ISO 15753:2016
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons
Animal and vegetable fats and oils — Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons
ISO 15753:2016 describes two methods for the determination of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in animal and vegetable fats and oils: - a general method; - a specific method for coconut oil and vegetable oils with short-chain fatty acids. These methods are not quantitative for the very volatile compounds such as naphthalene, acenaphthene and fluorene. Due to interferences provided by the matrix itself, palm oil and olive pomace oil cannot be analysed using this method. The quantification limit is 0,2 µg/kg for almost all compounds analysed, except for fluoranthene and benzo(g,h,i)perylene, where the quantification limit is 0,3 µg/kg, and indeno(1,2,3-c,d)pyrene, where the quantification limit is 1,0 µg/kg. NOTE The results for olive pomace oil in Annex B show that this method is not applicable to this type of oil. The precision data determined are very poor. Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this International Standard.
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des hydrocarbures aromatiques polycycliques
ISO 15753:2016 décrit deux méthodes pour la détermination de 15 hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans les corps gras d'origines animale et végétale: ? une méthode générale; ? une méthode spécifique pour l'huile de coprah et les huiles végétales avec acides gras à chaînes courtes. Ces méthodes ne sont pas quantitatives pour les composés très volatils tels que le naphtalène, l'acénaphtène et le fluorène. En raison des interférences causées par la matrice elle-même, l'huile de palme et l'huile de grignons d'olive ne peuvent pas être analysées par cette méthode. La limite de quantification est de 0,2 µg/kg pour la majorité des composés analysés, à l'exception du fluoranthène et du benzo(g,h,i)pérylène, dont la limite de quantification est de 0,3 µg/kg, et de l'indéno(1,2,3-c,d)pyrène, dont la limite de quantification est de 1,0 µg/kg. NOTE Les résultats pour l'huile de grignons d'olive dans l'Annexe B montrent que cette méthode n'est pas applicable à ce type d'huile. Les données de fidélité déterminées sont très médiocres. Le lait et les produits laitiers (ou la graisse provenant du lait et des produits laitiers) sont exclus du domaine d'application de la présente Norme internationale.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15753
Second edition
2016-04-01
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of polycyclic aromatic
hydrocarbons
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination des
hydrocarbures aromatiques polycycliques
Reference number
ISO 15753:2016(E)
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ISO 15753:2016(E)
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents and materials . 2
6 Apparatus . 3
7 Sampling . 4
8 Sample preparation . 5
9 Procedure for determination of PAHs from fats and oils: General method .5
9.1 Preliminary remarks . 5
9.2 Blank . 5
9.3 Determination of recovery values (without matrix) . 5
9.4 Extraction (liquid/liquid extraction) . 5
9.5 Purification on C18-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction). 6
9.6 Purification on Florisil-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction). 7
10 Procedure for determination of PAHs from fats and oils: Method specific for coconut oil .8
10.1 First extraction (liquid/liquid extraction) . 8
10.2 Second extraction (liquid/liquid extraction) . 8
10.3 Purification on C18-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction). 8
10.4 Purification on Florisil-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction). 9
11 High-performance liquid chromatography (HPLC) .10
11.1 Operating conditions .10
11.2 Detection parameters .10
11.3 Analysis of samples and standards .12
11.4 Confirmation of the presence of PAHs .12
12 Expression of results .12
13 Precision .13
13.1 Interlaboratory test.13
13.2 Repeatability .13
13.3 Reproducibility .13
14 Test report .13
Annex A (informative) Recovery values, flow charts, chromatograms and injection sequences .15
Annex B (informative) Results of the interlaboratory test .20
Bibliography .23
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ISO 15753:2016(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
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For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 15753:2006), of which it constitutes a
minor revision. It also incorporates Amendment ISO 15753:2006/Amd.1:2011. A non-applicability
statement for milk and milk products has been added to the Scope.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 15753:2016(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
polycyclic aromatic hydrocarbons
1 Scope
This International Standard describes two methods for the determination of 15 polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAHs) in animal and vegetable fats and oils:
— a general method;
— a specific method for coconut oil and vegetable oils with short-chain fatty acids.
These methods are not quantitative for the very volatile compounds such as naphthalene, acenaphthene
and fluorene. Due to interferences provided by the matrix itself, palm oil and olive pomace oil cannot be
analysed using this method.
The quantification limit is 0,2 µg/kg for almost all compounds analysed, except for fluoranthene and
benzo(g,h,i)perylene, where the quantification limit is 0,3 µg/kg, and indeno(1,2,3-c,d)pyrene, where
the quantification limit is 1,0 µg/kg.
NOTE The results for olive pomace oil in Annex B show that this method is not applicable to this type of oil.
The precision data determined are very poor.
Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this
International Standard.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
polycyclic aromatic hydrocarbon
PAH
compound that contains two or more condensed (fused) aromatic hydrocarbon rings and the content of
which can be determined according to the method specified in this International Standard
Note 1 to entry: The content is given in micrograms per kilogram.
Note 2 to entry: In general, PAHs are divided into light PAHs with two to four aromatic rings, and heavy PAHs
with five or more aromatic rings.
EXAMPLE Light PAHs include:
naphthalene (CAS RN [91-20-3]), acenaphthene (CAS RN [83-32-9]), acenaphthylene (CAS RN [208-96-8]),
fluorene (CAS RN [86-73-7]), anthracene (CAS RN [120-12-7]), phenanthrene (CAS RN [85-01-8]), fluoranthene
(CAS RN [206-44-0]), chrysene (CAS RN [218-01-9]), benz(a)anthracene (CAS RN [56-55-3]), pyrene
(CAS RN [129-00-0]).
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Heavy PAHs include:
benzo(a)pyrene (CAS RN [50-32-8]), benzo(b)fluoranthene (CAS RN [205-99-2]), benzo(k)fluoranthene
(CAS RN [207-08-9]), benzo(g,h,i)perylene (CAS RN [191-24-2]), dibenz(a,h)anthracene (CAS RN [53-70-3]),
indeno(1,2,3-c,d)pyrene (CAS RN [193-39-5]).
4 Principle
The polycyclic aromatic hydrocarbons are extracted with an acetonitrile/acetone mixture followed by
purification on C18 reversed-phase and then Florisil bonded-phase cartridges. Determination of the
content of the individual polycyclic aromatic hydrocarbons after separation is achieved by means of
high-pressure liquid chromatography (HPLC) and by measuring the fluorescence at various excitation
and emission wavelengths.
5 Reagents and materials
WARNING — Attention is drawn to the regulations governing the handling of dangerous matter.
Technical, organizational and personal safety measures should be followed.
Use only reagents of recognized analytical grade unless otherwise stated.
Check the quality of solvents before use by concentrating the solvent about 1 000 times by evaporation
and analysing the concentrate by HPLC (300 ml to 300 µl). The chromatogram shall be free from peaks
in the elution area of PAHs.
1)
5.1 Methanol, “ultra resi-analysed” grade.
1)
5.2 Hexane, HPLC grade.
1)
5.3 Acetonitrile, HPLC grade.
1)
5.4 Acetone, HPLC grade.
1)
5.5 Dichloromethane, HPLC grade.
1)
5.6 Toluene, HPLC grade.
1)
5.7 Water, HPLC grade.
1)
5.8 Tetrahydrofuran, HPLC grade.
5.9 Solvent mixture 1: acetonitrile/acetone (volume fraction 60 %/40 %).
Quantity used per sample: 41 ml for general method, 36 ml for specific method for coconut oil.
5.10 Solvent mixture 2: acetonitrile/acetone (volume fraction 80 %/20 %).
Quantity used per sample: 2 × 11 ml for method specific for coconut oil.
5.11 Solvent mixture 3: hexane/dichloromethane (volume fraction 75 %/25 %).
Quantity used per sample: 7 ml for general method, 2 × 7 ml for method specific for coconut oil.
1) These can be obtained from, for example, Baker. The information given in the footnotes is for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products. Equivalent products may
be used if they can be shown to lead to the same results.
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5.12 Mixture of tetrahydrofuran/methanol (volume fraction 50 %/50 %).
2)
5.13 Standard solution with 16 certified EPA Priority PAHs in toluene, at a concentration of
100 µg/ml (100 mg/l): naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, fluorene, phenanthrene, anthracene,
fluoranthene, pyrene, benz(a)anthracene, chrysene, benzo(b)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene,
benzo(a)pyrene, dibenz(a,h)anthracene, benzo(g,h,i)perylene, indeno(1,2,3-c,d)pyrene.
NOTE 1 This is stored at -20 °C.
Before use, allow the solution to warm up to ambient temperature for at least 1 h.
NOTE 2 Acenaphthylene is not fluorescent and, thus, it cannot be determined by these methods.
5.14 Stock standard solution, 200 ng/ml (200 µg/l).
Add 100 µl of standard solution (5.13) with a 250 µl syringe (6.11) to a 50 ml volumetric flask (6.20) and
dilute to the mark with acetonitrile.
5.15 Working standard solution, 50 ng/ml (50 µg/l).
Add 250 µl of stock standard solution (5.14) with a 250 µl syringe (6.11) to 750 µl of THF/methanol
mixture (5.12) or acetonitrile (5.3).
3)
5.16 C18 bonded-phase cartridges, 2 g phase, 12 ml capacity.
3)
5.17 Florisil bonded-phase cartridges, 500 mg phase, 3 ml capacity.
5.18 Stream of nitrogen, pressure regulated at 34,5 kPa (5 psi, about 1,5 l/min).
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
The use of disposable glass tubes is acceptable. The general use of glass is necessary as plastics can
contain PAHs.
−1
6.1 Centrifuge, capable of attaining at least 4 000 min , suitable for 100 ml and 10 ml tubes.
6.2 HPLC system with binary gradient elution, with solvent reservoir of 1 l capacity, a mobile
phase liner filter, pump, autosampler, column temperature regulation set at 25 °C, fluorescence detector
programmable over time for various excitation and emission wavelengths, and computer-assisted
acquisition and data treatment.
4)
6.3 C18 reversed-phase column, 250 mm in length, 4,6 mm internal diameter, 5 µm particles,
suitable for PAH analysis.
6.4 Vortex mixer.
2) This can be obtained from, for example, Promochem.
3) This can be obtained from, for example, Varian.
4) This can be obtained from, for example, Vydac, ref. 201TP54.
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5)
6.5 Automatic evaporator, for 10 ml tube (optional), or water bath (6.6).
Recommended operating conditions:
— temperature of water bath 35 °C;
— nitrogen pressure 34,5 kPa.
6.6 Water bath, regulated at 35 °C.
6.7 Balance, with readability of 0,1 mg.
6.8 Centrifuge tubes, of 100 ml capacity (one per sample).
6.9 Conical centrifuge tubes, of 11 ml capacity (three per sample), with PTFE septa and closed top
screw caps (one per sample).
[6]
6.10 Graduated measuring cylinders, ISO 4788 , class A.
6.11 Microsyringe, 250 µl.
6.12 Syringe, 1 000 µl.
[4]
6.13 Graduated pipette, capacity 5 ml, ISO 835 , class A.
6.14 Syringe, 5 ml, equipped with an adapter cap for SPE cartridges.
6.15 Vials for autosampler.
6.16 Microvials, of 250 µl capacity, adapted for HPLC system.
6.17 Ultrasonic bath, with water temperature not higher than 40 °C.
[7]
6.18 Pasteur pipettes, with cotton wool in the top part to prevent contamination, ISO 7712 .
6)
6.19 Device composed of stand and pincers, to hold SPE cartridges or, if available, an automatic SPE
work station.
NOTE Depending on the SPE sample processing station used, the proposed extraction methods may require
slight adaptations (times, pressure, volumes).
[5]
6.20 One-mark volumetric flask, capacity 50 ml, ISO 1042 , class A.
7 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling
method is given in ISO 5555.
5) This can be obtained from, for example, Zymark, Zymark TurboVap LV evaporator.
6) This can be obtained from, for example, Zymark, Zymark Rapid Trace.
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ISO 15753:2016(E)
8 Sample preparation
Prepare the test sample in accordance with the method given in ISO 661. Before sampling, the liquid
samples shall be at room temperature and homogenized by magnetic agitation.
Sample the solid matrix by melting the entire sample or by melting and homogenizing several core
samples.
9 Procedure for determination of PAHs from fats and oils: General method
9.1 Preliminary remarks
In order to obtain repeatable results, the ambient temperature of the laboratory shall be regulated
(≤20 °C). This is a very important condition for the extraction of PAHs from coconut oil (or vegetable
oils containing short-chain fatty acids). These oils contain fatty acids with short and long chains; when
the ambient temperature is higher than 20 °C, the solubility of short-chain fatty acids increases.
Before use, rinse the whole vessel three times with hexane (5.2).
Each sequence of samples shall include a blank (9.2), and a standard solution extracted under the same
conditions as the sample in order to calculate the recovery values of the extraction (9.3). The recovery
values shall be within the range 70 % to 110 %. The mean recovery values are given in Table A.1.
For a quantitative analysis, two test portions shall be extracted and analysed separately, the final result
being the mean value of the results of these two subsamples.
It is not possible to complete the entire analysis within a single day. Sample extracts shall be stored
overnight under deep-freeze conditions of at least -18 °C:
— 1st day: step 1, step 2 and step 3, up to purification on C18 cartridge (see Figure A.1);
— 2nd day: step 3, purification on Florisil cartridge and preparation of HPLC system for sample
analysis (see Figure A.1);
— following night and day(s): analysis of the samples (see Table A.2).
9.2 Blank
To ensure the absence of contamination of solvents and cartridges, the purification procedure
(according to 9.5, 9.6 and Clause 11) shall first be carried out on a blank sample (sample with solvent
mixture but with the oil omitted). The chromatogram obtained shall be free from the compounds of
interest. If the chromatogram contains interferences, the source of interferences shall be determined
and eliminated. Blank values cannot be used to correct sample values as blank values are generally not
homogenous (repeatability).
9.3 Determination of recovery values (without matrix)
In order to verify the extraction efficiency of cartridges, carry out a test with a standard solution. Spike
1 750 µl of solvent mixture 1 (5.9) with 250 µl of working standard solution (5.15) with a 250 µl syringe
(6.11). Transfer to a C18 cartridge and treat as described in 9.5, 9.6 and Clause 11.
WARNING — When removing solvents under a stream of nitrogen (see 9.5.6), do not evaporate to
dryness but leave about 50 µl in the vial, otherwise, volatile PAHs will be lost.
9.4 Extraction (liquid/liquid extraction)
9.4.1 The flow chart of the isolation procedure is given in Figure A.1.
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ISO 15753:2016(E)
9.4.2 Weigh, to the nearest 1 mg, about 2,5 g of the sample into a 100 ml centrifuge tube (6.8).
Add 10 ml of solvent mixture 1 (5.9).
9.4.3 Agitate the centrifuge tube for 30 s with the vortex mixer (half speed), and then put the tube in
an ultrasonic bath (6.17) for 5 min.
−1
9.4.4 Centrifuge for 5 min at 4 000 min .
9.4.5 Carefully remove the top layer with a Pasteur pipette (6.18) and transfer it to a weighed conical
tube (6.9).
9.4.6 Evaporate the solvent from the conical tube for 30 min to 40 min, under a stream of nitrogen
(5.18), using either a water bath at 35 °C (6.6) or an automatic evaporator (6.5).
9.4.7 Repeat the extraction twice with a further 10 ml of solvent mixture 1 (5.9).
Concentrate the extracts in the same conical tube under a stream of nitrogen (5.18) using water bath set
at 35 °C (6.6) or using an automatic evaporator (6.5). The fat residue should be about 200 mg to 800 mg.
If the fat residue mass is higher than 800 mg, then the general method (see Clause 9) is not suitable and
the method specific for coconut oil should be used (see Clause 10).
9.5 Purification on C18-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction)
9.5.1 Cartridge conditioning: Put the cartridge (5.16) on a stand (6.19).
Rinse the cartridge with 2 volumes of 12 ml of methanol (5.1) then 2 volumes of 12 ml of acetonitrile (5.3).
Allow the solvent to flow through under atmospheric pressure.
9.5.2 Put a weighed conical tube (6.9) under the cartridge (5.16).
9.5.3 With a syringe (6.12) or a graduated pipette (6.13), introduce 2 ml of solvent mixture 1 (5.9) into
the conical tube containing residual fat material (9.4.6).
Agitate the tube with the vortex mixer (6.4) for 15 s. Centrifuge for 30 s. Transfer the top layer to the
cartridge (5.16) with a Pasteur pipette (6.18). Repeat the operation twice (2 ml of solvent mixture 1,
mixing, centrifuging and transferring onto the cartridge). Collect the solvent eluting from the cartridge
together with the elution solvent.
9.5.4 Add 5 ml of solvent mixture 1 (5.9) to the top of the cartridge (5.16) and allow the elution to
proceed under atmospheric pressure.
9.5.5 Using a syringe (6.14), inject air into the cartridge in order to elute the remaining solvent and any
PAHs which could be retained in the phase.
9.5.6 Remove solvents under a stream of nitrogen (5.18) using a water bath set at 35 °C (6.6) or an
automatic evaporator (6.5).
The fat residue should be not more than 50 mg.
9.5.7 Dilute the residue in 1 ml of hexane (5.2), measured with a syringe (6.12).
Close the conical tube hermetically and store at -18 °C until further use.
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ISO 15753:2016(E)
9.6 Purification on Florisil-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction)
9.6.1 Allow the extract (9.5.7) to warm up to ambient temperature for at least 1 h.
9.6.2 Cartridge conditioning: Put the cartridge (5.17) on a stand (6.19).
Rinse the cartridge with 5 volumes of 3 ml of dichloromethane (5.5) then 4 volumes of 3 ml of
hexane (5.2).
9.6.3 Put a weighed conical tube (6.9) under the cartridge (5.17).
9.6.4 Transfer the extract (9.5.7) to the cartridge (5.17) with a Pasteur pipette (6.18).
9.6.5 Introduce 1 ml of solvent mixture 3 (5.11), using a syringe (6.12) or a graduated pipette (6.13),
to the conical tube containing the extract.
Agitate it for 15 s with the vortex mixer and transfer it to the cartridge (5.17). Rinse the tube with
2 × 2 ml of solvent mixture 3 (5.11) and transfer it onto the cartridge. Collect the solvent eluting from
the cartridge together with the elution solvent.
Pay careful attention to avoid contact between the pipette and the conical tube in order to prevent
cross contamination.
9.6.6 Elute 4 ml of solvent mixture 3 (5.11) through the cartridge (5.17).
Using a syringe (6.14), inject air into the cartridge in order to elute the remaining solvent.
9.6.7 Concentrate the solution under a stream of nitrogen (5.18), using a water bath set at 35 °C (6.6)
or an automatic evaporator (6.5), to about 1 ml (takes 10 min to 15 min).
Add about 0,5 ml of toluene (5.6) (keeper) and continue to evaporate until about 50 µl remain.
The solvent should not be removed completely.
9.6.8 The exact volume is determined by weighing the conical tube, and calculating using the density
of toluene.
Add the necessary volume of solvent [MeOH/THF (5.12) or acetonitrile (5.3)], V , to make up to 250 µl:
add
m
V =−250 (1)
add
d
where
m is the sample mass, in milligrams;
3
d is the density of toluene (0,866 9 kg/m ).
9.6.9 Transfer the sample to a microvial (6.16) placed in a vial (6.15).
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ISO 15753:2016(E)
10 Procedure for determination of PAHs from fats and oils: Method specific for
coconut oil
10.1 First extraction (liquid/liquid extraction)
10.1.1 The flow chart of the isolation procedure is given in Figure A.2.
10.1.2 Weigh, to the nearest 1 mg, about 2 g of the sample into a 100 ml centrifuge tube (6.8).
Add 10 ml of solvent mixture 1 (5.9).
10.1.3 Agitate the centrifuge tube for 30 s with the vortex mixer (half speed), and then put the tube in
an ultrasonic bath (6.17) for 5 min.
−1
10.1.4 Centrifuge for 5 min at 4 000 min .
10.1.5 Carefully remove the top layer with a Pasteur pipette (6.18) and introduce it into a conical
tube (6.9).
10.1.6 Evaporate the solvent from the conical tube for 30 min to 40 min under a stream of nitrogen
(5.18) using the water bath set at 35 °C (6.6) or an automatic evaporator (6.5).
10.1.7 Repeat the extraction twice, with a further 10 ml of solvent mixture 1 (5.9).
Concentrate the extracts in the same conical tube under a stream of nitrogen (5.18) using water bath
set at 35 °C (6.6) or an automatic evaporator (6.5).
10.2 Second extraction (liquid/liquid extraction)
10.2.1 With a syringe (6.12) or a graduated pipette (6.13), introduce 2 ml of solvent mixture 1 (5.9) to
the conical tube containing residual fat material (10.1.7).
Agitate the tube with the vortex mixer for 15 s. Centrifuge for 30 s. Divide the extract into two equal
parts in two weighed conical tubes (6.9).
Pay careful attention to avoid contact between the pipette and the conical tube in order to prevent
cross contamination.
10.2.2 Repeat twice the procedure detailed in 10.2.1 using the same conical tubes.
10.2.3 Concentrate the two extracts under a stream of nitrogen (5.18) using the water bath set at 35 °C
(6.6) or an automatic evaporator (6.5).
Each fat residue should be about 250 mg.
10.3 Purification on C18-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction)
10.3.1 Cartridge conditioning: Put two cartridges (5.16) on a stand (6.19).
Rinse the cartridges with 2 volumes of 12 ml of methanol (5.1) then 2 volumes of 12 ml of
acetonitrile (5.3). Allow the solvent to flow under atmospheric pressure.
10.3.2 Put a weighed conical tube (6.9) under each cartridge (5.16).
8 © ISO 2016 – All rights reserved
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ISO 15753:2016(E)
10.3.3 With a syringe (6.12) or a graduated pipette (6.13), introduce 2 ml of solvent mixture 2 (5.10) to
the two conical tubes containing the residual fat material (10.2.3).
Agitate the tubes with the vortex mixer for 15 s. Transfer the whole extract of each conical tube to
each cartridge (5.16) with a Pasteur pipette (6.18). Rinse the tube with 2 × 2 ml of solvent mixture 2
(5.10) and transfer it onto the cartridge. Collect the solvent eluting from the cartridge together with the
elution solvent.
10.3.4 Elute 5 ml of solvent mixture 2 (5.10) through the cartridges (do not inject air on the cartridges).
10.3.5 Remove solvents under a stream of nitrogen (5.18) using the water
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15753
Deuxième édition
2016-04-01
Corps gras d’origines animale
et végétale — Détermination
des hydrocarbures aromatiques
polycycliques
Animal and vegetable fats and oils — Determination of polycyclic
aromatic hydrocarbons
Numéro de référence
ISO 15753:2016(F)
©
ISO 2016
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ISO 15753:2016(F)
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ISO 15753:2016(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et matériaux . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage . 5
8 Préparation de l’échantillon . 5
9 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras:
Méthode générale . 5
9.1 Remarques préliminaires . 5
9.2 Essai à blanc . 6
9.3 Détermination des valeurs des taux de récupération (sans matrice) . 6
9.4 Extraction (extraction liquide/liquide) . 6
9.5 Purification sur des cartouches de phase greffée en C18 (extraction solide/liquide) . 7
9.6 Purification sur des cartouches de phase greffée de Florisil (extraction solide/liquide) . 7
10 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras: Méthode
spécifique pour l’huile de coprah . 8
10.1 Première extraction (extraction liquide/liquide) . 8
10.2 Deuxième extraction (extraction liquide/liquide) . 9
10.3 Purification sur des cartouches de phase greffée en C18 (extraction solide/liquide) . 9
10.4 Purification sur des cartouches de phase greffée de Florisil (extraction solide/liquide) . 9
11 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP) .10
11.1 Conditions de fonctionnement .10
11.2 Paramètres de détection .11
11.3 Analyse des échantillons et des étalons .12
11.4 Confirmation de la présence des HAP .13
12 Expression des résultats.13
13 Fidélité .13
13.1 Essai interlaboratoires .13
13.2 Répétabilité .13
13.3 Reproductibilité .14
14 Rapport d’essai .14
Annexe A (informative) Valeurs des taux de récupération, schémas fonctionnels,
chromatogrammes et séquences d’injection .15
Annexe B (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires .20
Bibliographie .23
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ISO 15753:2016(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 15753:2006), dont elle constitue
une révision mineure. Elle incorpore également l’Amendement ISO 15753:2006/Amd.1:2011. Un énoncé
relatif à la non applicabilité au lait et aux produits laitiers a été ajouté au Domaine d’application.
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NORME INTERNATIONALE ISO 15753:2016(F)
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination
des hydrocarbures aromatiques polycycliques
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit deux méthodes pour la détermination de 15 hydrocarbures
aromatiques polycycliques (HAP) dans les corps gras d’origines animale et végétale:
— une méthode générale;
— une méthode spécifique pour l’huile de coprah et les huiles végétales avec acides gras à chaînes
courtes.
Ces méthodes ne sont pas quantitatives pour les composés très volatils tels que le naphtalène,
l’acénaphtène et le fluorène. En raison des interférences causées par la matrice elle-même, l’huile de
palme et l’huile de grignons d’olive ne peuvent pas être analysées par cette méthode.
La limite de quantification est de 0,2 µg/kg pour la majorité des composés analysés, à l’exception
du fluoranthène et du benzo(g,h,i)pérylène, dont la limite de quantification est de 0,3 µg/kg, et de
l’indéno(1,2,3-c,d)pyrène, dont la limite de quantification est de 1,0 µg/kg.
NOTE Les résultats pour l’huile de grignons d’olive dans l’Annexe B montrent que cette méthode n’est pas
applicable à ce type d’huile. Les données de fidélité déterminées sont très médiocres.
Le lait et les produits laitiers (ou la graisse provenant du lait et des produits laitiers) sont exclus du
domaine d’application de la présente Norme internationale.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de façon normative dans le présent document
et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
hydrocarbures aromatiques polycycliques
HAP
composés contenant au moins deux noyaux d’hydrocarbures aromatiques condensés (accolés) et dont
la teneur peut être déterminée à l’aide de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
Note 1 à l’article: La teneur est indiquée en microgrammes par kilogramme.
Note 2 à l’article: On divise, en général, les HAP en HAP légers, avec deux à quatre noyaux aromatiques, et HAP
lourds avec au moins cinq noyaux aromatiques.
EXEMPLE
Les HAP légers incluent:
© ISO 2016 – Tous droits réservés 1
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ISO 15753:2016(F)
le naphtalène (n° CAS [91-20-3]), l’acénaphtène (n° CAS [83-32-9]), l’acénaphthylène (n° CAS [208-96-8]), le
fluorène (n° CAS [86-73-7]), l’anthracène (n° CAS [120-12-7]), le phénanthrène (n° CAS [85-01-8]), le fluoranthène
(n° CAS [206-44-0]), le chrysène (n° CAS [218-01-9]), le benzo(a)anthracène (n° CAS [56-55-3]), le pyrène (n°
CAS [129-00-0]).
Les HAP lourds incluent:
le benzo(a)pyrène (n° CAS [50-32-8]), le benzo(b)fluoranthène (n° CAS [205-99-2]), le benzo(k)fluoranthène
(n° CAS [207-08-9]), le benzo(g,h,i)pérylène (n° CAS [191-24-2]), le dibenzo(a,h)anthracène (n° CAS [53-70-3]),
l’indéno(1,2,3-c,d)pyrène (n° CAS [193-39-5]).
4 Principe
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont extraits avec un mélange acétonitrile/acétone,
puis purifiés sur des cartouches de phase inversée C18 et, ensuite, sur des cartouches de Florisil. La
détermination de la teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques individuels après séparation
est réalisée par le biais de la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en mesurant la
fluorescence à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission différentes.
5 Réactifs et matériaux
AVERTISSEMENT — L’attention est attirée sur la réglementation régissant la manipulation de
matières dangereuses. Il convient de respecter des mesures de sécurité sur le plan technique,
organisationnel et personnel.
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, sauf indication contraire.
Vérifier la qualité des solvants avant utilisation en concentrant le solvant environ 1 000 fois par
évaporation, puis analyser le concentré par CLHP (300 ml à 300 µl). Le chromatogramme doit être
exempt de pics dans la zone d’élution des HAP.
1)
5.1 Méthanol, qualité «ultra resi-analysed» .
1)
5.2 Hexane, qualité CLHP .
1)
5.3 Acétonitrile, qualité CLHP .
1)
5.4 Acétone, qualité CLHP .
1)
5.5 Dichlorométhane, qualité CLHP .
1)
5.6 Toluène, qualité CLHP .
1)
5.7 Eau, qualité CLHP .
1)
5.8 Tétrahydrofuranne, qualité CLHP .
5.9 Mélange de solvants 1: acétonitrile/acétone (fraction volumique 60 %/40 %).
Quantité utilisée par échantillon: 41 ml pour la méthode générale, 36 ml pour la méthode spécifique
pour l’huile de coprah.
1) Ces produits peuvent, par exemple, être obtenus auprès de Baker. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux
mêmes résultats.
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ISO 15753:2016(F)
5.10 Mélange de solvants 2: acétonitrile/acétone (fraction volumique 80 %/20 %).
Quantité utilisée par échantillon: 2 × 11 ml pour la méthode spécifique pour l’huile de coprah.
5.11 Mélange de solvants 3: hexane/dichlorométhane (fraction volumique 75 %/25 %).
Quantité utilisée par échantillon: 7 ml pour la méthode générale, 2 × 7 ml pour la méthode spécifique
pour l’huile de coprah.
5.12 Mélange de tétrahydrofuranne (THF)/méthanol (MeOH) (fraction volumique 50 %/50 %).
5.13 Solution étalon avec 16 HAP certifiés prioritaires par l’EPA (Agence de protection de
2)
l’environnement) dans le toluène , à une concentration de 100 µg/ml (100 mg/l): le naphtalène,
l’acénaphthylène, l’acénaphtène, le fluorène, le phénanthrène, l’anthracène, le fluoranthène, le pyrène, le
benzo(a)anthracène, le chrysène, le benzo(b)fluoranthène, le benzo(k)fluoranthène, le benzo(a)pyrène,
le dibenzo(a,h)anthracène, le benzo(g,h,i)pérylène, l’indéno(1,2,3-c,d)pyrène.
NOTE 1 Cette solution est conservée à −20 °C.
Avant emploi, laisser la solution se réchauffer à température ambiante pendant au minimum 1 h.
NOTE 2 L’acénaphthylène n’est pas fluorescent et ne peut donc pas être déterminé par ces méthodes.
5.14 Solution mère étalon, à 200 ng/ml (200 µg/l).
Ajouter 100 µl de solution étalon (5.13) avec une seringue de 250 µl (6.11) dans une fiole jaugée de
50 ml (6.20) et diluer au volume avec de l’acétonitrile.
5.15 Solution étalon de travail, à 50 ng/ml (50 µg/l).
Ajouter 250 µl de solution mère étalon (5.14) avec une seringue de 250 µl (6.11) à 750 µl de mélange
THF/méthanol (5.12) ou d’acétonitrile (5.3).
3)
5.16 Cartouches de phase greffée en C18 , phase 2 g, capacité de 12 ml.
3)
5.17 Cartouches de phase greffée de Florisil , phase 500 mg, capacité de 3 ml.
5.18 Flux d’azote, pression contrôlée à 34,5 kPa (5 psi, environ 1,5 l/min).
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
L’utilisation de tubes jetables en verre est acceptable. L’utilisation généralisée du verre est nécessaire
parce que les plastiques peuvent contenir des HAP.
−1
6.1 Centrifugeuse, tournant au moins à 4 000 min , convenant pour les tubes de 100 ml et de 10 ml.
2) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Promochem. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.
3) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Varian. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.
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ISO 15753:2016(F)
6.2 Système de CLHP avec élution de gradient binaire, avec réservoir de solvant d’une capacité de
1 l, filtre à membrane pour phase mobile, pompe, passeur d’échantillons, régulation de température de
colonne réglée à 25 °C, détecteur fluorimétrique programmable dans le temps pour des longueurs d’onde
d’excitation et d’émission différentes et un système d’acquisition et de traitement des données assisté
par ordinateur.
4)
6.3 Colonne de phase inversée C18 , 250 mm de longueur, 4,6 mm de diamètre intérieur, particules
de 5 µm, convenant pour l’analyse des HAP.
6.4 Agitateur vortex.
5)
6.5 Évaporateur automatique , pour un tube de 10 ml (facultatif) ou bain-marie (6.6).
Conditions de fonctionnement recommandées:
— température du bain-marie 35 °C;
— pression d’azote 34,5 kPa.
6.6 Bain-marie, régulé à 35 °C.
6.7 Balance, lisibilité de 0,1 mg.
6.8 Tubes à centrifuger, d’une capacité de 100 ml (un par échantillon).
6.9 Tubes à centrifuger coniques, d’une capacité de 11 ml (trois par échantillon) avec capuchons
vissés munis de joints en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (un par échantillon).
[6]
6.10 Éprouvettes graduées, ISO 4788 , classe A.
6.11 Microseringue, de 250 µl.
6.12 Seringue, de 1 000 µl.
[4]
6.13 Pipette graduée, de capacité 5 ml, ISO 835 , classe A.
6.14 Seringue, de 5 ml, munie d’un bouchon adaptateur pour les cartouches SPE.
6.15 Flacons pour passeur d’échantillons.
6.16 Microflacons, d’une capacité de 250 µl, adaptés au système CLHP.
6.17 Bain à ultrasons, température de l’eau ne dépassant pas 40 °C.
4) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Vydac, réf. 201TP54. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
5) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Zymark, turbo-évaporateur Zymark TurboVap LV. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés
s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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ISO 15753:2016(F)
6.18 Pipettes Pasteur, munies de coton dans la partie supérieure pour éviter toute contamination,
[7]
ISO 7712 .
6)
6.19 Appareil disposant d’un support et de pinces pour maintenir les cartouches SPE ou, si
possible, une station de travail SPE automatique.
NOTE Selon la station de traitement d’échantillons SPE utilisée, les méthodes d’extraction proposées peuvent
nécessiter de légères adaptations (temps, pression, volumes).
[5]
6.20 Fiole jaugée à un trait, d’une capacité de 50 ml, ISO 1042 , classe A.
7 Échantillonnage
Il convient que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, qui n’a été ni endommagé ni modifié
pendant le transport ou le stockage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d’échantillonnage recommandée est fournie dans l’ISO 5555.
8 Préparation de l’échantillon
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la méthode indiquée dans l’ISO 661. Avant
l’échantillonnage, les échantillons liquides doivent être à température ambiante et être homogénéisés
par agitation magnétique.
Échantillonner la matrice solide en fondant la totalité de l’échantillon ou en fondant, puis en
homogénéisant, plusieurs carottes d’échantillons.
9 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras:
Méthode générale
9.1 Remarques préliminaires
Pour obtenir des résultats répétables, la température ambiante du laboratoire doit être régulée
(≤ 20 °C). Ce paramètre est très important pour l’extraction des HAP à partir de l’huile de coprah (ou
des huiles végétales contenant des acides gras à chaînes courtes). Ces huiles contiennent des acides gras
à chaînes courtes et longues; si la température ambiante dépasse 20 °C, la solubilité des acides gras à
chaînes courtes augmente.
Avant emploi, rincer la totalité de la verrerie trois fois avec de l’hexane (5.2).
Chaque séquence d’échantillons doit inclure un essai à blanc (9.2) et une solution étalon extraite dans
les mêmes conditions que l’échantillon afin de calculer les taux de récupération de l’extraction (9.3). Les
valeurs des taux de récupération doivent être comprises entre 70 % et 110 %. Les valeurs des taux de
récupération moyens sont données dans le Tableau A.1.
Pour une analyse quantitative, deux prises d’essai doivent être extraites et analysées séparément, le
résultat final étant la valeur moyenne des résultats des deux sous-échantillons.
Il n’est pas possible d’effectuer la totalité de l’analyse en une journée. Les extraits des échantillons
doivent être conservés jusqu’au lendemain dans des conditions de surgélation à −18 °C:
er
— 1 jour: étape 1, étape 2 et étape 3 jusqu’à la purification sur cartouche C18 (voir Figure A.1);
6) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Zymark, Zymark Rapid Trace. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
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e
— 2 jour: étape 3, purification sur cartouche de Florisil et préparation du système CLHP pour l’analyse
d’échantillon (voir Figure A.1);
— nuit et jour(s) suivants: analyse des échantillons (voir Tableau A.2).
9.2 Essai à blanc
Pour garantir l’absence de contamination des solvants et cartouches, l’opération de purification
(conformément à 9.5, à 9.6 et à l’Article 11) doit d’abord être effectuée sur un échantillon à blanc
(échantillon avec un mélange de solvants mais sans l’huile). Le chromatogramme obtenu doit être
exempt de composés d’intérêt. Si le chromatogramme contient des interférences, l’origine de ces
interférences doit être déterminée et éliminée. Les valeurs des essais à blanc ne peuvent pas être
utilisées pour corriger les valeurs des échantillons puisque les valeurs des essais à blanc ne sont
généralement pas homogènes (répétabilité).
9.3 Détermination des valeurs des taux de récupération (sans matrice)
Afin de vérifier l’efficacité d’extraction des cartouches, effectuer un essai avec une solution étalon.
Complémenter 1 750 µl de mélange de solvants 1 (5.9) avec 250 µl de solution étalon de travail (5.15)
à l’aide d’une seringue de 250 µl (6.11). Déposer sur une cartouche C18, puis suivre le mode opératoire
décrit en 9.5, en 9.6 et à l’Article 11.
AVERTISSEMENT — Lors de l’élimination du solvant sous un flux d’azote (voir 9.5.6), ne pas
évaporer à sec mais conserver environ 50 µl dans le tube afin de ne pas perdre les HAP volatils.
9.4 Extraction (extraction liquide/liquide)
9.4.1 Le schéma fonctionnel du mode opératoire d’isolement est fourni à la Figure A.1.
9.4.2 Peser, à 1 mg près, environ 2,5 g de l’échantillon dans un tube à centrifuger de 100 ml (6.8).
Ajouter 10 ml de mélange de solvants 1 (5.9).
9.4.3 Agiter le tube à centrifuger pendant 30 s à l’aide de l’agitateur vortex (demi-vitesse), puis placer
le tube dans un bain à ultrasons (6.17) pendant 5 min.
−1
9.4.4 Centrifuger pendant 5 min à 4 000 min .
9.4.5 Prélever avec précaution la phase supérieure à l’aide d’une pipette Pasteur (6.18), puis la
transférer dans un tube conique taré (6.9).
9.4.6 Évaporer le solvant du tube conique pendant 30 min à 40 min sous un flux d’azote (5.18) en
utilisant un bain-marie à 35 °C (6.6) ou un évaporateur automatique (6.5).
9.4.7 Répéter l’extraction deux fois avec 10 ml supplémentaires de mélange de solvants 1 (5.9).
Concentrer les extraits dans le même tube conique sous un flux d’azote (5.18) en utilisant un bain-marie
à 35 °C (6.6) ou un évaporateur automatique (6.5). Il convient que le résidu de corps gras soit d’environ
200 mg à 800 mg.
Si le poids du résidu de corps gras est supérieur à 800 mg, la méthode générale (voir Article 9) n’est
pas appropriée; il convient, dans ce cas, d’utiliser la méthode spécifique pour l’huile de coprah (voir
Article 10).
6 © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO 15753:2016(F)
9.5 Purification sur des cartouches de phase greffée en C18 (extraction solide/liquide)
9.5.1 Conditionnement des cartouches: placer la cartouche (5.16) sur un support (6.19).
Rincer la cartouche avec 2 volumes de 12 ml de méthanol (5.1), puis avec 2 volumes de 12 ml
d’acétonitrile (5.3). Laisser le solvant s’écouler à la pression atmosphérique.
9.5.2 Placer un tube conique taré (6.9) sous la cartouche (5.16).
9.5.3 À l’aide d’une seringue (6.12) ou d’une pipette graduée (6.13), introduire 2 ml de mélange de
solvants 1 (5.9) dans le tube conique contenant le résidu de corps gras (9.4.6).
Agiter le tube pendant 15 s à l’aide de l’agitateur vortex (6.4). Centrifuger pendant 30 s. Transférer la
phase supérieure en tête de la cartouche (5.16) à l’aide d’une pipette Pasteur (6.18). Répéter l’opération
deux fois (2 ml de mélange de solvants 1, mélanger, centrifuger et transférer sur la cartouche). Recueillir
le solvant éluant de la cartouche avec le solvant d’élution.
9.5.4 Ajouter 5 ml de mélange de solvants 1 (5.9) en tête de la cartouche (5.16), puis laisser l’élution se
développer à la pression atmosphérique.
9.5.5 À l’aide d’une seringue (6.14), injecter de l’air dans la cartouche dans le but d’éluer le solvant
restant et les HAP pouvant être retenus dans la phase solide.
9.5.6 Évaporer les solvants sous un flux d’azote (5.18) à l’aide d’un bain-marie à 35 °C (6.6) ou d’un
évaporateur automatique (6.5).
Il convient que le résidu de corps gras ne dépasse pas 50 mg.
9.5.7 Diluer le résidu dans 1 ml d’hexane (5.2), mesuré avec une seringue (6.12).
Fermer hermétiquement le tube conique et le conserver à −18 °C jusqu’à la prochaine utilisation.
9.6 Purification sur des cartouches de phase greffée de Florisil (extraction
solide/liquide)
9.6.1 Laisser l’extrait (9.5.7) se réchauffer à température ambiante pendant au moins 1 h.
9.6.2 Conditionnement des cartouches: placer la cartouche (5.17) sur un support (6.19).
Rincer la cartouche avec 5 volumes de 3 ml de dichlorométhane (5.5), puis avec 4 volumes de 3 ml
d’hexane (5.2).
9.6.3 Placer un tube conique taré (6.9) sous la cartouche (5.17).
9.6.4 Transférer l’extrait (9.5.7) en tête de la cartouche (5.17) à l’aide d’une pipette Pasteur (6.18).
9.6.5 Introduire 1 ml de mélange de solvants 3 (5.11) à l’aide d’une seringue (6.12) ou d’une pipette
graduée (6.13) dans le tube conique contena
...
PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 15753
ISO/TC 34/SC 11
Corps gras d’origines animale
Secrétariat: BSI
et végétale — Détermination
Début de vote:
2015-12-10 des hydrocarbures aromatiques
polycycliques
Vote clos le:
2016-02-10
Animal and vegetable fats and oils — Determination of polycyclic
aromatic hydrocarbons
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
Veuillez consulter les notes administratives en page iii
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 15753:2015(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
©
TION NATIONALE. ISO 2015
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ISO/FDIS 15753:2015(F)
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet final a été élaboré dans le cadre de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) et
soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l’ISO, tel que défini dans l’Accord de Vienne. Le
projet final a été établi sur la base des observations reçues lors de l’enquête parallèle sur le projet.
Le projet final est par conséquent soumis aux comités membres de l’ISO et aux comités membres du CEN en
parallèle à un vote d’approbation de deux mois au sein de l’ISO et à un vote formel au sein du CEN.
Les votes positifs ne doivent pas être accompagnés d’observations.
Les votes négatifs doivent être accompagnés des arguments techniques pertinents.
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ISO/FDIS 15753:2015(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et matériaux . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage . 5
8 Préparation de l’échantillon . 5
9 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras:
Méthode générale . 5
9.1 Remarques préliminaires . 5
9.2 Essai à blanc . 5
9.3 Détermination des valeurs des taux de récupération (sans matrice) . 6
9.4 Extraction (extraction liquide/liquide) . 6
9.5 Purification sur des cartouches de phase greffée en C18 (extraction solide/liquide) . 6
9.6 Purification sur des cartouches de phase greffée de Florisil (extraction solide/liquide) . 7
10 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras: Méthode
spécifique pour l’huile de coprah . 8
10.1 Première extraction (extraction liquide/liquide) . 8
10.2 Deuxième extraction (extraction liquide/liquide) . 8
10.3 Purification sur des cartouches de phase greffée en C18 (extraction solide/liquide) . 9
10.4 Purification sur des cartouches de phase greffée de Florisil (extraction solide/liquide) . 9
11 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP) .10
11.1 Conditions de fonctionnement .10
11.2 Paramètres de détection .11
11.3 Analyse des échantillons et des étalons .12
11.4 Confirmation de la présence des HAP .13
12 Expression des résultats.13
13 Fidélité .13
13.1 Essai interlaboratoires .13
13.2 Répétabilité .13
13.3 Reproductibilité .14
14 Rapport d’essai .14
Annexe A (informative) Valeurs des taux de récupération, schémas fonctionnels,
chromatogrammes et séquences d’injection .15
Annexe B (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires .20
Bibliographie .23
© ISO 2015 – Tous droits réservés iii
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ISO/FDIS 15753:2015(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 15753:2006), dont elle constitue
une révision mineure.
Elle intègre également l’Amendement ISO 15753:2006/Amd, 1.
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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 15753:2015(F)
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination
des hydrocarbures aromatiques polycycliques
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit deux méthodes pour la détermination de 15 hydrocarbures
aromatiques polycycliques (HAP) dans les corps gras d’origines animale et végétale:
— une méthode générale;
— une méthode spécifique pour l’huile de coprah et les huiles végétales avec acides gras à chaînes courtes.
Ces méthodes ne sont pas quantitatives pour les composés très volatils tels que le naphtalène,
l’acénaphtène et le fluorène. En raison des interférences causées par la matrice elle-même, l’huile de
palme et l’huile de grignons d’olive ne peuvent pas être analysées par cette méthode.
La limite de quantification est de 0,2 µg/kg pour la majorité des composés analysés, à l’exception
du fluoranthène et du benzo(g,h,i)pérylène, dont la limite de quantification est de 0,3 µg/kg, et de
l’indéno(1,2,3-c,d)pyrène, dont la limite de quantification est de 1 µg/kg.
Le lait et les produits laitiers (ou la graisse provenant du lait et des produits laitiers) sont exclus du
domaine d’application de la présente Norme internationale.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de façon normative dans le présent document
et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
hydrocarbures aromatiques polycycliques
HAP
composés contenant au moins deux noyaux d’hydrocarbures aromatiques condensés (accolés) et dont
la teneur peut être déterminée à l’aide de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
Note 1 à l’article: La teneur est indiquée en microgrammes par kilogramme.
Note 2 à l’article: On divise, en général, les HAP en HAP légers, avec deux à quatre noyaux aromatiques, et HAP
lourds avec au moins cinq noyaux aromatiques.
EXEMPLE
Les HAP légers incluent:
le naphtalène (n° CAS [91-20-3]), l’acénaphtène (n° CAS [83-32-9]), l’acénaphthylène (n° CAS [208-96-8]), le
fluorène (n° CAS [86-73-7]), l’anthracène (n° CAS [120-12-7]), le phénanthrène (n° CAS [85-01-8]), le fluoranthène
(n° CAS [206-44-0]), le chrysène (n° CAS [218-01-9]), le benzo(a)anthracène (n° CAS [56-55-3]), le pyrène (n°
CAS [129-00-0]).
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ISO/FDIS 15753:2015(F)
Les HAP lourds incluent:
le benzo(a)pyrène (n° CAS [50-32-8]), le benzo(b)fluoranthène (n° CAS [205-99-2]), le benzo(k)fluoranthène
(n° CAS [207-08-9]), le benzo(g,h,i)pérylène (n° CAS [191-24-2]), le dibenzo(a,h)anthracène (n° CAS [53-70-3]),
l’indéno(1,2,3-c,d)pyrène (n° CAS [193-39-5]).
4 Principe
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont extraits avec un mélange acétonitrile/acétone,
puis purifiés sur des cartouches de phase inversée C18 et, ensuite, sur des cartouches de Florisil. La
détermination de la teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques individuels après séparation
est réalisée par le biais de la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en mesurant la
fluorescence à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission différentes.
5 Réactifs et matériaux
AVERTISSEMENT — L’attention est attirée sur la réglementation régissant la manipulation de
matières dangereuses. Il convient de respecter des mesures de sécurité sur le plan technique,
organisationnel et personnel.
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, sauf indication contraire.
Vérifier la qualité des solvants avant utilisation en concentrant le solvant environ 1 000 fois par
évaporation, puis analyser le concentré par CLHP (300 ml à 300 µl). Le chromatogramme doit être
exempt de pics dans la zone d’élution des HAP.
1)
5.1 Méthanol, qualité «ultra resi-analysed» .
1)
5.2 Hexane, qualité CLHP .
1)
5.3 Acétonitrile, qualité CLHP .
1)
5.4 Acétone, qualité CLHP .
1)
5.5 Dichlorométhane, qualité CLHP .
1)
5.6 Toluène, qualité CLHP .
1)
5.7 Eau, qualité CLHP .
1)
5.8 Tétrahydrofuranne, qualité CLHP .
5.9 Mélange de solvants 1: acétonitrile/acétone (fraction volumique 60 % / 40 %).
Quantité utilisée par échantillon: 41 ml pour la méthode générale, 36 ml pour la méthode spécifique
pour l’huile de coprah.
5.10 Mélange de solvants 2: acétonitrile/acétone (fraction volumique 80 % / 20 %).
Quantité utilisée par échantillon: 2 × 11 ml pour la méthode spécifique pour l’huile de coprah.
1) Ces produits peuvent, par exemple, être obtenus auprès de Baker. Ces informations sont données par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne sauraient constituer un
engagement de l’ISO à l’égard de ces produits. Il est possible d’utiliser des produits équivalents, à condition qu’il soit
établi qu’ils donnent les mêmes résultats.
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ISO/FDIS 15753:2015(F)
5.11 Mélange de solvants 3: hexane/dichlorométhane (fraction volumique 75 % / 25 %).
Quantité utilisée par échantillon: 7 ml pour la méthode générale, 2 × 7 ml pour la méthode spécifique
pour l’huile de coprah.
5.12 Mélange de tétrahydrofuranne (THF)/méthanol (MeOH) (fraction volumique 50 % / 50 %).
5.13 Solution étalon avec 16 HAP certifiés prioritaires par l’EPA (Agence de protection de
2)
l’environnement) dans le toluène , à une concentration de 100 µg/ml (100 mg/l): le naphtalène,
l’acénaphthylène, l’acénaphtène, le fluorène, le phénanthrène, l’anthracène, le fluoranthène, le pyrène, le
benzo(a)anthracène, le chrysène, le benzo(b)fluoranthène, le benzo(k)fluoranthène, le benzo(a)pyrène,
le dibenzo(a,h)anthracène, le benzo(g,h,i)pérylène, l’indéno(1,2,3-c,d)pyrène.
NOTE 1 Cette solution est conservée à −20 °C.
Avant emploi, laisser la solution se réchauffer à température ambiante pendant au minimum 1 h.
NOTE 2 L’acénaphthylène n’est pas fluorescent et ne peut donc pas être déterminé par ces méthodes.
5.14 Solution mère étalon, à 200 ng/ml (200 µg/l).
Ajouter 100 µl de solution étalon (5.13) avec une seringue de 250 µl (6.11) dans une fiole jaugée de
50 ml (6.20) et diluer au volume avec de l’acétonitrile.
5.15 Solution étalon de travail, à 50 ng/ml (50 µg/l).
Ajouter 250 µl de solution mère étalon (5.14) avec une seringue de 250 µl (6.11) à 750 µl de mélange
THF/méthanol (5.12) ou d’acétonitrile (5.3).
3)
5.16 Cartouches de phase greffée en C18 , phase 2 g, capacité de 12 ml.
3)
5.17 Cartouches de phase greffée de Florisil , phase 500 mg, capacité de 3 ml.
5.18 Flux d’azote, pression contrôlée à 34,5 kPa (5 psi, environ 1,5 l/min).
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
L’utilisation de tubes jetables en verre est acceptable. L’utilisation généralisée du verre est nécessaire
parce que les plastiques peuvent contenir des HAP.
−1
6.1 Centrifugeuse, tournant au moins à 4 000 min , convenant pour les tubes de 100 ml et de 10 ml.
6.2 Système de CLHP avec élution de gradient binaire, avec réservoir de solvant d’une capacité de
1 l, filtre à membrane pour phase mobile, pompe, passeur d’échantillons, régulation de température de
colonne réglée à 25 °C, détecteur fluorimétrique programmable dans le temps pour des longueurs d’onde
d’excitation et d’émission différentes et un système d’acquisition et de traitement des données assisté
par ordinateur.
2) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Promochem.
3) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Varian. Ces informations sont données par souci de
commodité à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne sauraient constituer un
engagement de l’ISO à l’égard de ces produits. Il est possible d’utiliser des produits équivalents, à condition qu’il soit
établi qu’ils donnent les mêmes résultats.
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ISO/FDIS 15753:2015(F)
4)
6.3 Colonne de phase inversée C18 , 250 mm de longueur, 4,6 mm de diamètre intérieur, particules
de 5 µm, convenant pour l’analyse des HAP.
6.4 Agitateur vortex.
5)
6.5 Évaporateur automatique , pour un tube de 10 ml (facultatif) ou bain-marie (6.6).
Conditions de fonctionnement recommandées:
— température du bain-marie 35 °C;
— pression d’azote 34,5 kPa.
6.6 Bain-marie, régulé à 35 °C.
6.7 Balance, lisibilité de 0,1 mg.
6.8 Tubes à centrifuger, d’une capacité de 100 ml (un par échantillon).
6.9 Tubes à centrifuger coniques, d’une capacité de 11 ml (trois par échantillon) avec capuchons
vissés munis de joints en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (un par échantillon).
6.10 Éprouvettes graduées.
6.11 Microseringue, de 250 µl.
6.12 Seringue, de 1 000 µl.
6.13 Pipette graduée, de 5 ml.
6.14 Seringue, de 5 ml, munie d’un bouchon adaptateur pour les cartouches SPE.
6.15 Flacons pour passeur d’échantillons.
6.16 Microflacons, d’une capacité de 250 µl, adaptés au système CLHP.
6.17 Bain à ultrasons, température de l’eau ne dépassant pas 40 °C.
6.18 Pipettes Pasteur, munies de coton dans la partie supérieure pour éviter toute contamination.
6)
6.19 Appareil disposant d’un support et de pinces pour maintenir les cartouches SPE ou, si
possible, une station de travail SPE automatique.
NOTE Selon la station de traitement d’échantillons SPE utilisée, les méthodes d’extraction proposées peuvent
nécessiter de légères adaptations (temps, pression, volumes).
6.20 Fiole jaugée, d’une capacité de 50 ml.
4) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Vydac, réf. 201TP54.
5) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Zymark, turbo-évaporateur Zymark TurboVap LV.
6) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Zymark, Zymark Rapid Trace. Ces informations sont
données par souci de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne sauraient
constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ces produits. Il est possible d’utiliser des produits équivalents, à
condition qu’il soit établi qu’ils donnent les mêmes résultats.
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ISO/FDIS 15753:2015(F)
7 Échantillonnage
Il convient que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, qui n’a été ni endommagé ni modifié
pendant le transport ou le stockage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d’échantillonnage recommandée est fournie dans l’ISO 5555.
8 Préparation de l’échantillon
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la méthode indiquée dans l’ISO 661. Avant
l’échantillonnage, les échantillons liquides doivent être à température ambiante et être homogénéisés
par agitation magnétique.
Échantillonner la matrice solide en fondant la totalité de l’échantillon ou en fondant, puis en
homogénéisant, plusieurs carottes d’échantillons.
9 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras:
Méthode générale
9.1 Remarques préliminaires
Pour obtenir des résultats répétables, la température ambiante du laboratoire doit être régulée
(≤ 20 °C). Ce paramètre est très important pour l’extraction des HAP à partir de l’huile de coprah (ou
des huiles végétales contenant des acides gras à chaînes courtes). Ces huiles contiennent des acides gras
à chaînes courtes et longues; si la température ambiante dépasse 20 °C, la solubilité des acides gras à
chaînes courtes augmente.
Avant emploi, rincer la totalité de la verrerie trois fois avec de l’hexane (5.2).
Chaque séquence d’échantillons doit inclure un essai à blanc (9.2) et une solution étalon extraite dans
les mêmes conditions que l’échantillon afin de calculer les taux de récupération de l’extraction (9.3). Les
valeurs des taux de récupération doivent être comprises entre 70 % et 110 %. Les valeurs des taux de
récupération moyens sont données dans le Tableau A.1.
Pour une analyse quantitative, deux prises d’essai doivent être extraites et analysées séparément, le
résultat final étant la valeur moyenne des résultats des deux sous-échantillons.
Il n’est pas possible d’effectuer la totalité de l’analyse en une journée. Les extraits des échantillons
doivent être conservés jusqu’au lendemain dans des conditions de surgélation à −18 °C:
er
— 1 jour: étape 1, étape 2 et étape 3 jusqu’à la purification sur cartouche C18 (voir Figure A.1);
e
— 2 jour: étape 3, purification sur cartouche de Florisil et préparation du système CLHP pour l’analyse
d’échantillon (voir Figure A.1);
— nuit et jour(s) suivants: analyse des échantillons (voir Tableau A.2).
9.2 Essai à blanc
Pour garantir l’absence de contamination des solvants et cartouches, l’opération de purification
(conformément à 9.5, à 9.6 et à l’Article 11) doit d’abord être effectuée sur un échantillon à blanc
(échantillon avec un mélange de solvants mais sans l’huile). Le chromatogramme obtenu doit être
exempt de composés d’intérêt. Si le chromatogramme contient des interférences, l’origine de ces
interférences doit être déterminée et éliminée. Les valeurs des essais à blanc ne peuvent pas être
utilisées pour corriger les valeurs des échantillons puisque les valeurs des essais à blanc ne sont
généralement pas homogènes (répétabilité).
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ISO/FDIS 15753:2015(F)
9.3 Détermination des valeurs des taux de récupération (sans matrice)
Afin de vérifier l’efficacité d’extraction des cartouches, effectuer un essai avec une solution étalon.
Complémenter 1 750 µl de mélange de solvants 1 (5.9) avec 250 µl de solution étalon de travail (5.15)
à l’aide d’une seringue de 250 µl (6.11). Déposer sur une cartouche C18, puis suivre le mode opératoire
décrit en 9.5, en 9.6 et à l’Article 11.
AVERTISSEMENT — Lors de l’élimination du solvant sous un flux d’azote (voir 9.5.6), ne pas
évaporer à sec mais conserver environ 50 µl dans le tube afin de ne pas perdre les HAP volatils.
9.4 Extraction (extraction liquide/liquide)
9.4.1 Le schéma fonctionnel du mode opératoire d’isolement est fourni à la Figure A.1.
9.4.2 Peser, à 1 mg près, environ 2,5 g de l’échantillon dans un tube à centrifuger de 100 ml (6.8).
Ajouter 10 ml de mélange de solvants 1 (5.9).
9.4.3 Agiter le tube à centrifuger pendant 30 s à l’aide de l’agitateur vortex (demi-vitesse), puis placer
le tube dans un bain à ultrasons (6.17) pendant 5 min.
−1
9.4.4 Centrifuger pendant 5 min à 4 000 min .
9.4.5 Prélever avec précaution la phase supérieure à l’aide d’une pipette Pasteur (6.18), puis la
transférer dans un tube conique taré (6.9).
9.4.6 Évaporer le solvant du tube conique pendant 30 min à 40 min sous un flux d’azote (5.18) en
utilisant un bain-marie à 35 °C (6.6) ou un évaporateur automatique (6.5).
9.4.7 Répéter l’extraction deux fois avec 10 ml supplémentaires de mélange de solvants 1 (5.9).
Concentrer les extraits dans le même tube conique sous un flux d’azote (5.18) en utilisant un bain-marie
à 35 °C (6.6) ou un évaporateur automatique (6.5). Il convient que le résidu de corps gras soit d’environ
200 mg à 800 mg.
Si le poids du résidu de corps gras est supérieur à 800 mg, la méthode générale (voir Article 9) n’est pas
appropriée; il convient, dans ce cas, d’utiliser la méthode spécifique pour l’huile de coprah (voir Article 10).
9.5 Purification sur des cartouches de phase greffée en C18 (extraction solide/liquide)
9.5.1 Conditionnement des cartouches: placer la cartouche (5.16) sur un support (6.19).
Rincer la cartouche avec 2 volumes de 12 ml de méthanol (5.1), puis avec 2 volumes de 12 ml
d’acétonitrile (5.3). Laisser le solvant s’écouler à la pression atmosphérique.
9.5.2 Placer un tube conique taré (6.9) sous la cartouche (5.16).
9.5.3 À l’aide d’une seringue (6.12) ou d’une pipette graduée (6.13), introduire 2 ml de mélange de
solvants 1 (5.9) dans le tube conique contenant le résidu de corps gras (9.4.6).
Agiter le tube pendant 15 s à l’aide de l’agitateur vortex (6.4). Centrifuger pendant 30 s. Transférer la
phase supérieure en tête de la cartouche (5.16) à l’aide d’une pipette Pasteur (6.18). Répéter l’opération
deux fois (2 ml de mélange de solvants 1, mélanger, centrifuger et transférer sur la cartouche). Recueillir
le solvant éluant de la cartouche avec le solvant d’élution.
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ISO/FDIS 15753:2015(F)
9.5.4 Ajouter 5 ml de mélange de solvants 1 (5.9) en tête de la cartouche (5.16), puis laisser l’élution se
développer à la pression atmosphérique.
9.5.5 À l’aide d’une seringue (6.14), injecter de l’air dans la cartouche dans le but d’éluer le solvant
restant et les HAP pouvant être retenus dans la phase solide.
9.5.6 Évaporer les solvants sous un flux d’azote (5.18) à l’aide d’un bain-marie à 35 °C (6.6) ou d’un
évaporateur automatique (6.5).
Il convient que le résidu de corps gras ne dépasse pas 50 mg.
9.5.7 Diluer le résidu dans 1 ml d’hexane (5.2), mesuré avec une seringue (6.12).
Fermer hermétiquement le tube conique et le conserver à −18 °C jusqu’à la prochaine utilisation.
9.6 Purification sur des cartouches de phase greffée de Florisil (extraction
solide/liquide)
9.6.1 Laisser l’extrait (9.5.7) se réchauffer à température ambiante pendant au moins 1 h.
9.6.2 Conditionnement des cartouches: placer la cartouche (5.17) sur un support (6.19).
Rincer la cartouche avec 5 volumes de 3 ml de dichlorométhane (5.5), puis avec 4 volumes de 3 ml
d’hexane (5.2).
9.6.3 Plac
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