ISO 21567:2004
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Shigella spp.
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Shigella spp.
ISO 21567:2004 specifies a horizontal method for the detection of Shigella species. Subject to certain limitations, ISO 21567:2004 is applicable to products intended for human consumption and the feeding of animals, and environmental samples in the area of food production and food handling.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche de Shigella spp.
L'ISO 21567:2004 spécifie une méthode horizontale pour la recherche d'espèces de Shigella. Sous réserve de certaines limitations, l'ISO 21567:2004 est applicable aux produits pour l'alimentation humaine et animale et aux échantillons environnementaux pour la production et la distribution des aliments.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21567
First edition
2004-11-01
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
detection of Shigella spp.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche de
Shigella spp.
Reference number
ISO 21567:2004(E)
©
ISO 2004
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ISO 21567:2004(E)
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ISO 21567:2004(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle . 2
4.1 General. 2
4.2 Enrichment in selective liquid medium . 2
4.3 Plating out and identification of colonies. 2
4.4 Biochemical and serological confirmation. 2
5 Culture media, reagents and antisera. 2
6 Apparatus and glassware. 3
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample. 3
9 Procedure (see diagram in Annex A) . 4
9.1 Test portion . 4
9.2 Enrichment. 4
9.3 Plating out and colony selection. 4
9.4 Confirmation of colonies. 4
9.5 Serological confirmation. 10
10 Expression of results. 11
11 Test report. 11
Annex A (normative) Diagram of test procedure . 12
Annex B (normative) Composition and preparation of culture media and reagents . 13
Annex C (normative) Description of Shigella colony morphology and colour on selective agars,
for both identification and quality control purposes . 26
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ISO 21567:2004(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21567 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
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ISO 21567:2004(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods which are specific to these products may be used if
absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt should be made to apply this
horizontal method as far as possible.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken of all information then available
regarding the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from
this method in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain groups of products, International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is
hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this International Standard
so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for
well-established technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21567:2004(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the detection of Shigella spp.
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that the whole of
this method is only carried out by skilled personnel using good laboratory practices and preferably
working in a containment facility. Relevant national Health and Safety Regulations relating to this
organism shall be adhered to. Care shall be taken in the disposal of all infectious materials.
1 Scope
This International Standard specifies a horizontal method for the detection of Shigella species.
Subject to the limitations discussed in the Introduction, this International Standard is applicable to
products intended for human consumption and the feeding of animals, and
environmental samples in the area of food production and food handling.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 6887-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 2: Specific rules for the preparation of meat and
meat products
ISO 6887-3, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 3: Specific rules for the preparation of fish and
fishery products
ISO 6887-4, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 4: Specific rules for the preparation of products
other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products
ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological
examinations
ISO 8261, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions
and decimal dilutions for microbiological examination
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance of culture media in the laboratory
ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
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ISO 21567:2004(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Shigella
microorganisms which form colonies fitting the description of these species on the solid selective media used,
and which display the biochemical and serological characteristics described when tests are carried out in
accordance with this International Standard
3.2
detection of Shigella spp.
determination of the presence or absence of these microorganisms in a particular mass of product, when tests
are carried out in accordance with this International Standard
4 Principle
4.1 General
The detection of Shigella necessitates four successive stages (see Annex A).
4.2 Enrichment in selective liquid medium
A test portion is inoculated into Shigella broth containing 0,5 µg/ml of novobiocin, then incubated anaerobically
at (41,5 ± 1) °C for 16 h to 20 h.
4.3 Plating out and identification of colonies
From the enrichment culture obtained, three selective differential media are inoculated: MacConkey agar with
low selectivity; XLD agar with moderate selectivity; and Hektoen enteric agar with the greatest selectivity. All
are incubated at 37 °C for 20 h to 24 h.
4.4 Biochemical and serological confirmation
Typical and suspect colonies are selected from each of the three selective agars. The colonies are purified on
nutrient agar, then biochemical and serological characterizations are carried out using the tests described.
5 Culture media, reagents and antisera
For current laboratory practices, see ISO 7218, ISO/TS 11133-1 and ISO/TS 11133-2 for the preparation,
production and performance testing of culture media.
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized
water or water of equivalent purity.
See Annex B for descriptions of all media, reagents and antisera.
Commercially available dehydrated media should give more consistent results than media prepared from their
component parts in the laboratory. Follow the manufacturer's instructions exactly, as small changes in
preparation can significantly change the performance of selective media. Excessive heating of the selective
agars used in this International Standard by autoclaving, storage and then re-heating for use may result in
loss of selectivity.
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ISO 21567:2004(E)
6 Apparatus and glassware
Disposable equipment is an acceptable alternative to re-usable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) and wet sterilization (autoclave) of equipment.
See ISO 7218.
6.2 Drying cabinet or oven, ventilated by convection, and capable of operating at a set temperature
between 37 °C and 55 °C.
6.3 Incubators, capable of operating at (37 ± 1) °C and (41,5 ± 1) °C.
6.4 Modified atmosphere jars or anaerobic incubation cabinets, and related apparatus to achieve
anaerobic conditions, with a gas composition of < 1 % O and 9 % to 13 % CO . See ISO 7218.
2 2
6.5 Water baths, operating at a set temperature of (47 ± 3) °C, for the cooling of molten media prior to
plate pouring, and another set at (50 ± 1) °C (see B 6.3.2 and B 10.2.2).
6.6 Peristaltic homogenizer (stomacher) or rotary blender.
See ISO 7218.
6.7 Inoculation needles and loops, made of platinum/iridium or nickel/chrome, of diameter approximately
3 mm, or plastic disposable loops and needles of suitable specifications.
6.8 pH-meter, having an accuracy of calibration of ± 0,1 pH unit at 25 °C.
6.9 Flasks and bottles, with closures, of suitable capacities for use in the preparation of enrichment broths
and agars and their storage.
6.10 Measuring cylinders.
6.11 Tubes, 18 mm in diameter and 160 mm in length (plugged or with screw caps), or culture bottles, of
nominal capacity 30 ml and 10 ml, with non-toxic metallic caps with liners or plastic disposable caps.
6.12 Petri dishes, of diameter between 90 mm to 100 mm and diameter 140 mm.
6.13 Glass slides or plates, suitable for use in agglutination tests.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample that is truly representative and has not been damaged or
changed during transit or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. See the specific International
Standard dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard, it is recommended
that the parties concerned come to an agreement on this subject.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the appropriate part of ISO 6887 and/or ISO 8261.
Analysis of samples should begin as quickly as possible, as survival of Shigella is poor.
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9 Procedure (see diagram in Annex A)
9.1 Test portion
See the appropriate part of ISO 6887 and/or ISO 8261 dealing with the procedures for the different types of
products concerned.
9.2 Enrichment
In general add x g or x ml of test portion to 9x ml of Shigella broth containing 0,5 µg/ml of novobiocin (B.1.2) to
make a 1 in 10 dilution of the test sample. Homogenize the test portion in the broth using a peristaltic
homogenizer or rotary blender (6.6). Aseptically adjust the pH to 7,0 ± 0,2, if necessary.
Incubate (6.4) the Shigella broth under anaerobic conditions with caps and closures loose, or with equipment
giving an equivalent effect, so that gas exchange can readily occur without contamination at (41,5 ± 1) °C
(6.3) for 16 h to 20 h.
9.3 Plating out and colony selection
9.3.1 Using the cultures obtained in 9.2, gently mix the contents by hand and allow the larger particles to
settle.
Inoculate, by means of a loop (6.7), the surface of the following selective agars to obtain well-isolated
colonies: MacConkey agar (B.2.1) with low selectivity; XLD agar (B.2.2) with moderate selectivity; and
Hektoen enteric agar (B.2.3) with a greater selectivity.
9.3.2 Incubate (6.3) the plates at (37 ± 1) °C for between 20 h and 24 h.
9.3.3 The appearance of different Shigella species can vary on the same selective agar. See Annex C for a
description of Shigella colonies on the different selective agars used.
Shigella species can form a minority proportion of the total microbial flora when contaminating a food sample
or after enrichment. In these circumstances, the direct streaking of the enrichment broth onto one plate per
selective agar may fail to allow the detection of Shigella colonies. It may therefore be appropriate in some
circumstances (e.g. the investigation of foods implicated in illness) to consider the inoculation of either two
90 mm dishes or one large (140 mm) Petri dish (6.12) to increase the possibility of detection.
The colonies of some Enterobacteriaceae strains are very similar in appearance to those of Shigella. Any
typical or suspect colonies shall be confirmed (see 9.4) as Shigella species or not. Also in some
circumstances (e.g. foods implicated in food poisoning), it may be appropriate to investigate more than
five colonies from a plate to increase confidence in the absence of Shigella in the food sample tested.
Mark any typical or suspect colonies found on each plate.
If no typical colonies are seen and the growth of other microorganisms is weak (particularly on the more
selective agar), re-incubate the plates for a further 24 h. Examine them again for typical Shigella colonies.
Carry out the confirmation procedure described in 9.4.
9.4 Confirmation of colonies
9.4.1 General
Identification kits (currently commercially available) that have been shown by the user to be reliable for the
identification of the different species of Shigella may be used. Follow the manufacturer's instructions precisely.
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For confirmation, sub-culture from each dish of each selective medium (see 9.3) five marked typical or
suspect colonies.
If on one dish there are fewer than five typical or suspect colonies, take all the marked colonies for
confirmation.
Use pure cultures for biochemical and serological confirmation.
9.4.2 Purification of colonies
Streak the selected colonies onto the surface of nutrient agar plates (B.3) so as to gain well-isolated colonies.
Incubate (6.3) the plates at (37 ± 1) °C for 18 h to 24 h.
If the cultures on nutrient agar are mixed, sub-culture the suspect colony onto a further plate of nutrient agar
and incubate at (37 ± 1) °C for 18 h to 24 h to obtain the pure culture.
Shigella sonnei can give two colony types on the same agar plate: a smooth round domed colony (phase 1),
and a flat irregular colony with a mat surface (phase 2).
NOTE It is possible to first test the most characteristic colony from each selective agar plate. If positive, it is not
necessary to test other colonies. If negative, progress through the other selected colonies until either all are negative or a
positive is found.
9.4.3 Biochemical confirmation
9.4.3.1 General
By means of an inoculation needle (6.7), inoculate the media specified in 9.4.3.2 to 9.4.3.9 respectively with
each of the cultures selected in 9.4.1 and record all the results.
9.4.3.2 Triple sugar iron agar (TSI slopes) (B.4)
Stab the butt and streak the agar slope.
Incubate (6.3) at (37 ± 1) °C for (24 ± 3) h.
Interpret the changes in the medium as follows:
Area of slope Appearance Indication
Butt Yellow Glucose fermented: positive
Red or unchanged Glucose not fermented: negative
Black Formation of hydrogen sulfide: positive
Bubbles or cracks Gas formation
Slant surface Yellow Lactose and/or sucrose utilized: positive
Red or unchanged Lactose and sucrose not utilized: negative
Typical Shigella cultures show a yellow butt (acid formation) and no gas bubbles, there is no change in the
colour of the slant (no utilization of lactose or sucrose) and no hydrogen sulfide production (see Table 1).
9.4.3.3 Semi-solid nutrient agar for motility tests (B.5)
Stab the semi-solid nutrient agar with a colony using an inoculation needle (6.7).
Incubate (6.3) tubes at (37 ± 1) °C for 18 h to 24 h.
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ISO 21567:2004(E)
Examine the line of inoculation for spreading growth. Non-motile microorganisms will give a discrete line;
motile strains will give diffuse growth away from the inoculum line.
All Shigella species are non-motile.
9.4.3.4 Urea agar (B.6)
Streak the agar surface.
Incubate (6.3) at (37 ± 1) °C for (24 ± 3) h and examine at intervals.
If urea is hydrolysed, a rose-pink to deep cerise colour develops from the release of ammonia by the
decomposition of the urea with a change in the colour of the pH indicator. There is no change in colour of the
agar with a negative reaction.
Shigella species do not hydrolyse urea.
9.4.3.5 L-Lysine decarboxylase medium (B.7)
Inoculate below the surface of the liquid broth.
Incubate (6.3) at (37 ± 1) °C for (24 ± 3) h.
Turbidity and a purple colour after incubation indicate a positive reaction; yellow indicates a negative result.
Shigella species do not decarboxylate lysine.
NOTE The use of a paraffin overlay in the tubes can help to ensure anaerobic conditions.
9.4.3.6 L-Ornithine decarboxylase medium (B.8)
Inoculate below the surface of the liquid broth.
Incubate (6.3) at (37 ± 1) °C for (24 ± 3) h.
If a purple colour develops, the test is positive; a yellow colour means a negative result.
Shigella sonnei decarboxylates ornithine, but other Shigella species do not (see Table 1).
9.4.3.7 Detection of indole formation (B.9)
Inoculate a tube containing 5 ml of tryptone/tryptophan medium (B.9.1) with the pure culture.
Incubate (6.3) at (37 ± 1) °C for (24 ± 3) h.
After incubation, add 1 ml of Kovac’s reagent (B.9.2).
The formation of a red ring within 10 min indicates indole formation, and a yellow/brown colour indicates a
negative reaction.
Shigella sonnei is negative whilst other strains give variable reactions (see Table 1).
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ISO 21567:2004(E)
9.4.3.8 Detection of ββββ-galactosidase (B.10)
Suspend a loopful of the purified culture from the nutrient agar into 0,25 ml of saline solution (B.12) in a screw
cap bottle or test tube.
Add one drop of toluene and shake to mix well.
Put the tube in an incubator (6.3) set at 37 °C and leave for several minutes.
Add 0,25 ml of the complete reagent and mix.
Replace in the incubator set at 37 °C and leave for (24 ± 3) h, examining at intervals.
A yellow colour indicates the formation of β-galactosidase, which can occur in as little as 20 min.
Shigella sonnei is positive. S. dysenteriae and S. boydii give variable reactions and S. flexneri is negative.
(see Table 1).
9.4.3.9 Utilization of carbohydrates (B.11)
Inoculate each of the prepared carbohydrate broths with a small inoculum.
Incubate (6.3) at (37 ± 1) °C for (24 ± 3) h.
A positive reaction when carbohydrate is utilized gives a change in the pH indicator from purple to yellow.
See Table 1 for the reactions of different Shigella species.
9.4.3.10 Interpretation of biochemical results
Strains within some Shigella species vary in their biochemical reactions (see Table 1), therefore interpretation
based only on biochemical results is difficult and serotyping is essential to establish identity.
Shigella are Gram-negative bacilli, 2 µm to 4 µm by 0,5 µm in size, but often show a tendency to shorter
cocco-bacillary forms and typically do not produce gas from glucose. They are non-motile, do not produce
hydrogen sulfide or decarboxylate lysine, and are lactose negative at 24 h. The other tests described above
give variable reactions or differing reactions according to the species.
Within the genus Shigella, mannitol discriminates Shigella dysenteriae (negative) from other species and
L-ornithine decarboxylase differentiates Shigella sonnei (positive) from other species.
9.4.4 Additional biochemical differentiation
9.4.4.1 General
It is recommended to carry out additional biochemical differentiation tests for a better identification of the
strains: some strains of Escherichia coli and Shigella species are similar.
9.4.4.2 Sodium acetate
Streak the slope of the sodium acetate medium (B.13) with the pure culture (9.4.1). Use a straight wire to
minimize the amount of culture medium transferred with the inoculum, or use an inoculation needle.
Incubate under aerobic conditions for 2 days at (37 ± 1) °C.
Examine the green medium for growth: a positive result is found when the medium turns blue.
Look for the growth, a blue colour indicates a positive reaction.
If no growth occurs, incubate the culture for 2 additional days at (37 ± 1) °C. Examine the medium again.
Shigella species do not grow or grow very poorly. Strains of E. coli give blue colonies with the surrounding
medium blue/green.
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ISO 21567:2004(E)
Table 1 — Biochemical differentiation and confirmation of Shigella species from Escherichia coli,
Hafnia and Providencia species
Test Escherichia Hafnia Providencia Shigella Shigella Shigella Shigella
coli species sonnei flexneri dysenteriae boydii
H S from TSI
− − − − − − −
2
e e
Gas from glucose (TSI) + V +
− −
− −
Motility + V V
− − − −
Urease − − V − − − −
i
L-Lysine decarboxylase V + − − − −
−
L-Ornithine decarboxylase V + − + − − −
d d d
Indole formation + − + −
V (61 %) V (44 %) V (29 %)
f f
β-Galactosidase + V - + (95 %) -
V (50 %) V (11 %)
Acid from:
g g g
Dulcitol V V
− −
V (9,4 %) V (4.5 %) V (6,7 %)
Glucose + + + (100 %) + (100 %) + (100 %) + (100 %)
−
c a a
Lactose V V − −
− − −
b
Mannitol + + V + (99 %) − + (98 %)
+ (94 %)
Melibiose V V V − V V V
c
Raffinose V V − V (53 %) − −
− (2,5 %)
Salicin V V − − − − −
Sorbitol + − − − V (31 %) V (29 %) V (42 %)
c
Sucrose V − V − − −
− (1,5 %)
h
Xylose + + − − − V (57 %)
V (4,0 %)
1)
V: strains variable within or between serovars of a species and, where given, (x %) indicates percentage of positive strains .
a
Some strains of S. flexneri serovar 2a and S. boydii 9 produce acid.
b
Some strains of S. flexneri serovars 4 and 6b do not produce acid.
c
Shigella sonnei produces acid after several days incubation.
d
Some serotypes of Shigella dysenteriae and S. flexneri serovar 6 and S. boydii are negative.
e
Strains of S. flexneri and S. boydii serovars 13 and 14 produce acid and gas.
f
Strains of S. dysenteriae serovar 1 and S. boydii serovar 13 are always positive.
g
Strains of S. dysenteriae serovar 5 and S. flexneri serovar 6 are positive.
h
Strains of S. dysenteriae serovars 8 and 10 are positive and 4 and 6 are variable.
i
Only strains of S. boydii serovar 13 are positive.
1) From Ewing W.H. and Lindberg A.A. Serology of the Shigella. In: Methods in Microbiology (Ed. Bergan T.), Vol. 14,
Academic Press, 1984.
8 © ISO 2004 – All rights reserved
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ISO 21567:2004(E)
9.4.4.3 Christensen's citrate
Inoculate the slant surface of the Christensen’s citrate (B.14) using an inoculation needle with a pure culture
(9.4.1). Minimize as far as possible the quantity of medium transferred with the inoculum.
Incubate aerobically for 2 days at (37 ± 1) °C.
Examine to detect a cream/pink growth. In this case, the medium changes to red.
If no growth occurs, incubate the culture for a further 2 days and examine again.
Shigella species do not grow.
9.4.4.4 Sodium mucate
Inoculate the test broth (B.15.1) and the control broth ( B.15.2) with the pure culture (9.4.1).
Incubate aerobically for 2 days at (37 ± 1) °C.
Examine the medium to detect growth and colour development. A blue colour indicates a negative reaction
and a yellow/straw colour indicates a positive reaction.
If no growth occurs in the test broth, incu
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21567
Première édition
2004-11-01
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche de Shigella
spp.
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for
the detection of Shigella spp.
Numéro de référence
ISO 21567:2004(F)
©
ISO 2004
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ISO 21567:2004(F)
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Généralités. 2
4.2 Enrichissement en milieu sélectif liquide. 2
4.3 Isolement et identification des colonies. 2
4.4 Confirmation biochimique et sérologique. 2
5 Milieux de culture, réactifs et antisérums . 2
6 Appareillage et verrerie . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 4
9 Mode opératoire (voir schéma en Annexe A). 4
9.1 Prise d'essai . 4
9.2 Enrichissement . 4
9.3 Isolement et choix des colonies pour la confirmation. 4
9.4 Confirmation des colonies. 5
9.5 Confirmation sérologique . 10
10 Expression des résultats. 11
11 Rapport d'essai . 12
Annexe A (normative) Diagramme de procédure. 13
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs. 14
Annexe C (normative) Description de la morphologie et de la couleur des colonies des Shigella
sur géloses sélectives à des fins d'identification et de contrôle qualité . 27
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 21567 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
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Introduction
En raison de la grande diversité des produits, il est possible que cette méthode horizontale, dans tout son
détail, ne convienne pas à certains produits. Dans ce cas, il est possible d'employer des méthodes différentes,
spécifiques à ces produits, si cela est absolument nécessaire pour des raisons techniques justifiées.
Néanmoins, il est recommandé que tous les efforts soient faits pour appliquer, chaque fois qu'il sera possible,
cette méthode horizontale.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu compte de tous les renseignements
disponibles à ce moment-là, à savoir dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie et les
raisons pour lesquelles il aura été nécessaire d'y déroger dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation des méthodes d'essai ne peut pas être immédiate et, pour certains groupes de produits, des
Normes internationales et/ou des normes nationales existent peut-être déjà, qui ne concordent pas avec la
méthode horizontale décrite dans le présent document. Il serait souhaitable que lorsque ces normes viendront
en révision, elles soient modifiées de façon à se conformer à la présente Norme internationale si bien que,
finalement, les seules divergences restantes seront celles nécessaires pour des raisons techniques bien
établies.
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NORME INTERNATIONALE ISO 21567:2004(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche de Shigella spp.
AVERTISSEMENT — Afin de protéger la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que cette
méthode ne soit mise en œuvre que par du personnel compétent suivant les bonnes pratiques de
laboratoire et manipulant de préférence dans une enceinte de confinement. La réglementation
nationale en matière de santé et de sécurité concernant ce microorganisme doit être respectée. Des
précautions doivent être prises lors de l'élimination des déchets contaminés.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode horizontale pour la recherche d'espèces de Shigella.
Sous réserve des limitations mentionnées en introduction, la présente Norme internationale est applicable aux
produits pour l'alimentation humaine et animale, et
échantillons environnementaux pour la production et la distribution des aliments.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 6887-2, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 2: Règles spécifiques pour la préparation
des viandes et produits à base de viande
ISO 6887-3, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 3: Règles spécifiques pour la préparation
des produits de la pêche
ISO 6887-4, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 4: Règles spécifiques pour la préparation de
produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche
ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques
ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour
essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
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ISO/TS 11133-2, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Shigella
micro-organismes formant des colonies correspondant à la description de ces espèces sur les milieux
sélectifs solides utilisés, et présentant les caractéristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque les
essais sont effectués selon la méthode décrite dans la présente Norme internationale
3.2
recherche de Shigella spp.
détermination de la présence ou de l'absence de ces micro-organismes dans une masse déterminée de
produit, lorsque les essais sont effectués selon la méthode décrite dans la présente Norme internationale
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche des Shigella nécessite quatre étapes successives (voir Annexe A).
4.2 Enrichissement en milieu sélectif liquide
Ensemencement de la prise d'essai dans un bouillon Shigella contenant 0,5 µg/ml de novobiocine et
incubation en anaérobiose à (41,5 ± 1) °C pendant 16 h à 20 h.
4.3 Isolement et identification des colonies
À partir de la culture d'enrichissement, ensemencement de trois milieux sélectifs différents: une gélose
MacConkey ayant un faible pouvoir sélectif, une gélose XLD ayant un pouvoir de sélection moyen et une
gélose entérique Hektoen ayant un fort pouvoir de sélection. Incubation des trois milieux à 37 °C pendant 20 h
à 24 h.
4.4 Confirmation biochimique et sérologique
Sélection de colonies caractéristiques et de colonies suspectes à partir de ces trois géloses sélectives,
purification de ces colonies sur gélose nutritive et caractérisation biochimique ainsi que sérologique à l'aide
des essais décrits dans la présente Norme internationale.
5 Milieux de culture, réactifs et antisérums
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l'ISO 7218, l'ISO/TS 11133-1 et l'ISO/TS 11133-2 pour la
préparation, la production et les performances des milieux de culture.
Sauf spécification contraire, utiliser exclusivement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau
distillée ou de l'eau déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
Pour la description de tous les milieux, les réactifs et les antisérums, voir l'Annexe B.
Les milieux déshydratés disponibles dans le commerce devraient donner des résultats plus homogènes que
les milieux préparés en laboratoire à partir de leurs composants. Suivre exactement les instructions du
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fabricant; en effet, de petites variations dans la préparation peuvent modifier significativement les
performances des milieux sélectifs. Le chauffage excessif des géloses sélectives dont l'utilisation est spécifiée
dans la présente Norme internationale par chauffage en autoclave, stockage puis rechauffage peut entraîner
une perte de sélectivité.
6 Appareillage et verrerie
L'utilisation de matériels à usage unique est une alternative acceptable à l'utilisation de verrerie réutilisable si
ce matériel répond aux exigences spécifiées.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir ISO 7218) et, notamment, ce qui suit.
6.1 Appareil de stérilisation en chaleur sèche (four) et en chaleur humide (autoclave)
Voir ISO 7218.
6.2 Enceinte de séchage ou four, ventilé(e) par convection et réglable entre 37 °C et 55 °C.
6.3 Étuves, réglable sur (37 ± 1) °C et sur (41,5 ± 1) °C.
6.4 Jarres permettant de créer une atmosphère modifiée ou incubateur anaérobie, et appareillage
associé pour atteindre des conditions anaérobies, avec une teneur en O < 1 % et en CO de 9 % à 13 %.
2 2
Voir ISO 7218.
6.5 Bains d'eau, l'un réglable à (47 ± 3) °C pour refroidir les milieux fondus avant de les répartir en boîtes
de Petri, l'autre réglable à (50 ± 1) °C (voir B 6.3.2 et B.10.2.2).
6.6 Homogénéisateur péristaltique ou rotatif.
Voir ISO 7218.
6.7 Aiguilles et anses à ensemencer, en platine iridié ou en nickel-chrome, de 3 mm de diamètre
approximativement, ou aiguilles et anses en plastiques jetables répondant aux exigences spécifiées.
6.8 pHmètre, réglable à ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
6.9 Fioles et flacons avec bouchons, de capacité appropriée, pour la préparation et la conservation de
bouillons d'enrichissement et de géloses.
6.10 Éprouvettes graduées.
6.11 Tubes, de 18 mm de diamètre et de 160 mm de hauteur (avec bouchons ou capuchons vissés), ou
flacons de culture, de 30 ml et de 10 ml de capacité, avec capuchons vissés métalliques non toxiques ou
capuchons en plastique jetables.
6.12 Boîtes de Petri, de 90 mm à 100 mm de diamètre et de 140 mm de diamètre.
6.13 Lamelles ou plaques en verre, appropriées aux essais d'agglutination.
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ni modifié
lors du transport et de la conservation.
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L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode indiquée dans la présente Norme internationale. Voir la
Norme internationale spécifique à l'échantillonnage du produit concerné. S'il n'existe pas de Norme
internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d'accord à ce sujet.
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon soumis à essai conformément à la partie appropriée de l'ISO 6887 et/ou à l'ISO 8261.
Il est recommandé de commencer l'analyse des échantillons aussitôt que possible, car la durée de survie des
Shigella est faible.
9 Mode opératoire (voir schéma en Annexe A)
9.1 Prise d'essai
Voir la partie appropriée de l'ISO 6887 et/ou l'ISO 8261, qui couvrent les modes opératoires pour les différents
types de produits.
9.2 Enrichissement
En général, ajouter x g ou x ml de prise d'essai à 9x ml de bouillon Shigella contenant 0,5 µg/ml de
novobiocine (B.1.2) afin d'obtenir une dilution de 1 à 10 de l'échantillon. Homogénéiser la prise d'essai dans le
bouillon à l'aide d'un homogénéisateur péristaltique ou rotatif (6.6). Ajuster le pH de manière aseptique pour
qu'il soit égal à 7,0 ± 0,2, si nécessaire.
Incuber le bouillon Shigella dans des conditions anaérobies (6.4), les bouchons (ou matériel permettant un
effet équivalent) étant mis en place de façon à permettre l'échange de gaz sans contamination, à l'étuve (6.3)
à (41,5 ± 1) °C pendant 16 h à 20 h.
9.3 Isolement et choix des colonies pour la confirmation
9.3.1 À l'aide des cultures obtenues en 9.2, mélanger manuellement et délicatement le contenu et laisser
les particules les plus grosses se déposer.
Pour obtenir des colonies bien isolées, ensemencer à l'aide d'une anse (6.7) la surface des géloses sélectives
suivantes: gélose de MacConkey (B.2.1) ayant une faible sélectivité, gélose XLD (B.2.2) ayant une sélectivité
modérée et gélose entérique Hektoen (B.2.3) ayant une sélectivité supérieure.
9.3.2 Incuber (6.3) les plaques à (37 ± 1) °C pendant 20 h à 24 h.
9.3.3 L'apparence des différentes espèces de Shigella peut varier sur une même gélose sélective. Pour la
description des colonies de Shigella sur les différentes géloses sélectives utilisées, voir l'Annexe C.
Les Shigella spp. peuvent constituer une proportion minoritaire de la flore microbienne totale lors de la
contamination d'un échantillon alimentaire ou après enrichissement. Dans ces circonstances, il se peut que
l'ensemencement direct en stries sur une boîte en gélose sélective à partir du bouillon d'enrichissement ne
permette pas la recherche des colonies de Shigella. Dans un tel cas, par exemple lors de l'étude d'aliments
responsables d'une infection d'origine alimentaire, il peut donc être nécessaire pour faciliter la recherche de
considérer l'ensemencement soit de deux boîtes de Petri (6.12) de 90 mm, soit d'une grande boîte de Petri
(140 mm).
Les colonies de certaines souches d'Enterobacteriaceae sont morphologiquement très similaires à celles des
Shigella. Toute colonie caractéristique ou suspecte doit être confirmée (voir 9.4) comme étant une colonie de
Shigella. De même, dans certaines circonstances, par exemple dans le cas d'aliments impliqués dans une
infection d'origine alimentaire, il peut être approprié de considérer plus de cinq colonies provenant d'une boîte
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de Petri pour augmenter la fiabilité du résultat d'essai «absence de Shigella» dans les échantillons
alimentaires soumis à essai.
Marquer toute colonie caractéristique ou suspecte trouvée sur chaque boîte.
Si aucune colonie caractéristique n'apparaît et que la croissance d'autres micro-organismes est faible (en
particulier sur les géloses les plus sélectives) incuber les plaques pendant 24 h supplémentaires. Procéder à
une nouvelle recherche des colonies typiques de Shigella.
Mettre en œuvre le mode opératoire de confirmation décrit en 9.4.
9.4 Confirmation des colonies
9.4.1 Généralités
Il est possible d'utiliser des méthodes d'identification (actuellement disponibles dans le commerce) validées
par l'utilisateur pour l'identification des différentes espèces de Shigella. Suivre scrupuleusement les
instructions du fabricant.
Pour confirmation, repiquer cinq colonies à partir de chaque boîte de milieu sélectif (voir 9.3) marquées
comme étant caractéristiques ou suspectes.
Si, sur l'une des boîtes, il se trouve moins de cinq colonies caractéristiques ou suspectes, utiliser toutes les
colonies marquées pour confirmation.
Utiliser des cultures pures pour la confirmation biochimique et sérologique.
9.4.2 Purification des colonies
Ensemencer en stries les colonies sélectionnées sur la surface des boîtes de gélose nutritive (B.3) de façon à
obtenir des colonies bien isolées.
Incuber (6.3) ces boîtes à (37 ± 1) °C pendant 18 h à 24 h.
Si les cultures sur la gélose nutritive ne sont pas pures, repiquer la colonie suspecte sur une boîte
supplémentaire de gélose nutritive et l'incuber à (37 ± 1) °C pendant 18 h à 24 h pour obtenir une culture pure.
Shigella sonnei est susceptible de donner deux types de colonies sur la même plaque de gélose: une colonie
en forme de dôme rond et lisse (phase 1) et une colonie de forme plate et irrégulière avec une surface matte
(phase 2).
NOTE Il est possible de soumettre en premier à essai la colonie la plus caractéristique de chaque plaque de gélose
sélective. Si le résultat de l'essai est positif, il n'est pas nécessaire de soumettre à essai les autres colonies. Si le résultat
est négatif, soumettre à essai les autres colonies sélectionnées jusqu'à obtenir pour chacune un résultat négatif ou obtenir
un résultat positif.
9.4.3 Confirmation biochimique
9.4.3.1 Généralités
À l'aide d'une aiguille (6.7), ensemencer respectivement les milieux spécifiés en 9.4.3.2 à 9.4.3.9 avec
chacune des cultures sélectionnées en 9.4.1 et noter les résultats.
9.4.3.2 Gélose triple sucres-fer (pente TSI) (B.4)
Ensemencer le culot à l'aide d'une aiguille et ensemencer en stries la pente de gélose.
Incuber (6.3) à (37 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h.
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Interpréter les changements survenant dans le milieu de la façon suivante:
Aire de la pente Apparence Interprétation
Culot
Jaune Glucose fermenté: positif
Rouge ou inchangée Glucose non fermenté: négatif
Noir Formation d'hydrogène sulfuré: positif
Bulles ou craquelures Formation de gaz
Pente Jaune Lactose et/ou sucrose utilisés: positif
Rouge ou inchangée Lactose et sucrose non utilisés: négatif
Les cultures typiques de Shigella sont caractérisées par un culot jaune (formation acide) et l'absence de
bulles de gaz. La couleur de la pente ne change pas (lactose ou sucrose non utilisés) et il n'y a aucune
production d'hydrogène sulfuré (voir Tableau 1).
9.4.3.3 Gélose nutritive semi-solide pour essais de mobilité (B.5)
Ensemencer la gélose nutritive semi-solide avec une colonie à l'aide d'une aiguille (6.7)
Incuber (6.3) ces tubes à (37 ± 1) °C pendant 18 h à 24 h.
Examiner la piqûre d'ensemencement pour vérifier si la culture se développe en s'étalant. Les
micro-organismes immobiles se développent le long de la piqûre tandis que les souches mobiles se
développent en se diffusant à partir de la piqûre d'ensemencement.
Toutes les espèces de Shigella sont immobiles.
9.4.3.4 Gélose à l'urée (B.6)
Ensemencer en stries la surface de la gélose.
Incuber (6.3) à (37 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h en procédant à des examens par intervalles.
Si l'urée est hydrolysée, une couleur rose à cerise foncé se développe du fait de la présence d'ammoniac
suite à la décomposition de l'urée, tandis que la couleur de l'indicateur de pH change. Aucun changement de
couleur de la gélose n'est constaté en cas de réaction négative.
Les Shigella spp. n'hydrolysent pas l'urée.
9.4.3.5 Milieu de décarboxylation de la L-lysine (B.7)
Ensemencer au-dessous de la surface du bouillon.
Incuber (6.3) à (37 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h.
Un trouble et une couleur violette se développant après l'incubation indiquent une réaction positive. Une
couleur jaune indique un résultat négatif.
Les Shigella spp. ne décarboxylent pas la lysine.
NOTE L'utilisation d'une couche de paraffine pour recouvrir les tubes peut permettre d'obtenir de meilleurs conditions
d'anaérobie.
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9.4.3.6 Milieu à la L-ornithine décarboxylase (B.8)
Ensemencer au-dessous de la surface du bouillon.
Incuber (6.3) à (37 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h.
Une couleur violette se développe si l'essai est positif et une couleur jaune si l'essai est négatif.
Les Shigella sonnei décarboxylent l'ornithine, mais pas les autres espèces de Shigella (voir Tableau 1).
9.4.3.7 Recherche de la formation d'indole (B.9)
Ensemencer un tube contenant 5 ml de milieu au tryptone/tryptophane (B.9.1) à partir d'une culture pure.
Incuber (6.3) à (37 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h.
Après incubation, ajouter 1 ml de réactif de Kovacs (B.9.2).
La formation d'un anneau rouge dans les 10 min indique la formation d'indole, et l'apparition d'une couleur
jaune/marron, une réaction négative.
La réaction obtenue avec les Shigella sonnei est négative, tandis que d'autres souches donnent des réactions
variables (voir Tableau 1).
9.4.3.8 Recherche de ββββ-galactosidase (B.10)
Suspendre le contenu d'une anse de culture purifiée issue de la gélose nutritive dans 0,25 ml de solution
saline (B.12) dans un flacon à capuchon vissé ou dans un tube à essai.
Ajouter une goutte de toluène et bien mélanger.
Placer le tube dans une étuve (6.3) à 37 °C et l'y laisser pendant plusieurs minutes.
Ajouter 0,25 ml de réactif complet et mélanger.
Replacer le tube dans l'étuve à 37 °C et l'y laisser pendant (24 ± 3) h en procédant à des examens par
intervalles.
L'apparition d'une couleur jaune indique la formation de β-galactosidase, qui peut intervenir en 20 min.
Les Shigella sonnei donnent un résultat positif. Les S. dysenteriae et les S. boydii donnent des réactions
variables, et les S. flexneri, un résultat négatif (voir Tableau 1).
9.4.3.9 Utilisation de glucides (B.11)
Ensemencer chacun des bouillons contenant un glucide avec un petit inoculum.
Incuber (6.3) à (37 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h.
Quand les glucides sont utilisés, une réaction positive entraîne un changement de couleur de l'indicateur de
pH du violet au jaune.
Pour les réactions des différentes espèces de Shigella, voir Tableau 1.
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9.4.3.10 Interprétation des résultats biochimiques
Les réactions biochimiques des souches de certaines espèces de Shigella varient (voir Tableau 1); il est donc
difficile de se baser sur l'interprétation des résultats biochimiques et la sérotypie est essentielle pour
déterminer l'identité des souches.
Les Shigella sont des bacilles à Gram négatif, de taille 2 µm à 4 µm par 0,5 µm, mais elles se présentent
souvent sous la forme de coccobacilles plus courts et ne produisent en général pas de gaz à partir du glucose.
Elles ne sont pas mobiles, ne produisent pas d'hydrogène sulfuré. Elles ne décarboxylent pas la lysine et sont
lactose négatives à 24 h. Les autres essais ci-dessus donnent des réactions variables ou des réactions qui
diffèrent selon les espèces.
Au sein du genre Shigella, le mannitol permet de distinguer les Shigella dysenteriae (négatives) des autres
espèces et la L-ornithine décarboxylase permet de différencier les Shigella sonnei (positives) des autres
espèces.
9.4.4 Différentiation biochimique complémentaire
9.4.4.1 Généralités
Du fait de la grande similarité entre les Shigella spp. et certaines souches d'Escherichia coli, il est
recommandé de procéder à des essais biochimiques différentiels pour mieux identifier les souches.
9.4.4.2 Acétate de sodium
Ensemencer la pente du milieu à l'acétate de sodium (B.13) à partir de la culture pure (9.4.1). Utiliser un fil
droit pour réduire le plus possible la quantité de milieu de culture transférée avec l'inoculum, ou utiliser une
aiguille d'inoculation.
Incuber en conditions aérobies à (37 ± 1) °C pendant 2 jours.
Examiner la croissance; le résultat est positif quand le milieu vire au bleu.
Si aucune croissance n'apparaît, incuber la culture à (37 ± 1) °C pendant 2 jours de plus. Procéder à un
nouvel examen.
Les Shigella spp. ne se développent pas ou se développent très faiblement. Les
...
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