également impératif de s’assurer que le mélange d’enzymes utilisé hydrolysera complètement

le saccharose présent dans le produit sans hydrolyser le fructane. Pour le vérifier, effectuer

une analyse en utilisant le saccharose comme analyte et un fructane pur comme analyte. Il

convient que le fructane ne soit pas détecté lorsque le saccharose est analysé, et qu’un taux de

récupération supérieur à 90 % soit obtenu lorsqu’un fructane de pureté connue est analysé

(recommandation de vérifier avec de l’inuline à longue chaîne et des fructo-oligosaccharides

à courte chaîne). Un autre essai de contrôle de l’applicabilité et de la performance du mélange

d’enzymes est décrit à l’Annexe C.

2) Ceci est un exemple d’un produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par

souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement

de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils

conduisent aux mêmes résultats.
4 © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 22579:2020(F)
FIL 241:2020(F)
5.2.11 Solution de fructanase (exo-/endo-inulinases et endo-lévanase).

Dissoudre le contenu du flacon contenant le mélange en poudre lyophilisé d’exo- et endo-inulinases et

d’endo-lévanase dans 22,0 ml de solution tampon d’acétate de sodium (5.2.3). Bien mélanger et diviser

en aliquotes de 2 ml chacune. Conserver au congélateur à ‒20 °C dans des tubes en polypropylène

jusqu’à utilisation. Cette solution est stable pendant cinq ans à ‒20 °C.

IMPORTANT — Pour la mise au point et la validation de cette méthode, un mélange d’enzymes prêt

à l’emploi disponible dans le commerce auprès de Megazyme (5.1.18) a été utilisé. Lorsque des

enzymes d’une autre provenance sont utilisées, il peut être nécessaire d’adapter la composition

du tampon (type, concentration et pH) en fonction des recommandations du fournisseur. Il est

également impératif de s’assurer que le mélange d’enzymes utilisé hydrolysera complètement

le fructane sans hydrolyser l’oligosaccharide ou le polysaccharide contenant du glucose ou du

fructose potentiellement présent après traitement avec le mélange de sucrase ci-dessus. Pour le

vérifier, effectuer une analyse en utilisant un fructane pur comme analyte. Il convient d’obtenir

un taux de récupération supérieur à 90 % lorsqu’un fructane de pureté connue est analysé.

5.2.12 Solution de lavage pour colonne d’extraction en phase solide (SPE) garnie de carbone

graphitisé, TFA 0,1 % dans l’acétonitrile 80 % (fraction volumique).

Dans une fiole jaugée de 100 ml, ajouter 80 ml d’acétonitrile et 100 µl de TFA. Compléter jusqu’au trait

avec de l’eau déionisée. Cette solution est stable pendant six mois à température ambiante.

5.2.13 Solution de chlorure de sodium, c = 1 mol/l, pour colonne SPE garnie de carbone graphitisé.

Dans une fiole jaugée de 100 ml, peser 5,8 g de chlorure de sodium et dissoudre dans 90 ml d’eau

déionisée. Compléter jusqu’au trait avec de l’eau déionisée. Cette solution est stable pendant six mois à

température ambiante.

5.2.14 Solution d’élution pour colonne SPE garnie de carbone graphitisé, TFA 0,05 % dans

l’acétonitrile 25 % (fraction volumique).

Dans une fiole jaugée de 100 ml, ajouter 25 ml d’acétonitrile et 50 µl de TFA. Compléter jusqu’au trait

avec de l’eau déionisée. Cette solution est stable pendant six mois à température ambiante.

5.3 Préparation des phases mobiles à l’aide de la colonne A (6.13.1) ou d’une colonne

équivalente

En cas d’utilisation de colonnes B (6.13.2), passer ce paragraphe et aller directement au paragraphe 5.4.

5.3.1 Éluant A pour colonne A (6.13.1), solution d’hydroxyde de sodium, c = 0,600 mol/l.

Dans un flacon d’éluant, introduire 970 ml d’eau déionisée et dégazer avec de l’hélium pendant 20 min.

Ajouter 31,2 ml de solution d’hydroxyde de sodium (5.1.10) (à l’aide d’une pipette à usage unique en

plastique). Dégazer avec de l’hélium pendant 20 min et protéger l’éluant de toute exposition au dioxyde

de carbone jusqu’à et pendant l’utilisation, par un moyen approprié (par exemple, en le conservant sous

une couche d’hélium). Cette solution est stable pendant une semaine à température ambiante.

5.3.2 Éluant B pour colonne A (6.13.1), eau déionisée ayant une résistivité ≥
...