ISO 9363-1:1994
(Main)Optics and optical instruments — Contact lenses — Determination of cytotoxicity of contact lens material — Part 1: Agar overlay test and growth inhibition test
Optics and optical instruments — Contact lenses — Determination of cytotoxicity of contact lens material — Part 1: Agar overlay test and growth inhibition test
Specifies two in vitro methods for determining the cytotoxicity of contact lens materials: the agar overlay test and the growth inhibition test. Primary purpose of these tests is to reveal the presence of leachable cytotoxic substances in or on contact lenses.
Optique et instruments d'optique — Lentilles de contact — Détermination de la cytotoxicité des matériaux des lentilles de contact — Partie 1: Essai de diffusion à travers l'agar et essai d'inhibition de la croissance cellulaire
La présente partie de l'ISO 9363 prescrit deux méthodes in vitro pour la détermination de la cytotoxicité des matériaux des lentilles de contact:- l'essai de diffusion à travers l'agar; et- l'essai d'inhibition de la croissance cellulaire.Ces essais ont pour objet principal de détecter la présence de substances cytotoxiques extractibles dans ou sur les lentilles de contact.NOTES:1 L'attention est attirée sur l'ISO 10993-5.2 Il est recommandé d'effectuer au moins un essai in vitro pour une évaluation préclinique des lentilles de contact neuves. On peut utiliser l'un ou l'autre des deux essais in vitro suivants.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9363-1
First edition
1994-1 l-l 5
Optics and Optical instruments - Contact
lenses - Determination of cytotoxicity of
contact lens material -
Part 1:
Agar overlay test and growth inhibition test
Optique et instruments d’optique - LentilIes de contact - D&ermination
de Ia cytotoxicitk des matkiaux des lentilles de contact -
Partie 7: Essai de recouvrement par de I’agar-agar et essai d’inhibition de
croissance
Reference number
ISO 9363-1: 1994(E)
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ISO 9363=1:1994(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 9363-1 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 172, Optics and optica/ Instruments, Subcommittee SC 7,
Oph thalmic, endoscopic, me trological ins trumen ts and tes t me thods.
Annex A forms an integral pat of this part of ISO 9363. Annex B is for
information only.
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All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronie or mechanical, incruding photocopying and
microfilm, without Permission in writing from the publisher.
zation for Standardization
International Organi
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Case postale 56 l
Printed in Switzerland
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INTERNATIONAL STANDARD o ISO ISO 9363=1:1994(E)
Optics and Optical instruments - Contact lenses -
Determination of cytotoxicity of contact lens material -
Part 1:
Agar overlay test and growth inhibition test
The growth inhibition test is designed to ascertain the
1 Scope
presence of extractable cytotoxic substances. The
growth rate of mammalian cells is significantly
This part of ISO 9363 specifies two in vitro methods
decreased in the presence of toxic substances.
for determining the cytotoxicity of contact lens
Usually, the growth rate is determined by comparing
materials:
the cell number or the Protein content of cells at
- the agar overlay test; and
different time intervals. Since there is a linear
relationship between cell number and Protein
- the growth inhibition test.
concentration under conditions of the assay to be
described, the growth rate is determined by Protein
The primary purpose of these tests is to reveal the
measurement. Cell counting tan be used as an
presence of leachable cytotoxic substances in or on
alternative method of assessment.
contact lenses.
In the growth inhibition test, medium extracts of
NOTES
contact lenses are added to the culture medium of
cells and the Protein content of the cell culture after
1 Attention is drawn to ISO 10993-5.
72 h in the presence of the extract is compared with
the Protein content in cell cultures without the extract.
2 A minimum of one in vitro test is recommended for
preclinical evaluation of new types of contact lenses. Either
In Order to ensure high quality work, the cytotoxicity
one of the following two in v;tro tests may be used for the
testing of contact lenses should be carried out in
in vitro requirement.
experienced laboratories according to GLP guidelines.
The Overall assessment of the results should be
carried out by an expert in the field of toxicology who
is informed about the final product and the conditions
2 Principle of its use and has appropriate Chemical and biological
data concerning it.
The proposed tests are designed to ascertain the
absence of extractable cytotoxic substances.
The agar overlay test is designed to assess the
3 Agar overlay test
presence of leachable toxic substances in solid ma-
terials. The test Sample is placed in contact with the
surface of an agar layer which covers a monolayer of
3.1 Apparatus and solutions
cells treated with a vital stain. After 24 h of incubation,
the presence of leachable toxic substances is
3.1.1 Apparatus
manifested by the loss of dye from the cells within
the diffusion zone of the soluble substance(s) leaching
from the Sample and by lysis of the cells within the Standard tissue culture facilities, including sterilization
zone if the concentrations and toxicity of the diffusing equipment (autoclave and membrane filtration),
substance(s) are sufficiently high. laminar airflow hood, 37 “C carbon dioxide-air
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ISO 9363=1:1994(E)
incubator, water bath, tissue culture glass and plastics 3.1.6 Trypsin solution
Ware.
A suitable concentration (0,l g/l to 025 g/l) of trypsin
in PBS or other agent to dissociate the cell monolayer
shall be used for preparation of cell suspensions.
3.1.2 Culture medium
The culture medium shall be sterile.
3.2 Test material
NOTE 3 To ensure this, the culture medium may be
purchased sterile and ready for use, may be prepared from
The test material shall be representative of the final
sterile ingredients using aseptic techniques, or, when one
product. At least two contact lenses of each Sample
or more ingredients are not available in sterile form, may be
are necessary.
sterilized after preparation by membrane filtration.
The complete culture medium shall be Dulbecco’s 3.3 Controls
Modified Eagle Medium containing 3,7 g/l sodium
hydrogen carbonate, 10 % by volume fetal calf Serum
3.3.1 Positive control material
(FCS), 100 IU/mI Penicillin and 100 pg/mI streptomycin
or any other culture medium which tan be
The positive control shall be any material which, when
demonstrated to give reproducible results five times.
tested by the procedure described in 3.52, produces
a cytotoxic response.
3.1.3 Agar medium
3.3.2 Negative control material
The agar medium shall be comprised of one part
double concentration of sterile complete culture
The negative control shall be only material which,
medium (all Supplements are double concentration as
when tested by the procedure described in 3.5.2, is
weil) plus one part of sterile 3 g/l agarose or
known not to produce a cytotoxic response.
equivalent in bidistilled water or equivalent.
3.4 Cells
Bring melted agarose to approximately 50 “C and
medium to 37 “C in a water bath or both to 42 “C and
One of the following cell lines shall be used:
mix aseptically. Use at 42 “C.
a) American Type Culture Collection CCL 1, NCTC
Clone 929 (connective tissue, mouse), clone of
3.1.4 Phosphate buffered Saline (PBS), Calcium- and Strain L (referred to hereafter as L 929 cells).
magnesium-free
b) Any other cell line, provided that when tested in
accordance with this part of ISO 9363 a repro-
The Phosphate buffered Saline shall consist of 8,0 g of
ducible toxic titre is obtained for the positive
sodium chloride, 0,2 g of potassium chloride, 2,9 g of
control material and no cytotoxicity is observed for
disodium hydrogen orthophosphate dodecahydrate
the negative control material and fresh cell culture
(Na2HP04. 12H,O), 0,2 g of potassium dihydrogen
medium.
orthophosphate ( KHZPOJ) dissolved in bidistilled water
or equivalent (cell culture grade) to give 1 000 ml of
NOTES
Solution. Adjust to pH 7,2, sterilize by an appropriate
method. Warm up to 37 “C before use.
4 The passage number should be recorded.
5 Stock cultures should be tested for the absence of
mycoplasma before use. Test for mycoplasma tan be
3.1.5 Vital stain
performed in accordance with W. C. Russe11 et al. or any
other established method. Only cells free from myco-
The vital stain shall be neutral red or an equivalent
Plasma should be used for the test.
vital stain. Neutral red vital stain shall be prepared as
follows:
3.5 Test procedure and evaluation
Stock Solution: 1,O g/l neutral red in bidistilled water.
3.5.1 Sample preparation
Adjust to pH 7,2, sterilize by filtration. Protect from
strong light.
The contact lenses should be applied directly. The
Vital stain: 1 :lO stock Solution in sterile PBS, prepare
agar overlay test does not require sterile samples,
freshly and protect from strong light.
although sterility is desirable.
2
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0 ISO ISO 9363=1:1994(E)
Neutral red is a redox dye which particularly con-
3.5.2 Procedure
centrates in the lysosomes of living viable cells.
Decolorization of cells is a first sign of cell darnage
Use L 929 cells from an exponentially growing
and precedes detachment from the Substrate and cell
monolayer culture.
lysis. Depending on the water solubility and concen-
Prepare a working stock of cells. Remove the tration of toxic substances of low molecular mass in
medium, wash twice with PBS, add approximately the specimen, those cells under and around the
3 ml trypsin Solution per 75 cm* tissue culture flask Sample are decolorized (Zone-index). Frequently, a
and incubate until cells become detached (approxi- decolorization of the cells directly under the Sample is
mately 3 min at 37 “C with 0,25 % trypsin in PBS). observed but without cell lysis. However, a material is
judged as “cytotoxic” only if lysis is observed simul-
Stop the enzyme reaction by adding 10 ml of
taneously. If a material releases highly diffusible
complete culture medium, centrifuge for 10 min at
cytotoxic compounds in a low concentration, decolor-
100 g and bring to 2,5 x IO5 cells/ml medium. The
ization of the cells without lysis is possible. Therefore,
viability of the cells shall be more than 75 % as
a Zone-index of 2 or higher without cell lysis is also
determined by trypan blue staining or any other
considered a significant reaction. In any case, the
appropriate method.
reaction-index shall be given and the result has to be
interpreted.
Plate 10 ml (4,5 ml) of the adjusted cell Suspension
into 90 mm (60 mm) diameter disposable Petri dishes
NOTE 6 Hydrophylic contact lens materials tan passively
and incubate for 24 h at 37 “C in humidified air
absorb dye, giving a discoloration which would not be due
containing 5 % by volume carbon dioxide.
to cytotoxic effects.
Aspirate the medium after incubation and add 10 ml
3.5.4 General considerations
(4,5 ml) of agar medium at 42 “C to each Petri dish.
Allow the agar medium to solidify (approximately
A positive response index of l/l or higher is a definite
30 min in the incubator).
indication of the presence of a diffusible toxic sub-
stance in the Sample.
Dispense 10 ml (4,5 ml) of freshly prepared vital stain
Solution onto the solidified agar surface. Incubate the
Petri dishes for 30 min at 37 “C in the dark, and
3.5.5 Assessment of results
aspirate the excess stain solution.
The Overall assessment of the test results shall be
Place two test specimens, together with one negative
carried out by an expert in the field of toxicology
and one positive control, symmetrically on each of
familiar with this type of test System. If the
two 90 mm Petri dishes. If 60 mm Petri dishes are
toxicologist considers the results to be inconclusive or
u
...
NORME
ISO
INTERNATIONALE
9363-l
Première édition
1994-I l-1 5
Optique et instruments d’optique -
Lentilles de contact - Détermination de la
cytotoxicité des matériaux des lentilles de
contact -
Partie 1:
Essai de diffusion à travers I’agar et essai
d’inhibition de la croissance cellulaire
Optics and optical instruments - Contact lenses - Determination of
cytotoxicity of contact lens material-
Part 7: Agar overlay test and growth inhibition test
Numéro de référence
ISO 9363-l :1994(F)
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ISO 9363=1:1994(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé a cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO
collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale
(CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 9363-l a été élaborée par le comité technique
lSO/TC 172, Optique et instruments d’optique, sous-comité SC 7,
Instruments ophtalmiques, endoscopiques et m6 trologiques et méthodes
d’essais.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 9363.
L’annexe B est donnée uniquement à titre d’information.
0 ISO 1994
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun
procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans
l’accord écrit de l’éditeur.
internationale de normali
Organisation sation
56 0 CH-121 1 Genève
Case postale 20 l
Version française tirée en 1995
Imprimé en Suisse
ii
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NORME INTERNATIONALE o ISO
ISO 9363-l : 1994(F)
Optique et instruments d’optique - Lentilles de contact -
Détermination de la cytotoxicité des matériaux des lentilles
de contact -
Partie 1:
Essai de diffusion à travers I’agar et essai d’inhibition de la
croissance cellulaire
dans la zone de diffusion de la (des) substance(s)
1 Domaine d’application
soluble(s) sortant de l’échantillon et par la lyse des
cellules dans cette zone si les concentrations et la
La présente partie de I’ISO 9363 prescrit deux
toxicité de la (des) substance(s) diffusante(s) est
méthodes in vitro pour la détermination de la
(sont) suffisamment élevée(s).
cytotoxicité des matériaux des lentilles de contact:
- l’essai de diffusion à travers I’agar; et
L’essai d’inhibition de la croissance cellulaire a pour
but d’évaluer la présence de substances cytotoxiques
- l’essai d’inhibition de la croissance cellulaire.
extractibles. La vitesse de croissance des cellules de
mammifères diminue significativement en présence
Ces essais ont pour objet principal de détecter la
de substances toxiques. Généralement, le taux de
présence de substances cytotoxiques extractibles
croissance est déterminé en comparant le nombre de
dans ou sur les lentilles de contact.
cellules ou la teneur en protéines des cellules à
NOTES
différents temps. Etant donné qu’il y a une relation
linéaire entre le nombre de cellules et la concentration
1 L’attention est attirée sur I’ISO 10993-5.
en protéines dans les conditions de l’essai décrit, la
vitesse de croissance est déterminée par dosage des
2 II est recommandé d’effectuer au moins un essai in vitro
pour une évaluation préclinique des lentilles de contact protéines. On peut utiliser le comptage des cellules
neuves. On peut utiliser l’un ou l’autre des deux essais in
comme autre méthode d’évaluation.
vitro suivants.
Dans l’essai d’inhibition de la croissance cellulaire, des
extraits de matériau des lentilles de contact sont
ajoutés au milieu de culture cellulaire et la teneur en
2 Principe
protéines de la culture cellulaire après 72 h de contact
avec l’extrait est comparée à la teneur en protéines
Les essais proposés sont conçus pour constater
des cultures de cellules sans extrait.
l’absence de substances cytotoxiques extractibles.
Pour assurer un travail de bonne qualité, il convient
L’essai de diffusion à travers I’agar est conçu pour
évaluer la présence de substances toxiques libérables d’effectuer les essais de cytotoxicité des lentilles de
dans les matériaux solides. L’échantillon pour essai contact dans des laboratoires expérimentés confor-
est placé en contact avec la surface d’une couche mément aux principes généraux des B.P.L. II convient
d’agar qui couvre une couche monocellulaire traitée que l’évaluation globale des résultats soit effectuée
avec un colorant vital. Après 24 h d’incubation, la par un expert toxicologue informé sur le produit fini,
présence de substances toxiques extractibles se les conditions de son utilisation et les données
manifeste par la décoloration des cellules situées chimiques et biologiques appropriées sur ce produit.
1
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ISO 9363=1:1994(F) 0 ISO
3.1.5 Colorant vital
3 Essai de diffusion à travers I’agar
Le colorant vital doit être du rouge neutre ou toute
3.1 Appareillage et solutions
teinture vitale équivalente. Le colorant vital rouge
neutre doit être préparé comme suit.
3.1 .i Appareillage
Solution mère: 1,O g/l de rouge neutre dans de l’eau
Installations types pour la culture de tissus, compre- bidistillée. Ajuster le pH à 72, stériliser par filtration.
nant un équipement de stérilisation (autoclave et Protéger de la lumière directe.
filtration sur membrane), hotte à flux laminaire,
incubateur dioxyde de carbone/air a 37 OC, bain-marie, Colorant vital: 1 :lO de solution mère dans du TPS
verrerie et récipients plastiques pour culture de tissus. stérile, préparer extemporanément et protéger de la
lumière directe.
3.1.2 Milieu de culture
3.1.6 Solution de trypsine
Le milieu de culture doit être stérile.
Une concentration appropriée (0,l g/l à 0,25 g/l) de
NOTE 3 À cet effet, on peut se procurer le milieu de
trypsine dans du TPS ou tout autre agent (pour
culture stérile et prêt a l’emploi, ou le préparer à partir de
dissocier la monocouche cellulaire) doit être utilisée
composants stériles en utilisant des techniques aseptiques,
pour la préparation des suspensions de cellules.
ou, lorsqu’on ne dispose pas d’un ou de plusieurs
composants sous forme stérile, on peut le stériliser après
préparation par filtration sur membrane.
3.2 Matériau à essayer
Le milieu de culture complet doit être le milieu
Le matériau à essayer doit être représentatif du
modifié Eagle de Dulbecco, contenant 3,7 g/l de
produit fini. II est nécessaire d’avoir au moins deux
bicarbonate de sodium, 10 % (Vi de sérum foetal de
lentilles de contact par essai.
veau (FCS), 100 IU/mI de pénicilline et 100 ug/mI de
streptomycine ou de tout autre milieu de culture avec
lequel on peut démontrer que l’on obtient des
3.3 Témoins
résultats reproductibles sur cinq essais.
3.3.1 Matériau témoin positif
3.1.3 Milieu d’agar
Le témoin positif doit être un matériau qui, lors de
Le milieu d’agar doit se composer d’un mélange à part
l’essai selon la procédure décrite en 3.5.2, produit une
égale de milieu de culture complet stérile à double
réponse cytotoxique (tout matériau approprié et don-
concentration (tous les ajouts sont également à
nant une réponse cytotoxique reproductible).
double concentration) et d’agarose ou équivalent
stérile à 3 g/l dans de l’eau bidistillée ou équivalent.
3.3.2 Matériau témoin négatif
Porter I’agarose fondu à environ 50 “C et le milieu à
Le témoin négatif doit être un matériau qui, lors de
37 OC dans un bain-marie, ou les deux à 42 OC, et
l’essai selon la procédure décrite en 3.5.2, ne produit
mélanger dans des conditions aseptiques. Utiliser à
pas de réponse cytotoxique (tout matériau approprié
42 OC.
et reconnu non cytotoxique).
3.1.4 Tampon phosphate salin (TPS) exempt de
3.4 Cellules
calcium et de magnésium
Utiliser une des lignées cellulaires suivantes:
Le tampon phosphate salin doit se composer de 8,0 g
de chlorure de sodium, 0,2 g de chlorure de potas-
a) Le type de culture de la collection américaine,
sium, 2,9 g d’hydrogénophosphate disodique dodéca-
CCL 1, Clone 929 NCTC (tissu conjonctif, souris),
hydraté (NaH2POJ,1 2H,O), 0,2 g de dihydrogéno-
clone de race L (ci-après référencé cellules L 929).
phosphate monopotassique (KH2P04) dissous dans de
l’eau bidistillée ou équivalent (grade culture de cellule)
b) Toute autre lignée cellulaire, à condition d’avoir
afin d’obtenir 1 000 ml de solution. Ajuster le pH à 7,2,
obtenu, lors des essais conformément à la pré-
stériliser selon une méthode appropriée. Réchauffer à
sente partie de I’ISO 9363, un niveau de toxicité
37 OC avant utilisation.
reproductible pour le matériau témoin positif et de
2
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0 ISO
ISO 9363=1:1994(F)
n’avoir observé aucune cytotoxicité pour le maté-
Laisser incuber les boîtes de Petri pendant 30 min à
riau témoin négatif et le milieu de culture cellulaire
37 “C dans l’obscurité et aspirer la solution de colorant
frais.
excédentaire.
NOTES
Placer deux spécimens du matériau à essayer, ainsi
qu’un témoin négatif et un témoin positif symé-
4 II convient d’enregistrer le nombre de passages.
triquement sur chacune des deux boîtes de Petri de
5 II convient que les cultures souches stockées soient
90 mm. Si l’on utilise des boîtes de Petri de 60 mm,
contrôlées avant utilisation pour vérifier l’absence de
placer un échantillon par plaque et utiliser deux
mycoplasme. La recherche des mycoplasmes peut être
plaques séparées pour chaque contrôle.
effectuée conformément à W.C. Russel et a/. ou par toute
autre méthode reconnue. II convient de n’utiliser pour
Pour les lentilles rigides,, il est recommandé de placer
l’essai que des cellules exemptes de mycoplasme.
une goutte d’agar sur la surface de I’agar avant de
déposer la lentille pour éviter que celle-ci ne se
déplace à la surface de I’agar.
3.5 Mode opératoire et évaluation
Pour les lentilles hydrophiles, il est recommandé de
faire deux ou trois coupes équidistantes sur la
3.5.1 Préparation de l’échantillon
circonférence de la lentille afin de permettre de poser
la lentille à plat sur la surface de I’agar. Laisser incuber
Les lentilles de contact devraient être appliquées
pendant 24 h de plus à 37 “C dans de l’air humidifié
directement sur la couche d’agar. L’essai de diffusion
contenant 5 % (V/v) de dioxyde de carbone.
à travers I’agar ne nécessite pas d’échantillons
stériles, bien que la stérilité soit souhaitable.
3.5.3 Résultats d’essai
3.5.2 Déroulement des essais
Contrôler la réponse de la monocouche colorée par
l’étendue de la décoloration (éventuelle) sous et
Utiliser les cellules L 929 provenant d’une culture en
autour de l’échantillon à essayer, à l’aide d’un
monocouche à croissance exponentielle.
microscope inversé ayant un grossissement de x 100.
Utiliser le système de comptage donné à l’annexe A.
Préparer une quantité suffisante de cellules. Retirer le
milieu, laver deux fois avec du TPS, ajouter environ
Rejeter la plaque (pour les plaques de 90 mm) ou
3 ml de solution de trypsine par flacon de culture de
l’essai (pour les plaques de 60 mm) si la monocouche
tissus de 75 cm* et laisser incuber jusqu’à ce que les
de cellules sous le témoin négatif ou autour de ce
cellules se détachent (environ 3 min à 37 “C avec de
témoin, a perdu de la couleur, ou si l’on n’observe pas
la trypsine à 0,25 % dans du TPS).
la réponse type du contrôle positif.
Arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 10 ml de
Le rouge neutre est un colorant redox qui est
milieu de culture complet, centrifuger pendant 10 min
particulièrement concentré dans les lysosomes des
à 100 g et amener le milieu à 2,5 x 105 cellules viables
cellules vitales. La décoloration des cellules est un
par millilitre. La viabilité des cellules doit être
premier signe de lésion cellulaire et précède le
supérieure à 75 %; elle peut être déterminée par la
détachement du substrat et la lyse des cellules. Selon
méthode de coloration au bleu de trypan ou par toute
la solubilité dans l’eau et la concentration des
autre méthode appropriée.
substances toxiques de faible masse moléculaire
dans la préparation, les cellules sous et autour de
Déposer 10 ml (4,5 ml) de la suspension de cellules
l’échantillon sont décolorées (indice de zone).
ajustée dans des boîtes de Petri à usage unique de
Souvent, on observe une décoloration des cellules
90 mm (60 mm) de diamètre et laisser incuber
placées directement sous l’échantillon, mais sans lyse
pendant 24 h à 37 “C dans de l’air humide contenant
de cellules. Cependant, un matériau n’est jugé
5 % (WV) de dioxyde de carbone.
«cytotoxique» que si l’on observe simultanément la
lyse. Si un matériau libère des composés cyto-
Aspirer le milieu après incubation et ajouter
toxiques hautement dif
...
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ISO
INTERNATIONALE
9363-l
Première édition
1994-I l-1 5
Optique et instruments d’optique -
Lentilles de contact - Détermination de la
cytotoxicité des matériaux des lentilles de
contact -
Partie 1:
Essai de diffusion à travers I’agar et essai
d’inhibition de la croissance cellulaire
Optics and optical instruments - Contact lenses - Determination of
cytotoxicity of contact lens material-
Part 7: Agar overlay test and growth inhibition test
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé a cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO
collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale
(CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 9363-l a été élaborée par le comité technique
lSO/TC 172, Optique et instruments d’optique, sous-comité SC 7,
Instruments ophtalmiques, endoscopiques et m6 trologiques et méthodes
d’essais.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 9363.
L’annexe B est donnée uniquement à titre d’information.
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Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun
procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans
l’accord écrit de l’éditeur.
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Détermination de la cytotoxicité des matériaux des lentilles
de contact -
Partie 1:
Essai de diffusion à travers I’agar et essai d’inhibition de la
croissance cellulaire
dans la zone de diffusion de la (des) substance(s)
1 Domaine d’application
soluble(s) sortant de l’échantillon et par la lyse des
cellules dans cette zone si les concentrations et la
La présente partie de I’ISO 9363 prescrit deux
toxicité de la (des) substance(s) diffusante(s) est
méthodes in vitro pour la détermination de la
(sont) suffisamment élevée(s).
cytotoxicité des matériaux des lentilles de contact:
- l’essai de diffusion à travers I’agar; et
L’essai d’inhibition de la croissance cellulaire a pour
but d’évaluer la présence de substances cytotoxiques
- l’essai d’inhibition de la croissance cellulaire.
extractibles. La vitesse de croissance des cellules de
mammifères diminue significativement en présence
Ces essais ont pour objet principal de détecter la
de substances toxiques. Généralement, le taux de
présence de substances cytotoxiques extractibles
croissance est déterminé en comparant le nombre de
dans ou sur les lentilles de contact.
cellules ou la teneur en protéines des cellules à
NOTES
différents temps. Etant donné qu’il y a une relation
linéaire entre le nombre de cellules et la concentration
1 L’attention est attirée sur I’ISO 10993-5.
en protéines dans les conditions de l’essai décrit, la
vitesse de croissance est déterminée par dosage des
2 II est recommandé d’effectuer au moins un essai in vitro
pour une évaluation préclinique des lentilles de contact protéines. On peut utiliser le comptage des cellules
neuves. On peut utiliser l’un ou l’autre des deux essais in
comme autre méthode d’évaluation.
vitro suivants.
Dans l’essai d’inhibition de la croissance cellulaire, des
extraits de matériau des lentilles de contact sont
ajoutés au milieu de culture cellulaire et la teneur en
2 Principe
protéines de la culture cellulaire après 72 h de contact
avec l’extrait est comparée à la teneur en protéines
Les essais proposés sont conçus pour constater
des cultures de cellules sans extrait.
l’absence de substances cytotoxiques extractibles.
Pour assurer un travail de bonne qualité, il convient
L’essai de diffusion à travers I’agar est conçu pour
évaluer la présence de substances toxiques libérables d’effectuer les essais de cytotoxicité des lentilles de
dans les matériaux solides. L’échantillon pour essai contact dans des laboratoires expérimentés confor-
est placé en contact avec la surface d’une couche mément aux principes généraux des B.P.L. II convient
d’agar qui couvre une couche monocellulaire traitée que l’évaluation globale des résultats soit effectuée
avec un colorant vital. Après 24 h d’incubation, la par un expert toxicologue informé sur le produit fini,
présence de substances toxiques extractibles se les conditions de son utilisation et les données
manifeste par la décoloration des cellules situées chimiques et biologiques appropriées sur ce produit.
1
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ISO 9363=1:1994(F) 0 ISO
3.1.5 Colorant vital
3 Essai de diffusion à travers I’agar
Le colorant vital doit être du rouge neutre ou toute
3.1 Appareillage et solutions
teinture vitale équivalente. Le colorant vital rouge
neutre doit être préparé comme suit.
3.1 .i Appareillage
Solution mère: 1,O g/l de rouge neutre dans de l’eau
Installations types pour la culture de tissus, compre- bidistillée. Ajuster le pH à 72, stériliser par filtration.
nant un équipement de stérilisation (autoclave et Protéger de la lumière directe.
filtration sur membrane), hotte à flux laminaire,
incubateur dioxyde de carbone/air a 37 OC, bain-marie, Colorant vital: 1 :lO de solution mère dans du TPS
verrerie et récipients plastiques pour culture de tissus. stérile, préparer extemporanément et protéger de la
lumière directe.
3.1.2 Milieu de culture
3.1.6 Solution de trypsine
Le milieu de culture doit être stérile.
Une concentration appropriée (0,l g/l à 0,25 g/l) de
NOTE 3 À cet effet, on peut se procurer le milieu de
trypsine dans du TPS ou tout autre agent (pour
culture stérile et prêt a l’emploi, ou le préparer à partir de
dissocier la monocouche cellulaire) doit être utilisée
composants stériles en utilisant des techniques aseptiques,
pour la préparation des suspensions de cellules.
ou, lorsqu’on ne dispose pas d’un ou de plusieurs
composants sous forme stérile, on peut le stériliser après
préparation par filtration sur membrane.
3.2 Matériau à essayer
Le milieu de culture complet doit être le milieu
Le matériau à essayer doit être représentatif du
modifié Eagle de Dulbecco, contenant 3,7 g/l de
produit fini. II est nécessaire d’avoir au moins deux
bicarbonate de sodium, 10 % (Vi de sérum foetal de
lentilles de contact par essai.
veau (FCS), 100 IU/mI de pénicilline et 100 ug/mI de
streptomycine ou de tout autre milieu de culture avec
lequel on peut démontrer que l’on obtient des
3.3 Témoins
résultats reproductibles sur cinq essais.
3.3.1 Matériau témoin positif
3.1.3 Milieu d’agar
Le témoin positif doit être un matériau qui, lors de
Le milieu d’agar doit se composer d’un mélange à part
l’essai selon la procédure décrite en 3.5.2, produit une
égale de milieu de culture complet stérile à double
réponse cytotoxique (tout matériau approprié et don-
concentration (tous les ajouts sont également à
nant une réponse cytotoxique reproductible).
double concentration) et d’agarose ou équivalent
stérile à 3 g/l dans de l’eau bidistillée ou équivalent.
3.3.2 Matériau témoin négatif
Porter I’agarose fondu à environ 50 “C et le milieu à
Le témoin négatif doit être un matériau qui, lors de
37 OC dans un bain-marie, ou les deux à 42 OC, et
l’essai selon la procédure décrite en 3.5.2, ne produit
mélanger dans des conditions aseptiques. Utiliser à
pas de réponse cytotoxique (tout matériau approprié
42 OC.
et reconnu non cytotoxique).
3.1.4 Tampon phosphate salin (TPS) exempt de
3.4 Cellules
calcium et de magnésium
Utiliser une des lignées cellulaires suivantes:
Le tampon phosphate salin doit se composer de 8,0 g
de chlorure de sodium, 0,2 g de chlorure de potas-
a) Le type de culture de la collection américaine,
sium, 2,9 g d’hydrogénophosphate disodique dodéca-
CCL 1, Clone 929 NCTC (tissu conjonctif, souris),
hydraté (NaH2POJ,1 2H,O), 0,2 g de dihydrogéno-
clone de race L (ci-après référencé cellules L 929).
phosphate monopotassique (KH2P04) dissous dans de
l’eau bidistillée ou équivalent (grade culture de cellule)
b) Toute autre lignée cellulaire, à condition d’avoir
afin d’obtenir 1 000 ml de solution. Ajuster le pH à 7,2,
obtenu, lors des essais conformément à la pré-
stériliser selon une méthode appropriée. Réchauffer à
sente partie de I’ISO 9363, un niveau de toxicité
37 OC avant utilisation.
reproductible pour le matériau témoin positif et de
2
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0 ISO
ISO 9363=1:1994(F)
n’avoir observé aucune cytotoxicité pour le maté-
Laisser incuber les boîtes de Petri pendant 30 min à
riau témoin négatif et le milieu de culture cellulaire
37 “C dans l’obscurité et aspirer la solution de colorant
frais.
excédentaire.
NOTES
Placer deux spécimens du matériau à essayer, ainsi
qu’un témoin négatif et un témoin positif symé-
4 II convient d’enregistrer le nombre de passages.
triquement sur chacune des deux boîtes de Petri de
5 II convient que les cultures souches stockées soient
90 mm. Si l’on utilise des boîtes de Petri de 60 mm,
contrôlées avant utilisation pour vérifier l’absence de
placer un échantillon par plaque et utiliser deux
mycoplasme. La recherche des mycoplasmes peut être
plaques séparées pour chaque contrôle.
effectuée conformément à W.C. Russel et a/. ou par toute
autre méthode reconnue. II convient de n’utiliser pour
Pour les lentilles rigides,, il est recommandé de placer
l’essai que des cellules exemptes de mycoplasme.
une goutte d’agar sur la surface de I’agar avant de
déposer la lentille pour éviter que celle-ci ne se
déplace à la surface de I’agar.
3.5 Mode opératoire et évaluation
Pour les lentilles hydrophiles, il est recommandé de
faire deux ou trois coupes équidistantes sur la
3.5.1 Préparation de l’échantillon
circonférence de la lentille afin de permettre de poser
la lentille à plat sur la surface de I’agar. Laisser incuber
Les lentilles de contact devraient être appliquées
pendant 24 h de plus à 37 “C dans de l’air humidifié
directement sur la couche d’agar. L’essai de diffusion
contenant 5 % (V/v) de dioxyde de carbone.
à travers I’agar ne nécessite pas d’échantillons
stériles, bien que la stérilité soit souhaitable.
3.5.3 Résultats d’essai
3.5.2 Déroulement des essais
Contrôler la réponse de la monocouche colorée par
l’étendue de la décoloration (éventuelle) sous et
Utiliser les cellules L 929 provenant d’une culture en
autour de l’échantillon à essayer, à l’aide d’un
monocouche à croissance exponentielle.
microscope inversé ayant un grossissement de x 100.
Utiliser le système de comptage donné à l’annexe A.
Préparer une quantité suffisante de cellules. Retirer le
milieu, laver deux fois avec du TPS, ajouter environ
Rejeter la plaque (pour les plaques de 90 mm) ou
3 ml de solution de trypsine par flacon de culture de
l’essai (pour les plaques de 60 mm) si la monocouche
tissus de 75 cm* et laisser incuber jusqu’à ce que les
de cellules sous le témoin négatif ou autour de ce
cellules se détachent (environ 3 min à 37 “C avec de
témoin, a perdu de la couleur, ou si l’on n’observe pas
la trypsine à 0,25 % dans du TPS).
la réponse type du contrôle positif.
Arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 10 ml de
Le rouge neutre est un colorant redox qui est
milieu de culture complet, centrifuger pendant 10 min
particulièrement concentré dans les lysosomes des
à 100 g et amener le milieu à 2,5 x 105 cellules viables
cellules vitales. La décoloration des cellules est un
par millilitre. La viabilité des cellules doit être
premier signe de lésion cellulaire et précède le
supérieure à 75 %; elle peut être déterminée par la
détachement du substrat et la lyse des cellules. Selon
méthode de coloration au bleu de trypan ou par toute
la solubilité dans l’eau et la concentration des
autre méthode appropriée.
substances toxiques de faible masse moléculaire
dans la préparation, les cellules sous et autour de
Déposer 10 ml (4,5 ml) de la suspension de cellules
l’échantillon sont décolorées (indice de zone).
ajustée dans des boîtes de Petri à usage unique de
Souvent, on observe une décoloration des cellules
90 mm (60 mm) de diamètre et laisser incuber
placées directement sous l’échantillon, mais sans lyse
pendant 24 h à 37 “C dans de l’air humide contenant
de cellules. Cependant, un matériau n’est jugé
5 % (WV) de dioxyde de carbone.
«cytotoxique» que si l’on observe simultanément la
lyse. Si un matériau libère des composés cyto-
Aspirer le milieu après incubation et ajouter
toxiques hautement dif
...
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