ISO 8199:2018
(Main)Water quality — General requirements and guidance for microbiological examinations by culture
Water quality — General requirements and guidance for microbiological examinations by culture
This document specifies requirements and gives guidance for performing the manipulations common to each culture technique for the microbiological examination of water, particularly the preparation of samples, culture media, and general apparatus and glassware, unless otherwise required in the specific standard. It also describes the various techniques available for detection and enumeration by culture and the criteria for determining which technique is appropriate. This document is mainly intended for examinations for bacteria, yeasts and moulds, but some aspects are also applicable to bacteriophages, viruses and parasites. It excludes techniques not based on culturing microorganisms, such as polymerase chain reaction (PCR) methods.
Qualité de l’eau — Exigences et lignes directrices générales pour les examens microbiologiques sur milieu de culture
Le présent document établit les exigences et fournit les lignes directrices sur les manipulations communes à chaque technique de culture pour l'examen microbiologique de l'eau, en particulier la préparation des échantillons, les milieux de culture ainsi que l'appareillage général et la verrerie, sauf autre exigence dans la norme spécifique. Il décrit également les diverses techniques disponibles pour la détection et le dénombrement sur milieu de culture et les critères permettant de déterminer la technique appropriée. Le présent document concerne principalement les examens portant sur les bactéries, les levures et les moisissures, mais certains aspects peuvent aussi s'appliquer aux bactériophages, aux virus et aux parasites. Sont exclues les techniques ne reposant pas sur la culture de micro-organismes, telles que les méthodes de réaction en chaîne par polymérase (PCR).
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 8199
Third edition
2018-10
Water quality — General requirements
and guidance for microbiological
examinations by culture
Qualité de l’eau — Exigences et lignes directrices générales pour les
examens microbiologiques sur milieu de culture
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vii
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 4
5 General measurement requirements . 4
5.1 Uniformity of temperatures . 4
5.2 Incubation times . 4
5.3 Volumes and masses . 4
6 Diluents and culture media . 5
6.1 General . 5
6.2 Quality requirements of ingredients . 5
6.3 Diluents . 5
7 Sterilization and decontamination . 5
7.1 Sterilization of apparatus and glassware . 5
7.2 Sterilization of consumables . 6
7.3 Decontamination of glassware and materials after use . 6
7.4 Waste management . 6
8 Samples and sample handling . 6
8.1 Sampling . 6
8.2 Sample preparation . 7
8.2.1 Waters and other aqueous matrices . 7
8.2.2 Swabs . 7
9 Enumeration (quantitative) methods . 8
9.1 Inoculation of test portions in (or on) solid media . 8
9.1.1 General. 8
9.1.2 Pour plate technique . 8
9.1.3 Spread plate technique . 9
9.1.4 Membrane filtration technique .10
9.1.5 Incubation .12
9.1.6 Counting and confirmation from solid media .12
9.1.7 General guidance for calculation of results . .13
9.1.8 Expression of results .14
9.2 Enumeration using a liquid medium.24
9.2.1 General.24
9.2.2 Procedure .25
9.2.3 Choice of inoculation system .25
9.2.4 Incubation .26
9.2.5 Interpretation of results .26
9.2.6 Uncertainty of test results .27
9.2.7 Determination of MPN values .27
10 Detection (qualitative) methods .30
10.1 General .30
10.2 Procedure .31
10.3 Uncertainty of test results .31
11 Performance characteristics of methods .31
12 Analytical quality control .32
12.1 General .32
12.2 Internal quality control .32
12.2.1 General.32
12.2.2 Process controls .32
12.3 External quality assessment.33
Annex A (informative) Criteria for the choice of technique.35
Annex B (informative) Confidence intervals for colony count technique and choice of
method of calculation in special cases .40
Annex C (normative) Counting and calculations with two Petri dishes per dilution .44
Annex D (normative) Composition, preparation and performance testing of diluents .51
Bibliography .55
iv © ISO 2018 – All rights reserved
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 8199:2005), which has been technically
revised. The main changes compared with the previous edition are as follows.
— Clauses have been added for terms and definitions, detection (qualitative) methods, performance
characteristics and analytical quality control (AQC).
— The clauses referencing culture media and diluent preparation and QC have been revised to align
with ISO 11133 and have been included in a new Annex D.
— The subclause on general guidance for the calculation of results for solid media techniques has
[9]
been updated to reflect the changes in ISO 7218:2007/Amd.1:2013 on which the relevant clauses
and subclauses in the second edition were based. Modifications have been made, however, to take
account of water microbiology techniques (e.g. membrane filtration) and to allow for dilutions other
than ten-fold dilutions.
— Annex B has been added to give guidance on confidence intervals when calculating special cases,
relating to the update of the subclause on general guidance for the calculation of results for solid
media techniques.
— Annex C has been added to describe calculations when using duplicate dishes per dilution, relating
to the update of the subclause on general guidance for the calculation of results for solid media
techniques.
— The subclause relating to enumeration using liquid media had been expanded and includes
additional guidance on the use of MPN calculators. The former Annex B containing MPN tables has
been removed.
— The title of this document has been amended to reflect these changes.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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Introduction
Techniques for the detection and enumeration of microorganisms based on their ability to grow on or
in specified culture media are an important and widely used means of assessing the microbiological
quality of water. The purpose of this document is to gather in a single document the information
common to the various techniques. This reduces repetition of technical details in individual standards
and facilitates choice of the technique most suitable for a particular situation. Other guidance has been
included on general topics of relevance to these techniques, such as analytical quality control, method
performance characteristics and uncertainty of test results.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 8199:2018(E)
Water quality — General requirements and guidance for
microbiological examinations by culture
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this document be
carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This document specifies requirements and gives guidance for performing the manipulations common
to each culture technique for the microbiological examination of water, particularly the preparation of
samples, culture media, and general apparatus and glassware, unless otherwise required in the specific
standard. It also describes the various techniques available for detection and enumeration by culture
and the criteria for determining which technique is appropriate.
This document is mainly intended for examinations for bacteria, yeasts and moulds, but some aspects
are also applicable to bacteriophages, viruses and parasites. It excludes techniques not based on
culturing microorganisms, such as polymerase chain reaction (PCR) methods.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 7704, Water quality — Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
accuracy
closeness of agreement between a test result and the accepted reference value
[SOURCE: ISO 6107-8:1993, 1, modified — The note has been deleted.]
3.2
bias
difference between the expectation of the test results and an accepted reference value
[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.8, modified — Note 1 to entry has been deleted.]
3.3
confirmed count
count (3.4) corrected for not confirmed presumptive counts (3.9) by further testing of the
presumptive objects
3.4
count
observed number of objects such as colonies or cells determined by direct counting, or
most probable number (MPN) estimation based on statistical calculation using the number of positive
units or presumptive positive units in a dilution series of a test sample (3.16)
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 22, modified — “or presumptive positive units” has been added.]
3.5
detection level
minimum concentration of organisms that produce evidence of growth with a probability of p = 0,95
when inoculated into a specified culture medium and incubated under defined conditions
Note 1 to entry: The theoretical level that conforms to this definition is an average of three viable cells in an
inoculum volume.
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.10]
3.6
intralaboratory reproducibility
intermediate precision
closeness of agreement between test results obtained with the same method on the same or similar test
materials in the same laboratory with different operators using different equipment
3.7
limit of determination
lowest analyte concentration per analytical portion where the expected relative standard uncertainty
equals a specified value
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.17]
3.8
precision
closeness of agreement between independent test results obtained under stipulated conditions
[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.12, modified — Notes 1 to 3 to entry have been deleted.]
3.9
presumptive count
colony count (3.4) or most probable number (MPN) estimate based on the number of colonies or reaction
vessels that have an outward appearance that is interpreted as typical of a target organism
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 62, modified — “fermentation tubes” has been replaced with “reaction
vessels”.]
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3.10
relative standard deviation
u
rel
estimate of the standard deviation of a population from a sample of n results divided by the mean of
that sample
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.30]
3.11
repeatability
measurement repeatability
measurement precision (3.8) under a set of repeatability conditions (3.12) of measurement
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.32]
3.12
repeatability conditions
condition of measurement, out of a set of conditions that includes the same measurement procedure,
same operators, same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate
measurements on the same or similar objects over a short period of time
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.33]
3.13
reproducibility
measurement reproducibility
measurement precision (3.8) under reproducibility conditions (3.14) of measurement
Note 1 to entry: Relevant statistical terms are given in ISO 5725-1 and ISO 5725-2.
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.34]
3.14
reproducibility conditions
condition of measurement, out of a set of conditions that includes different locations, operators,
measuring systems, and replicate measurements on the same or similar objects
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.35]
3.15
test portion
specified quantity of the sample that is taken for analysis
EXAMPLE 0,1 ml, 1 ml, 100 ml of sample.
3.16
test sample
undiluted, diluted or otherwise prepared test portion (3.15) of a sample to be tested, after completion
of all preparation steps such as centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and
determination of ionic strength
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92, modified — Note 1 to entry has been deleted.]
3.17
trueness
closeness of agreement between the average value obtained from a large series of test results and an
accepted reference value
Note 1 to entry: The measure of trueness is usually expressed in terms of bias (3.2).
[SOURCE: ISO 6107-8:1993, 63]
3.18
uncertainty of counting
relative standard deviation (3.10) of results of repeated counting of the colonies or particles of the same
plate(s) or field(s) under stipulated conditions (same person, different persons in one laboratory, or
different laboratories)
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 103, modified — The domain has been deleted.]
4 Principle
The general principle of these techniques consists of inoculating a test portion of a water sample, or
resultant test sample following membrane filtration or centrifugation, on or into a culture medium
(solid or liquid). It is assumed that after incubation each target microorganism present multiplies,
giving either a colony visible directly on or in the solid medium or changes in the observable properties
of the liquid medium. The choice of a particular culture method depends not only on the nature and
numbers of the microorganisms sought, but also on the nature of the water and the reasons for the
examination.
5 General measurement requirements
5.1 Uniformity of temperatures
The following accepted ranges of temperatures and their ranges for incubation or storage are applied,
where appropriate for the intended target organism and unless otherwise required in the specific
standard.
Storage temperatures: (−70 ± 10) °C; (−20 ± 5) °C; (5 ± 3) °C
Incubation temperatures: (22 ± 2) °C; (36 ± 2) °C; (44 ± 0,5) °C
Media tempering temperature: 44 °C to 47 °C
The upper incubation temperature limits shall be followed strictly to ensure optimal growth. The lower
temperature limits may be exceeded for short periods, e.g. due to opening the door of an incubator, but
recovery to the operating temperature should be rapid.
5.2 Incubation times
The following accepted ranges of incubation times are applied, where appropriate for the intended
target organism and unless otherwise required in the specific standard.
Incubation times: (21 ± 3) h; (44 ± 4) h; (68 ± 4) h
5.3 Volumes and masses
Measuring equipment shall be appropriate to the required accuracy and precision. The accepted range
of any measured value is ±2 % where the stated value is critical to method performance and test results,
and ±5 % where the stated value has been shown not to be critical. Examples of critical values having
a direct effect on test results are inoculum and diluent volumes. For tolerances relating to the mass of
ingredients used to prepare culture media, refer to ISO 11133.
NOTE Critical tolerances have been set at 2 % to minimize the uncertainty of test results.
4 © ISO 2018 – All rights reserved
6 Diluents and culture media
6.1 General
General requirements for preparation, production, sterilization, storage and performance of culture
media are given in ISO 11133.
For preparation of microbiological culture media, unless otherwise stated, add the ingredients to the
volume of water, rather than make the ingredients up to a certain volume.
Before use, check the quality of the culture media, diluents, membrane filters and reagents by following
the procedures described in ISO 11133 and ISO 7704 or as given in the specific standard.
For information on storage of culture media, refer to ISO 11133.
6.2 Quality requirements of ingredients
Use constituents of uniform quality and analytical grade chemicals for the preparation of media.
Other grades of chemicals may be used provided they can be shown to produce equivalent results.
Alternatively, dehydrated complete media or diluents may be used. Follow the manufacturer’s
instructions strictly.
[2]
Refer to ISO 11133 and ISO 3696 for further information on the quality of ingredients and the quality
of water that should be used for media preparation.
6.3 Diluents
The following diluents are commonly used in water microbiology. However, other appropriate diluents
may be used and this list is not exhaustive:
— saline solution;
— peptone diluent;
— peptone saline solution [maximum recovery diluent (MRD)];
— quarter-strength Ringer’s solution;
— phosphate buffer solution.
Follow the formulations and the preparation, storage and performance testing instructions given in
Annex D for these diluents.
7 Sterilization and decontamination
7.1 Sterilization of apparatus and glassware
Sterilize apparatus and glassware not supplied sterile by one of the following methods:
a) in an oven, operating at (170 ± 10) °C for at least 1 h (excluding pre-heating time);
b) in an autoclave, operating at (121 ± 3) °C for at least 15 min.
Some heat labile items may require sterilization by other means (e.g. ultraviolet light or irradiation) but
these are not carried out in the routine laboratory.
7.2 Sterilization of consumables
Sterile disposable equipment and materials may be used instead of re-usable items (glassware, Petri
dishes, pipettes, bottles, tubes, loops, spreaders, etc.) if the specifications are similar.
If membrane filters are not obtained sterile, these are usually sterilized by moist heat according to
process b) described in 7.1, or by following the manufacturer’s instructions.
7.3 Decontamination of glassware and materials after use
Materials for decontamination and disposal should be placed in appropriate containers, e.g. autoclavable
plastic bags. Autoclaving is the preferred method for all decontamination processes (at least 30 min at
121 °C). The autoclave should be loaded in a way that favours heat penetration into the load (e.g. without
over packing). Take care to loosen caps/lids and open bags to prevent dangerous pressurization of the
container, which could lead to possible breakage, e.g. explosion of glass bottles.
Modern autoclaves may not require caps to be loosened, but follow the manufacturer’s instructions
strictly to avoid dangerous pressurization of the containers.
Alternative methods other than autoclaving may be used.
Autoclave all equipment which has been in contact with microbiological cultures (solid or liquid culture
media), including re-usable containers prior to being washed.
During examination, decontamination by immersion in freshly prepared disinfectant, prepared at the
correct dilution, may be used for small-sized and corrosion resistant equipment (e.g. pipettes).
Pasteur pipettes may be difficult to clean and are usually discarded after a single use.
Most disinfectants have some toxic effects. Wear gloves and eye protection when handling disinfectant
and follow the manufacturer’s instructions.
7.4 Waste management
The correct disposal of contaminated materials does not directly affect the quality of sample analysis,
but it is a matter of good laboratory management. A system for identification and separation of waste
materials and their containers should be established for:
— non-contaminated waste (e.g. uncultured water samples) that can be disposed of using general
waste streams;
— scalpels, needles, knives and broken glass;
— contaminated materials for autoclaving and recycling;
— contaminated materials for autoclaving and disposal, or for disposal only if the material is to be
incinerated.
Materials contaminated with risk category 3 microorganisms and their containers shall be autoclaved
before they are incinerated.
8 Samples and sample handling
8.1 Sampling
Take samples in accordance with ISO 19458. Collect disinfected water samples in sample bottles
containing suitable and sufficient neutralizers.
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8.2 Sample preparation
8.2.1 Waters and other aqueous matrices
Clean and dirty water should be separated and processed using separate equipment in separate areas
to reduce cross-contamination risk where possible. Alternatively, process batches of clean waters
before dirty water.
Before examination, mix the sample thoroughly by agitation to achieve uniform distribution of
microorganisms and other particles. This can be achieved by inversion of the sample or by a to-and-
fro motion. Depending on the nature of the water and the microbial content anticipated, make any
necessary dilutions at this stage.
For plate counts, ten-fold dilutions are usually used. For membrane filtration (with a smaller surface
area), smaller dilution steps are recommended. For many most probable number (MPN) techniques,
dilutions are an inherent part of the procedure. Refer to 9.2.3 for guidance on dilutions in MPN
[7]
techniques. See ISO 6887-1 for general guidance on the preparation of serial dilutions.
For ten-fold dilutions, aseptically measure nine volumes of the diluent and one volume of the water
sample into sterile dilution bottles or tubes. Alternatively, volumes of diluent pre-sterilized in screw-
capped bottles are used and volumes verified after autoclaving. One or more ten-fold dilutions are made
by transferring one volume of water sample to nine volumes of diluent. Mix the solution thoroughly
with a fresh pipette or by mechanical means and transfer one volume of this dilution to another nine
volumes of diluent. Repeat these steps as many times as required. Prepare sufficient volumes of each
dilution for all the tests to be carried out on each water sample.
For dilutions of other magnitudes, the volume of diluent to volume of sample is adjusted accordingly.
For example, four-fold dilutions can be made as described above for ten-fold dilutions, only in this case
one volume of water sample is mixed with three volumes of diluent. Another approach is to use a ten-
fold dilution series, but filter both 10 ml and 30 ml volumes.
If the concentration of the target organism is expected to be high, hundred-fold dilution steps may
be used by mixing one volume of water sample with 99 volumes of diluent, but such large intervals
between measurements can adversely affect the reliability of the test results.
8.2.2 Swabs
8.2.2.1 General
Swabs are sometimes used for assessing water quality, e.g. investigation of biofilms, and may be tested
by both quantitative and qualitative methods.
Different types of swabs are available for specific purposes, including stick and sponge swabs, with
and without neutralizing agents for any disinfectants present. Where transport times before testing
are likely to be extended, special transport swabs giving some protection to the organisms present
are recommended. All types of swabs should be evaluated before use, as some have been found to be
inhibitory to certain microorganisms. Further guidance on the use of swabs and swabbing techniques
[18]
can be found in ISO 18593 .
NOTE Dry stick swabs are not suitable for microbiological testing because they offer no protection against
dehydration or disinfectant residues for any microorganisms present during transport and storage before
testing.
8.2.2.2 Stick swab preparation
Stick swabs in neutralizing solution are mixed thoroughly, either manually or by vortexing, in the
solution.
Transport swabs in agar are carefully removed from the packaging and immersed in a volume (usually
10 ml) of diluent. The stick is then broken or cut off to allow thorough mixing in the sealed bottle or
tube. Mix either manually or by other means, such as vortexing, shaking or ultrasonication, to optimize
the recovery of any organisms present.
In both cases, the resulting suspensions are used as the initial dilution and the results are expressed
accordingly.
8.2.2.3 Sponge swab preparation
Sponge swabs are recommended for qualitative testing to ensure a representative sample is taken and a
“not detected” result is more reliable based on the larger sample. These contain a volume of neutralizer
sufficient to protect any organisms present during transport, which makes their use for quantitative
testing problematic, unless this volume is known and can be included in subsequent calculations.
On receipt at the laboratory, a larger volume (usually 100 ml) of (pre-)enrichment broth is added to the
sponge swab in the original packaging and testing continued according to the specific method.
9 Enumeration (quantitative) methods
9.1 Inoculation of test portions in (or on) solid media
9.1.1 General
A test portion of the water sample or any dilutions prepared is inoculated, either directly or concentrated
on a membrane filter, on the surface of a specified solid culture medium or in a molten medium so that
once incubated, microorganisms form colonies either on or in the medium.
For practical purposes, each colony is considered to have originated from a single microorganism or a
clump of microorganisms present in the test portion at the time of inoculation. Taking into account the
volume of the test portion and the number of colonies formed, the result can therefore be expressed as
a number of colony-forming units (cfu) or colony-forming particles (cfp) in a given volume of the sample,
e.g. 1 ml or 100 ml.
Three procedures are used predominantly for the inoculation of solid media and the choice of technique
depends on several factors. These include the physical and chemical characteristics of the water as
well as the nature of the microorganisms sought, their probable concentration, the effective recovery
of stressed or (sub-lethally) injured microorganisms, and the test precision and sensitivity required.
Indications are given in 9.1.2.2, 9.1.3.2 and 9.1.4.2 of the volumes of water samples that may be used for
each technique.
NOTE 1 Limits of determination and the accuracy of the various techniques are discussed in A.2.
NOTE 2 The nature of the sample and organisms sought are discussed in A.3.
9.1.2 Pour plate technique
9.1.2.1 General
The test portion is mixed with the medium, which has previously been melted and cooled (tempered)
to a temperature close to that of solidification, i.e. 44 °C to 47 °C, so that heat damage to organisms is
minimized. After incubation, the colonies that develop within and on the surface of the medium are
counted.
9.1.2.2 Test portion
The volume of the test portion of the sample, or of a dilution of the sample, can vary between 0,1 ml and
5 ml depending on the size of the Petri dish and the volume of culture medium used. The dilution should
be chosen so that the expected number of colonies formed on plates of 90 mm diameter is less than 300,
and the number of target colonies is greater than 10.
8 © ISO 2018 – All rights reserved
The acceptable maximum number of target colonies on a plate will depend on the specific method,
colony size, the nature of the colonies (e.g. spreading) and the presence of non-target colonies, and may
be based on the results of verification exercises. As guidance, the maximum number of colonies on a
[8]
90 mm plate (both target and non-target) is typically regarded as 300 (refer to ISO 7218 ). Larger
(such as 140 mm) dishes need separate consideration (see 9.1.7.2).
9.1.2.3 Inoculation
Melt the medium required in boiling water or by any other process (e.g. a steam flow-through
autoclave or microwave oven, if the heating time/temperature combination has been verified for
media preparation). Loosen caps before heating, avoid over-heating and remove the medium as soon
as it has melted. Place the molten medium in a water bath or incubator at 44 °C to 47 °C for sufficient
time, depending on the numbers and volumes of containers, so that the medium will equilibrate to this
temperature throughout. Verify the time required for tempering agar for all quantities and volumes
routinely used. Do not keep heat-sensitive molten media for more than 4 h (or the maximum time stated
in the specific standard) as the quality may be reduced after this time. Do not melt agar media more
than once.
Waterbaths are likely to contain microorganisms, which could be a source of contamination of molten
media. Regularly changing the water and cleaning is advised to minimize this risk.
Prepare and mark the Petri dishes required with sample and other details. Make any dilutions necessary
in accordance with 8.2.1. Distribute the test portions into the dishes after thorough mixing.
Remove each tube or flask of tempered medium from the water bath in turn; dry the outside of the
tube or flask completely and flame the neck. Add the medium to each Petri dish without delay,
avoiding the test portion to minimize heat shock, and mix carefully to obtain a uniform distribution
of microorganisms. Generally, (18 ± 2) ml of medium is used for a test portion of up to 1 ml in 90 mm
Petri dishes. Alternatively, if demonstrated as suitable by the laboratory, a minimum of 10 ml medium
may be used if the samples are bagged for incubation. Leave the plates to cool on a horizontal surface to
solidify the agar. As soon as the agar is set, incubate the plates in accordance with 9.1.5.
Agar preparators, pourers and shaker systems may be useful in laboratories analysing large numbers
[8]
of samples (see ISO 7218 ).
9.1.3 Spread plate technique
9.1.3.1 General
The test portion is spread over the dry surface of an agar medium with a sterile implement and colonies
that develop on the surface after incubation are counted.
9.1.3.2 Test portion
For a Petri dish of 90 mm diameter, the volume of the test portion of the sample, or of a dilution of the
sample, should be 0,1 ml to a maximum of 0,5 ml. For optimal precision, choose the dilution so that the
expected number of colonies formed is less than 300, and the number of target colonies is greater than 10.
The acceptable maximum number of target colonies on a plate will depend on the specific method, the
colony size, the nature of the colonies (e.g. spreading) and the presence of non-target colonies, and may
be based on the results of verification exercises. As guidance, the maximum number of colonies on a
[8]
90 mm plate (both target and non-target) is typically regarded as 300 (refer to ISO 7218 ). Larger
(such as 140 mm) dishes need separate consideration (see 9.1.7.2).
Spiral platers use smaller volumes and the limit of determination will consequently be raised. Follow
the manufacturer’s guidance for use of spiral platers. Spiral platers may not be suitable for fungi.
9.1.3.3 Inoculation
Prepare and mark the plates required, each containing (18 ± 2) ml of culture medium for 90 mm Petri
dishes, with sample and other details. For longer incubation periods (e.g. incubation periods longer
than the example incubations periods stated in 5.2), larger volumes of culture media might be required.
In this case, refer to ISO 11133 for guidance on culture medium volumes. Dry the surface of the medium
if necessary before use as described below. Pipette the test portion onto the surface of the medium and
spread over the surface with a sterile implement, or mechanical device such as a spiral plater, avoiding
the edges of the agar. Leave the plates on the bench until the inoculum is absorbed (maximum time
15 min), then incubate the plates in accordance with 9.1.5.
For drying plates, the following points are important.
— The degree of humidity in culture media, because optimum growth of microorganisms will depend
on the humidity conditions in and on the medium. Extensive humidity loss may lead, for example,
to an increase in the concentrations of inhibitors in selective culture media and a reduction in the
water activity at the surface of the medium.
— When bacteria, which do not swarm rapidly, are cultured and the plates appear to be dry after
reaching ambient temperature, drying is not always necessary. In this case, drying can be omitted
as it only increases the likelihood of contamination and unnecessary humidity loss.
— Select the temperature and drying time so that the likelihood of contamination is kept as low as
possible and excessive heating will not reduce the quality of the culture medium. The drying time
depends on the amount of condensation in the Petri dish, but shall be kept as short as possible.
Plates shall, wherever possible, be dried with the surface of the medium downwards to avoid airborne
contamination.
Sufficiently dry plates can usually be obtained by placing them with lids half open in an incubator or
drying cabinet set at a temperature between 25 °C and 50 °C. Dry the plates until moisture droplets
have disappeared from the lids, but do not dry any further. Agar plates are also dried (positioned as
described above) in a laminar flow cabinet at room temperature for 30 min to 60 min, or on the open
bench but drying times may be longer. Storage of plates inverted but with the lids still in place overnight
at room temperature is also effective if the plates are freshly poured and in vented Petri dishes.
9.1.4 Membrane filtration technique
9.1.4.1 General
The test portion is passed through a membrane filter, which r
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 8199
Troisième édition
2018-10
Qualité de l’eau — Exigences et
lignes directrices générales pour les
examens microbiologiques sur milieu
de culture
Water quality — General requirements and guidance for
microbiological examinations by culture
Numéro de référence
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ISO 2018
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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CH-1214 Vernier, Genève
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Fax: +41 22 749 09 47
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 4
5 Exigences générales concernant les mesurages . 4
5.1 Uniformité des températures . 4
5.2 Durées d’incubation. 5
5.3 Volumes et masses . 5
6 Diluants et milieux de culture . 5
6.1 Généralités . 5
6.2 Exigences de qualité des ingrédients . 5
6.3 Diluants . 5
7 Stérilisation et décontamination . 6
7.1 Stérilisation d’appareillage et de verrerie . 6
7.2 Stérilisation des consommables . 6
7.3 Décontamination de la verrerie et du matériel après utilisation . 6
7.4 Gestion des déchets . 7
8 Échantillons et manipulation des échantillons . 7
8.1 Échantillonnage . 7
8.2 Préparation des échantillons . 7
8.2.1 Eaux et autres matrices aqueuses . 7
8.2.2 Écouvillons . 8
9 Méthodes de dénombrement (quantitatives) . 9
9.1 Ensemencement des prises d’essai dans (ou sur) un milieu solide . 9
9.1.1 Généralités . 9
9.1.2 Technique par incorporation . 9
9.1.3 Technique par étalement .10
9.1.4 Technique par filtration sur membrane.11
9.1.5 Incubation .13
9.1.6 Numération et confirmation sur milieux solides .14
9.1.7 Lignes directrices générales pour le calcul des résultats .15
9.1.8 Expression des résultats .16
9.2 Dénombrement utilisant un milieu liquide .26
9.2.1 Généralités .26
9.2.2 Mode opératoire .26
9.2.3 Choix d’un système d’ensemencement .27
9.2.4 Incubation .28
9.2.5 Interprétation des résultats .28
9.2.6 Incertitude des résultats d’essai.28
9.2.7 Détermination des indices NPP .29
10 Méthodes de détection (qualitatives) .32
10.1 Généralités .32
10.2 Mode opératoire .32
10.3 Incertitude des résultats d’essai .33
11 Caractéristiques de performances des méthodes .33
12 Contrôle qualité analytique.34
12.1 Généralités .34
12.2 Contrôle qualité interne .34
12.2.1 Généralités .34
12.2.2 Contrôles de procédé .34
12.3 Évaluation de qualité externe .36
Annexe A (informative) Critères de choix de la technique .37
Annexe B (informative) Intervalles de confiance pour la technique de numération
de colonies et choix de la méthode de calcul dans des cas particuliers.42
Annexe C (normative) Numération et calculs avec deux boîtes de Petri par dilution .46
Annexe D (normative) Composition, préparation et essai de performances des diluants .53
Bibliographie .57
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 8199:2005), qui a fait l’objet d’une
révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes.
— Des articles ont été ajoutés concernant les termes et définitions, les méthodes de détection
(qualitatives), les caractéristiques de performance et le contrôle qualité analytique (AQC).
— Les articles faisant référence à la préparation et au Contrôle Qualité (QC) des milieux de culture et
des diluants ont été révisés à des fins d’harmonisation avec l’ISO 11133 et ont été inclus dans une
nouvelle Annexe D.
— Le paragraphe portant sur les lignes directrices générales de calcul des résultats pour les techniques
sur milieu solide a été mis à jour afin de tenir compte des changements apportés à l’ISO 7218:2007/
[9]
Amd.1:2013 , sur laquelle se fondaient les articles et paragraphes correspondants de la deuxième
édition. Toutefois, les modifications ont été faites de sorte à prendre en considération les techniques
de microbiologie de l’eau (telles que la filtration sur membrane) et à permettre des dilutions autres
que des dilutions décimales.
— L’Annexe B a été ajoutée pour donner des lignes directrices sur les intervalles de confiance lors
du calcul de cas spéciaux, en relation avec la mise à jour du paragraphe sur les lignes directrices
générales de calcul des résultats pour les techniques sur milieu solide.
— L’Annexe C a été ajoutée pour décrire les calculs en cas d’utilisation de boîtes en duplicat par
dilution, en relation avec la mise à jour du paragraphe sur les lignes directrices générales de calcul
des résultats pour les techniques sur milieu solide.
— Le paragraphe concernant le dénombrement utilisant un milieu liquide a été complété et inclut des
lignes directrices supplémentaires relatives à l’utilisation des calculateurs NPP. L’ancienne Annexe B
contenant les tables NPP a été supprimée.
— Le titre du présent document a été modifié pour prendre en compte ces changements.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
vi © ISO 2018 – Tous droits réservés
Introduction
Les techniques de détection et de dénombrement des micro-organismes, basées sur leur capacité à se
multiplier sur ou dans des milieux de culture spécifiques, sont un moyen important et largement utilisé
pour évaluer la qualité microbiologique de l’eau. Le but du présent document est de réunir en un seul
document les informations communes aux diverses techniques afin d’éviter la répétition des détails
techniques dans chaque norme et de faciliter le choix de la technique la plus adaptée à une situation
donnée. D’autres lignes directrices ont été incluses, concernant des aspects généraux importants en
lien avec ces techniques, tels que le contrôle qualité analytique, les caractéristiques de performance des
méthodes et l’incertitude des résultats d’essai.
NORME INTERNATIONALE ISO 8199:2018(F)
Qualité de l’eau — Exigences et lignes directrices générales
pour les examens microbiologiques sur milieu de culture
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur
d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité.
IMPORTANT — Il est absolument indispensable que les essais menés conformément au présent
document le soient par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document établit les exigences et fournit les lignes directrices sur les manipulations
communes à chaque technique de culture pour l’examen microbiologique de l’eau, en particulier
la préparation des échantillons, les milieux de culture ainsi que l’appareillage général et la verrerie,
sauf autre exigence dans la norme spécifique. Il décrit également les diverses techniques disponibles
pour la détection et le dénombrement sur milieu de culture et les critères permettant de déterminer la
technique appropriée.
Le présent document concerne principalement les examens portant sur les bactéries, les levures et
les moisissures, mais certains aspects peuvent aussi s’appliquer aux bactériophages, aux virus et aux
parasites. Sont exclues les techniques ne reposant pas sur la culture de micro-organismes, telles que les
méthodes de réaction en chaîne par polymérase (PCR).
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 7704, Qualité de l'eau — Évaluation des membranes filtrantes utilisées pour des analyses
microbiologiques
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
exactitude
étroitesse de l’accord entre un résultat d’essai et une valeur de référence acceptée
[SOURCE: ISO 6107-8:1993, 1, modifiée — La note a été supprimée.]
3.2
biais
différence entre l’espérance mathématique des résultats d’essai et une valeur de référence acceptée
[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.8, modifiée — La note 1 à l’article a été supprimée.]
3.3
numération confirmée
numération (3.4) corrigée des numérations présomptives (3.9) non confirmées par des essais
supplémentaires des objets présomptifs
3.4
numération
nombre observé d’objets, tels que les colonies ou les cellules, déterminé par numération
directe ou par estimation du nombre le plus probable (NPP) en fonction du calcul statistique utilisant
le nombre d’unités positives ou d’unités positives présomptives dans une série de dilutions d’un
échantillon pour essai (3.16)
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 22, modifiée — «ou d’unités positives présomptives» a été ajouté.]
3.5
niveau de détection
concentration minimale en organismes fournissant la preuve de la croissance avec une probabilité
de p = 0,95 lorsqu’ils sont inoculés dans un milieu de culture spécifié et incubés dans des conditions
spécifiées
Note 1 à l'article: Le niveau théorique conforme à cette définition est une moyenne de trois cellules viables dans
un volume d’inoculum.
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.10]
3.6
reproductibilité interlaboratoires
fidélité intermédiaire
étroitesse d’accord entre des résultats d’essai obtenus par la même méthode, sur des matériels d’essai
identiques ou similaires, dans le même laboratoire, avec différents opérateurs utilisant des équipements
différents
3.7
limite de détermination
concentration d’analyte la plus faible par prise analytique lorsque l’incertitude-type relative prévue est
égale à une valeur spécifiée
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.17]
3.8
fidélité
étroitesse d’accord entre des résultats d’essai indépendants obtenus sous des conditions stipulées
[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.12, modifiée — Les notes 1 à 3 à l’article ont été supprimées.]
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3.9
numération présomptive
numération (3.4) de colonies ou estimation du nombre le plus probable (NPP) en fonction du nombre de
colonies ou d’unités réactionnelles dont l’apparence extérieure est interprétée comme caractéristique
d’un organisme cible
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 62, modifiée — «tubes de fermentation» a été remplacé par «unités
réactionnelles».]
3.10
écart-type relatif
u
rel
estimation de l’écart-type d’une population d’un échantillon de n résultats divisé par la moyenne de cet
échantillon
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.30]
3.11
répétabilité
répétabilité de mesure
fidélité (3.8) de mesure selon un ensemble de conditions de répétabilité (3.12)
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.32]
3.12
conditions de répétabilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent la même procédure de
mesure, les mêmes opérateurs, le même système de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement
et le même lieu, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets similaires pendant une
courte période de temps
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.33]
3.13
reproductibilité
reproductibilité de mesure
fidélité (3.8) de mesure selon un ensemble de conditions de reproductibilité (3.14)
Note 1 à l'article: Des termes statistiques pertinents sont donnés dans l’ISO 5725-1 et l’ISO 5725-2.
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.34]
3.14
conditions de reproductibilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent des lieux, des opérateurs et
des systèmes de mesure différents, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets
similaires
[SOURCE: ISO 13843:2017, 3.35]
3.15
prise d’essai
quantité spécifiée de l’échantillon prélevée pour analyse
EXEMPLE 0,1 ml, 1 ml, 100 ml d’échantillon.
3.16
échantillon pour essai
prise d’essai (3.15) non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à essai, après
exécution de toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation,
l’ajustement du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92, modifiée — «portion» a été remplacé par «prise d’essai» et la note 1 à
l’article a été supprimée.]
3.17
justesse
étroitesse de l’accord entre une valeur moyenne obtenue à partir de nombreux résultats d’essai et une
valeur de référence acceptée
Note 1 à l'article: La mesure de la justesse s’exprime généralement en termes de biais (3.2).
[SOURCE: ISO 6107-8:1993, 63]
3.18
incertitude de numération
écart-type relatif (3.10) des résultats de la numération répétée des colonies ou des particules présentes
sur la (les) même(s) plaque(s) ou le(s) même(s) champ(s) dans des conditions stipulées (même personne,
personnes différentes dans un seul laboratoire ou dans différents laboratoires)
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 103, modifiée — Le domaine a été supprimé.]
4 Principe
Le principe général de ces techniques consiste à ensemencer une prise d’essai d’un échantillon d’eau,
ou un échantillon pour essai résultant d’une filtration sur membrane ou centrifugation, sur ou dans un
milieu de culture (solide ou liquide). Il est supposé qu’au cours de l’incubation, chaque micro-organisme
cible présent se multiplie pour donner soit une colonie visible directement sur ou dans le milieu solide,
soit des changements d’aspect du milieu liquide. Le choix de telle ou telle méthode de culture dépend
non seulement de la nature et des nombres des micro-organismes recherchés, mais aussi de la nature
de l’eau et des raisons à l’origine de l’examen.
5 Exigences générales concernant les mesurages
5.1 Uniformité des températures
Les gammes suivantes de températures acceptées, et leurs amplitudes d’incubation ou de conservation
sont appliquées, dans la mesure où elles conviennent à l’organisme cible prévu et sauf autre exigence
dans la norme spécifique.
Températures de conservation: (−70 ± 10) °C; (−20 ± 5) °C; (5 ± 3) °C
Températures d’incubation: (22 ± 2) °C; (36 ± 2) °C; (44 ± 0,5) °C
Température de maintien des milieux en surfusion: 44 °C à 47 °C
Les limites supérieures de la température d’incubation doivent être rigoureusement respectées pour
garantir une croissance optimale. Les limites inférieures de température peuvent être dépassées
pendant de courtes périodes, par exemple lors de l’ouverture de la porte de l’incubateur, mais il convient
que la température de fonctionnement soit rapidement rétablie.
4 © ISO 2018 – Tous droits réservés
5.2 Durées d’incubation
Les gammes suivantes de durées d’incubation acceptées sont appliquées, dans la mesure où elles
conviennent à l’organisme cible prévu et sauf autre exigence dans la norme spécifique.
Durées d’incubation: (21 ± 3) h; (44 ± 4) h; (68 ± 4) h
5.3 Volumes et masses
L’équipement de mesure doit être adapté à l’exactitude et à la fidélité requises. La gamme acceptée
de toute valeur mesurée est de ± 2 %, lorsque la valeur indiquée est critique pour les performances
de la méthode et les résultats d’essai, et de ± 5 % lorsqu’il a été montré que la valeur indiquée n’est
pas critique. Des exemples de valeurs critiques ayant un effet direct sur les résultats d’essai sont les
volumes d’inoculum et de diluant. Pour les tolérances concernant la masse des ingrédients utilisés pour
préparer les milieux de culture, se reporter à l’ISO 11133.
NOTE Les tolérances critiques ont été fixées à 2 % afin de réduire au minimum l’incertitude des résultats
d’essai.
6 Diluants et milieux de culture
6.1 Généralités
Les exigences générales relatives à la préparation, la production, la stérilisation, la conservation et les
performances des milieux de culture sont spécifiées dans l’ISO 11133.
Pour la préparation des milieux de culture microbiologique, sauf indication contraire, ajouter les
ingrédients au volume d’eau, plutôt que de compléter les ingrédients à un certain volume.
Vérifier la qualité des milieux de culture, des diluants, des membranes filtrantes et des réactifs avant
utilisation, conformément aux modes opératoires décrits dans les normes ISO 11133 et ISO 7704 ou
suivant les indications de la norme spécifique.
Des informations sur la conservation des milieux de culture sont spécifiées dans l’ISO 11133.
6.2 Exigences de qualité des ingrédients
Les composants entrant dans la préparation des milieux de culture doivent être de qualité constante
et les produits chimiques de qualité analytique reconnue. Des produits chimiques de qualité différente
peuvent être utilisés à condition de pouvoir prouver qu’ils donnent des résultats équivalents. Il est
également permis d’utiliser des milieux complets ou des diluants déshydratés. Suivre scrupuleusement
les instructions du fabricant.
[2]
Se reporter à l’ISO 11133 et à l’ISO 3696 pour plus d’informations sur la qualité des ingrédients et la
qualité de l’eau qu’il convient d’utiliser pour la préparation des milieux.
6.3 Diluants
Les diluants suivants sont d’usage courant en microbiologie de l’eau. Toutefois, il est permis d’utiliser
d’autres diluants adaptés et cette liste n’est pas exhaustive:
— solution saline;
— eau peptonée;
— solution peptonée saline [diluant à récupération maximale (MRD)];
— solution de Ringer quart de concentration;
— solution tampon de phosphate.
Respecter les formulations et les instructions de préparation, de stockage et d’essai de performance
données dans l’Annexe D pour ces diluants.
7 Stérilisation et décontamination
7.1 Stérilisation d’appareillage et de verrerie
Les appareils et la verrerie qui ne sont pas fournis stériles doivent être stérilisés selon l’une des
méthodes suivantes:
a) dans un four, fonctionnant à (170 ± 10) °C durant 1 h au minimum (hormis la durée de préchauffage);
b) dans un autoclave, fonctionnant à (121 ± 3) °C durant 15 min au minimum.
Certains articles instables à la chaleur peuvent nécessiter une stérilisation par d’autres moyens (par
exemple, lumière ultraviolette ou irradiation), mais ces méthodes ne sont pas employées en routine.
7.2 Stérilisation des consommables
Équipement et matériels jetables stériles peuvent être utilisés à la place des articles réutilisables
(verrerie, boîtes de Petri, pipettes, flacons, tubes, anses, ensemenceurs, etc.) si les spécifications sont
similaires.
Si les membranes filtrantes ne sont pas fournies stériles, elles sont généralement stérilisées à la chaleur
humide conformément au procédé b) décrit en 7.1, ou selon les instructions du fabricant.
7.3 Décontamination de la verrerie et du matériel après utilisation
Il convient de placer le matériel destiné à être décontaminé et éliminé dans des récipients appropriés,
par exemple des poches en plastique pouvant passer à l’autoclave. L’autoclavage est la méthode
préférée pour tous les procédés de décontamination (au moins 30 min à 121 °C). Il convient de charger
l’autoclave de manière à favoriser la pénétration de chaleur dans la charge (par exemple, ne pas remplir
le dispositif de manière excessive). Veiller à desserrer les bouchons/couvercles et à ouvrir les poches
afin d’éviter une pressurisation dangereuse du récipient, qui pourrait conduire à sa casse, par exemple
à l’explosion des flacons en verre.
Certains autoclaves modernes peuvent ne pas nécessiter de desserrage des bouchons, mais suivre
scrupuleusement les instructions du fabricant afin d’éviter une pressurisation dangereuse des
récipients.
Il est admis d’utiliser d’autres méthodes que l’autoclavage.
Autoclaver l’ensemble de l’équipement ayant été en contact avec des cultures microbiologiques (milieux
de culture solides ou liquides), y compris les récipients réutilisables, avant lavage.
Pendant l’examen, la décontamination par immersion dans le désinfectant fraîchement préparé, à la
dilution appropriée, peut être utilisée pour les équipements de petite taille et résistant à la corrosion
(par exemple, les pipettes).
Les pipettes Pasteur peuvent être difficiles à nettoyer et sont généralement jetées après une seule
utilisation.
La plupart des désinfectants ont des effets toxiques. Il convient de porter des gants et des lunettes de
protection lors de la manipulation des désinfectants, et de suivre les instructions du fabricant.
6 © ISO 2018 – Tous droits réservés
7.4 Gestion des déchets
L’élimination correcte des matières contaminées n’a pas d’incidence directe sur la qualité de l’analyse
des échantillons, mais elle fait partie de la bonne gestion du laboratoire. Il est recommandé d’établir un
système d’identification et de séparation des déchets et de leurs récipients pour:
— les déchets non contaminés (par exemple, les échantillons d’eau non mis en culture) pouvant être
éliminés via les circuits généraux de traitement des déchets;
— les scalpels, les aiguilles, les couteaux et le verre cassé;
— les matières contaminées pour l’autoclavage et le recyclage;
— les matières contaminées pour l’autoclavage et l’élimination, ou l’élimination uniquement s’il est
prévu d’incinérer la matière.
Les matières contaminées par des micro-organismes de catégorie de risque 3 et leurs récipients doivent
être autoclavés avant d’être incinérés.
8 Échantillons et manipulation des échantillons
8.1 Échantillonnage
Effectuer l’échantillonnage selon l’ISO 19458. Recueillir les échantillons d’eau désinfectés dans des
flacons d’échantillons contenant un agent neutralisant adapté et en quantité suffisante.
8.2 Préparation des échantillons
8.2.1 Eaux et autres matrices aqueuses
Il convient de séparer les eaux propres et sales et de les traiter en utilisant un équipement distinct dans
des zones distinctes, afin de réduire le risque de contamination croisée dans la mesure du possible. Les
lots d’eaux propres peuvent également être traités avant les eaux sales.
Avant l’examen, homogénéiser l’échantillon en agitant pour obtenir une répartition uniforme des
micro-organismes et des autres particules. Cette homogénéisation peut être obtenue par inversion
de l’échantillon ou par un mouvement de va-et-vient. Selon la nature de l’eau et la teneur en bactéries
attendue, faire toutes les dilutions nécessaires à ce stade.
Dans le cas des numérations sur gélose, une dilution décimale est généralement utilisée. Dans le cas de
la filtration sur membrane (surface plus réduite), il est recommandé d’appliquer des facteurs de dilution
moindres. Pour de nombreuses techniques du nombre le plus probable (NPP), les dilutions font partie
intégrante du mode opératoire. Se reporter à 9.2.3 pour des lignes directrices sur les dilutions dans
les techniques NPP. Pour des lignes directrices générales sur la préparation des dilutions en série, se
[7]
reporter à l’ISO 6887-1 .
Pour les dilutions décimales, mesurer de manière aseptique neuf volumes du diluant et un volume de
l’échantillon d’eau dans des flacons ou des tubes de dilution stériles. Il est également possible d’utiliser
des volumes de diluant préalablement stérilisé dans des flacons à bouchon à vis et de vérifier les volumes
après l’autoclavage. Une ou plusieurs dilutions décimales sont réalisées par transfert d’un volume
d’échantillon d’eau à neuf volumes de diluant. À l’aide d’une autre pipette ou par un moyen mécanique,
homogénéiser soigneusement et prélever un volume de cette dilution pour l’ajouter à un nouveau tube
contenant neuf volumes de diluant. Répéter ces étapes autant de fois que nécessaire. Préparer un
volume suffisant de chaque dilution pour tous les essais à effectuer avec chaque échantillon d’eau.
Pour les dilutions d’un autre facteur, ajuster le volume de diluant en fonction du volume d’échantillon.
Par exemple, des dilutions d’ordre 4 peuvent être effectuées en suivant la méthode décrite plus haut
pour les dilutions décimales, mais en mélangeant dans ce cas un volume d’échantillon d’eau avec trois
volumes de diluant. Une autre approche consiste à utiliser une série de dilutions décimales, mais en
filtrant des volumes de 10 ml et de 30 ml.
Si de hautes concentrations de l’organisme cible sont attendues, il est possible d’utiliser des facteurs de
dilution d’ordre 100 en mélangeant un volume d’échantillon d’eau avec 99 volumes de diluant, mais un
intervalle aussi important entre les mesurages peut nuire à la fiabilité des résultats de l’essai.
8.2.2 Écouvillons
8.2.2.1 Généralités
Les écouvillons sont parfois utilisés pour évaluer la qualité de l’eau, par exemple pour examiner les
biofilms, et peuvent être soumis à des méthodes quantitatives et qualitatives.
Différents types d’écouvillons sont disponibles pour des besoins spécifiques, notamment les cotons-
tiges et les éponges, avec et sans agents neutralisants des éventuels désinfectants présents. Lorsqu’il
est probable que les temps de transport avant essai seront longs, des écouvillons de transport spéciaux
assurant une certaine protection des organismes présents sont recommandés. Il convient d’évaluer
tous les types d’écouvillons avant utilisation, car il a été démontré que certains d’entre eux ont un
[18]
effet inhibiteur sur certains micro-organismes. Voir l’ISO 18593 pour obtenir des lignes directrices
supplémentaires sur l’utilisation des écouvillons et les techniques d’écouvillonnage.
NOTE Les cotons-tiges secs ne sont pas adaptés aux essais microbiologiques, car ils n’offrent aucune
protection contre la déshydratation ou les résidus de désinfectants à de quelconques micro-organismes présents
durant le transport ou la conservation avant essai.
8.2.2.2 Préparation des cotons-tiges
Les cotons-tiges dans la solution de neutralisation sont soigneusement mélangés, manuellement ou
au vortex.
Les écouvillons de transport dans la gélose sont délicatement sortis de leur emballage et immergés
dans un volume (généralement 10 ml) de diluant. Le coton-tige est alors cassé ou coupé afin de pouvoir
être bien mélangé dans le flacon ou le tube scellé. Mélanger manuellement ou par d’autres moyens, par
exemple au vortex, par agitation ou ultrasonication, afin d’optimiser la récupération des organismes
présents.
Dans les deux cas, les suspensions résultantes sont utilisées comme dilution initiale et les résultats sont
exprimés en conséquence.
8.2.2.3 Préparation des écouvillons éponges
Les écouvillons éponges sont recommandés dans le cas d’un essai qualitatif, pour garantir le prélèvement
d’un échantillon représentatif et un résultat «non détecté» plus fiable basé sur un échantillon plus
grand. Les écouvillons éponges contiennent un volume d’agent neutralisant suffisant pour protéger
tous les organismes présents durant le transport, ce qui rend leur utilisation problématique dans le cas
des essais quantitatifs, sauf si ce volume est connu et peut être inclus dans les calculs ultérieurs.
À réception par le laboratoire, un grand volume (généralement 100 ml) de bouillon de
(pré-)enrichissement est ajouté à l’écouvillon éponge dans le conditionnement d’origine et l’essai est
poursuivi conformément à la méthode spécifique.
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9 Méthodes de dénombrement (quantitatives)
9.1 Ensemencement des prises d’essai dans (ou sur) un milieu solide
9.1.1 Généralités
Une prise d’essai de l’échantillon d’eau, ou n’importe quelle dilution préparée, est ensemencée soit
directement, soit après concentration sur une membrane filtrante, sur la surface d’un milieu de culture
solide spécifique ou dans un milieu maintenu en surfusion, de sorte que lors de l’incubation, les micro-
organismes forment des colonies dans ou sur le milieu.
Pour des raisons pratiques, chaque colonie est considérée comme provenant d’un seul micro-organisme
ou d’un agrégat de micro-organismes présents dans la prise d’essai au moment de l’ensemencement. En
tenant compte du volume de la prise d’essai et du nombre de colonies formées, le résultat peut donc être
exprimé comme le nombre d’unités formant colonies (UFC) ou de particules formant colonies (PFC)
dans un volume donné de l’échantillon, par exemple 1 ml ou 100 ml.
Trois modes opératoires sont principalement utilisés pour l’ensemencement en milieu solide et le
choix de la technique dépend de plusieurs facteurs, parmi lesquels les caractéristiques physiques et
chimiques de l’eau, ainsi que la nature des micro-organismes recherchés, leur concentration probable, la
récupération effective des micro-organismes en état de stress ou abîmés de manière sublétale ainsi que
la fidélité et la sensibilité requises pour l’essai. Des indications concernant les volumes d’échantillons
d’eau qui peuvent être utilisés pour chaque technique sont données en 9.1.2.2, 9.1.3.2 et 9.1.4.2.
NOTE 1 Les limites de détermination et l’exactitude des différentes techniques sont traitées en A.2.
NOTE 2 La nature de l’échantillon et les organismes recherchés sont traités en A.3.
9.1.2 Technique par incorporation
9.1.2.1 Généralités
La prise d’essai est mélangée au milieu qui a été préalablement fondu et refroidi (tempéré) à une
température proche de la température de solidification, c’est-à-dire de 44 °C à 47 °C, afin de réduire
au minimum les dommages aux organismes dus à la chaleur. Après incubation, les colonies qui se
développent à la surface et à l’intérieur du milieu sont dénombrées.
9.1.2.2 Prise d’essai
Le volume de la prise d’essai de l’échantillon, ou d’une dilution de l’échantillon, peut varier de 0,1 ml à
5 ml selon la dimension de la boîte de Petri et le volume de milieu de culture utilisé. Il convient de choisir
la dilution de sorte que le nombre attendu de colonies formées sur les boîtes de 90 mm de diamètre soit
inférieur à 300 et que le nombre de colonies cibles soit supérieur à 10.
Le nombre maximal acceptable de colonies cibles sur une boîte dépend de la méthode spécifique, de
la taille et de la nature des colonies (par exemple, s’étalant) et de la présence de colonies non cibles, et
peut être basé sur les résultats des exercices de vérification. À titre de guide, le nombre maximal de
colonies sur une boîte de 90 mm (à la fois cibles et non cibles) est généralement considéré comme étant
[8]
de 300 (voir l’ISO 7218 ). Les éléments à prendre en compte seront différents pour les boîtes plus
grandes (par exemple, de 140 mm) (voir 9.1.7.2).
9.1.2.3 Ensemencement
Faire fondre la quantité de milieu nécessaire dans l’eau bouillante ou par un autre procédé (par
exemple, stérilisateur vapeur [autoclave] ou four à micro-ondes, à condition que la combinaison durée/
température ait été vérifiée pour la préparation du milieu). Desserrer les bouchons avant le chauffage,
éviter la surchauffe et retirer le milieu dès qu’il est fondu. Maintenir le milieu fondu dans un bain
d’eau thermostaté ou un incubateur à 44 °C à 47 °C pendant un temps suffisant, selon le nombre et le
volume des récipients, pour que le milieu s’équilibre à cette température. Vérifier le temps nécessaire
au maintien en surfusion de la gélose pour toutes les quantités et les volumes utilisés en routine. Ne
pas maintenir un milieu en surfusion thermosensible pendant plus de 4 h (ou le temps maximal indiqué
dans la norme spécifique), car au-delà de cette période, sa qualité pourrait être réduite. Ne pas faire
fondre les milieux gélosés plus d’une fois.
Les bains d’eau thermostatés sont susceptibles de contenir des micro-organismes pouvant constituer
une source de contamination des milieux maintenus en surfusion. Il est conseillé de changer l’eau
régulièrement et de nettoyer les bains pour réduire ce risque au maximum.
Préparer et marquer les boîtes de Petri requises avec l’échantillon et d’autres détails. Effectuer toutes
les dilutions nécessaires conformément à 8.2.1. Après avoir vigoureusement mélangé, répartir les prises
d’essai dans les
...
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