ISO 7932:2004/Amd 1:2020
(Amendment)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C — Amendment 1: Inclusion of optional tests
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C — Amendment 1: Inclusion of optional tests
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement de Bacillus cereus présomptifs — Technique par comptage des colonies à 30 degrés C — Amendement 1: Ajout de tests optionnels
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STANDARD 7932
Third edition
2004-06-15
AMENDMENT 1
2020-03-31
Corrected version 2
2020-08
Microbiology of food and animal
feeding stuffs — Horizontal method
for the enumeration of presumptive
Bacillus cereus — Colony-count
technique at 30 °C
AMENDMENT 1: Inclusion of optional
tests
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement de Bacillus cereus présomptifs — Technique par
comptage des colonies à 30 °C
AMENDEMENT 1: Ajout de tests optionnels
Reference number
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This second corrected version of ISO 7932:2004/Amd.1:2020 incorporates the following corrections:
— Annexes A, B, C and D have been corrected to Annexes C, D, E and F, respectively (as per the first
corrected version);
— in Table D.2, the volume per reaction for EM1F and EM1R has been corrected from 2,5 to 5.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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Microbiology of food and animal feeding stuffs —
Horizontal method for the enumeration of presumptive
Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 °C
AMENDMENT 1: Inclusion of optional tests
In the Scope
Designate the existing NOTE as NOTE 1 and add the following new NOTE:
[21][22]
NOTE 2 The diversity within the Bacillus cereus group is large with 7 phylogenetic groups and a growing
number of species.
After 9.4
Add the following new subclause 9.5:
9.5 Optional tests
9.5.1 General
All the tests mentioned below are optional and intended for complementary investigations
(i.e. epidemiological) on isolated Bacillus cereus group strains obtained in 9.4.1, following the procedures
described in Annexes C to F.
In this amendment, the term “B. cereus group” is used instead of “presumptive B. cereus”, as it is
[28]
scientifically more precise, as explained in the EFSA scientific opinion published in 2016 .
9.5.2 Detection of cytK-1 or cytK-2 gene variants of the gene encoding Cytotoxin K
Some strains within the B. cereus group bacteria carry one of the two variants found for the gene
[17][22]
encoding Cytotoxin K, cytK-1 and cytK-2. The cytK-1 gene is specific to Bacillus cytotoxicus and
[20]
thus constitutes the possibility to rapidly identify B. cytotoxicus . The procedure in Annex C describes
a validated PCR method that targets both cytK gene variants and, if present, indicates which of the two
forms is present. It also allows confirmation of isolates as B. cytotoxicus.
9.5.3 Detection of Bacillus cereus group strains able to produce cereulide
Some strains within the B. cereus group bacteria are able to produce a heat-stable dodecadepsipeptide,
named cereulide. This cereulide, when produced in food, can cause an emetic food poisoning syndrome.
[10]
NOTE The method for cereulide quantification is described in ISO 18465 .
[16]
A cereulide peptide synthetase (ces) gene is involved in the non-ribosomal synthesis of cereulide .
The procedure in Annex D describes a rapid and validated PCR method that targets the ces gene.
9.5.4 Motility test for B. anthracis screening
The motility test described in Annex E allows for screening for presumptive B. anthracis among isolated
B. cereus group bacteria.
NOTE This test has nevertheless strong limitations as indicated in Annex E (see E.1 and Table E.1).
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9.5.5 Microscopic examination of the parasporal crystal from Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis, one of the B. cereus group species, can be distinguished from the other species of this
group by the microscopic examination of the parasporal crystal formation.
The procedure for the examination of the parasporal crystal formation is described in Annex F.
After Annex B
Add the following as Annexes C, D, E and F.
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Annex C
(informative)
Polymerase chain reaction for the detection of cytK-1 or cytK-2
gene variants of cytotoxin K in isolated strains of Bacillus cereus
group and identification of Bacillus cytotoxicus
C.1 General
The chromosomally located cytK-2 gene encodes cytotoxin K, an enterotoxin that is present in B. cereus
[22]
sensu stricto and B. thuringiensis strains .
[29]
Presence of cytK-2 genes are also mentioned in strains of other B. cereus group species . CytK-1 gene
is a variant of cytK-2 gene due to a marked polymorphism and encodes to a more cytotoxic form of
[18]
cytotoxin K that is present only in B. cytotoxicus .
This method is applicable to well-isolated colonies of B. cereus group strains, after appropriate
preparation of the DNA.
C.2 Principles
C.2.1 General
The method comprises the following consecutive steps:
a) nucleic acid extraction;
b) amplification of target gene and interpretation.
C.2.2 Nucleic acid extraction
Bacterial cells are harvested from well isolated colonies and the nucleic acid is extracted for use in PCR
reaction.
C.2.3 Amplification of target gene and interpretation
The extracted nucleic acid is selectively amplified using PCR. Detection of the PCR products is achieved
by electrophoresis on agarose. Interpretation is deduced from presence or absence of the expected band.
C.3 Reagents
C.3.1 General
All reagents needed for this annex are molecular grade reagents and consumables suitable for molecular
[11] [12]
biology. They shall be used as given in ISO 20837 and ISO 20838 .
C.3.2 Nucleic acid extraction
Nucleic acid extraction procedure and reagents appropriate for Gram-positive bacteria shall be used.
Commercial kits can also be used.
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C.3.3 Reagents for PCR
[14] [12]
Refer to ISO 22174 and ISO 20838 .
C.3.4 Primers
The primers used for detection of cytotoxin K genes are listed in Table C.1.
Table C.1 — Sequences of oligonucleotides, characteristics and resulting amplicon
Gene Position on Amplicon size
Primer Sequence (5′ – > 3′)
variant cytK gene (bp)
CK1F F CAA TTC CAG GGG CAA GTG TC cytK-1 314–333
Accession
426
a
CK1R R CCT CGT GCA TCT GTT TCA TGA G 740–719
number
DQ885233.1
CK2F F CAA TCC CTG GCG CTA GTG CA cytK-2 314–333
Accession
585
a
CK2R R GTG IAG CCT GGA CGA AGT TGG 899–879
number
AJ318876.2
Key
F: forward
R: reverse
a
Make reference to the publicly available nucleotide sequences available at http:// www .www .ncbi .nlm .nih .gov
C.4 Equipment and consumables
C.4.1 General
Appropriate equipment according to the method and, in particular, the following.
C.4.2 Equipment for nucleic acid extraction
C.4.2.1 Micro-centrifuge tubes, with capacities of 1,5 ml or 2,0 ml.
C.4.2.2 Centrifuge, for reaction tubes with a capacity of 1,5 ml or 2,0 ml and capable of achieving an
acceleration up to approximately 14 000g.
C.4.2.3 Thermoblock, with heating capacity of up to 100 °C.
C.4.2.4 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 μl to 1 000 μl.
C.4.2.5 Mixer.
C.4.3 Equipment for PCR
C.4.3.1 PCR thermal cycler.
C.4.3.2 Thin-walled PCR microtubes, 0,2 ml or 0,5 ml reaction tubes, multi-well PCR microplates or
other suitable equipment.
C.4.4 Equipment for the detection of PCR products
[12]
Refer to ISO 20838 .
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C.5 Procedure
C.5.1 General
See Figure C.1.
Figure C.1 — Flow diagram for PCR detection of cytotoxin K gene
(cytK-1 or cytK-2 variants) in B. cereus group strains and identification of B. cytotoxicus
C.5.2 Nucleic acid extraction
Confirmed B. cereus group colonies according to 9.4 should be used for DNA extraction. Prior to DNA
extraction, the colonies can be optionally washed by centrifugation in 1 ml of nuclease free water. Any
nucleic acid extraction procedure appropriate for Gram-positive bacteria suitable for this purpose can
be used (e.g. Reference [15]).
A 10 µl loopfull of colony material is harvested (from MYP or non selective agars) and suspended in 1 ml
of nuclease free water, pelleted at 11 000g for 15 min. The pellet is resuspended in 500 µl extraction
buffer [1,7 g/l sodium dodecylsulfate, 200 mmol/l Tris-HCl (pH 8), 20 mmol/l EDTA, 200 mmol/l NaCl].
The suspension is incubated at 55 °C for 1 h with 25 µl of proteinase K (10 µg/µl). DNA is extracted
with one volume of phenol and subsequently with one volume of chloroform. The aqueous phase is
precipitated with 2,5 volumes of cold ethanol (100 % volume fraction) and centrifuged at 11 000g for
20 min. The supernatant is discarded and the pellet washed once with 800 µl of cold ethanol (70 %
volume fraction). After drying, the pellet is dissolved in 50 µl nuclease free water and stored at −20 °C.
DNA amount is quantified by absorbance at 260 nm in a spectrophotometer and shall be adjusted to a
concentration compatible with the sensitivity of the PCR (see C.6.3).
Other methods or commercial ready-to-use purification kits can be used if controls (see C.5.3.2) are
scrupulously used.
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C.5.3 PCR amplification
C.5.3.1 General
The total PCR volume is 15 μl per reaction. The reagents are listed in Table C.2. The final concentrations
of reagents as outlined in the table have proven to be suitable.
Table C.2 — PCR reaction reagents
Reagent (concentration) Final concentration Volume per reaction (μl)
a
DNA polymerase buffer (10X) 1x 1,5
dNTPs mix (5 mmol/l each) 0,2 mmol/l each 0,6
CK1F (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK1R (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK2F (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK2R (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
MgCl (25 mmol/l) 2,5 mmol/l 1,5
2
a
DNA polymerase 0,75 U 0,15
Template DNA (Genomic - 25 ng/µl) 2,5
Adjust the volume to 15 μl using nuclease free water
a 1)
This protocol has been validated using commercially available AmpliTaq®10x Buffer and AmpliTaq® polymerase
and Master Mix containing the four dNTPs.
1)
AmpliTaq®10x Buffer and AmpliTaq® polymerase are products supplied by Applied Biosystems, Forster City, CA, USA.
Master Mix is a product supplied by Eurogentec. This information is given for the convenience of users of this document and
does not constitute an endorsement by ISO of the products named. Equivalent products can be used if they can be shown to
lead to the same results.
Different protocols for PCR amplification can be used, depending on the DNA polymerase and DNA
preparation that is used. However, the PCR reaction shall be stringent, using the primers described
in Table C.1 with appropriate hybridization temperature (see Table C.4) and appropriate controls (see
C.5.3.2), with the reliability of primers being validated with a specific hybridization temperature. The
control strains are listed in Table C.3.
Table C.3 — Control strains to be included in PCR assays
a
WDCM number (species) cytK-1 cytK-2
WDCM 00218 Negative control Positive control
(Bacillus cereus)
WDCM 00220 Positive control Negative control
(Bacillus cytotoxicus)
WDCM 00222 (Bacillus Negative control Negative control
weihenstephanensis)
a
Refer to the reference strain catalogue available on http:// www .wfcc .info for information on
culture collection strain numbers and contact details.
C.5.3.2 PCR controls
[14]
All appropriate controls as given in ISO 22174 shall be performed. At least a positive and a negative
control, represented for each gene variant by a known positive and a known negative bacterial strain
DNA respectively, shall be included in the PCR assay to check the conditions of amplification.
[14]
DNA positive controls (including process controls as given in ISO 22174 ) should be obtained by the
same DNA extraction protocol as used for test isolates.
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C.5.3.3 Temperature-time programme
The temperature-time programme, as outlined in Table C.4, has been used in the evaluation study.
Table C.4 — Temperature-time programme
Initial denaturation 94 °C for 5 min
Denaturation 94 °C for 15 s
Amplification Hybridization 57 °C for 30 s
Elongation 72 °C for 30 s
Number of cycles 30
Final extension 72 °C for 7 min
C.5.3.4 Detection of the PCR products
The PCR products are detected after electrophoresis on agarose gel (1,5 %) with an appropriate
[12]
molecular weight marker (refer to ISO 20838 ).
C.5.4 Interpretation of the PCR result
The result obtained, including the controls specified above (see C.5.3.2), should be as follows. Otherwise,
the PCR shall be repeated.
The PCR result will be one of the following:
a) positive for cytK-1 variant, if a specific PCR product of 426 bp has been detected and all the controls
give expected results, or
b) positive for cytK-2 variant, if a specific PCR product of 585 bp has been detected and all the controls
give expected results, or
c) negative for cytotoxin K genes, if a specific PCR product has not been detected, and all controls give
expected results.
C.5.5 Confirmation of the PCR product
[14]
Refer to ISO 22174 .
C.6 Performance characteristics
C.6.1 General
This method was evaluated in a single-laboratory validation study. It was tested on a total of 160 B.
[23]
cereus group strains and 10 outgroup species, including Southern blotting or PCR product sequencing ,
[22]
and then applied on 391 strains . The assay turned out to be highly reliable with 0 % false-negative
[25]
reactions and 0 % false-positive reactions. BLASTN analysis also showed that there were no targets
in the bacterial organisms other than cytK gene for the four primers included in the PCR reaction. The
[23]
specificity for cytK-1 and cytK-2 variant was 100 % under the PCR conditions described and with the
recommended controls (see C.5.3.2).
C.6.2 Selectivity
C.6.2.1 General
Selectivity was performed in duplex PCR using the primers CK1F, CK1R, CK2F, CK2R, working by couple
(CK1F/CK1R and CK2F/CK2R). It was checked that the respective primer pairs run exclusively on cytK-1
variant or cytK-2 variant and target low conserved regions between the two variants.
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C.6.2.2 Inclusivity
Inclusivity of the PCR assay for cytK-2 fragment was tested on 66 target strains. A 100 % inclusivity
was obtained. Inclusivity of the PCR assay for cytK-1 fragment was tested on 5 target strains. A
100 % inclusivity was obtained. The tested strains for cytK-2 variant were B. cereus sensu stricto and
B. thuringiensis strains. Target strains for cytK-1 correspond to all 5 B. cytotoxicus strains that were
available at the time of evaluation. They were enough distant from the remaining species of the group
to exhibit a particular polymorphism resulting in cytK-1 variant for cytK gene.
C.6.2.3 Exclusivity
Exclusivity of the assay for cytK-1 fragment was tested on 157 non-target strains. A 100 % exclusivity
was obtained. Exclusivity of the assay for cytK-2 fragment was tested on 94 non-target strains. A 100 %
exclusivity was obtained.
Strains tested were from all species of the B. cereus group and eight diverse food-related species.
C.6.3 Sensitivity
The limits for PCR amplification ranged from 15 ng to 75 ng of genomic DNA per 15 µl of final reaction.
C.7 Limitations of the PCR assay
This PCR assay allows to a) detect cytotoxin K genes (and particularly one of its two variants), and b)
identify B. cytotoxicus strains, two characteristics that are both associated with food poisoning. Even if
that indicates a potential risk, the sole presence of the gene or species identification does not allow to
confirm cytK gene expression.
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Annex D
(informative)
Polymerase chain reaction for the detection of ces gene encoding
cereulide peptide synthetase in strains of Bacillus cereus group
D.1 Gel-based PCR assay for detection of ces gene encoding cereulide peptide
synthetase in strains of Bacillus cereus group
D.1.1 General
This annex describes a method for the amplification and detection of the ces gene specific for the
production of cereulide in Bacillus cereus group strains using agarose gel electrophoresis.
D.1.2 Principle
Specific DNA fragment of the ces gene is amplified by PCR using two primers. The detection of the PCR
product is done using agarose gel-electrophoresis.
D.1.3 Reagents
D.1.3.1 General
All reagents needed for this annex are molecular grade reagents and consumables suitable for molecular
[11] [12]
biology. They shall be used as given in ISO 20837 and ISO 20838 .
D.1.3.2 Reagents for nucleic acid extraction
Nucleic acid extraction procedure and reagents appropriate for Gram-positive bacteria shall be used.
Commercial kits can also be used.
D.1.3.3 Reagents for PCR
D.1.3.3.1 PCR buffer solution.
The 10x PCR buffer solution is usually delivered with the DNA polymerase, which may or may not
include MgCl in a concentration specified by the manufacturer. The final MgCl concentrations are
2 2
method specific and are therefore listed in Table D.2. Commercially available ready-to-use reagents
may be used. The manufacturer’s instructions for use should be considered.
D.1.3.3.2 MgCl solution, c (MgCl ) = 25 mmol/l.
2 2
D.1.3.3.3 Thermostable DNA polymerase (for hot-start PCR), 5 IU/µl.
D.1.3.3.4 dNTP solution, c (dNTP) = 10 mmol/l, for the mix.
D.1.3.3.5 Oligonucleotides.
Sequences of the oligonucleotides are listed in Table D.1.
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Table D.1 — Sequences of oligonucleotides
Amplicon
Gene Primer Sequence (5′ – 3′)
size (bp)
ces EM1F GAC AAG AGA AAT TTC TAC GAG CAA GTA CAA T 635
EM1R GCA GCC TTC CAA TTAC TCC TTC TGC CAC AGT
D.1.3.4 Reagents for gel electrophoresis
[12]
Refer to ISO 20838 .
D.1.4 Equipment and consumables
D.1.4.1 General
Appropriate equipment according to the method and, in particular, the following.
D.1.4.2 Equipment used for nucleic acid extraction
D.1.4.2.1 Micro-centrifuge tubes, with capacities of 1,5 ml or 2,0 ml.
D.1.4.2.2 Centrifuge, for reaction tubes with a capacity of 1,5 ml or 2,0 ml and capable of achieving
an acceleration up to approximately 14 000g.
D.1.4.2.3 Thermoblock, with heating capacity of up to 100 °C.
D.1.4.2.4 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 μl to 1 000 μl.
D.1.4.2.5 Mixer.
D.1.4.3 Equipment used for PCR
D.1.4.3.1 Pipettes and pipette filter tips, having a capacity between 1 µl and 1 000 µl.
D.1.4.3.2 Microcentrifuge tubes, having a capacity of 1,5 ml or 2,0 ml.
D.1.4.3.3 Thin walled PCR microtubes, 0,2 ml or 0,5 ml reaction tubes, multi-well PCR microplates
or other suitable equipment.
D.1.4.3.4 Thermal cycler.
D.1.4.4 Equipment used for the detection of the PCR product
[12]
Refer to ISO 20838 .
D.1.5 Procedure
D.1.5.1 Nucleic acid extraction
Confirmed B. cereus group colonies according to 9.4 should be used for DNA extraction. Prior to DNA
extraction, the colonies can be optionally washed by centrifugation in 1 ml of nuclease free water. The
protocol described in C.5.2 can be used as well as any nucleic acid extraction procedure appropriate for
Gram-positive bacteria and suitable for this purpose (e.g. Reference [15]).
D.1.5.2 PCR set-up
The method is described for a total PCR volume of 50 µl per reaction with the reagents as listed in
Table D.2. The PCR can also be carried out in a smaller volume if the solutions are adjusted accordingly.
The final concentrations of reagents as outlined in Table D.2 have proven to be suitable.
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
Table D.2 — PCR reaction reagents
Reagent (concentration) Final concentration Volume per reaction (µl)
a
DNA polymerase buffer without MgCl (10X) 5
2
MgCl (25 mmol/l) 150 µmol/l 0,3
2
dNTP mix (10 mmol/l each) 800 µmol/l 4
EM1F (5 µmol/l) 0,5 µmol/l 5
EM1R (5 μmol/l) 0,5 µmol/l 5
Template DNA / 1
Thermostable DNA polymerase, 5 IU/µl 0,5 IU/µl 5
Adjust the volume to 50 µl using nuclease-free water
a
If the DNA polymerase buffer already contains MgCl , the final concentration of MgCl in the reaction mixture is
2 2
adjusted to 0,15 mmol/l.
D.1.5.3 PCR controls
[14]
All appropriate controls as given in ISO 22174 shall be performed.
The following strain can be used as positive controls.
Bacillus cereus, emetic strain WDCM 00219.
D.1.5.4 Temperature-time-programme
The temperature-time programme as outlined in Table D.3 and the MasterMix according to Table D.2
[16]
were used in the validation study . The use of other thermal cyclers might make an adaptation
necessary. The time for activation/initial denaturation depends on the polymerase used. The
recommendation of the DNA polymerase manufacturer shall be followed.
Table D.3 — Temperature-time programme
Activation/initial denaturation 95 °C for 15 min
95 °C for 30 s
Amplification 59 °C for 30 s
72 °C for 60 s
Number of cycles (amplification) 30
Final extension 72 °C for 5 min
D.1.5.5 Detection of PCR products
The PCR product is detected after electrophoresis on agarose gel (1,5 %) with an appropriate molecular
[12]
weight marker (refer to ISO 20838 ).
The target sequence is considered to be detected if the size of the PCR product corresponds to the
expected length of the target DNA sequence (see amplicon size in Table D.1). For the interpretation of
[14]
the results, see ISO 22174 .
D.1.5.6 Confirmation of a positive PCR result
[14]
Refer to ISO 22174 .
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D.1.6 Performance characteristics
D.1.6.1 General
[16]
The method has been validated for DNA extracted from different emetic Bacillus cereus group strains .
D.1.6.2 Theoretical evaluation of the method
Theoretical evaluation was done by performing a sequence similarity search against the GenBank/
[27]
EMBL/DDBJ database . The result of the search confirmed a complete identity of the primers only
with the expected target sequence.
D.1.6.3 Selectivity
D.1.6.3.1 Inclusivity
The inclusivity of the method was tested with 30 emetic Bacillus cereus group strains, see Table D.4.
Table D.4 — Inclusivity of the PCR using target strains
Source Number of strains ces gene detected
Food (without connection to a 5 5
foodborne illness/outbreak)
Food connected to foodborne 13 13
illness
Human samples (vomit, faeces) 12 12
D.1.6.3.2 Exclusivity
The exclusivity of the method was tested with 178 non-target organisms, see Table D.5. No cross-
reactivity was observed with the non-target bacteria.
Table D.5 — Exclusivity of the PCR using non-target strains
Species Number of strains ces gene detected
Bacillus cereus non-emetic strains 100 0
Bacillus anthracis 7 0
Bacillus mycoides 6 0
Bacillus thuringiensis 6 0
Bacillus pseudomycoides 3 0
Bacillus weihenstephanensis 7 0
other Bacillus spp. 8 0
Staphylococcus aureus 10 0
Staphylococcus equorum 1 0
Clostridium perfringens 3 0
Listeria monocytogenes 6 0
Campylobacter spp. 3 0
Escherichia coli 4 0
Salmonella spp. 6 0
Yersinia enterocolitica 8 0
12 © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
D.1.6.4 Sensitivity
The detection limit was found to be 2,5 pg template DNA for a 30-cycle PCR protocol, which corresponds
[16]
to approximately 500 genome equivalents .
D.2 Real-time PCR assay for detection of ces gene encoding cereulide peptide
synthetase in strains of Bacillus cereus group
D.2.1 General
This annex describes a probe-based real-time PCR method based on TaqMan technology for the
detection of the ces gene specific for emetic Bacillus cereus group strains.
D.2.2 Principle
Specific DNA fragment of the ces gene specific for emetic Bacillus cereus group strains is amplified by
real-time-PCR. The PCR product is detected by measuring the fluorescence of the probe.
D.2.3 Reagents
D.2.3.1 General
[13] [14]
For the quality of reagents used, refer to ISO 22119 and ISO 22174 .
D.2.3.2 Reagents for nucleic acid extraction
All reagents needed for this annex are molecular grade reagents and consumables suitable for molecular
[11] [12]
biology. They shall be used as given in ISO 20837 and ISO 20838 .
D.2.3.3 Ready to use MasterMix for real-time-PCR
A ready-to-use MasterMix contains PCR-buffer solution, MgCl -solution, dNTP-solution, optional a
2
decontamination System (dUTP included uracil N-glycosylase) and Taq-Polymerase and is mostly
adapted to the thermal cycler used. The manufacturer’s instructions for use should be considered.
D.2.3.4 pUC 19 plasmid
The plasmid is used as internal amplification control (IAC).
D.2.3.5 Oligonucleotides
Sequences of the oligonucleotides are listed in Table D.6.
© ISO 2020 – All rights reserved 13
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
Table D.6 — Sequences of oligonucleotides
Gene Primer/probe Sequence (5′ – 3′)
ces_TaqMan_for CGC CGA AAG TGA TTA TAC CAA
ces ces_TaqMan_re TAT GCC CCG TTC TCA AAC TG
a b
ces_TaqMan_probe FAM -GGGAAAATAACGAGAAATGCA-TAMRA
IAC_for TGT GAA ATA CCG CAC AGA TG
Internal amplification
control (IAC) IAC_re AGC TGG CGT AAT AGC GAA G
[9]
(see ISO/TS 17919 )
c b
IAC_probe HEX - GAG AAA ATA CCG CAT CAG GC -TAMRA
a
FAM: 6-carboxyfluorescein
b
TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine
c
HEX: 5′-Hexachloro-Fluorescein
NOTE The use of other fluorescence labels for the probes has not been tested or validated.
D.2.4 Equipment and consumables
D.2.4.1 General
Appropriate equipment according to the method and, in particular, the following.
D.2.4.2 Equipment for nucleic acid extraction
D.2.4.2.1 Micro-centrifuge tubes, with capacities of 1,5 ml or 2,0 ml.
D.2.4.2.2 Centrifuge, for reaction tubes with a capacity of 1,5 ml or 2,0 ml and capable of achieving
an acceleration up to approximately 14 000g.
D.2.4.2.3 Thermoblock, with heating capacity of up to 100 °C.
D.2.4.2.4 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 μl to 1 000 μl.
D.2.4.2.5 Mixer.
D.2.4.3 Equipment for PCR
D.2.4.3.1 PCR thermal cycler.
D.2.4.3.2 Thin-walled PCR microtubes, 0,2 ml or 0,5 ml reaction tubes, multi-well PCR microplates
or other suitable equipment.
D.2.4.4 Equipment for the detection of PCR products
[12]
Refer to ISO 20838 .
D.2.5 Procedure
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 7932
Third edition
2004-06-15
AMENDMENT 1
2020-03
Microbiology of food and animal
feeding stuffs — Horizontal method
for the enumeration of presumptive
Bacillus cereus — Colony-count
technique at 30 degrees C
AMENDMENT 1: Inclusion of optional
tests
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement de Bacillus cereus présomptifs — Technique par
comptage des colonies à 30 degrés C
AMENDEMENT 1: Ajout de tests optionnels
Reference number
ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
©
ISO 2020
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Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
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Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs —
Horizontal method for the enumeration of presumptive
Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C
AMENDMENT 1: Inclusion of optional tests
In the Scope
Designate the existing NOTE as NOTE 1 and add the following new NOTE:
[21][22]
NOTE 2 The diversity within the Bacillus cereus group is large with 7 phylogenetic groups and a growing
number of species.
After 9.4
Add the following new subclause 9.5:
9.5 Optional tests
9.5.1 General
All the tests mentioned below are optional and intended for complementary investigations
(i.e. epidemiological) on isolated Bacillus cereus group strains obtained in 9.4.1, following the procedures
described in Annexes C to F.
In this amendment, the term “B. cereus group” is used instead of “presumptive B. cereus”, as it is
[28]
scientifically more precise, as explained in the EFSA scientific opinion published in 2016 .
9.5.2 Detection of cytK-1 or cytK-2 gene variants of the gene encoding Cytotoxin K
Some strains within the B. cereus group bacteria carry one of the two variants found for the gene
[17][22]
encoding Cytotoxin K, cytK-1 and cytK-2. The cytK-1 gene is specific to Bacillus cytotoxicus and
[20]
thus constitutes the possibility to rapidly identify B. cytotoxicus . The procedure in Annex C describes
a validated PCR method that targets both cytK gene variants and, if present, indicates which of the two
forms is present. It also allows confirmation of isolates as B. cytotoxicus.
9.5.3 Detection of Bacillus cereus group strains able to produce cereulide
Some strains within the B. cereus group bacteria are able to produce a heat-stable dodecadepsipeptide,
named cereulide. This cereulide, when produced in food, can cause an emetic food poisoning syndrome.
[10]
NOTE The method for cereulide quantification is described in ISO 18465 .
[16]
A cereulide peptide synthetase (ces) gene is involved in the non-ribosomal synthesis of cereulide .
The procedure in Annex D describes a rapid and validated PCR method that targets the ces gene.
9.5.4 Motility test for B. anthracis screening
The motility test described in Annex E allows for screening for presumptive B. anthracis among isolated
B. cereus group bacteria.
NOTE This test has nevertheless strong limitations as indicated in Annex E (see E.1 and Table E.1).
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
9.5.5 Microscopic examination of the parasporal crystal from Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis, one of the B. cereus group species, can be distinguished from the other species of this
group by the microscopic examination of the parasporal crystal formation.
The procedure for the examination of the parasporal crystal formation is described in Annex F.
After Annex B
Add the following as Annexes C, D, E and F.
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Annex A
(informative)
Polymerase chain reaction for the detection of cytK-1 or cytK-2
gene variants of cytotoxin K in isolated strains of Bacillus cereus
group and identification of Bacillus cytotoxicus
A.1 General
The chromosomally located cytK-2 gene encodes cytotoxin K, an enterotoxin that is present in B. cereus
[22]
sensu stricto and B. thuringiensis strains .
[29]
Presence of cytK-2 genes are also mentioned in strains of other B. cereus group species . CytK-1 gene
is a variant of cytK-2 gene due to a marked polymorphism and encodes to a more cytotoxic form of
[18]
cytotoxin K that is present only in B. cytotoxicus .
This method is applicable to well-isolated colonies of B. cereus group strains, after appropriate
preparation of the DNA.
A.2 Principles
A.2.1 General
The method comprises the following consecutive steps:
a) nucleic acid extraction;
b) amplification of target gene and interpretation.
A.2.2 Nucleic acid extraction
Bacterial cells are harvested from well isolated colonies and the nucleic acid is extracted for use in PCR
reaction.
A.2.3 Amplification of target gene and interpretation
The extracted nucleic acid is selectively amplified using PCR. Detection of the PCR products is achieved
by electrophoresis on agarose. Interpretation is deduced from presence or absence of the expected band.
A.3 Reagents
A.3.1 General
All reagents needed for this annex are molecular grade reagents and consumables suitable for molecular
[11] [12]
biology. They shall be used as given in ISO 20837 and ISO 20838 .
A.3.2 Nucleic acid extraction
Nucleic acid extraction procedure and reagents appropriate for Gram-positive bacteria shall be used.
Commercial kits can also be used.
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
A.3.3 Reagents for PCR
[14] [12]
Refer to ISO 22174 and ISO 20838 .
A.3.4 Primers
The primers used for detection of cytotoxin K genes are listed in Table C.1.
Table C.1 — Sequences of oligonucleotides, characteristics and resulting amplicon
Gene Position on Amplicon
Primer Sequence (5′ – > 3′)
variant cytK gene size (bp)
CK1F F CAA TTC CAG GGG CAA GTG TC cytK-1 314–333
Accession
426
a
CK1R R CCT CGT GCA TCT GTT TCA TGA G 740–719
number
DQ885233.1
CK2F F CAA TCC CTG GCG CTA GTG CA cytK-2 314–333
Accession
585
a
CK2R R GTG IAG CCT GGA CGA AGT TGG 899–879
number
AJ318876.2
Key
F: forward
R: reverse
a
Make reference to the publicly available nucleotide sequences available at
http:// www .www .ncbi .nlm .nih .gov
A.4 Equipment and consumables
A.4.1 General
Appropriate equipment according to the method and, in particular, the following.
A.4.2 Equipment for nucleic acid extraction
C.4.2.1 Micro-centrifuge tubes, with capacities of 1,5 ml or 2,0 ml.
C.4.2.2 Centrifuge, for reaction tubes with a capacity of 1,5 ml or 2,0 ml and capable of achieving an
acceleration up to approximately 14 000 g.
C.4.2.3 Thermoblock, with heating capacity of up to 100 °C.
C.4.2.4 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 μl to 1 000 μl.
C.4.2.5 Mixer.
A.4.3 Equipment for PCR
C.4.3.1 PCR thermal cycler.
C.4.3.2 Thin-walled PCR microtubes, 0,2 ml or 0,5 ml reaction tubes, multi-well PCR microplates or
other suitable equipment.
A.4.4 Equipment for the detection of PCR products
[12]
Refer to ISO 20838 .
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
A.5 Procedure
A.5.1 General
See Figure C.1.
Figure C.1 — Flow diagram for PCR detection of cytotoxin K gene
(cytK-1 or cytK-2 variants) in B. cereus group strains and identification of B. cytotoxicus
A.5.2 Nucleic acid extraction
Confirmed B. cereus group colonies according to 9.4 should be used for DNA extraction. Prior to DNA
extraction, the colonies can be optionally washed by centrifugation in 1 ml of nuclease free water. Any
nucleic acid extraction procedure appropriate for Gram-positive bacteria suitable for this purpose can
be used (e.g. Reference [15]).
A 10 µl loopfull of colony material is harvested (from MYP or non selective agars) and suspended in 1 ml
of nuclease free water, pelleted at 11 000g for 15 min. The pellet is resuspended in 500 µl extraction
buffer [1,7 g/l sodium dodecylsulfate, 200 mmol/l Tris-HCl (pH 8), 20 mmol/l EDTA, 200 mmol/l NaCl].
The suspension is incubated at 55 °C for 1 h with 25 µl of proteinase K (10 µg/µl). DNA is extracted
with one volume of phenol and subsequently with one volume of chloroform. The aqueous phase is
precipitated with 2,5 volumes of cold ethanol (100 % volume fraction) and centrifuged at 11 000g for
20 min. The supernatant is discarded and the pellet washed once with 800 µl of cold ethanol (70 %
volume fraction). After drying, the pellet is dissolved in 50 µl nuclease free water and stored at −20 °C.
DNA amount is quantified by absorbance at 260 nm in a spectrophotometer and shall be adjusted to a
concentration compatible with the sensitivity of the PCR (see C.6.3).
Other methods or commercial ready-to-use purification kits can be used if controls (see C.5.3.2) are
scrupulously used.
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A.5.3 PCR amplification
A.5.3.1 General
The total PCR volume is 15 μl per reaction. The reagents are listed in Table C.2. The final concentrations
of reagents as outlined in the table have proven to be suitable.
Table C.2 — PCR reaction reagents
Reagent (concentration) Final concentration Volume per reaction (μl)
a
DNA polymerase buffer (10X) 1x 1,5
dNTPs mix (5 mmol/l each) 0,2 mmol/l each 0,6
CK1F (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK1R (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK2F (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK2R (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
MgCl (25 mmol/l) 2,5 mmol/l 1,5
2
a
DNA polymerase 0,75 U 0,15
Template DNA (Genomic - 25 ng/µl) 2,5
Adjust the volume to 15 μl using nuclease free water
a 1)
This protocol has been validated using commercially available AmpliTaq®10x Buffer and AmpliTaq® polymerase
and Master Mix containing the four dNTPs.
1)
AmpliTaq®10x Buffer and AmpliTaq® polymerase are products supplied by Applied Biosystems, Forster City, CA, USA.
Master Mix is a product supplied by Eurogentec. This information is given for the convenience of users of this document and
does not constitute an endorsement by ISO of the products named. Equivalent products can be used if they can be shown to
lead to the same results.
Different protocols for PCR amplification can be used, depending on the DNA polymerase and DNA
preparation that is used. However, the PCR reaction shall be stringent, using the primers described
in Table C.1 with appropriate hybridization temperature (see Table C.4) and appropriate controls (see
C.5.3.2), with the reliability of primers being validated with a specific hybridization temperature. The
control strains are listed in Table C.3.
Table C.3 — Control strains to be included in PCR assays
a
WDCM number (species) cytK-1 cytK-2
WDCM 00218 Negative control Positive control
(Bacillus cereus)
WDCM 00220 Positive control Negative control
(Bacillus cytotoxicus)
WDCM 00222 (Bacillus Negative control Negative control
weihenstephanensis)
a
Refer to the reference strain catalogue available on http:// www .wfcc .info for information on
culture collection strain numbers and contact details.
A.5.3.2 PCR controls
[14]
All appropriate controls as given in ISO 22174 shall be performed. At least a positive and a negative
control, represented for each gene variant by a known positive and a known negative bacterial strain
DNA respectively, shall be included in the PCR assay to check the conditions of amplification.
[14]
DNA positive controls (including process controls as given in ISO 22174 ) should be obtained by the
same DNA extraction protocol as used for test isolates.
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A.5.3.3 Temperature-time programme
The temperature-time programme, as outlined in Table C.4, has been used in the evaluation study.
Table C.4 — Temperature-time programme
Initial denaturation 94 °C for 5 min
Denaturation 94 °C for 15 s
Amplification Hybridization 57 °C for 30 s
Elongation 72 °C for 30 s
Number of cycles 30
Final extension 72 °C for 7 min
A.5.3.4 Detection of the PCR products
The PCR products are detected after electrophoresis on agarose gel (1,5 %) with an appropriate
[12]
molecular weight marker (refer to ISO 20838 ).
A.5.4 Interpretation of the PCR result
The result obtained, including the controls specified above (see C.5.3.2), should be as follows. Otherwise,
the PCR shall be repeated.
The PCR result will be one of the following:
a) positive for cytK-1 variant, if a specific PCR product of 426 bp has been detected and all the controls
give expected results, or
b) positive for cytK-2 variant, if a specific PCR product of 585 bp has been detected and all the controls
give expected results, or
c) negative for cytotoxin K genes, if a specific PCR product has not been detected, and all controls give
expected results.
A.5.5 Confirmation of the PCR product
[14]
Refer to ISO 22174 .
A.6 Performance characteristics
A.6.1 General
This method was evaluated in a single-laboratory validation study. It was tested on a total of 160 B.
[23]
cereus group strains and 10 outgroup species, including Southern blotting or PCR product sequencing ,
[22]
and then applied on 391 strains . The assay turned out to be highly reliable with 0 % false-negative
[25]
reactions and 0 % false-positive reactions. BLASTN analysis also showed that there were no targets
in the bacterial organisms other than cytK gene for the four primers included in the PCR reaction. The
[23]
specificity for cytK-1 and cytK-2 variant was 100 % under the PCR conditions described and with the
recommended controls (see C.5.3.2).
A.6.2 Selectivity
A.6.2.1 General
Selectivity was performed in duplex PCR using the primers CK1F, CK1R, CK2F, CK2R, working by couple
(CK1F/CK1R and CK2F/CK2R). It was checked that the respective primer pairs run exclusively on cytK-1
variant or cytK-2 variant and target low conserved regions between the two variants.
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A.6.2.2 Inclusivity
Inclusivity of the PCR assay for cytK-2 fragment was tested on 66 target strains. A 100 % inclusivity
was obtained. Inclusivity of the PCR assay for cytK-1 fragment was tested on 5 target strains. A
100 % inclusivity was obtained. The tested strains for cytK-2 variant were B. cereus sensu stricto and
B. thuringiensis strains. Target strains for cytK-1 correspond to all 5 B. cytotoxicus strains that were
available at the time of evaluation. They were enough distant from the remaining species of the group
to exhibit a particular polymorphism resulting in cytK-1 variant for cytK gene.
A.6.2.3 Exclusivity
Exclusivity of the assay for cytK-1 fragment was tested on 157 non-target strains. A 100 % exclusivity
was obtained. Exclusivity of the assay for cytK-2 fragment was tested on 94 non-target strains. A 100 %
exclusivity was obtained.
Strains tested were from all species of the B. cereus group and eight diverse food-related species.
A.6.3 Sensitivity
The limits for PCR amplification ranged from 15 ng to 75 ng of genomic DNA per 15 µl of final reaction.
A.7 Limitations of the PCR assay
This PCR assay allows to a) detect cytotoxin K genes (and particularly one of its two variants), and b)
identify B. cytotoxicus strains, two characteristics that are both associated with food poisoning. Even if
that indicates a potential risk, the sole presence of the gene or species identification does not allow to
confirm cytK gene expression.
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Annex B
(informative)
Polymerase chain reaction for the detection of ces gene encoding
cereulide peptide synthetase in strains of Bacillus cereus group
B.1 Gel-based PCR assay for detection of ces gene encoding cereulide peptide
synthetase in strains of Bacillus cereus group
B.1.1 General
This annex describes a method for the amplification and detection of the ces gene specific for the
production of cereulide in Bacillus cereus group strains using agarose gel electrophoresis.
B.1.2 Principle
Specific DNA fragment of the ces gene is amplified by PCR using two primers. The detection of the PCR
product is done using agarose gel-electrophoresis.
B.1.3 Reagents
B.1.3.1 General
All reagents needed for this annex are molecular grade reagents and consumables suitable for molecular
[11] [12]
biology. They shall be used as given in ISO 20837 and ISO 20838 .
B.1.3.2 Reagents for nucleic acid extraction
Nucleic acid extraction procedure and reagents appropriate for Gram-positive bacteria shall be used.
Commercial kits can also be used.
B.1.3.3 Reagents for PCR
D.1.3.3.1 PCR buffer solution.
The 10x PCR buffer solution is usually delivered with the DNA polymerase, which may or may not
include MgCl in a concentration specified by the manufacturer. The final MgCl concentrations are
2 2
method specific and are therefore listed in Table D.2. Commercially available ready-to-use reagents
may be used. The manufacturer’s instructions for use should be considered.
D.1.3.3.2 MgCl solution, c (MgCl ) = 25 mmol/l.
2 2
D.1.3.3.3 Thermostable DNA polymerase (for hot-start PCR), 5 IU/µl.
D.1.3.3.4 dNTP solution, c (dNTP) = 10 mmol/l, for the mix.
D.1.3.3.5 Oligonucleotides.
Sequences of the oligonucleotides are listed in Table D.1.
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Table D.1 — Sequences of oligonucleotides
Amplicon
Gene Primer Sequence (5′ – 3′)
size (bp)
ces EM1F GAC AAG AGA AAT TTC TAC GAG CAA GTA CAA T 635
EM1R GCA GCC TTC CAA TTAC TCC TTC TGC CAC AGT
B.1.3.4 Reagents for gel electrophoresis
[12]
Refer to ISO 20838 .
B.1.4 Equipment and consumables
B.1.4.1 General
Appropriate equipment according to the method and, in particular, the following.
B.1.4.2 Equipment used for nucleic acid extraction
D.1.4.2.1 Micro-centrifuge tubes, with capacities of 1,5 ml or 2,0 ml.
D.1.4.2.2 Centrifuge, for reaction tubes with a capacity of 1,5 ml or 2,0 ml and capable of achieving
an acceleration up to approximately 14 000g.
D.1.4.2.3 Thermoblock, with heating capacity of up to 100 °C.
D.1.4.2.4 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 μl to 1 000 μl.
D.1.4.2.5 Mixer.
B.1.4.3 Equipment used for PCR
D.1.4.3.1 Pipettes and pipette filter tips, having a capacity between 1 µl and 1 000 µl.
D.1.4.3.2 Microcentrifuge tubes, having a capacity of 1,5 ml or 2,0 ml.
D.1.4.3.3 Thin walled PCR microtubes, 0,2 ml or 0,5 ml reaction tubes, multi-well PCR microplates
or other suitable equipment.
D.1.4.3.4 Thermal cycler.
B.1.4.4 Equipment used for the detection of the PCR product
[12]
Refer to ISO 20838 .
B.1.5 Procedure
B.1.5.1 Nucleic acid extraction
Confirmed B. cereus group colonies according to 9.4 should be used for DNA extraction. Prior to DNA
extraction, the colonies can be optionally washed by centrifugation in 1 ml of nuclease free water. The
protocol described in C.5.2 can be used as well as any nucleic acid extraction procedure appropriate for
Gram-positive bacteria and suitable for this purpose (e.g. Reference [15]).
B.1.5.2 PCR set-up
The method is described for a total PCR volume of 50 µl per reaction with the reagents as listed in
Table D.2. The PCR can also be carried out in a smaller volume if the solutions are adjusted accordingly.
The final concentrations of reagents as outlined in Table D.2 have proven to be suitable.
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
Table D.2 — PCR reaction reagents
Reagent (concentration) Final concentration Volume per reaction (µl)
a
DNA polymerase buffer without MgCl (10X) 5
2
MgCl (25 mmol/l) 150 µmol/l 0,3
2
dNTP mix (10 mmol/l each) 800 µmol/l 4
EM1F (5 µmol/l) 0,5 µmol/l 2,5
EM1R (5 μmol/l) 0,5 µmol/l 2,5
Template DNA / 1
Thermostable DNA polymerase, 5 IU/µl 0,5 IU/µl 5
Adjust the volume to 50 µl using nuclease-free water
a
If the DNA polymerase buffer already contains MgCl , the final concentration of MgCl in the reaction mixture is
2 2
adjusted to 0,15 mmol/l.
B.1.5.3 PCR controls
[14]
All appropriate controls as given in ISO 22174 shall be performed.
The following strain can be used as positive controls.
Bacillus cereus, emetic strain WDCM 00219.
B.1.5.4 Temperature-time-programme
The temperature-time programme as outlined in Table D.3 and the MasterMix according to Table D.2
[16]
were used in the validation study . The use of other thermal cyclers might make an adaptation
necessary. The time for activation/initial denaturation depends on the polymerase used. The
recommendation of the DNA polymerase manufacturer shall be followed.
Table D.3 — Temperature-time programme
Activation/initial denaturation 95 °C for 15 min
95 °C for 30 s
Amplification 59 °C for 30 s
72 °C for 60 s
Number of cycles (amplification) 30
Final extension 72 °C for 5 min
B.1.5.5 Detection of PCR products
The PCR product is detected after electrophoresis on agarose gel (1,5 %) with an appropriate molecular
[12]
weight marker (refer to ISO 20838 ).
The target sequence is considered to be detected if the size of the PCR product corresponds to the
expected length of the target DNA sequence (see amplicon size in Table D.1). For the interpretation of
[14]
the results, see ISO 22174 .
B.1.5.6 Confirmation of a positive PCR result
[14]
Refer to ISO 22174 .
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B.1.6 Performance characteristics
B.1.6.1 General
[16]
The method has been validated for DNA extracted from different emetic Bacillus cereus group strains .
B.1.6.2 Theoretical evaluation of the method
Theoretical evaluation was done by performing a sequence similarity search against the GenBank/
[27]
EMBL/DDBJ database . The result of the search confirmed a complete identity of the primers only
with the expected target sequence.
B.1.6.3 Selectivity
B.1.6.3.1 Inclusivity
The inclusivity of the method was tested with 30 emetic Bacillus cereus group strains, see Table D.4.
Table D.4 — Inclusivity of the PCR using target strains
Source Number of strains ces gene detected
Food (without connection to a 5 5
foodborne illness/outbreak)
Food connected to foodborne 13 13
illness
Human samples (vomit, faeces) 12 12
B.1.6.3.2 Exclusivity
The exclusivity of the method was tested with 178 non-target organisms, see Table D.5. No cross-
reactivity was observed with the non-target bacteria.
Table D.5 — Exclusivity of the PCR using non-target strains
Species Number of strains ces gene detected
Bacillus cereus non-emetic strains 100 0
Bacillus anthracis 7 0
Bacillus mycoides 6 0
Bacillus thuringiensis 6 0
Bacillus pseudomycoides 3 0
Bacillus weihenstephanensis 7 0
other Bacillus spp. 8 0
Staphylococcus aureus 10 0
Staphylococcus equorum 1 0
Clostridium perfringens 3 0
Listeria monocytogenes 6 0
Campylobacter spp. 3 0
Escherichia coli 4 0
Salmonella spp. 6 0
Yersinia enterocolitica 8 0
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
B.1.6.4 Sensitivity
The detection limit was found to be 2,5 pg template DNA for a 30-cycle PCR protocol, which corresponds
[16]
to approximately 500 genome equivalents .
B.2 Real-time PCR assay for detection of ces gene encoding cereulide peptide
synthetase in strains of Bacillus cereus group
B.2.1 General
This annex describes a probe-based real-time PCR method based on TaqMan technology for the
detection of the ces gene specific for emetic Bacillus cereus group strains.
B.2.2 Principle
Specific DNA fragment of the ces gene specific for emetic Bacillus cereus group strains is amplified by
real-time-PCR. The PCR product is detected by measuring the fluorescence of the probe.
B.2.3 Reagents
B.2.3.1 General
[13] [14]
For the quality of reagents used, refer to ISO 22119 and ISO 22174 .
B.2.3.2 Reagents for nucleic acid extraction
All reagents needed for this annex are molecular grade reagents and consumables suitable for molecular
[11] [12]
biology. They shall be used as given in ISO 20837 and ISO 20838 .
B.2.3.3 Ready to use MasterMix for real-time-PCR
A ready-to-use MasterMix contains PCR-buffer solution, MgCl -solution, dNTP-solution, optional a
2
decontamination System (dUTP included uracil N-glycosylase) and Taq-Polymerase and is mostly
adapted to the thermal cycler used. The manufacturer’s instructions for use should be considered.
B.2.3.4 pUC 19 plasmid
The plasmid is used as internal amplification control (IAC).
B.2.3.5 Oligonucleotides
Sequences of the oligonucleotides are listed in Table D.6.
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(E)
Table D.6 — Sequences of oligonucleotides
Gene Primer/probe Sequence (5′ – 3′)
ces_TaqMan_for CGC CGA AAG TGA TTA TAC CAA
ces ces_TaqMan_re TAT GCC CCG TTC TCA AAC TG
a b
ces_TaqMan_probe FAM -GGGAAAATAACGAGAAATGCA-TAMRA
IAC_for TGT GAA ATA CCG CAC AGA TG
Internal amplification
control (IAC) IAC_re AGC TGG CGT AAT AGC GAA G
[9]
(see ISO/TS 17919 )
c b
IAC_probe HEX - GAG AAA ATA CCG CAT CAG GC -TAMRA
a
FAM: 6-carboxyfluorescein
b
TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine
c
HEX: 5’-Hexachloro-Fluorescein
NOTE The use of other fluorescence labels for the probes has not been tested or validated.
B.2.4 Equipment and consumables
B.2.4.1 General
Appropriate equipment according to the method and, in particular, the following.
B.2.4.2 Equipment for nucleic acid extraction
D.2.4.2.1 Micro-centrifuge tubes, with capacities of 1,5 ml or 2,0 ml.
D.2.4.2.2 Centrifuge, for reaction tubes with a capacity of 1,5 ml or 2,0 ml and capable of achieving
an acceleration up to approximately 14 000g.
D.2.4.2.3 Thermoblock, with heating capacity of up to 100 °C.
D.2.4.2.4 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 μl to 1 000 μl.
D.2.4.2.5 Mixer.
B.2.4.3 Equipment for PCR
D.2.4.3.1 PCR thermal cycler.
D.2.4.3.2 Thin-walled PCR microtubes, 0,2 ml or 0,5 ml reaction tubes, multi-well PCR microplates
or other suitable equipment.
B.2.4.4 Equipment for the detection of PCR products
[12]
Refer to ISO 20838 .
B.2.5 Procedure
B.2.5.1 Nucleic acid extraction
Confirmed B. cereus group colonies according to 9.4 should be used for DNA extraction. Prior to DNA
extraction, the colonies can be optionally washed by centrifugation in 1 ml of nuclease free water. Any
nucleic acid extraction procedure appropriate for Gram-
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 7932
Troisième édition
2004-06-15
AMENDEMENT 1
2020-03-31
Version corrigée 2
2020-08
Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour le
dénombrement de Bacillus cereus
présomptifs — Technique par
comptage des colonies à 30 °C
AMENDEMENT 1: Ajout de tests
optionnels
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus —
Colony-count technique at 30 °C
AMENDMENT 1: Inclusion of optional tests
Numéro de référence
ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
©
ISO 2020
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Publié en Suisse
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne
alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième version corrigée de l’ISO 7932:2004/Amd.1:2020 inclut les corrections suivantes:
— les Annexes A, B, C et D ont été corrigés en Annexes C, D, E et F (selon la première version corrigée);
— dans le Tableau D.2, le volume par réaction de EM1F et EM1R a été corrigé de 2,5 à 5.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement de Bacillus cereus présomptifs —
Technique par comptage des colonies à 30 °C
AMENDEMENT 1: Ajout de tests optionnels
Dans le Domaine d’application
Désigner la NOTE existante comme NOTE 1 et ajouter la NOTE suivante:
[21][22]
NOTE 2 La diversité au sein du groupe Bacillus cereus est importante, avec 7 groupes phylogénétiques et
un nombre croissant d’espèces.
Après le paragraphe 9.4
Ajouter le nouveau paragraphe 9.5:
9.5 Essais optionnels
9.5.1 Généralités
Tous les essais mentionnés ci-dessous sont optionnels et destinés à des recherches complémentaires
(par exemple épidémiologiques) sur les souches isolées du groupe Bacillus cereus obtenues en 9.4.1,
suivant les modes opératoires décrits aux Annexes C à F.
Dans cet amendement, le terme «groupe B. cereus» est utilisé à la place de «B. cereus présomptif», car
il est plus précis d’un point de vue scientifique, comme l’explique l’avis scientifique de l’EFSA publié
[28]
en 2016 .
9.5.2 Détection des variants cytK-1 ou cytK-2 du gène codant la cytotoxine K
Certaines souches présentes dans les bactéries du groupe B. cereus contiennent l’un des deux variants
rencontrés pour le gène codant la cytotoxine, cytK-1 et cytK-2. Le gène cytK-1 étant spécifique de Bacillus
[17][22] [20]
cytotoxicus, il permet d’identifier rapidement B. cytotoxicus. Le mode opératoire de l’Annexe C
décrit une méthode PCR validée qui cible les deux variants du gène cytK et, s’ils sont présents, indique
laquelle des deux formes est présente. Il permet également d’identifier les isolats de B. cytotoxicus.
9.5.3 Détection des souches du groupe Bacillus cereus capables de produire du céreulide
Certaines souches présentes dans les bactéries du groupe B. cereus sont capables de produire un
dodécadepsipeptide thermostable, appelé céreulide. Ce céreulide, lorsqu’il est produit dans les aliments,
peut provoquer une intoxication alimentaire avec syndrome émétique.
[10]
NOTE La méthode de quantification du céreulide est décrite dans l’ISO 18465 .
Le gène ces codant une peptide synthétase du céreulide est impliqué dans la synthèse non ribosomique
[16]
du céreulide . Le mode opératoire de l’Annexe D décrit une méthode PCR rapide et validée qui cible le
gène ces.
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
9.5.4 Essai de mobilité pour le dépistage de B. anthracis
L’essai de mobilité décrit à l’Annexe E permet de dépister les B. anthracis présomptifs présents parmi les
bactéries isolées du groupe B. cereus.
NOTE Cet essai présente toutefois des limites importantes telles qu’indiquées à l’Annexe E (voir E.1 et
Tableau E.1).
9.5.5 Examen au microscope du cristal parasporal de Bacillus thuringiensis
L’espèce B. thuringiensis, l’une des espèces du groupe B. cereus, peut être différenciée des autres espèces
de ce groupe par l’examen au microscope de la formation du cristal parasporal.
Le mode opératoire pour l’examen de la formation du cristal parasporal est décrit à l’Annexe F.
Après l’Annexe B
Ajouter ce qui suit sous forme d’Annexes C, D, E et F.
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
Annexe C
(informative)
Détection des gènes cytK-1 ou cytK-2 des variants de la
cytotoxine K par réaction en chaîne par polymérase (PCR) dans
les souches du groupe Bacillus cereus et identification de Bacillus
cytotoxicus
C.1 Généralités
Le gène chromosomique cytK-2 code la cytotoxine K, une entérotoxine présente parmi les souches de B.
[22]
cereus sensu stricto et de B. thuringiensis .
La présence du gène cytK-2 est également mentionnée dans des souches d’autres espèces du groupe B.
[29]
cereus . Le gène cytK-1 est un variant du gène cytK-2 en raison d’un polymorphisme marqué et code
[18]
une forme plus cytotoxique de la cytotoxine K qui est présente uniquement chez B. cytotoxicus .
Cette méthode est applicable aux colonies correctement isolées des souches du groupe B. cereus, après
une préparation appropriée de l’ADN.
C.2 Principes
C.2.1 Généralités
La méthode comprend les étapes successives suivantes:
a) extraction de l’acide nucléique;
b) amplification du gène cible et interprétation.
C.2.2 Extraction de l’acide nucléique
Les cellules bactériennes sont prélevées sur des colonies correctement isolées et l’acide nucléique est
extrait pour être utilisé dans la réaction de PCR.
C.2.3 Amplification du gène cible et interprétation
L’acide nucléique extrait est sélectivement amplifié par PCR. La détection des produits PCR est effectuée
par électrophorèse sur agarose. L’interprétation est déduite de la présence ou de l’absence de la bande
attendue.
C.3 Réactifs
C.3.1 Généralités
Tous les réactifs nécessaires à cette annexe sont des réactifs de qualité biologie moléculaire et les
consommables adaptés à la biologie moléculaire. Ils doivent être utilisés conformément aux indications
[11] [12]
données dans l’ISO 20837 et l’ISO 20838 .
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
C.3.2 Extraction de l’acide nucléique
Le mode opératoire et les réactifs d’extraction de l’acide nucléique utilisés doivent être adaptés aux
bactéries à Gram positif.
Des kits du commerce peuvent également être utilisés.
C.3.3 Réactifs pour PCR
[14] [12]
Se référer aux normes ISO 22174 et ISO 20838 .
C.3.4 Amorces
Les amorces utilisées pour la détection des gènes de la cytotoxine K sont répertoriées dans le
Tableau C.1.
Tableau C.1 — Séquences d’oligonucléotides, caractéristiques et amplicons obtenus
Variant Position sur Taille de
Amorce Séquence (5′ – > 3′)
du gène le gène cytK l’amplicon (pb)
CK1F F CAA TTC CAG GGG CAA GTG TC cytK-1 314–333
Numéro
426
a
CK1R R CCT CGT GCA TCT GTT TCA TGA G 740–719
d’accès
DQ885233.1
CK2F F CAA TCC CTG GCG CTA GTG CA cytK-2 314–333
Numéro
585
a
CK2R R GTG IAG CCT GGA CGA AGT TGG 899–879
d’accès
AJ318876.2
Légende
F: sens
R: antisens
a
Consulter les séquences nucléotidiques accessibles au public à l’adresse http:// www .www .ncbi .nlm .nih .gov
C.4 Équipement et consommables
C.4.1 Généralités
Équipement approprié conforme à la méthode et, en particulier, ce qui suit:
C.4.2 Équipement pour l’extraction de l’acide nucléique
C.4.2.1 Tubes pour microcentrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml.
C.4.2.2 Centrifugeuse, pour tubes d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml, et capable d’atteindre une
accélération d’environ 14 000g.
C.4.2.3 Bloc thermique, pouvant atteindre 100 °C.
C.4.2.4 Pipettes graduées et embouts à filtres pour pipettes, pour des volumes compris entre 1 μl
et 1 000 µl.
C.4.2.5 Agitateur.
C.4.3 Équipement pour PCR
C.4.3.1 Thermocycleur.
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
C.4.3.2 Microtubes de PCR à parois minces, tubes de 0,2 ml ou 0,5 ml, microplaques multipuits pour
PCR ou tout autre équipement approprié.
C.4.4 Équipement pour la détection de produits PCR
[12]
Voir l’ISO 20838 .
C.5 Mode opératoire
C.5.1 Généralités
Voir Figure C.1.
Figure C.1 — Logigramme pour la détection par PCR du gène de la cytotoxine K (variants cytK-1
ou cytK-2) dans les souches du groupe B. cereus et l’identification de B. cytotoxicus
C.5.2 Extraction de l’acide nucléique
Pour l’extraction de l’ADN, il convient d’utiliser des colonies du groupe B. cereus confirmées
conformément à 9.4. Facultativement, avant extraction de l’ADN, les colonies peuvent être lavées par
centrifugation dans 1 ml d’eau exempte de nucléases. Tout mode opératoire d’extraction de l’acide
nucléique applicable aux bactéries à Gram positif et adapté à cette fin peut être utilisé (par exemple,
Référence [15]).
Une anse de 10 µl de colonie est prélevée (d’une gélose MYP ou d’une gélose non sélective) et mise
en suspension dans 1 ml d’eau exempte de nucléases, centrifugée à 11 000g pendant 15 min. Le
culot est remis en suspension dans 500 µl de tampon d’extraction (1,7 g/l de dodécylsulfate de
sodium, 200 mmol/l de Tris-HCl (pH 8), 20 mmol/l d’EDTA, 200 mmol/l de NaCl). La suspension est
incubée à 55 °C pendant 1 h avec 25 µl de protéinase K (10 µg/µl). L’ADN est extrait avec un volume
de phénol puis avec un volume de chloroforme. La phase aqueuse est précipitée avec 2,5 volumes
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d’éthanol froid (fraction volumique de 100 %) et centrifugée à 11 000g pendant 20 min. Le surnageant
est jeté et le culot est lavé une fois avec 800 µl d’éthanol froid (fraction volumique de 70 %). Après
séchage, le culot est dissous dans 50 µl d’eau exempte de nucléases et conservé à ‒20 °C. La quantité
d’ADN est déterminée par absorbance à 260 nm dans un spectrophotomètre et doit être ajustée à une
concentration compatible avec la sensibilité de la PCR (voir C.6.3).
D’autres méthodes ou kits de purification prêts à l’emploi et disponibles dans le commerce peuvent être
utilisés si des témoins (voir C.5.3.2) sont soigneusement employés.
C.5.3 Amplification par PCR
C.5.3.1 Généralités
Le volume total de PCR est de 15 µl par réaction. Les réactifs sont répertoriés dans le Tableau C.2. Les
concentrations finales en réactifs indiquées dans le tableau se sont révélées appropriées.
Tableau C.2 — Réactifs de PCR
Réactif (concentration) Concentration finale Volume par réaction (μl)
Tampon ADN polymérasea (10x) 1x 1,5
Mélange de dNTP (5 mmol/l chacun) 0,2 mmol/l chacun 0,6
CK1F (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK1R (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK2F (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK2R (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
MgCl (25 mmol/l) 2,5 mmol/l 1,5
2
a
ADN polymérase 0,75 U 0,15
ADN matrice (génomique - 25 ng/µl) 2,5
Compléter au volume à 15 µl avec de l’eau exempte de nucléases
a 1)
Ce protocole a été validé à l’aide du tampon AmpliTaq®10x et de la polymérase AmpliTaq® disponibles dans
le commerce et du mélange maître contenant les quatre dNTP.
1)
Le tampon AmpliTaq®10x et la polymérase AmpliTaq® sont des produits fournis par Applied Biosystems,
Forster City, CA, États-Unis. Le mélange maître est un produit fourni par Eurogentec. Cette information est
donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un
engagement de l’ISO à l’égard de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré
qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
Différents protocoles d’amplification par PCR peuvent être utilisés, en fonction de l’ADN polymérase
et de la technique de préparation de l’ADN utilisées. Cependant, la réaction PCR doit être stringente,
réalisée à l’aide des amorces décrites dans le Tableau C.1 avec une température d’hybridation appropriée
(voir Tableau C.4) et les témoins appropriés (voir C.5.3.2), la fiabilité des amorces étant validée avec une
température d’hybridation spécifique. Les souches témoins sont répertoriées dans le Tableau C.3.
Tableau C.3 — Souches témoins à inclure dans les essais PCR
Numéro WDCMa (espèce) cytK-1 cytK-2
WDCM 00218 Témoin négatif Témoin positif
(Bacillus cereus)
WDCM 00220 Témoin positif Témoin négatif
(Bacillus cytotoxicus)
WDCM 00222 (Bacillus Témoin négatif Témoin négatif
weihenstephanensis)
a
Consulter le catalogue des souches de référence disponible sur http:// www .wfcc .info
pour avoir des informations sur les numéros de collection des souches de culture et les
coordonnées des contacts.
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C.5.3.2 Témoins de PCR
[14]
Tous les témoins appropriés indiqués dans l’ISO 22174 doivent être mis en œuvre. Au moins un
témoin positif et un témoin négatif, représentés pour chaque variant de gène par un ADN de souche
bactérienne négative connu et par un ADN de souche bactérienne positive connu, respectivement,
doivent être inclus dans la réaction PCR pour vérifier les conditions d’amplification.
Il convient que l’ADN des témoins positifs (notamment les témoins de processus indiqués dans
[14]
l’ISO 22174 ) soit obtenu selon le même protocole d’extraction de l’ADN que pour les souches d’essai.
C.5.3.3 Programme d’amplification
Le programme d’amplification indiqué dans le Tableau C.4 a été utilisé lors de l’étude d’évaluation.
Tableau C.4 — Programme d’amplification
Dénaturation initiale 94 °C pendant 5 min
Dénaturation 94 °C pendant 15 s
Amplification Hybridation 57 °C pendant 30 s
Élongation 72 °C pendant 30 s
Nombre de cycles 30
Extension finale 72 °C pendant 7 min
C.5.3.4 Détection des produits PCR
Les produits PCR sont détectés après électrophorèse sur gel d’agarose (1,5 %) avec un marqueur de
[12]
poids moléculaire approprié (voir l’ISO 20838 ).
C.5.4 Interprétation du résultat de la PCR
Il convient que le résultat obtenu, y compris les témoins spécifiés ci-dessus (voir C.5.3.2), soit tel
qu’indiqué ci-après, à défaut de quoi la PCR doit être répétée.
Le résultat de la PCR sera:
a) positif pour le variant cytK-1, si un produit PCR spécifique de 426 pb a été détecté et si tous les
témoins donnent les résultats attendus; ou
b) positif pour le variant cytK-2, si un produit PCR spécifique de 585 pb a été détecté et si tous les
témoins donnent les résultats attendus; ou
c) négatif pour les gènes de la cytotoxine K, si aucun produit PCR spécifique n’a été détecté et si tous
les témoins donnent les résultats attendus.
C.5.5 Confirmation du produit PCR
[14]
Voir l’ISO 22174 .
C.6 Caractéristiques de performance
C.6.1 Généralités
Cette méthode a été évaluée lors d’une étude de validation intralaboratoire. Elle a été soumise à essai
sur un total de 160 souches du groupe B. cereus et de 10 espèces hors-groupe, en incluant du transfert
[23] [22]
de Southern ou le séquençage des produits PCR , puis appliquée sur 391 souches . L’essai s’est avéré
[25]
très fiable, avec 0 % de faux-négatifs et 0 % de faux-positifs. L’analyse BLASTN a également montré
l’absence d’autre cible que le gène cytK parmi les organismes bactériens, pour les quatre amorces
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incluses dans la réaction PCR. La spécificité pour les variants cytK-1 et cytK-2 était de 100 % dans les
[23]
conditions de PCR décrites et avec les témoins recommandés (voir C.5.3.2).
C.6.2 Sélectivité
C.6.2.1 Généralités
La sélectivité a été déterminée lors d’une PCR duplex à l’aide des amorces CK1F, CK1R, CK2F, CK2R, en
travaillant par paire (CK1F/CK1R et CK2F/CK2R). Il a été démontré que chaque paire d’amorces amplifie
respectivement exclusivement le variant cytK-1 ou cytK-2, et cible les régions faiblement conservées de
chaque variant.
C.6.2.2 Inclusivité
L’inclusivité de la réaction PCR pour le fragment cytK-2 a été évaluée sur 66 souches cibles. Une
inclusivité de 100 % a été obtenue. L’inclusivité de la réaction PCR pour le fragment cytK-1 a été évaluée
sur 5 souches cibles. Une inclusivité de 100 % a été obtenue. Les souches évaluées pour le variant
cytK-2 étaient des souches de B. cereus sensu stricto et B. thuringiensis. Les souches cibles pour cytK-1
correspondent aux cinq souches de B. cytotoxicus qui étaient disponibles au moment de l’évaluation.
Elles étaient suffisamment distantes des autres espèces du groupe pour présenter un polymorphisme
particulier du variant cytK-1 pour le gène cytK.
C.6.2.3 Exclusivité
L’exclusivité de la réaction pour le fragment cytK-1 a été évaluée sur 157 souches non cibles. Une
exclusivité de 100 % a été obtenue. L’exclusivité de l’essai pour le fragment cytK-2 a été évaluée sur
94 souches non cibles. Une exclusivité de 100 % a été obtenue.
Les souches évaluées provenaient de toutes les espèces du groupe B. cereus et de huit autres espèces
d’origine alimentaire.
C.6.3 Sensibilité
Les limites pour l’amplification par PCR étaient comprises entre 15 ng et 75 ng d’ADN génomique pour
15 µl de réaction finale.
C.7 Limites de la réaction PCR
Cette réaction PCR permet a) de détecter les gènes de la cytotoxine K (en particulier l’un de ses deux
variants) et b) d’identifier les souches B. cytotoxicus, deux caractéristiques associées à l’intoxication
alimentaire. Même si elle indique un risque potentiel, la seule présence du gène ou l’identification de
l’espèce ne permet pas de confirmer l’expression du gène cytK.
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Annexe D
(informative)
Détection du gène ces codant la peptide synthétase du céreulide
par réaction en chaîne par polymérase (PCR) dans les souches du
groupe Bacillus cereus
D.1 Détection du gène ces codant la peptide synthétase du céreulide par PCR sur
gel d’agarose dans les souches du groupe Bacillus cereus
D.1.1 Généralités
Cette annexe décrit une méthode d’amplification et de détection par électrophorèse sur gel d’agarose
du gène ces spécifique de la production de céreulide dans les souches du groupe Bacillus cereus.
D.1.2 Principe
Le fragment d’ADN spécifique du gène ces est amplifié par PCR à l’aide de deux amorces. La détection du
produit PCR est effectuée par électrophorèse sur gel d’agarose.
D.1.3 Réactifs
D.1.3.1 Généralités
Tous les réactifs nécessaires à cette annexe sont des réactifs de qualité biologie moléculaire et des
consommables adaptés à la biologie moléculaire. Ils doivent être utilisés conformément aux indications
[11] [12]
données dans l’ISO 20837 et l’ISO 20838 .
D.1.3.2 Réactifs pour l’extraction de l’acide nucléique
Le mode opératoire et les réactifs d’extraction de l’acide nucléique utilisés doivent être adaptés aux
bactéries à Gram positif. Des kits du commerce peuvent également être utilisés.
D.1.3.3 Réactifs pour PCR
D.1.3.3.1 Solution tampon de PCR.
La solution tampon de PCR 10x est généralement fournie avec l’ADN polymérase, qui peut contenir ou
non du MgCl dans une concentration spécifiée par le fabricant. Les concentrations finales en MgCl
2 2
dépendent de la méthode et sont donc répertoriées dans le Tableau D.2. Des réactifs prêts à l’emploi
disponibles dans le commerce peuvent être utilisés. Il convient de suivre les instructions du fabricant.
D.1.3.3.2 Solution de MgCl , c (MgCl ) = 25 mmol/l.
2 2
D.1.3.3.3 ADN polymérase thermostable (pour PCR hot-start), 5 UI/µl.
D.1.3.3.4 Solution de dNTP, c (dNTP) = 10 mmol/l, pour le mélange.
D.1.3.3.5 Oligonucléotides.
Le Tableau D.1 présente les séquences d’oligonucléotides.
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Tableau D.1 — Séquences d’oligonucléotides
Taille de
Gène Amorce Séquence (5′ – 3′)
l’amplicon (pb)
ces EM1F GAC AAG AGA AAT TTC TAC GAG CAA GTA CAA T 635
EM1R GCA GCC TTC CAA TTAC TCC TTC TGC CAC AGT
D.1.3.4 Réactifs pour électrophorèse sur gel
[12]
Voir l’ISO 20838 .
D.1.4 Équipement et consommables
D.1.4.1 Généralités
Équipement approprié conforme à la méthode et, en particulier, ce qui suit:
D.1.4.2 Équipement pour l’extraction de l’acide nucléique
D.1.4.2.1 Tubes pour microcentrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml.
D.1.4.2.2 Centrifugeuse, pour tubes d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml, et capable d’atteindre une
accélération d’environ 14 000g.
D.1.4.2.3 Bloc thermique, pouvant atteindre 100 °C.
D.1.4.2.4 Pipettes graduées et embouts à filtres pour pipettes, pour des volumes compris
entre 1 μl et 1 000 µl.
D.1.4.2.5 Agitateur.
D.1.4.3 Équipement pour PCR
D.1.4.3.1 Pipettes et embouts à filtres pour pipettes, d’une capacité comprise entre 1 µl
et 1 000 µl.
D.1.4.3.2 Tubes pour microcentrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml.
D.1.4.3.3 Microtubes de PCR à parois minces, tubes de 0,2 ml ou 0,5 ml, microplaques multipuits
pour PCR ou tout autre équipement approprié.
D.1.4.3.4 Thermocycleur.
D.1.4.4 Équipement pour la détection du produit PCR
[12]
Voir l’ISO 20838 .
D.1.5 Mode opératoire
D.1.5.1 Extraction de l’acide nucléique
Pour l’extraction de l’ADN, il convient d’utiliser des colonies du groupe B. cereus confirmées
conformément à 9.4. Facultativement, avant extraction de l’ADN, les colonies peuvent être lavées par
centrifugation dans 1 ml d’eau exempte de nucléases. Le protocole décrit en C.5.2 peut être utilisé ainsi
que tout mode opératoire d’extraction de l’acide nucléique applicable aux bactéries à Gram positif et
adapté à cette fin (par exemple, Référence [15]).
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
D.1.5.2 Préparation de la PCR
La méthode est décrite pour un volume total de PCR de 50 µl par réaction, avec les réactifs énumérés
dans le Tableau D.2. La PCR peut également être effectuée dans un volume plus faible si les solutions
sont ajustées en conséquence. Les concentrations finales en réactifs indiquées dans le Tableau D.2 se
sont révélées appropriées.
Tableau D.2 — Réactifs de PCR
Réactif (concentration) Concentration finale Volume par réaction (μl)
a
Tampon ADN polymérase exempt de MgCl (10X) 5
2
MgCl (25 mmol/l) 150 µmol/l 0,3
2
Mélange de dNTP (10 mmol/l chacun) 800 µmol/l 4
EM1F (5 µmol/l) 0,5 µmol/l 5
EM1R (5 μmol/l) 0,5 µmol/l 5
ADN matrice / 1
ADN polymérase thermostable, 5 UI/µl 0,5 UI/µl 5
Compléter au volume à 50 µl avec de l’eau exempte de nucléases
a
Si le tampon ADN polymérase contient déjà du MgCl , la concentration finale en MgCl dans le mélange réac-
2 2
tionnel est ajustée à 0,15 mmol/l.
D.1.5.3 Témoins de PCR
[14]
Tous les témoins appropriés indiqués dans l’ISO 22174 doivent être mis en œuvre.
La souche suivante peut être utilisée comme témoin positif:
Bacillus cereus, souche émétique WDCM 00219.
D.1.5.4 Programme d’amplification
Le programme d’amplification décrit dans le Tableau D.3 et le mélange maître décrit dans le Tableau D.2
[16]
ont été utilisés lors de l’étude de validation . L’utilisation d’autres thermocycleurs peut nécessiter
une adaptation. Le temps nécessaire pour l’activation/la dénaturation initiale dépend de la polymérase
utilisée. La recommandation donnée par le fabricant de l’ADN polymérase doit être suivie.
Tableau D.3 — Programme d’amplification
Activation/dénaturation initiale 95 °C pendant 15 min
95 °C pendant 30 s
Amplification 59 °C pendant 30 s
72 °C pendant 60 s
Nombre de cycles (amplification) 30
Extension finale 72 °C pendant 5 min
D.1.5.5 Détection des produits PCR
Le produit PCR est détecté après électrophorèse sur gel d’agarose (1,5 %) avec un marqueur de poids
[12]
moléculaire approprié (voir l’ISO 20838 ).
La séquence cible est considérée comme étant détectée si la taille du produit PCR correspond à la
longueur escomptée de la séquence d’ADN cible (voir taille de l’amplicon dans le Tableau D.1). Pour
[14]
l’interprétation des résultats, voir l’ISO 22174 .
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D.1.5.6 Confirmation d’un résultat PCR positif
[14]
Voir l’ISO 22174 .
D.1.6 Caractéristiques de performance
D.1.6.1 Généralités
La méthode a été validée avec l’ADN extrait de différentes souches émétiques du groupe Bacillus
[16]
cereus .
D.1.6.2 Évaluation théorique de la méthode
L’évaluation théorique a été effectuée en réalisant une recherche de similarité de séquences dans la
[27]
base de données GenBank/EMBL/DDBJ . Le résultat de cette recherche a confirmé une homologie
complète des amorces uniquement avec la séquence cible prévue.
D.1.6.3 Sélectivité
D.1.6.3.1 Inclusivité
L’inclusivité de la méthode a été soumise à essai avec 30 souches émétiques du groupe Bacillus cereus,
voir Tableau D.4.
Tableau D.4 — Inclusivité de la PCR à l’aide de souches cibles
Source Nombre de souches Gène ces détecté
Aliments (sans rapport avec une 5 5
intoxication/épidémie alimentaire)
Aliments en rapport avec une 13 13
intoxication alimentaire
Échantillons d’origine humaine 12 12
(vomi, matières fécales)
D.1.6.3.2 Exclusivité
L’exclusivité de la méthode a été soumise à essai avec 178 organismes non cibles, voir Tableau D.5.
Aucune réactivité croisée n’a été observée avec les bactéries non cibles.
Tableau D.5 — Exclusivité de la PCR à l’aide de souches non cibles
Espèce Nombre de souches Gène ces détecté
Souches non émétiques du groupe 100 0
Bacillus cereus
Bacillus anthracis 7 0
Bacillus mycoides 6 0
Bacillus thuringiensis 6 0
Bacillus pseudomycoides 3 0
Bacillus weihenstephanensis 7 0
other Bacillus spp. 8 0
Staphylococcus aureus 10 0
Staphylococcus equorum 1 0
Clostridium perfringens 3 0
Listeria monocytogenes 6 0
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
Tableau D.5 (suite)
Espèce Nombre de souches Gène ces détecté
Campylobacter spp. 3 0
Escherichia coli 4 0
Salmonella spp. 6 0
Yersinia enterocolitica 8 0
D.1.6.4 Sensibilité
La limite de détection était de 2,5 pg d’ADN matrice pour un protocole PCR de 30 cycles, ce qui
[16]
correspond à environ 500 équ
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 7932
Troisième édition
2004-06-15
AMENDEMENT 1
2020-03
Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour le
dénombrement de Bacillus cereus
présomptifs — Technique par
comptage des colonies à 30 degrés C
AMENDEMENT 1: Ajout de tests
optionnels
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method
for the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count
technique at 30 degrees C
AMENDMENT 1: Inclusion of optional tests
Numéro de référence
ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
©
ISO 2020
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Publié en Suisse
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Avant-propos
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nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
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alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour
le dénombrement de Bacillus cereus présomptifs —
Technique par comptage des colonies à 30 degrés C
AMENDEMENT 1: Ajout de tests optionnels
Dans le Domaine d’application
Désigner la NOTE existante comme NOTE 1 et ajouter la NOTE suivante:
[21][22]
NOTE 2 La diversité au sein du groupe Bacillus cereus est importante, avec 7 groupes phylogénétiques et
un nombre croissant d’espèces.
Après le paragraphe 9.4
Ajouter le nouveau paragraphe 9.5:
9.5 Essais optionnels
9.5.1 Généralités
Tous les essais mentionnés ci-dessous sont optionnels et destinés à des recherches complémentaires
(par exemple épidémiologiques) sur les souches isolées du groupe Bacillus cereus obtenues en 9.4.1,
suivant les modes opératoires décrits aux Annexes C à F.
Dans cet amendement, le terme «groupe B. cereus» est utilisé à la place de «B. cereus présomptif», car
il est plus précis d’un point de vue scientifique, comme l’explique l’avis scientifique de l’EFSA publié
[28]
en 2016 .
9.5.2 Détection des variants cytK-1 ou cytK-2 du gène codant la cytotoxine K
Certaines souches présentes dans les bactéries du groupe B. cereus contiennent l’un des deux variants
rencontrés pour le gène codant la cytotoxine, cytK-1 et cytK-2. Le gène cytK-1 étant spécifique de Bacillus
[17][22] [20]
cytotoxicus, il permet d’identifier rapidement B. cytotoxicus. Le mode opératoire de l’Annexe C
décrit une méthode PCR validée qui cible les deux variants du gène cytK et, s’ils sont présents, indique
laquelle des deux formes est présente. Il permet également d’identifier les isolats de B. cytotoxicus.
9.5.3 Détection des souches du groupe Bacillus cereus capables de produire du céreulide
Certaines souches présentes dans les bactéries du groupe B. cereus sont capables de produire un
dodécadepsipeptide thermostable, appelé céreulide. Ce céreulide, lorsqu’il est produit dans les aliments,
peut provoquer une intoxication alimentaire avec syndrome émétique.
[10]
NOTE La méthode de quantification du céreulide est décrite dans l’ISO 18465 .
Le gène ces codant une peptide synthétase du céreulide est impliqué dans la synthèse non ribosomique
[16]
du céreulide . Le mode opératoire de l’Annexe D décrit une méthode PCR rapide et validée qui cible le
gène ces.
9.5.4 Essai de mobilité pour le dépistage de B. anthracis
© ISO 2020 – Tous droits réservés 1
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
L’essai de mobilité décrit à l’Annexe E permet de dépister les B. anthracis présomptifs présents parmi les
bactéries isolées du groupe B. cereus.
NOTE Cet essai présente toutefois des limites importantes telles qu’indiquées à l’Annexe E (voir E.1 et
Tableau E.1).
9.5.5 Examen au microscope du cristal parasporal de Bacillus thuringiensis
L’espèce B. thuringiensis, l’une des espèces du groupe B. cereus, peut être différenciée des autres espèces
de ce groupe par l’examen au microscope de la formation du cristal parasporal.
Le mode opératoire pour l’examen de la formation du cristal parasporal est décrit à l’Annexe F.
Après l’Annexe B
Ajouter ce qui suit sous forme d’Annexes C, D, E et F.
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
Annexe A
(informative)
Détection des gènes cytK-1 ou cytK-2 des variants de la
cytotoxine K par réaction en chaîne par polymérase (PCR) dans
les souches du groupe Bacillus cereus et identification de Bacillus
cytotoxicus
A.1 Généralités
Le gène chromosomique cytK-2 code la cytotoxine K, une entérotoxine présente parmi les souches de B.
[22]
cereus sensu stricto et de B. thuringiensis .
La présence du gène cytK-2 est également mentionnée dans des souches d’autres espèces du groupe B.
[29]
cereus . Le gène cytK-1 est un variant du gène cytK-2 en raison d’un polymorphisme marqué et code
[18]
une forme plus cytotoxique de la cytotoxine K qui est présente uniquement chez B. cytotoxicus .
Cette méthode est applicable aux colonies correctement isolées des souches du groupe B. cereus, après
une préparation appropriée de l’ADN.
A.2 Principes
A.2.1 Généralités
La méthode comprend les étapes successives suivantes:
a) extraction de l’acide nucléique;
b) amplification du gène cible et interprétation.
A.2.2 Extraction de l’acide nucléique
Les cellules bactériennes sont prélevées sur des colonies correctement isolées et l’acide nucléique est
extrait pour être utilisé dans la réaction de PCR.
A.2.3 Amplification du gène cible et interprétation
L’acide nucléique extrait est sélectivement amplifié par PCR. La détection des produits PCR est effectuée
par électrophorèse sur agarose. L’interprétation est déduite de la présence ou de l’absence de la bande
attendue.
A.3 Réactifs
A.3.1 Généralités
Tous les réactifs nécessaires à cette annexe sont des réactifs de qualité biologie moléculaire et les
consommables adaptés à la biologie moléculaire. Ils doivent être utilisés conformément aux indications
[11] [12]
données dans l’ISO 20837 et l’ISO 20838 .
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A.3.2 Extraction de l’acide nucléique
Le mode opératoire et les réactifs d’extraction de l’acide nucléique utilisés doivent être adaptés aux
bactéries à Gram positif.
Des kits du commerce peuvent également être utilisés.
A.3.3 Réactifs pour PCR
[14] [12]
Se référer aux normes ISO 22174 et ISO 20838 .
A.3.4 Amorces
Les amorces utilisées pour la détection des gènes de la cytotoxine K sont répertoriées dans le
Tableau C.1.
Tableau C.1 — Séquences d’oligonucléotides, caractéristiques et amplicons obtenus
Variant Position sur Taille de
Amorce Séquence (5′ – > 3′)
du gène le gène cytK l’amplicon (pb)
CK1F F CAA TTC CAG GGG CAA GTG TC cytK-1 314–333
Numéro
426
a
CK1R R CCT CGT GCA TCT GTT TCA TGA G 740–719
d’accès
DQ885233.1
CK2F F CAA TCC CTG GCG CTA GTG CA cytK-2 314–333
Numéro
585
a
CK2R R GTG IAG CCT GGA CGA AGT TGG 899–879
d’accès
AJ318876.2
Légende
F: sens
R: antisens
a
Consulter les séquences nucléotidiques accessibles au public à l’adresse http:// www .www .ncbi .nlm .nih .gov
A.4 Équipement et consommables
A.4.1 Généralités
Équipement approprié conforme à la méthode et, en particulier, ce qui suit:
A.4.2 Équipement pour l’extraction de l’acide nucléique
C.4.2.1 Tubes pour microcentrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml.
C.4.2.2 Centrifugeuse, pour tubes d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml, et capable d’atteindre une
accélération d’environ 14 000 g.
C.4.2.3 Bloc thermique, pouvant atteindre 100 °C.
C.4.2.4 Pipettes graduées et embouts à filtres pour pipettes, pour des volumes compris entre 1 μl
et 1 000 µl.
C.4.2.5 Agitateur.
A.4.3 Équipement pour PCR
C.4.3.1 Thermocycleur.
4 © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO 7932:2004/Amd.1:2020(F)
C.4.3.2 Microtubes de PCR à parois minces, tubes de 0,2 ml ou 0,5 ml, microplaques multipuits pour
PCR ou tout autre équipement approprié.
A.4.4 Équipement pour la détection de produits PCR
[12]
Voir l’ISO 20838 .
A.5 Mode opératoire
A.5.1 Généralités
Voir Figure C.1.
Figure C.1 — Logigramme pour la détection par PCR du gène de la cytotoxine K (variants cytK-1
ou cytK-2) dans les souches du groupe B. cereus et l’identification de B. cytotoxicus
A.5.2 Extraction de l’acide nucléique
Pour l’extraction de l’ADN, il convient d’utiliser des colonies du groupe B. cereus confirmées
conformément à 9.4. Facultativement, avant extraction de l’ADN, les colonies peuvent être lavées par
centrifugation dans 1 ml d’eau exempte de nucléases. Tout mode opératoire d’extraction de l’acide
nucléique applicable aux bactéries à Gram positif et adapté à cette fin peut être utilisé (par exemple,
Référence [15]).
Une anse de 10 µl de colonie est prélevée (d’une gélose MYP ou d’une gélose non sélective) et mise
en suspension dans 1 ml d’eau exempte de nucléases, centrifugée à 11 000 g pendant 15 min. Le
culot est remis en suspension dans 500 µl de tampon d’extraction (1,7 g/l de dodécylsulfate de
sodium, 200 mmol/l de Tris-HCl (pH 8), 20 mmol/l d’EDTA, 200 mmol/l de NaCl). La suspension est
incubée à 55 °C pendant 1 h avec 25 µl de protéinase K (10 µg/µl). L’ADN est extrait avec un volume
de phénol puis avec un volume de chloroforme. La phase aqueuse est précipitée avec 2,5 volumes
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d’éthanol froid (fraction volumique de 100 %) et centrifugée à 11 000 g pendant 20 min. Le surnageant
est jeté et le culot est lavé une fois avec 800 µl d’éthanol froid (fraction volumique de 70 %). Après
séchage, le culot est dissous dans 50 µl d’eau exempte de nucléases et conservé à ‒20 °C. La quantité
d’ADN est déterminée par absorbance à 260 nm dans un spectrophotomètre et doit être ajustée à une
concentration compatible avec la sensibilité de la PCR (voir C.6.3).
D’autres méthodes ou kits de purification prêts à l’emploi et disponibles dans le commerce peuvent être
utilisés si des témoins (voir C.5.3.2) sont soigneusement employés.
A.5.3 Amplification par PCR
A.5.3.1 Généralités
Le volume total de PCR est de 15 µl par réaction. Les réactifs sont répertoriés dans le Tableau C.2. Les
concentrations finales en réactifs indiquées dans le tableau se sont révélées appropriées.
Tableau C.2 — Réactifs de PCR
Réactif (concentration) Concentration finale Volume par réaction (μl)
Tampon ADN polymérasea (10x) 1x 1,5
Mélange de dNTP (5 mmol/l chacun) 0,2 mmol/l chacun 0,6
CK1F (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK1R (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK2F (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
CK2R (10 μmol/l) 0,25 µmol/l 0,375
MgCl (25 mmol/l) 2,5 mmol/l 1,5
2
a
ADN polymérase 0,75 U 0,15
ADN matrice (génomique - 25 ng/µl) 2,5
Compléter au volume à 15 µl avec de l’eau exempte de nucléases
a 1)
Ce protocole a été validé à l’aide du tampon AmpliTaq®10x et de la polymérase AmpliTaq® disponibles dans
le commerce et du mélange maître contenant les quatre dNTP.
1)
Le tampon AmpliTaq®10x et la polymérase AmpliTaq® sont des produits fournis par Applied Biosystems,
Forster City, CA, États-Unis. Le mélange maître est un produit fourni par Eurogentec. Cette information est
donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un
engagement de l'ISO à l’égard de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré
qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
Différents protocoles d’amplification par PCR peuvent être utilisés, en fonction de l’ADN polymérase
et de la technique de préparation de l’ADN utilisées. Cependant, la réaction PCR doit être stringente,
réalisée à l’aide des amorces décrites dans le Tableau C.1 avec une température d’hybridation appropriée
(voir Tableau C.4) et les témoins appropriés (voir C.5.3.2), la fiabilité des amorces étant validée avec une
température d’hybridation spécifique. Les souches témoins sont répertoriées dans le Tableau C.3.
Tableau C.3 — Souches témoins à inclure dans les essais PCR
Numéro WDCMa (espèce) cytK-1 cytK-2
WDCM 00218 Témoin négatif Témoin positif
(Bacillus cereus)
WDCM 00220 Témoin positif Témoin négatif
(Bacillus cytotoxicus)
WDCM 00222 (Bacillus Témoin négatif Témoin négatif
weihenstephanensis)
a
Consulter le catalogue des souches de référence disponible sur pour avoir des informa-
tions sur les numéros de collection des souches de culture et les coordonnées des contacts.
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A.5.3.2 Témoins de PCR
[14]
Tous les témoins appropriés indiqués dans l’ISO 22174 doivent être mis en œuvre. Au moins un
témoin positif et un témoin négatif, représentés pour chaque variant de gène par un ADN de souche
bactérienne négative connu et par un ADN de souche bactérienne positive connu, respectivement,
doivent être inclus dans la réaction PCR pour vérifier les conditions d’amplification.
Il convient que l’ADN des témoins positifs (notamment les témoins de processus indiqués dans
[14]
l’ISO 22174 ) soit obtenu selon le même protocole d’extraction de l’ADN que pour les souches d’essai.
A.5.3.3 Programme d'amplification
Le programme d’amplification indiqué dans le Tableau C.4 a été utilisé lors de l’étude d’évaluation.
Tableau C.4 — Programme d’amplification
Dénaturation initiale 94 °C pendant 5 min
Dénaturation 94 °C pendant 15 s
Amplification Hybridation 57 °C pendant 30 s
Élongation 72 °C pendant 30 s
Nombre de cycles 30
Extension finale 72 °C pendant 7 min
A.5.3.4 Détection des produits PCR
Les produits PCR sont détectés après électrophorèse sur gel d’agarose (1,5 %) avec un marqueur de
[12]
poids moléculaire approprié (voir l’ISO 20838 ).
A.5.4 Interprétation du résultat de la PCR
Il convient que le résultat obtenu, y compris les témoins spécifiés ci-dessus (voir C.5.3.2), soit tel
qu’indiqué ci-après, à défaut de quoi la PCR doit être répétée.
Le résultat de la PCR sera:
a) positif pour le variant cytK-1, si un produit PCR spécifique de 426 pb a été détecté et si tous les
témoins donnent les résultats attendus; ou
b) positif pour le variant cytK-2, si un produit PCR spécifique de 585 pb a été détecté et si tous les
témoins donnent les résultats attendus; ou
c) négatif pour les gènes de la cytotoxine K, si aucun produit PCR spécifique n’a été détecté et si tous
les témoins donnent les résultats attendus.
A.5.5 Confirmation du produit PCR
[14]
Voir l’ISO 22174 .
A.6 Caractéristiques de performance
A.6.1 Généralités
Cette méthode a été évaluée lors d’une étude de validation intralaboratoire. Elle a été soumise à essai
sur un total de 160 souches du groupe B. cereus et de 10 espèces hors-groupe, en incluant du transfert
[23] [22]
de Southern ou le séquençage des produits PCR , puis appliquée sur 391 souches . L’essai s’est avéré
[25]
très fiable, avec 0 % de faux-négatifs et 0 % de faux-positifs. L’analyse BLASTN a également montré
l’absence d’autre cible que le gène cytK parmi les organismes bactériens, pour les quatre amorces
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incluses dans la réaction PCR. La spécificité pour les variants cytK-1 et cytK-2 était de 100 % dans les
[23]
conditions de PCR décrites et avec les témoins recommandés (voir C.5.3.2).
A.6.2 Sélectivité
A.6.2.1 Généralités
La sélectivité a été déterminée lors d’une PCR duplex à l’aide des amorces CK1F, CK1R, CK2F, CK2R, en
travaillant par paire (CK1F/CK1R et CK2F/CK2R). Il a été démontré que chaque paire d’amorces amplifie
respectivement exclusivement le variant cytK-1 ou cytK-2, et cible les régions faiblement conservées de
chaque variant.
A.6.2.2 Inclusivité
L’inclusivité de la réaction PCR pour le fragment cytK-2 a été évaluée sur 66 souches cibles. Une
inclusivité de 100 % a été obtenue. L’inclusivité de la réaction PCR pour le fragment cytK-1 a été évaluée
sur 5 souches cibles. Une inclusivité de 100 % a été obtenue. Les souches évaluées pour le variant
cytK-2 étaient des souches de B. cereus sensu stricto et B. thuringiensis. Les souches cibles pour cytK-1
correspondent aux cinq souches de B. cytotoxicus qui étaient disponibles au moment de l’évaluation.
Elles étaient suffisamment distantes des autres espèces du groupe pour présenter un polymorphisme
particulier du variant cytK-1 pour le gène cytK.
A.6.2.3 Exclusivité
L’exclusivité de la réaction pour le fragment cytK-1 a été évaluée sur 157 souches non cibles. Une
exclusivité de 100 % a été obtenue. L’exclusivité de l’essai pour le fragment cytK-2 a été évaluée sur
94 souches non cibles. Une exclusivité de 100 % a été obtenue.
Les souches évaluées provenaient de toutes les espèces du groupe B. cereus et de huit autres espèces
d’origine alimentaire.
A.6.3 Sensibilité
Les limites pour l’amplification par PCR étaient comprises entre 15 ng et 75 ng d’ADN génomique pour
15 µl de réaction finale.
A.7 Limites de la réaction PCR
Cette réaction PCR permet a) de détecter les gènes de la cytotoxine K (en particulier l’un de ses deux
variants) et b) d’identifier les souches B. cytotoxicus, deux caractéristiques associées à l’intoxication
alimentaire. Même si elle indique un risque potentiel, la seule présence du gène ou l’identification de
l’espèce ne permet pas de confirmer l’expression du gène cytK.
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Annexe B
(informative)
Détection du gène ces codant la peptide synthétase du céreulide
par réaction en chaîne par polymérase (PCR) dans les souches du
groupe Bacillus cereus
B.1 Détection du gène ces codant la peptide synthétase du céreulide par PCR sur
gel d’agarose dans les souches du groupe Bacillus cereus
B.1.1 Généralités
Cette annexe décrit une méthode d’amplification et de détection par électrophorèse sur gel d’agarose
du gène ces spécifique de la production de céreulide dans les souches du groupe Bacillus cereus.
B.1.2 Principe
Le fragment d’ADN spécifique du gène ces est amplifié par PCR à l’aide de deux amorces. La détection du
produit PCR est effectuée par électrophorèse sur gel d’agarose.
B.1.3 Réactifs
B.1.3.1 Généralités
Tous les réactifs nécessaires à cette annexe sont des réactifs de qualité biologie moléculaire et des
consommables adaptés à la biologie moléculaire. Ils doivent être utilisés conformément aux indications
[11] [12]
données dans l’ISO 20837 et l’ISO 20838 .
B.1.3.2 Réactifs pour l’extraction de l’acide nucléique
Le mode opératoire et les réactifs d’extraction de l’acide nucléique utilisés doivent être adaptés aux
bactéries à Gram positif. Des kits du commerce peuvent également être utilisés.
B.1.3.3 Réactifs pour PCR
D.1.3.3.1 Solution tampon de PCR.
La solution tampon de PCR 10x est généralement fournie avec l’ADN polymérase, qui peut contenir ou
non du MgCl dans une concentration spécifiée par le fabricant. Les concentrations finales en MgCl
2 2
dépendent de la méthode et sont donc répertoriées dans le Tableau D.2. Des réactifs prêts à l’emploi
disponibles dans le commerce peuvent être utilisés. Il convient de suivre les instructions du fabricant.
D.1.3.3.2 Solution de MgCl , c (MgCl ) = 25 mmol/l.
2 2
D.1.3.3.3 ADN polymérase thermostable (pour PCR hot-start), 5 UI/µl.
D.1.3.3.4 Solution de dNTP, c (dNTP) = 10 mmol/l, pour le mélange.
D.1.3.3.5 Oligonucléotides.
Le Tableau D.1 présente les séquences d’oligonucléotides.
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Tableau D.1 — Séquences d’oligonucléotides
Taille de
Gène Amorce Séquence (5′ – 3′)
l’amplicon (pb)
ces EM1F GAC AAG AGA AAT TTC TAC GAG CAA GTA CAA T 635
EM1R GCA GCC TTC CAA TTAC TCC TTC TGC CAC AGT
B.1.3.4 Réactifs pour électrophorèse sur gel
[12]
Voir l’ISO 20838 .
B.1.4 Équipement et consommables
B.1.4.1 Généralités
Équipement approprié conforme à la méthode et, en particulier, ce qui suit:
B.1.4.2 Équipement pour l’extraction de l’acide nucléique
D.1.4.2.1 Tubes pour microcentrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml.
D.1.4.2.2 Centrifugeuse, pour tubes d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml, et capable d’atteindre une
accélération d’environ 14 000 g.
D.1.4.2.3 Bloc thermique, pouvant atteindre 100 °C.
D.1.4.2.4 Pipettes graduées et embouts à filtres pour pipettes, pour des volumes compris
entre 1 μl et 1 000 µl.
D.1.4.2.5 Agitateur.
B.1.4.3 Équipement pour PCR
D.1.4.3.1 Pipettes et embouts à filtres pour pipettes, d’une capacité comprise entre 1 µl
et 1 000 µl.
D.1.4.3.2 Tubes pour microcentrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml ou 2,0 ml.
D.1.4.3.3 Microtubes de PCR à parois minces, tubes de 0,2 ml ou 0,5 ml, microplaques multipuits
pour PCR ou tout autre équipement approprié.
D.1.4.3.4 Thermocycleur.
B.1.4.4 Équipement pour la détection du produit PCR
[12]
Voir l’ISO 20838 .
B.1.5 Mode opératoire
B.1.5.1 Extraction de l’acide nucléique
Pour l’extraction de l’ADN, il convient d’utiliser des colonies du groupe B. cereus confirmées
conformément à 9.4. Facultativement, avant extraction de l’ADN, les colonies peuvent être lavées par
centrifugation dans 1 ml d’eau exempte de nucléases. Le protocole décrit en C.5.2 peut être utilisé ainsi
que tout mode opératoire d’extraction de l’acide nucléique applicable aux bactéries à Gram positif et
adapté à cette fin (par exemple, Référence [15]).
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B.1.5.2 Préparation de la PCR
La méthode est décrite pour un volume total de PCR de 50 µl par réaction, avec les réactifs énumérés
dans le Tableau D.2. La PCR peut également être effectuée dans un volume plus faible si les solutions
sont ajustées en conséquence. Les concentrations finales en réactifs indiquées dans le Tableau D.2 se
sont révélées appropriées.
Tableau D.2 — Réactifs de PCR
Réactif (concentration) Concentration finale Volume par réaction (μl)
a
Tampon ADN polymérase exempt de MgCl (10X) 5
2
MgCl (25 mmol/l) 150 µmol/l 0,3
2
Mélange de dNTP (10 mmol/l chacun) 800 µmol/l 4
EM1F (5 µmol/l) 0,5 µmol/l 2,5
EM1R (5 μmol/l) 0,5 µmol/l 2,5
ADN matrice / 1
ADN polymérase thermostable, 5 UI/µl 0,5 UI/µl 5
Compléter au volume à 50 µl avec de l’eau exempte de nucléases
a
Si le tampon ADN polymérase contient déjà du MgCl , la concentration finale en MgCl dans le mélange réac-
2 2
tionnel est ajustée à 0,15 mmol/l.
B.1.5.3 Témoins de PCR
[14]
Tous les témoins appropriés indiqués dans l’ISO 22174 doivent être mis en œuvre.
La souche suivante peut être utilisée comme témoin positif:
Bacillus cereus, souche émétique WDCM 00219.
B.1.5.4 Programme d’amplification
Le programme d’amplification décrit dans le Tableau D.3 et le mélange maître décrit dans le Tableau D.2
[16]
ont été utilisés lors de l'étude de validation . L'utilisation d'autres thermocycleurs peut nécessiter
une adaptation. Le temps nécessaire pour l'activation/la dénaturation initiale dépend de la polymérase
utilisée. La recommandation donnée par le fabricant de l’ADN polymérase doit être suivie.
Tableau D.3 — Programme d’amplification
Activation/dénaturation initiale 95 °C pendant 15 min
95 °C pendant 30 s
Amplification 59 °C pendant 30 s
72 °C pendant 60 s
Nombre de cycles (amplification) 30
Extension finale 72 °C pendant 5 min
B.1.5.5 Détection des produits PCR
Le produit PCR est détecté après électrophorèse sur gel d’agarose (1,5 %) avec un marqueur de poids
[12]
moléculaire approprié (voir l’ISO 20838 ).
La séquence cible est considérée comme étant détectée si la taille du produit PCR correspond à la
longueur escomptée de la séquence d’ADN cible (voir taille de l’amplicon dans le Tableau D.1). Pour
[14]
l’interprétation des résultats, voir l’ISO 22174 .
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B.1.5.6 Confirmation d’un résultat PCR positif
[14]
Voir l’ISO 22174 .
B.1.6 Caractéristiques de performance
B.1.6.1 Généralités
La méthode a été validée avec l’ADN extrait de différentes souches émétiques du groupe Bacillus
[16]
cereus .
B.1.6.2 Évaluation théorique de la méthode
L’évaluation théorique a été effectuée en réalisant une recherche de similarité de séquences dans la
[27]
base de données GenBank/EMBL/DDBJ . Le résultat de cette recherche a confirmé une homologie
complète des amorces uniquement avec la séquence cible prévue.
B.1.6.3 Sélectivité
B.1.6.3.1 Inclusivité
L’inclusivité de la méthode a été soumise à essai avec 30 souches émétiques du groupe Bacillus cereus,
voir Tableau D.4.
Tableau D.4 — Inclusivité de la PCR à l’aide de souches cibles
Source Nombre de souches Gène ces détecté
Aliments (sans rapport avec une 5 5
intoxication/épidémie alimentaire)
Aliments en rapport avec une 13 13
intoxication alimentaire
Échantillons d’origine humaine 12 12
(vomi, matières fécales)
B.1.6.3.2 Exclusivité
L’exclusivité de la méthode a été soumise à essai avec 178 organismes non cibles, voir Tableau D.5.
Aucune réactivité croisée n’a été observée avec les bactéries non cibles.
Tableau D.5 — Exclusivité de la PCR à l’aide de souches non cibles
Espèce Nombre de souches Gène ces détecté
Souches non émétiques du groupe 100 0
Bacillus cereus
Bacillus anthracis 7 0
Bacillus mycoides 6 0
Bacillus thuringiensis 6 0
Bacillus pseudomycoides 3 0
Bacillus weihenstephanensis 7 0
other Bacillus spp. 8 0
Staphylococcus aureus 10 0
Staphylococcus equorum 1 0
Clostridium perfringens 3 0
Listeria monocytogenes 6 0
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Tableau D.5 (suite)
Espèce Nombre de souches Gène ces détecté
Campylobacter spp. 3 0
Escherichia coli 4 0
Salmonella spp. 6 0
Yersinia enterocolitica 8 0
B.1.6.4 Sensibilité
La limite de détection était de 2,5 pg d’ADN matrice pour un protocole PCR de 30 cycles, ce qui
[16]
correspond à environ 500 équivalents génome .
B.2 Détection du gène ces codant la peptide synthétase du céreulide par PCR en
temps réel dans les souches du groupe Bacillus cereus
B.2.1 Généralités
Cette annexe décrit une méthode par PCR en temps réel avec une sonde basée sur la technologie TaqMan
pour la détection du gèn
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.