Water quality — General requirements and guidance for microbiological examinations by culture

This document specifies requirements and gives guidance for performing the manipulations common to each culture technique for the microbiological examination of water, particularly the preparation of samples, culture media, and general apparatus and glassware, unless otherwise required in the specific standard. It also describes the various techniques available for detection and enumeration by culture and the criteria for determining which technique is appropriate. This document is mainly intended for examinations for bacteria, yeasts and moulds, but some aspects are also applicable to bacteriophages, viruses and parasites. It excludes techniques not based on culturing microorganisms, such as polymerase chain reaction (PCR) methods.

Qualité de l’eau — Exigences et lignes directrices générales pour les examens microbiologiques sur milieu de culture

Le présent document établit les exigences et fournit les lignes directrices sur les manipulations communes à chaque technique de culture pour l'examen microbiologique de l'eau, en particulier la préparation des échantillons, les milieux de culture ainsi que l'appareillage général et la verrerie, sauf autre exigence dans la norme spécifique. Il décrit également les diverses techniques disponibles pour la détection et le dénombrement sur milieu de culture et les critères permettant de déterminer la technique appropriée. Le présent document concerne principalement les examens portant sur les bactéries, les levures et les moisissures, mais certains aspects peuvent aussi s'appliquer aux bactériophages, aux virus et aux parasites. Sont exclues les techniques ne reposant pas sur la culture de micro-organismes, telles que les méthodes de réaction en chaîne par polymérase (PCR).

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Publication Date
30-Sep-2018
Current Stage
6060 - International Standard published
Completion Date
01-Oct-2018
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ISO 8199:2018 - Water quality -- General requirements and guidance for microbiological examinations by culture
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ISO 8199:2018 - Qualité de l’eau -- Exigences et lignes directrices générales pour les examens microbiologiques sur milieu de culture
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 8199
Third edition
2018-10
Water quality — General requirements
and guidance for microbiological
examinations by culture
Qualité de l’eau — Exigences et lignes directrices générales pour les
examens microbiologiques sur milieu de culture
Reference number
ISO 8199:2018(E)
ISO 2018
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 8199:2018(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2018

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Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 8199:2018(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ..............................................................................................................................................................................................................................vii

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 4

5 General measurement requirements ............................................................................................................................................. 4

5.1 Uniformity of temperatures ......................................................................................................................................................... 4

5.2 Incubation times .................................................................................................................................................................................... 4

5.3 Volumes and masses .......................................................................................................................................................................... 4

6 Diluents and culture media ....................................................................................................................................................................... 5

6.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 5

6.2 Quality requirements of ingredients .................................................................................................................................... 5

6.3 Diluents ......................................................................................................................................................................................................... 5

7 Sterilization and decontamination .................................................................................................................................................... 5

7.1 Sterilization of apparatus and glassware ......................................................................................................................... 5

7.2 Sterilization of consumables ....................................................................................................................................................... 6

7.3 Decontamination of glassware and materials after use ...................................................................................... 6

7.4 Waste management ............................................................................................................................................................................. 6

8 Samples and sample handling ................................................................................................................................................................ 6

8.1 Sampling ....................................................................................................................................................................................................... 6

8.2 Sample preparation ............................................................................................................................................................................ 7

8.2.1 Waters and other aqueous matrices ............................................................................................................... 7

8.2.2 Swabs ......................................................................................................................................................................................... 7

9 Enumeration (quantitative) methods ............................................................................................................................................ 8

9.1 Inoculation of test portions in (or on) solid media ................................................................................................. 8

9.1.1 General...................................................................................................................................................................................... 8

9.1.2 Pour plate technique .................................................................................................................................................... 8

9.1.3 Spread plate technique ............................................................................................................................................... 9

9.1.4 Membrane filtration technique ........................................................................................................................10

9.1.5 Incubation ...........................................................................................................................................................................12

9.1.6 Counting and confirmation from solid media ......................................................................................12

9.1.7 General guidance for calculation of results .................. ..........................................................................13

9.1.8 Expression of results .................................................................................................................................................14

9.2 Enumeration using a liquid medium.................................................................................................................................24

9.2.1 General...................................................................................................................................................................................24

9.2.2 Procedure ............................................................................................................................................................................25

9.2.3 Choice of inoculation system ..............................................................................................................................25

9.2.4 Incubation ...........................................................................................................................................................................26

9.2.5 Interpretation of results .........................................................................................................................................26

9.2.6 Uncertainty of test results ....................................................................................................................................27

9.2.7 Determination of MPN values ............................................................................................................................27

10 Detection (qualitative) methods .......................................................................................................................................................30

10.1 General ........................................................................................................................................................................................................30

10.2 Procedure .................................................................................................................................................................................................31

10.3 Uncertainty of test results ..........................................................................................................................................................31

11 Performance characteristics of methods .................................................................................................................................31

12 Analytical quality control .........................................................................................................................................................................32

12.1 General ........................................................................................................................................................................................................32

© ISO 2018 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 8199:2018(E)

12.2 Internal quality control .................................................................................................................................................................32

12.2.1 General...................................................................................................................................................................................32

12.2.2 Process controls ............................................................................................................................................................32

12.3 External quality assessment.....................................................................................................................................................33

Annex A (informative) Criteria for the choice of technique.......................................................................................................35

Annex B (informative) Confidence intervals for colony count technique and choice of

method of calculation in special cases ........................................................................................................................................40

Annex C (normative) Counting and calculations with two Petri dishes per dilution ......................................44

Annex D (normative) Composition, preparation and performance testing of diluents ...............................51

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................55

iv © ISO 2018 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 8199:2018(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,

Microbiological methods.

This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 8199:2005), which has been technically

revised. The main changes compared with the previous edition are as follows.

— Clauses have been added for terms and definitions, detection (qualitative) methods, performance

characteristics and analytical quality control (AQC).

— The clauses referencing culture media and diluent preparation and QC have been revised to align

with ISO 11133 and have been included in a new Annex D.

— The subclause on general guidance for the calculation of results for solid media techniques has

[9]

been updated to reflect the changes in ISO 7218:2007/Amd.1:2013 on which the relevant clauses

and subclauses in the second edition were based. Modifications have been made, however, to take

account of water microbiology techniques (e.g. membrane filtration) and to allow for dilutions other

than ten-fold dilutions.

— Annex B has been added to give guidance on confidence intervals when calculating special cases,

relating to the update of the subclause on general guidance for the calculation of results for solid

media techniques.

— Annex C has been added to describe calculations when using duplicate dishes per dilution, relating

to the update of the subclause on general guidance for the calculation of results for solid media

techniques.

— The subclause relating to enumeration using liquid media had been expanded and includes

additional guidance on the use of MPN calculators. The former Annex B containing MPN tables has

been removed.
— The title of this document has been amended to reflect these changes.
© ISO 2018 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 8199:2018(E)

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
vi © ISO 2018 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 8199:2018(E)
Introduction

Techniques for the detection and enumeration of microorganisms based on their ability to grow on or

in specified culture media are an important and widely used means of assessing the microbiological

quality of water. The purpose of this document is to gather in a single document the information

common to the various techniques. This reduces repetition of technical details in individual standards

and facilitates choice of the technique most suitable for a particular situation. Other guidance has been

included on general topics of relevance to these techniques, such as analytical quality control, method

performance characteristics and uncertainty of test results.
© ISO 2018 – All rights reserved vii
---------------------- Page: 7 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 8199:2018(E)
Water quality — General requirements and guidance for
microbiological examinations by culture

WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.

This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its

use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this document be

carried out by suitably trained staff.
1 Scope

This document specifies requirements and gives guidance for performing the manipulations common

to each culture technique for the microbiological examination of water, particularly the preparation of

samples, culture media, and general apparatus and glassware, unless otherwise required in the specific

standard. It also describes the various techniques available for detection and enumeration by culture

and the criteria for determining which technique is appropriate.

This document is mainly intended for examinations for bacteria, yeasts and moulds, but some aspects

are also applicable to bacteriophages, viruses and parasites. It excludes techniques not based on

culturing microorganisms, such as polymerase chain reaction (PCR) methods.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 7704, Water quality — Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses

ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and

performance testing of culture media
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
accuracy
closeness of agreement between a test result and the accepted reference value
[SOURCE: ISO 6107-8:1993, 1, modified — The note has been deleted.]
© ISO 2018 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 8199:2018(E)
3.2
bias

difference between the expectation of the test results and an accepted reference value

[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.8, modified — Note 1 to entry has been deleted.]
3.3
confirmed count

count (3.4) corrected for not confirmed presumptive counts (3.9) by further testing of the

presumptive objects
3.4
count

observed number of objects such as colonies or cells determined by direct counting, or

most probable number (MPN) estimation based on statistical calculation using the number of positive

units or presumptive positive units in a dilution series of a test sample (3.16)

[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 22, modified — “or presumptive positive units” has been added.]

3.5
detection level

minimum concentration of organisms that produce evidence of growth with a probability of p = 0,95

when inoculated into a specified culture medium and incubated under defined conditions

Note 1 to entry: The theoretical level that conforms to this definition is an average of three viable cells in an

inoculum volume.
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.10]
3.6
intralaboratory reproducibility
intermediate precision

closeness of agreement between test results obtained with the same method on the same or similar test

materials in the same laboratory with different operators using different equipment

3.7
limit of determination

lowest analyte concentration per analytical portion where the expected relative standard uncertainty

equals a specified value
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.17]
3.8
precision

closeness of agreement between independent test results obtained under stipulated conditions

[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.12, modified — Notes 1 to 3 to entry have been deleted.]

3.9
presumptive count

colony count (3.4) or most probable number (MPN) estimate based on the number of colonies or reaction

vessels that have an outward appearance that is interpreted as typical of a target organism

[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 62, modified — “fermentation tubes” has been replaced with “reaction

vessels”.]
2 © ISO 2018 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 8199:2018(E)
3.10
relative standard deviation
rel

estimate of the standard deviation of a population from a sample of n results divided by the mean of

that sample
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.30]
3.11
repeatability
measurement repeatability

measurement precision (3.8) under a set of repeatability conditions (3.12) of measurement

[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.32]
3.12
repeatability conditions

condition of measurement, out of a set of conditions that includes the same measurement procedure,

same operators, same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate

measurements on the same or similar objects over a short period of time
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.33]
3.13
reproducibility
measurement reproducibility

measurement precision (3.8) under reproducibility conditions (3.14) of measurement

Note 1 to entry: Relevant statistical terms are given in ISO 5725-1 and ISO 5725-2.

[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.34]
3.14
reproducibility conditions

condition of measurement, out of a set of conditions that includes different locations, operators,

measuring systems, and replicate measurements on the same or similar objects
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.35]
3.15
test portion
specified quantity of the sample that is taken for analysis
EXAMPLE 0,1 ml, 1 ml, 100 ml of sample.
3.16
test sample

undiluted, diluted or otherwise prepared test portion (3.15) of a sample to be tested, after completion

of all preparation steps such as centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and

determination of ionic strength
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92, modified — Note 1 to entry has been deleted.]
3.17
trueness

closeness of agreement between the average value obtained from a large series of test results and an

accepted reference value

Note 1 to entry: The measure of trueness is usually expressed in terms of bias (3.2).

[SOURCE: ISO 6107-8:1993, 63]
© ISO 2018 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 8199:2018(E)
3.18
uncertainty of counting

relative standard deviation (3.10) of results of repeated counting of the colonies or particles of the same

plate(s) or field(s) under stipulated conditions (same person, different persons in one laboratory, or

different laboratories)
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 103, modified — The domain has been deleted.]
4 Principle

The general principle of these techniques consists of inoculating a test portion of a water sample, or

resultant test sample following membrane filtration or centrifugation, on or into a culture medium

(solid or liquid). It is assumed that after incubation each target microorganism present multiplies,

giving either a colony visible directly on or in the solid medium or changes in the observable properties

of the liquid medium. The choice of a particular culture method depends not only on the nature and

numbers of the microorganisms sought, but also on the nature of the water and the reasons for the

examination.
5 General measurement requirements
5.1 Uniformity of temperatures

The following accepted ranges of temperatures and their ranges for incubation or storage are applied,

where appropriate for the intended target organism and unless otherwise required in the specific

standard.
Storage temperatures: (−70 ± 10) °C; (−20 ± 5) °C; (5 ± 3) °C
Incubation temperatures: (22 ± 2) °C; (36 ± 2) °C; (44 ± 0,5) °C
Media tempering temperature: 44 °C to 47 °C

The upper incubation temperature limits shall be followed strictly to ensure optimal growth. The lower

temperature limits may be exceeded for short periods, e.g. due to opening the door of an incubator, but

recovery to the operating temperature should be rapid.
5.2 Incubation times

The following accepted ranges of incubation times are applied, where appropriate for the intended

target organism and unless otherwise required in the specific standard.
Incubation times: (21 ± 3) h; (44 ± 4) h; (68 ± 4) h
5.3 Volumes and masses

Measuring equipment shall be appropriate to the required accuracy and precision. The accepted range

of any measured value is ±2 % where the stated value is critical to method performance and test results,

and ±5 % where the stated value has been shown not to be critical. Examples of critical values having

a direct effect on test results are inoculum and diluent volumes. For tolerances relating to the mass of

ingredients used to prepare culture media, refer to ISO 11133.

NOTE Critical tolerances have been set at 2 % to minimize the uncertainty of test results.

4 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 8199:2018(E)
6 Diluents and culture media
6.1 General

General requirements for preparation, production, sterilization, storage and performance of culture

media are given in ISO 11133.

For preparation of microbiological culture media, unless otherwise stated, add the ingredients to the

volume of water, rather than make the ingredients up to a certain volume.

Before use, check the quality of the culture media, diluents, membrane filters and reagents by following

the procedures described in ISO 11133 and ISO 7704 or as given in the specific standard.

For information on storage of culture media, refer to ISO 11133.
6.2 Quality requirements of ingredients

Use constituents of uniform quality and analytical grade chemicals for the preparation of media.

Other grades of chemicals may be used provided they can be shown to produce equivalent results.

Alternatively, dehydrated complete media or diluents may be used. Follow the manufacturer’s

instructions strictly.
[2]

Refer to ISO 11133 and ISO 3696 for further information on the quality of ingredients and the quality

of water that should be used for media preparation.
6.3 Diluents

The following diluents are commonly used in water microbiology. However, other appropriate diluents

may be used and this list is not exhaustive:
— saline solution;
— peptone diluent;
— peptone saline solution [maximum recovery diluent (MRD)];
— quarter-strength Ringer’s solution;
— phosphate buffer solution.

Follow the formulations and the preparation, storage and performance testing instructions given in

Annex D for these diluents.
7 Sterilization and decontamination
7.1 Sterilization of apparatus and glassware

Sterilize apparatus and glassware not supplied sterile by one of the following methods:

a) in an oven, operating at (170 ± 10) °C for at least 1 h (excluding pre-heating time);

b) in an autoclave, operating at (121 ± 3) °C for at least 15 min.

Some heat labile items may require sterilization by other means (e.g. ultraviolet light or irradiation) but

these are not carried out in the routine laboratory.
© ISO 2018 – All rights reserved 5
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ISO 8199:2018(E)
7.2 Sterilization of consumables

Sterile disposable equipment and materials may be used instead of re-usable items (glassware, Petri

dishes, pipettes, bottles, tubes, loops, spreaders, etc.) if the specifications are similar.

If membrane filters are not obtained sterile, these are usually sterilized by moist heat according to

process b) described in 7.1, or by following the manufacturer’s instructions.
7.3 Decontamination of glassware and materials after use

Materials for decontamination and disposal should be placed in appropriate containers, e.g. autoclavable

plastic bags. Autoclaving is the preferred method for all decontamination processes (at least 30 min at

121 °C). The autoclave should be loaded in a way that favours heat penetration into the load (e.g. without

over packing). Take care to loosen caps/lids and open bags to prevent dangerous pressurization of the

container, which could lead to possible breakage, e.g. explosion of glass bottles.

Modern autoclaves may not require caps to be loosened, but follow the manufacturer’s instructions

strictly to avoid dangerous pressurization of the containers.
Alternative methods other than autoclaving may be used.

Autoclave all equipment which has been in contact with microbiological cultures (solid or liquid culture

media), including re-usable containers prior to being washed.
During ex
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 8199
Troisième édition
2018-10
Qualité de l’eau — Exigences et
lignes directrices générales pour les
examens microbiologiques sur milieu
de culture
Water quality — General requirements and guidance for
microbiological examinations by culture
Numéro de référence
ISO 8199:2018(F)
ISO 2018
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 8199:2018(F)
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© ISO 2018

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 8199:2018(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ..............................................................................................................................................................................................................................vii

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 4

5 Exigences générales concernant les mesurages .................................................................................................................. 4

5.1 Uniformité des températures ..................................................................................................................................................... 4

5.2 Durées d’incubation............................................................................................................................................................................ 5

5.3 Volumes et masses ............................................................................................................................................................................... 5

6 Diluants et milieux de culture ................................................................................................................................................................ 5

6.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 5

6.2 Exigences de qualité des ingrédients ................................................................................................................................... 5

6.3 Diluants ......................................................................................................................................................................................................... 5

7 Stérilisation et décontamination ......................................................................................................................................................... 6

7.1 Stérilisation d’appareillage et de verrerie ....................................................................................................................... 6

7.2 Stérilisation des consommables .............................................................................................................................................. 6

7.3 Décontamination de la verrerie et du matériel après utilisation ................................................................ 6

7.4 Gestion des déchets ............................................................................................................................................................................ 7

8 Échantillons et manipulation des échantillons .................................................................................................................... 7

8.1 Échantillonnage ...................................................................................................................................................................................... 7

8.2 Préparation des échantillons ...................................................................................................................................................... 7

8.2.1 Eaux et autres matrices aqueuses ..................................................................................................................... 7

8.2.2 Écouvillons ............................................................................................................................................................................ 8

9 Méthodes de dénombrement (quantitatives) ........................................................................................................................ 9

9.1 Ensemencement des prises d’essai dans (ou sur) un milieu solide .......................................................... 9

9.1.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 9

9.1.2 Technique par incorporation ................................................................................................................................ 9

9.1.3 Technique par étalement .......................................................................................................................................10

9.1.4 Technique par filtration sur membrane....................................................................................................11

9.1.5 Incubation ...........................................................................................................................................................................13

9.1.6 Numération et confirmation sur milieux solides ..............................................................................14

9.1.7 Lignes directrices générales pour le calcul des résultats ..........................................................15

9.1.8 Expression des résultats ........................................................................................................................................16

9.2 Dénombrement utilisant un milieu liquide .................................................................................................................26

9.2.1 Généralités .........................................................................................................................................................................26

9.2.2 Mode opératoire ............................................................................................................................................................26

9.2.3 Choix d’un système d’ensemencement ......................................................................................................27

9.2.4 Incubation ...........................................................................................................................................................................28

9.2.5 Interprétation des résultats ................................................................................................................................28

9.2.6 Incertitude des résultats d’essai......................................................................................................................28

9.2.7 Détermination des indices NPP .......................................................................................................................29

10 Méthodes de détection (qualitatives) ..........................................................................................................................................32

10.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................32

10.2 Mode opératoire .................................................................................................................................................................................32

10.3 Incertitude des résultats d’essai ...........................................................................................................................................33

11 Caractéristiques de performances des méthodes ..........................................................................................................33

12 Contrôle qualité analytique....................................................................................................................................................................34

12.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................34

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ISO 8199:2018(F)

12.2 Contrôle qualité interne ...............................................................................................................................................................34

12.2.1 Généralités .........................................................................................................................................................................34

12.2.2 Contrôles de procédé ................................................................................................................................................34

12.3 Évaluation de qualité externe ..................................................................................................................................................36

Annexe A (informative) Critères de choix de la technique .........................................................................................................37

Annexe B (informative) Intervalles de confiance pour la technique de numération

de colonies et choix de la méthode de calcul dans des cas particuliers...................................................42

Annexe C (normative) Numération et calculs avec deux boîtes de Petri par dilution ....................................46

Annexe D (normative) Composition, préparation et essai de performances des diluants .......................53

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................57

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ISO 8199:2018(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité

SC 4, Méthodes microbiologiques.

Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 8199:2005), qui a fait l’objet d’une

révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes.

— Des articles ont été ajoutés concernant les termes et définitions, les méthodes de détection

(qualitatives), les caractéristiques de performance et le contrôle qualité analytique (AQC).

— Les articles faisant référence à la préparation et au Contrôle Qualité (QC) des milieux de culture et

des diluants ont été révisés à des fins d’harmonisation avec l’ISO 11133 et ont été inclus dans une

nouvelle Annexe D.

— Le paragraphe portant sur les lignes directrices générales de calcul des résultats pour les techniques

sur milieu solide a été mis à jour afin de tenir compte des changements apportés à l’ISO 7218:2007/

[9]

Amd.1:2013 , sur laquelle se fondaient les articles et paragraphes correspondants de la deuxième

édition. Toutefois, les modifications ont été faites de sorte à prendre en considération les techniques

de microbiologie de l’eau (telles que la filtration sur membrane) et à permettre des dilutions autres

que des dilutions décimales.

— L’Annexe B a été ajoutée pour donner des lignes directrices sur les intervalles de confiance lors

du calcul de cas spéciaux, en relation avec la mise à jour du paragraphe sur les lignes directrices

générales de calcul des résultats pour les techniques sur milieu solide.

— L’Annexe C a été ajoutée pour décrire les calculs en cas d’utilisation de boîtes en duplicat par

dilution, en relation avec la mise à jour du paragraphe sur les lignes directrices générales de calcul

des résultats pour les techniques sur milieu solide.
© ISO 2018 – Tous droits réservés v
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ISO 8199:2018(F)

— Le paragraphe concernant le dénombrement utilisant un milieu liquide a été complété et inclut des

lignes directrices supplémentaires relatives à l’utilisation des calculateurs NPP. L’ancienne Annexe B

contenant les tables NPP a été supprimée.

— Le titre du présent document a été modifié pour prendre en compte ces changements.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
vi © ISO 2018 – Tous droits réservés
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ISO 8199:2018(F)
Introduction

Les techniques de détection et de dénombrement des micro-organismes, basées sur leur capacité à se

multiplier sur ou dans des milieux de culture spécifiques, sont un moyen important et largement utilisé

pour évaluer la qualité microbiologique de l’eau. Le but du présent document est de réunir en un seul

document les informations communes aux diverses techniques afin d’éviter la répétition des détails

techniques dans chaque norme et de faciliter le choix de la technique la plus adaptée à une situation

donnée. D’autres lignes directrices ont été incluses, concernant des aspects généraux importants en

lien avec ces techniques, tels que le contrôle qualité analytique, les caractéristiques de performance des

méthodes et l’incertitude des résultats d’essai.
© ISO 2018 – Tous droits réservés vii
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NORME INTERNATIONALE ISO 8199:2018(F)
Qualité de l’eau — Exigences et lignes directrices générales
pour les examens microbiologiques sur milieu de culture

AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les

pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les

problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur

d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité.

IMPORTANT — Il est absolument indispensable que les essais menés conformément au présent

document le soient par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application

Le présent document établit les exigences et fournit les lignes directrices sur les manipulations

communes à chaque technique de culture pour l’examen microbiologique de l’eau, en particulier

la préparation des échantillons, les milieux de culture ainsi que l’appareillage général et la verrerie,

sauf autre exigence dans la norme spécifique. Il décrit également les diverses techniques disponibles

pour la détection et le dénombrement sur milieu de culture et les critères permettant de déterminer la

technique appropriée.

Le présent document concerne principalement les examens portant sur les bactéries, les levures et

les moisissures, mais certains aspects peuvent aussi s’appliquer aux bactériophages, aux virus et aux

parasites. Sont exclues les techniques ne reposant pas sur la culture de micro-organismes, telles que les

méthodes de réaction en chaîne par polymérase (PCR).
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 7704, Qualité de l'eau — Évaluation des membranes filtrantes utilisées pour des analyses

microbiologiques

ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,

stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
© ISO 2018 – Tous droits réservés 1
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ISO 8199:2018(F)
3.1
exactitude

étroitesse de l’accord entre un résultat d’essai et une valeur de référence acceptée

[SOURCE: ISO 6107-8:1993, 1, modifiée — La note a été supprimée.]
3.2
biais

différence entre l’espérance mathématique des résultats d’essai et une valeur de référence acceptée

[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.8, modifiée — La note 1 à l’article a été supprimée.]

3.3
numération confirmée

numération (3.4) corrigée des numérations présomptives (3.9) non confirmées par des essais

supplémentaires des objets présomptifs
3.4
numération

nombre observé d’objets, tels que les colonies ou les cellules, déterminé par numération

directe ou par estimation du nombre le plus probable (NPP) en fonction du calcul statistique utilisant

le nombre d’unités positives ou d’unités positives présomptives dans une série de dilutions d’un

échantillon pour essai (3.16)

[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 22, modifiée — «ou d’unités positives présomptives» a été ajouté.]

3.5
niveau de détection

concentration minimale en organismes fournissant la preuve de la croissance avec une probabilité

de p = 0,95 lorsqu’ils sont inoculés dans un milieu de culture spécifié et incubés dans des conditions

spécifiées

Note 1 à l'article: Le niveau théorique conforme à cette définition est une moyenne de trois cellules viables dans

un volume d’inoculum.
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.10]
3.6
reproductibilité interlaboratoires
fidélité intermédiaire

étroitesse d’accord entre des résultats d’essai obtenus par la même méthode, sur des matériels d’essai

identiques ou similaires, dans le même laboratoire, avec différents opérateurs utilisant des équipements

différents
3.7
limite de détermination

concentration d’analyte la plus faible par prise analytique lorsque l’incertitude-type relative prévue est

égale à une valeur spécifiée
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.17]
3.8
fidélité

étroitesse d’accord entre des résultats d’essai indépendants obtenus sous des conditions stipulées

[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.12, modifiée — Les notes 1 à 3 à l’article ont été supprimées.]

2 © ISO 2018 – Tous droits réservés
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ISO 8199:2018(F)
3.9
numération présomptive

numération (3.4) de colonies ou estimation du nombre le plus probable (NPP) en fonction du nombre de

colonies ou d’unités réactionnelles dont l’apparence extérieure est interprétée comme caractéristique

d’un organisme cible

[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 62, modifiée — «tubes de fermentation» a été remplacé par «unités

réactionnelles».]
3.10
écart-type relatif
rel

estimation de l’écart-type d’une population d’un échantillon de n résultats divisé par la moyenne de cet

échantillon
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.30]
3.11
répétabilité
répétabilité de mesure
fidélité (3.8) de mesure selon un ensemble de conditions de répétabilité (3.12)
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.32]
3.12
conditions de répétabilité

condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent la même procédure de

mesure, les mêmes opérateurs, le même système de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement

et le même lieu, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets similaires pendant une

courte période de temps
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.33]
3.13
reproductibilité
reproductibilité de mesure

fidélité (3.8) de mesure selon un ensemble de conditions de reproductibilité (3.14)

Note 1 à l'article: Des termes statistiques pertinents sont donnés dans l’ISO 5725-1 et l’ISO 5725-2.

[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.34]
3.14
conditions de reproductibilité

condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent des lieux, des opérateurs et

des systèmes de mesure différents, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets

similaires
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.35]
3.15
prise d’essai
quantité spécifiée de l’échantillon prélevée pour analyse
EXEMPLE 0,1 ml, 1 ml, 100 ml d’échantillon.
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ISO 8199:2018(F)
3.16
échantillon pour essai

prise d’essai (3.15) non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à essai, après

exécution de toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation,

l’ajustement du pH et la détermination de la force ionique

[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92, modifiée — «portion» a été remplacé par «prise d’essai» et la note 1 à

l’article a été supprimée.]
3.17
justesse

étroitesse de l’accord entre une valeur moyenne obtenue à partir de nombreux résultats d’essai et une

valeur de référence acceptée

Note 1 à l'article: La mesure de la justesse s’exprime généralement en termes de biais (3.2).

[SOURCE: ISO 6107-8:1993, 63]
3.18
incertitude de numération

écart-type relatif (3.10) des résultats de la numération répétée des colonies ou des particules présentes

sur la (les) même(s) plaque(s) ou le(s) même(s) champ(s) dans des conditions stipulées (même personne,

personnes différentes dans un seul laboratoire ou dans différents laboratoires)
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 103, modifiée — Le domaine a été supprimé.]
4 Principe

Le principe général de ces techniques consiste à ensemencer une prise d’essai d’un échantillon d’eau,

ou un échantillon pour essai résultant d’une filtration sur membrane ou centrifugation, sur ou dans un

milieu de culture (solide ou liquide). Il est supposé qu’au cours de l’incubation, chaque micro-organisme

cible présent se multiplie pour donner soit une colonie visible directement sur ou dans le milieu solide,

soit des changements d’aspect du milieu liquide. Le choix de telle ou telle méthode de culture dépend

non seulement de la nature et des nombres des micro-organismes recherchés, mais aussi de la nature

de l’eau et des raisons à l’origine de l’examen.
5 Exigences générales concernant les mesurages
5.1 Uniformité des températures

Les gammes suivantes de températures acceptées, et leurs amplitudes d’incubation ou de conservation

sont appliquées, dans la mesure où elles conviennent à l’organisme cible prévu et sauf autre exigence

dans la norme spécifique.
Températures de conservation: (−70 ± 10) °C; (−20 ± 5) °C; (5 ± 3) °C
Températures d’incubation: (22 ± 2) °C; (36 ± 2) °C; (44 ± 0,5) °C
Température de maintien des milieux en surfusion: 44 °C à 47 °C

Les limites supérieures de la température d’incubation doivent être rigoureusement respectées pour

garantir une croissance optimale. Les limites inférieures de température peuvent être dépassées

pendant de courtes périodes, par exemple lors de l’ouverture de la porte de l’incubateur, mais il convient

que la température de fonctionnement soit rapidement rétablie.
4 © ISO 2018 – Tous droits réservés
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ISO 8199:2018(F)
5.2 Durées d’incubation

Les gammes suivantes de durées d’incubation acceptées sont appliquées, dans la mesure où elles

conviennent à l’organisme cible prévu et sauf autre exigence dans la norme spécifique.

Durées d’incubation: (21 ± 3) h; (44 ± 4) h; (68 ± 4) h
5.3 Volumes et masses

L’équipement de mesure doit être adapté à l’exactitude et à la fidélité requises. La gamme acceptée

de toute valeur mesurée est de ± 2 %, lorsque la valeur indiquée est critique pour les performances

de la méthode et les résultats d’essai, et de ± 5 % lorsqu’il a été montré que la valeur indiquée n’est

pas critique. Des exemples de valeurs critiques ayant un effet direct sur les résultats d’essai sont les

volumes d’inoculum et de diluant. Pour les tolérances concernant la masse des ingrédients utilisés pour

préparer les milieux de culture, se reporter à l’ISO 11133.

NOTE Les tolérances critiques ont été fixées à 2 % afin de réduire au minimum l’incertitude des résultats

d’essai.
6 Diluants et milieux de culture
6.1 Généralités

Les exigences générales relatives à la préparation, la production, la stérilisation, la conservation et les

performances des milieux de culture sont spécifiées dans l’ISO 11133.

Pour la préparation des milieux de culture microbiologique, sauf indication contraire, ajouter les

ingrédients au volume d’eau, plutôt que de compléter les ingrédients à un certain volume.

Vérifier la qualité des milieux de culture, des diluants, des membranes filtrantes et des réactifs avant

utilisation, conformément aux modes opératoires décrits dans les normes ISO 11133 et ISO 7704 ou

suivant les indications de la norme spécifique.

Des informations sur la conservation des milieux de culture sont spécifiées dans l’ISO 11133.

6.2 Exigences de qualité des ingrédients

Les composants entrant dans la préparation des milieux de culture doivent être de qualité constante

et les produits chimiques de qualité analytique reconnue. Des produits chimiques de qualité différente

peuvent être utilisés à condition de pouvoir prouver qu’ils donnent des résultats équivalents. Il est

également permis d’utiliser des milieux complets ou des diluants déshydratés. Suivre scrupuleusement

les instructions du fabricant.
[2]

Se reporter à l’ISO 11133 et à l’ISO 3696 pour plus d’informations sur la qualité des ingrédients et la

qualité de l’eau qu’il convient d’utiliser pour la préparation des milieux.
6.3 Diluants

Les diluants suivants sont d’usage courant en microbiologie de l’eau. Toutefois, il est permis d’utiliser

d’autres diluants adaptés et cette liste n’est pas exhaustive:
— solution saline;
— eau peptonée;
— solution p
...

Questions, Comments and Discussion

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