ISO 10272-1:2017

Microbiology of the food chain - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. - Part 1: Detection method

ISO 10272-1:2017 specifies a horizontal method for the detection by enrichment or direct plating of Campylobacter spp. It is applicable to - products intended for human consumption, - products intended for animal feeding, - environmental samples in the area of food and feed production, handling, and - samples from the primary production stage such as animal faeces, dust, and swabs.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. — Partie 1: Méthode de recherche

L'ISO 10272-1:2017 spécifie une méthode horizontale de recherche par enrichissement ou ensemencement direct de Campylobacter spp. Il s'applique: - aux produits destinés à la consommation humaine; - aux produits destinés à l'alimentation des animaux; - aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention des aliments; et - aux échantillons au stade de la production primaire tels que les matières fécales des animaux, la poussière et les prélèvements de surface.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 27-Jun-2017
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 26-Sep-2022
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Consolidates: ISO 15469:1997 - Spatial distribution of daylight - CIE standard overcast sky and clear sky
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Amended By: ISO 10272-1:2017/Amd 1:2023 - Microbiology of the food chain - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. - Part 1: Detection method - Amendment 1: Inclusion of methods for molecular confirmation and identification of thermotolerant Campylobacter spp., the use of growth supplement in Preston broth and changes in the performance testing of culture media
• Effective Date: 07-Aug-2021
• Revises: ISO 10272-1:2006 - Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. - Part 1: Detection method
• Effective Date: 08-Dec-2012

Overview

ISO 10272-1:2017 - "Microbiology of the food chain - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. - Part 1: Detection method" - specifies a validated, horizontal laboratory method for detection of Campylobacter spp. in food, feed and production environments. The standard covers detection by enrichment or direct plating, and applies to products intended for human consumption, animal feed, environmental samples in food/feed production and handling, and primary production samples (e.g., animal faeces, dust, swabs).

This second edition (2017) updates procedures to improve robustness against background flora (addition of Preston broth option), includes direct plating on mCCDA, and revises confirmation tests (study of aerobic growth at 25 °C and oxidase testing).

Key Topics

• Scope and applicability: Foods, feeds, environmental and primary-production samples relevant to the food chain.
• Detection procedures: Three detection procedures (A, B, C) using enrichment in selective liquid media or direct plating on selective solid media.
• Selective media options: Inclusion of Bolton broth and an alternative (Preston broth) to address resistant background flora; direct plating on mCCDA as an option.
• Isolation and confirmation: Isolation on selective agar followed by confirmation steps - colony selection, morphology and motility examination, oxidase activity, and aerobic growth assessment at 25 °C. Optional species identification includes catalase, hippurate and indoxyl acetate tests.
• Performance and validation: The document defines performance characteristics (sensitivity, specificity, LOD) and includes interlaboratory study results and validation guidance in annexes.
• Quality and safety: References for media preparation and performance testing (ISO 11133) and mandatory laboratory biosafety practices; work must be performed by skilled microbiologists in properly equipped labs.

Applications

• Routine testing in food and feed microbiology laboratories for surveillance, batch release, and outbreak investigation.
• Environmental monitoring in food processing plants and primary production farms (e.g., testing swabs, dust, and faecal material).
• Regulatory compliance and verification testing by public health agencies and third-party auditors.
• Method selection and laboratory accreditation where a harmonized, horizontal Campylobacter detection method is required.

Who should use this standard

• Food and feed microbiology laboratories
• Quality assurance and food safety managers in food production and processing
• Public health and regulatory laboratories
• Laboratory accreditation bodies and method validation specialists

Related standards

• ISO 6887 (sample preparation)
• ISO 7218 (general microbiological requirements)
• ISO 11133 (culture media preparation and testing)
• Other parts of the ISO 10272 series (enumeration methods and guidance)

Keywords: ISO 10272-1:2017, Campylobacter detection, food microbiology, enrichment method, mCCDA, Preston broth, Bolton broth, horizontal method.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10272-1
Second edition
2017-06
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for detection and
enumeration of Campylobacter spp. —
Part 1:
Detection method
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. —
Partie 1: Méthode de recherche
Reference number
©
ISO 2017
© ISO 2017, Published in Switzerland
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written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Enrichment in selective liquid medium . 2
4.2.1 Detection procedure A . 2
4.2.2 Detection procedure B . 2
4.2.3 Detection procedure C . 2
4.3 Isolation on selective solid medium . 3
4.3.1 Detection procedure A . 3
4.3.2 Detection procedure B . 3
4.3.3 Detection procedure C . 3
4.3.4 Detection procedure A, B and C . 3
4.4 Confirmation . 3
5 Culture media and reagents . 3
6 Equipment and consumables . 3
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure. 4
9.1 General . 4
9.2 Test portion and initial suspension . 5
9.2.1 General. 5
9.2.2 Detection procedure A . 5
9.2.3 Detection procedure B . 5
9.2.4 Detection procedure C . 5
9.3 Enrichment . 6
9.3.1 Detection procedure A . 6
9.3.2 Detection procedure B . 6
9.4 Isolation . 6
9.4.1 Detection procedure A . 6
9.4.2 Detection procedure B . 6
9.4.3 Detection procedures A, B and C . 6
9.5 Confirmation of Campylobacter . 6
9.5.1 General. 6
9.5.2 Selection of colonies for confirmation . 7
9.5.3 Examination of morphology and motility . 7
9.5.4 Study of aerobic growth at 25 °C . 7
9.5.5 Detection of oxidase activity . 7
9.5.6 Interpretation . 7
9.6 Identification of Campylobacter species (optional) . 8
9.6.1 General. 8
9.6.2 Detection of catalase activity. 8
9.6.3 Detection of hippurate hydrolysis . 8
9.6.4 Detection of indoxyl acetate hydrolysis . 8
9.6.5 Interpretation . 9
10 Expression of results . 9
11 Performance characteristics of the method . 9
11.1 Interlaboratory study . 9
11.2 Sensitivity . 9
11.3 Specificity . 9
11.4 LOD .
50 9
12 Test report .10
Annex A (normative) Diagram of procedures .11
Annex B (normative) Culture media and reagents .12
Annex C (informative) Method validation studies and performance characteristics .21
Bibliography .24
iv © ISO 2017 – All rights reserved

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www . i so .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN), Technical
Committee CEN/TC 275, Food Analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 10272-1:2006), which has been technically
revised with the following main changes:
— samples from the primary production stage have been added to the scope;
— the detection method was extended to include the option of a second enrichment broth (Preston
broth), primarily to overcome problems with background flora resistant to third generation
ß-lactams (like cefoperazone in Bolton broth);
— the detection method was extended to include the option of direct plating on mCCDA;
— the note on the use of closed containers with reduced headspace as an alternative to incubation in a
microaerobic atmosphere has been deleted;
— the confirmation tests on study of microaerobic growth at 25 °C and aerobic growth at 41,5 °C were
replaced by the study of aerobic growth at 25 °C;
— performance testing for the quality assurance of the culture media has been added to Annex B;
— performance characteristics have been added to Annex C.
A list of all parts in the ISO 10272 series can be found on the ISO website.
Introduction
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO 10272-1:2006
are considered as minor (see ISO 17468).
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate
in every detail for certain products, and for some other products it may be necessary to use different
methods. Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to apply this horizontal
method as far as possible and that deviations from this will only be made if absolutely necessary for
technical reasons.
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed, and the reasons for deviations from this
in the case of particular products. The harmonization of test methods cannot be immediate and, for
certain group of products, International Standards and/or national standards may already exist that do
not comply with this horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed, they will
be changed to comply with this document so that eventually the only remaining departures from this
horizontal method will be those necessary for well-established technical reasons.
vi © ISO 2017 – All rights reserved

INTERNATIONAL STANDARD ISO 10272-1:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
detection and enumeration of Campylobacter spp. —
Part 1:
Detection method
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests
for detecting Campylobacter are only undertaken in properly equipped laboratories, under the
control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials. Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the detection by enrichment or direct plating of
Campylobacter spp. It is applicable to
— products intended for human consumption,
— products intended for animal feeding,
— environmental samples in the area of food and feed production, handling, and
— samples from the primary production stage such as animal faeces, dust, and swabs.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www.e lectropedia. org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www. iso. org/o bp
3.1
Campylobacter
microorganism forming characteristic colonies on solid selective media when incubated in a
microaerobic atmosphere at 41,5 °C, and which possesses the characteristic morphology and motility
and biochemical and growth properties described when the tests are conducted in accordance with
this document
Note 1 to entry: This document targets the thermotolerant Campylobacter species relevant to human health. The
most frequently encountered and relevant to human health thermotolerant species are Campylobacter jejuni and
Campylobacter coli. However, other species have been described (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis
and others).
3.2
detection of Campylobacter
determination of the presence or absence of Campylobacter (3.1) in a defined quantity of product, when
the test is conducted in accordance with this document
4 Principle
4.1 General
The detection of Campylobacter requires three successive stages as specified in Annex A.
Depending on the type of sample and the purpose of the test, three different detection procedures can
be used:
— detection procedure A: Detection of Campylobacter by enrichment, in samples with low numbers
of campylobacters and low level of background microflora and/or with stressed campylobacters;
— detection procedure B: Detection of Campylobacter by enrichment, in samples with low numbers
of campylobacters and high level of background microflora;
— detection procedure C: Detection of Campylobacter by direct plating, in samples with high numbers
of campylobacters.
4.2 Enrichment in selective liquid medium
4.2.1 Detection procedure A
The test portion is added to the liquid enrichment medium (Bolton broth).
It is incubated in a microaerobic atmosphere at 37 °C for 4 h to 6 h and then at 41,5 °C for 44 h.
4.2.2 Detection procedure B
The test portion is added to the liquid enrichment medium (Preston broth).
It is incubated in a microaerobic atmosphere at 41,5 °C for 24 h.
4.2.3 Detection procedure C
Enrichment technique is not used.
2 © ISO 2017 – All rights reserved

4.3 Isolation on selective solid medium
4.3.1 Detection procedure A
From the enrichment culture obtained in 4.2, two selective solid media are inoculated:
— modified Charcoal Cefoperozone Deoxycholate agar (mCCD agar);
— any other solid selective Campylobacter medium using different selective principles from those in
mCCD agar.
4.3.2 Detection procedure B
From the enrichment culture obtained in 4.2, the selective mCCD agar is inoculated.
4.3.3 Detection procedure C
The test portion is plated directly or after suspending in an appropriate amount of liquid onto the
selective mCCD agar.
4.3.4 Detection procedure A, B and C
The selective solid media are incubated at 41,5 °C in a microaerobic atmosphere and examined after
44 h to detect the presence of suspect Campylobacter colonies.
4.4 Confirmation
The suspect Campylobacter colonies are examined for morphology and motility using a microscope
and sub-cultured on a non-selective blood agar, and then confirmed by detection of oxidase activity
and an aerobic growth test at 25 °C. Optionally, the Campylobacter species are identified by specific
biochemical tests and/or molecular methods.
5 Culture media and reagents
For current laboratory practice, see ISO 7218 and ISO 11133.
Composition of culture media and reagents and their preparation are described in Annex B.
For performance testing of culture media, see Annex B.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Incubators, capable of operating at 25 °C ± 1 °C, 37 °C ± 1 °C and 41,5 °C ± 1 °C.
6.2 Water bath, capable of operating at 37 °C ± 1 °C.
6.3 Sterile loops, of 10 µl volume and of 1 µl volume, and inoculation needle or wire.
A nickel/chromium loop is not suitable for use in the oxidase test (see 9.5.5).
6.4 Microscope, preferably with phase contrast (for observing the characteristic morphology and
motility of Campylobacter).
6.5 Apparatus suitable for achieving a microaerobic atmosphere, with oxygen content of
5 % ± 2 %, carbon dioxide 10 % ± 3 %, optional hydrogen ≤10 %, with the balance nitrogen.
The appropriate microaerobic atmosphere can be obtained using gastight jars and gas-generating kits,
following precisely the manufacturer’s instructions. Alternatively, the jar or incubator may be filled
with an appropriate gas mixture prior to incubation.
6.6 Sterile Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm, preferably with vents to facilitate
microaerobic incubation.
6.7 Refrigerators, capable of operating at 3 °C ± 2 °C and at 5 °C ± 3 °C.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. See the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing with the
sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an agreement
on this subject.
A recommended sampling method is given in ISO/TS 17728 for food and animal feed, in ISO 13307 for
sampling at the primary production stage, in ISO 17604 for sampling of carcasses, and in ISO 18593 for
sampling of surfaces.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative and the sample should not
have been damaged or changed during transport or storage.
Since Campylobacter is very sensitive to freezing but survives best at low temperatures, samples to be
tested should not be frozen but stored at 3 °C (6.7) and subjected to analysis as rapidly as possible. Also
take care to prevent the samples from drying.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International
Standard dealing with the product concerned: see ISO 6887 (all parts). If there is no specific
International Standard, it is recommended that the parties concerned come to an agreement on this
subject.
9 Procedure
9.1 General
Depending on the type of sample and the purpose of the test, one or more of three different detection
procedures is/are used:
— detection procedure A: Detection of Campylobacter by enrichment, in samples with low numbers
of campylobacters and low level of background microflora and/or with stressed campylobacters,
e.g. cooked or frozen products;
— detection procedure B: Detection of Campylobacter by enrichment, in samples with low numbers
of campylobacters and high level of background microflora, e.g. raw meats (including poultry) or
raw milk;
— detection procedure C: Detection of Campylobacter by direct plating, in samples with high numbers
of campylobacters, e.g. faeces, poultry caecal contents or raw poultry meat. This can be used in
combination with ISO 10272-2 in order to count numbers of Campylobacter per g, per ml, or per cm
in the test material.
4 © ISO 2017 – All rights reserved

If little information is available concerning the best method for the particular type of sample to be
tested, then use detection procedure C, in parallel with detection procedure(s) A and/or B.
In general, detection procedure B is useful for products (including cooked or frozen) that contain
significant numbers of microflora resistant to third generation ß-lactams like cefoperazone.
Cefoperazone is used in Bolton broth (detection procedure A) as well as in mCCD agar. Preston broth
(detection procedure B) uses different selective principles and is therefore more suitable to suppress
this type of resistant microflora.
9.2 Test portion and initial suspension
9.2.1 General
For preparation of the initial suspension, in the general case, use as diluent the enrichment medium
specified in 9.2.2 or 9.2.3. Pre-warm the enrichment medium to room temperature before use.
In general, an amount of test portion (mass or volume) is mixed with a quantity of enrichment medium
(mass or volume) to yield a tenfold dilution. However, for some types of samples (e.g. boot socks, swabs),
it may be necessary to use another ratio.
This document has been validated for test portions of 10 g (or ml), except for the caecal samples. A
smaller size of test portion may be used, without the need for additional validation/verification,
providing that the same ratio between enrichment broth and test portion is maintained. A larger test
portion than that initially validated may be used, if a validation/verification study has shown that there
are no adverse effects on the detection of Campylobacter.
NOTE Validation can be conducted in accordance with the appropriate documents of ISO 16140 (all parts).
Verification for pooling samples can be conducted in accordance with the protocol described in ISO 6887-1:2017,
Annex D (verification protocol for pooling samples for qualitative tests).
9.2.2 Detection procedure A
In general, for preparing the initial suspension, combine a quantity of 10 g or 10 ml of the test portion
with 90 ml of the enrichment medium Bolton broth (B.2), so as to obtain a 1 in 10 dilution, and
homogenize (see ISO 7218).
9.2.3 Detection procedure B
In general, for preparing the initial suspension, combine a quantity of 10 g or 10 ml of the test portion
with 90 ml of the enrichment medium Preston broth (B.3), so as to obtain a 1 in 10 dilution, and
homogenize (see ISO 7218).
9.2.4 Detection procedure C
9.2.4.1 For caecal or faecal samples, use a loop (6.3) or a sterile swab to bring some of the well-mixed
sample material onto the first half of a mCCD agar plate (B.4). Use another loop to streak out on the
second half of the plate.
9.2.4.2 For all other samples, add an appropriate amount of liquid (e.g. peptone salt solution or Preston
broth), for example, 1 in 2 (volume fraction), mix well, and either streak the plate using a loop (6.3), or
dispense a suitable volume and spread it over the mCCD agar plate (B.4).
NOTE Using a second plating medium (B.5) with selective agents different from those in mCCD agar could
improve Campylobacter detection, especially in the presence of background flora resistant to 3rd generation
ß-lactams like cefoperazone.
9.3 Enrichment
9.3.1 Detection procedure A
Incubate the initial suspension (9.2.2) in a microaerobic atmosphere (6.5) at 37 °C (6.1) for 4 h to 6 h,
then at 41,5 °C (6.1) for 44 h ± 4 h.
9.3.2 Detection procedure B
Incubate the initial suspension (9.2.3) in a microaerobic atmosphere (6.5) at 41,5 °C (6.1) for 24 h ± 2 h.
9.4 Isolation
9.4.1 Detection procedure A
Using the culture obtained in the enrichment medium (9.3.1), inoculate with a sterile 10 µl loop (6.3)
the surface of the first selective isolation medium, mCCD agar (B.4).
Proceed in the same manner with the second Campylobacter selective isolation medium chosen (B.5).
9.4.2 Detection procedure B
Using the culture obtained in the enrichment medium (9.3.2), inoculate with a sterile 10 µl loop (6.3)
the surface of the isolation medium, mCCD agar (B.4).
9.4.3 Detection procedures A, B and C
Incubate the plates (9.2.4, 9.4.1 and 9.4.2) at 41,5 °C (6.1) in a microaerobic atmosphere (6.5).
After 44 h ± 4 h of incubation, examine the plates for typical and/or suspect colonies o
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 10272-1
Deuxième édition
2017-06
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le
dénombrement de Campylobacter spp.
—
Partie 1:
Méthode de recherche
Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection
and enumeration of Campylobacter spp. —
Part 1: Detection method
Numéro de référence
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ISO 2017
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Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Enrichissement en milieu sélectif liquide . 2
4.2.1 Mode opératoire de recherche A . 2
4.2.2 Mode opératoire de recherche B . 2
4.2.3 Mode opératoire de recherche C . 2
4.3 Isolement sur milieu sélectif solide . 3
4.3.1 Mode opératoire de recherche A . 3
4.3.2 Mode opératoire de recherche B . 3
4.3.3 Mode opératoire de recherche C . 3
4.3.4 Modes opératoires de recherche A, B et C. 3
4.4 Confirmation . 3
5 Milieux de culture et réactifs . 3
6 Matériel et consommables . 3
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire. 4
9.1 Généralités . 4
9.2 Prise d’essai et suspension mère. 5
9.2.1 Généralités . 5
9.2.2 Mode opératoire de recherche A . 5
9.2.3 Mode opératoire de recherche B . 5
9.2.4 Mode opératoire de recherche C . 5
9.3 Enrichissement . 6
9.3.1 Mode opératoire de recherche A . 6
9.3.2 Mode opératoire de recherche B . 6
9.4 Isolement . 6
9.4.1 Mode opératoire de recherche A . 6
9.4.2 Mode opératoire de recherche B . 6
9.4.3 Modes opératoires de recherche A, B et C. 6
9.5 Confirmation de Campylobacter . 6
9.5.1 Généralités . 6
9.5.2 Sélection des colonies à confirmer . 7
9.5.3 Examen de la morphologie et de la mobilité . 7
9.5.4 Étude de la croissance aérobie à 25 °C . 7
9.5.5 Recherche de l’activité de l’oxydase . 7
9.5.6 Interprétation . 7
9.6 Identification de l’espèce de Campylobacter (facultative) . 8
9.6.1 Généralités . 8
9.6.2 Recherche de l’activité de la catalase . 8
9.6.3 Recherche de l’hydrolyse de l’hippurate . 8
9.6.4 Recherche de l’hydrolyse de l’acétate d’indoxyle . 8
9.6.5 Interprétation . 9
10 Expression des résultats. 9
11 Caractéristiques de performance de la méthode . 9
11.1 Étude interlaboratoires . 9
11.2 Sensibilité . 9
11.3 Spécificité . 9
11.4 LOD .
50 9
12 Rapport d’essai .10
Annexe A (normative) Représentation schématique des modes opératoires .11
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs .12
Annexe C (informative) Études de validation des méthodes et caractéristiques de performance .21
Bibliographie .24
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ foreword .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires
— Méthodes horizontales du Comité européen de normalisation (CEN), en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’accord de
coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 10272-1:2006), qui a fait l’objet
d’une révision technique. Les modifications suivantes ont été apportées:
— ajout des échantillons provenant de l’étape de production primaire au domaine d’application;
— extension de la méthode de recherche afin d’inclure l’option consistant à utiliser un deuxième
bouillon d’enrichissement (bouillon de Preston), principalement pour résoudre les problèmes de
résistance de la flore annexe aux ß-lactamines de troisième génération (comme la cefopérazone
dans le bouillon de Bolton);
— extension de la méthode de recherche afin d’inclure l’ensemencement direct sur mCCDA;
— suppression de la note relative à l’utilisation de récipients fermés avec espace libre réduit comme
alternative à l’incubation en atmosphère microaérophile;
— remplacement des essais de confirmation de l’étude de la croissance microaérophile à 25 °C et de la
croissance aérobie à 41,5 °C par l’étude de la croissance aérobie à 25 °C;
— ajout à l’Annexe B d’essais de performance relatifs à l’assurance qualité des milieux de culture;
— ajout des caractéristiques de performance à l’Annexe C.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 10272 est disponible sur le site Internet de l’ISO.
Introduction
Les principaux changements énumérés dans l’avant-propos qui ont été apportés au présent document
par rapport à l’ISO 10272-1:2006 sont considérés comme mineurs (voir l’ISO 17468).
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il se peut que la présente méthode horizontale
ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, à certains d’entre eux et que, pour certains autres,
il puisse être nécessaire d’employer d’autres méthodes. Néanmoins, il est à espérer que tous les efforts
seront entrepris dans tous les cas afin d’appliquer, dans la mesure du possible, la présente méthode
horizontale et qu’il n’y aura d’écarts par rapport à celle-ci qu’en cas d’absolue nécessité et pour des
raisons techniques.
Lors du prochain réexamen périodique du présent document, il sera tenu compte de toutes les évolutions
intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure cette méthode horizontale aura
été suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers. L’harmonisation
des méthodes d’essai ne peut être instantanée et, pour certains groupes de produits, des Normes
internationales et/ou nationales ne concordant pas avec la présente méthode horizontale existent
peut-être déjà. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait souhaitable de les aligner
avec les spécifications du présent document et de ne conserver que les seules divergences justifiées
indispensables pour des raisons techniques.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 10272-1:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement de
Campylobacter spp. —
Partie 1:
Méthode de recherche
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel
que les essais de recherche de Campylobacter ne soient effectués que dans des laboratoires
correctement équipés, sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand
soin soit apporté à l’élimination de tous les matériaux incubés. Il convient que les personnes qui
utilisent le présent document connaissent les pratiques classiques de laboratoire. Le présent
document n’a pas pour but de traiter tous les aspects de la sécurité (s’il y en a) qui sont liés à son
utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques d’hygiène et de sécurité appropriées.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale de recherche par enrichissement ou
ensemencement direct de Campylobacter spp. Il s’applique:
— aux produits destinés à la consommation humaine;
— aux produits destinés à l’alimentation des animaux;
— aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention
des aliments; et
— aux échantillons au stade de la production primaire tels que les matières fécales des animaux, la
poussière et les prélèvements de surface.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ ;
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp.
3.1
Campylobacter
microorganismes formant des colonies caractéristiques sur des milieux sélectifs solides lorsqu’ils
sont incubés en atmosphère microaérophile à 41,5 °C et possédant la mobilité et la morphologie
caractéristiques, ainsi que les propriétés biochimiques et de croissance décrites lorsque les essais sont
réalisés conformément au présent document
Note 1 à l’article: Le présent document vise les espèces Campylobacter thermotolérantes pertinentes pour la santé
humaine. Les espèces thermotolérantes le plus souvent rencontrées et les plus pertinentes pour la santé humaine
sont Campylobacter jejuni et Campylobacter coli. D’autres espèces ont toutefois été décrites (Campylobacter lari,
Campylobacter upsaliensis, et autres).
3.2
recherche des Campylobacter
détection ou non-détection de Campylobacter (3.1) dans une quantité déterminée de produit, lorsque
l’essai est réalisé conformément au présent document
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche de Campylobacter exige trois étapes successives telles que spécifiées à l’Annexe A.
En fonction du type d’échantillon et de la finalité de l’essai, trois modes opératoires de recherche
peuvent être utilisés:
— Mode opératoire de recherche A: recherche de Campylobacter par enrichissement, dans des
échantillons contenant de faibles nombres de Campylobacter, peu de flore annexe et/ou des formes
stressées de Campylobacter;
— Mode opératoire de recherche B: recherche de Campylobacter par enrichissement, dans des
échantillons contenant de faibles nombres de Campylobacter et beaucoup de flore annexe;
— Mode opératoire de recherche C: recherche de Campylobacter par ensemencement direct, dans
des échantillons contenant de grands nombres de Campylobacter.
4.2 Enrichissement en milieu sélectif liquide
4.2.1 Mode opératoire de recherche A
Ajout de la prise d’essai au bouillon d’enrichissement de Bolton.
Incubation en atmosphère microaérophile à 37 °C pendant 4 h à 6 h, puis à 41,5 °C pendant 44 h.
4.2.2 Mode opératoire de recherche B
Ajout de la prise d’essai au bouillon d’enrichissement de Preston.
Incubation en atmosphère microaérophile à 41,5 °C pendant 24 h.
4.2.3 Mode opératoire de recherche C
La technique d’enrichissement n’est pas utilisée.
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés

4.3 Isolement sur milieu sélectif solide
4.3.1 Mode opératoire de recherche A
À partir de la culture d’enrichissement obtenue en 4.2, deux milieux sélectifs solides sont ensemencés:
— une gélose modifiée à la céfopérazone, au charbon et au désoxycholate (gélose mCCD);
— un autre milieu sélectif solide pour Campylobacter basé sur des principes de sélection différents de
ceux de la gélose mCCD.
4.3.2 Mode opératoire de recherche B
À partir de la culture d’enrichissement obtenue en 4.2, la gélose sélective mCCD est ensemencée.
4.3.3 Mode opératoire de recherche C
Ensemencement direct ou après suspension dans un volume approprié de liquide de la prise d’essai sur
une gélose mCCD sélective.
4.3.4 Modes opératoires de recherche A, B et C
Incubation des milieux sélectifs solides en atmosphère microaérophile à 41,5 °C et examen au bout
de 44 h afin de détecter la présence de colonies présumées de Campylobacter.
4.4 Confirmation
Examen au microscope de la morphologie et de la mobilité des colonies présumées de Campylobacter,
repiquage de ces colonies sur un milieu non sélectif (gélose au sang), puis confirmation par recherche
de l’activité de l’oxydase et test de croissance aérobie à 25 °C. Identification facultative des espèces de
Campylobacter par des tests biochimiques et/ou des méthodes moléculaires spécifiques.
5 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l’ISO 7218 et l’ISO 11133.
La composition des milieux de culture et des réactifs ainsi que leur préparation sont décrites à
l’Annexe B.
Pour les essais de performance des milieux de culture, voir l’Annexe B.
6 Matériel et consommables
Le matériel jetable est une alternative acceptable à la verrerie réutilisable si ses spécifications sont
appropriées.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et en particulier ce qui suit.
6.1 Étuves, réglables à 25 °C ± 1 °C, 37 °C ± 1 °C et 41,5 °C ± 1 °C.
6.2 Bain d’eau, réglable à 37 °C ± 1 °C.
6.3 Anses stériles, de 10 µl et 1 µl de volume, et aiguille ou fil à ensemencer.
L’anse en nickel-chrome ne convient pas au test de l’oxydase (9.5.5).
6.4 Microscope, de préférence à contraste de phase, pour observer la morphologie et le mouvement
caractéristiques des Campylobacter.
6.5 Appareillage approprié à la culture en atmosphère microaérophile, permettant de maintenir
tout au long de l’incubation une teneur de 5 % ± 2 % en oxygène, de 10 % ± 3 % en dioxyde de carbone,
≤10 % en hydrogène (facultatif) et le complément en azote.
Une atmosphère microaérophile appropriée peut être obtenue en utilisant des jarres étanches aux gaz et
des sachets générateurs de gaz (suivre rigoureusement les instructions du fabricant). Alternativement,
il est possible d’injecter dans la jarre ou l’étuve, avant l’incubation, un mélange gazeux avec les
proportions des différents gaz appropriés.
6.6 Boîtes de Petri stériles, d’un diamètre de 90 mm environ, de préférence dotées d’aérations pour
faciliter l’incubation microaérophile.
6.7 Réfrigérateurs, réglables à 3 °C ± 2 °C et 5 °C ± 3 °C.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Voir la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées se
mettent d’accord à ce sujet.
Une méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO/TS 17728 pour les aliments,
dans l’ISO 13307 pour l’échantillonnage au stade de production primaire, dans l’ISO 17604 pour
l’échantillonnage sur les carcasses et dans l’ISO 18593 pour l’échantillonnage des surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, et il convient que l’échantillon
n’ait pas été endommagé ou altéré lors du transport ou du stockage.
Étant donné que les Campylobacter sont très sensibles à la congélation, mais qu’ils survivent bien à basse
température, il convient de ne pas congeler les échantillons à analyser, mais de les conserver à 3 °C (6.7)
et de les analyser le plus rapidement possible. Par ailleurs, éviter la déshydratation des échantillons.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire, conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné: voir l’ISO 6887 (toutes les parties). En l’absence de
Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à
ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
En fonction du type d’échantillon et de la finalité de l’essai, un ou plusieurs des trois modes opératoires
de recherche est/sont utilisé(s):
— mode opératoire de recherche A: recherche de Campylobacter par enrichissement, dans des
échantillons contenant de faibles nombres de Campylobacter, peu de flore annexe et/ou des formes
stressées de Campylobacter, par exemple dans les produits cuits ou surgelés;
— mode opératoire de recherche B: recherche de Campylobacter par enrichissement, dans des
échantillons contenant de faibles nombres de Campylobacter et beaucoup de flore annexe, par
exemple dans les viandes crues (notamment la volaille) ou le lait cru;
4 © ISO 2017 – Tous droits réservés

— mode opératoire de recherche C: recherche de Campylobacter par ensemencement direct, dans
des échantillons contenant des nombres élevés de Campylobacter, par exemple dans les matières
fécales, le contenu cæcal de volailles ou la viande de volaille crue. Ce mode opératoire peut être
utilisé en association avec la technique décrite dans l’ISO 10272-2 afin de compter le nombre de
Campylobacter par g, par ml ou par cm dans la prise d’essai.
S’il existe peu d’informations quant à la meilleure méthode à utiliser pour le type particulier
d’échantillon à soumettre à essai, utiliser le mode opératoire de recherche C, en parallèle avec les modes
opératoires de recherche A et/ou B.
En général, le mode opératoire B est adapté aux produits (notamment cuits ou surgelés) contenant une
importante microflore résistante aux ß-lactamines de troisième génération, comme la céfopérazone.
La céfopérazone est utilisée dans le bouillon de Bolton (mode opératoire de recherche A) et dans la
gélose mCCD. Le bouillon de Preston (mode opératoire de recherche B) se base sur des principes de
sélection différents et est de ce fait plus adapté pour supprimer ce type de microflore résistante.
9.2 Prise d’essai et suspension mère
9.2.1 Généralités
De façon générale, pour préparer la suspension mère, utiliser comme diluant le milieu d’enrichissement
spécifié en 9.2.2 ou 9.2.3. Préchauffer le milieu d’enrichissement à température ambiante avant
utilisation.
En général, une quantité de la partie d’essai (masse ou volume) est mélangée avec une quantité de
milieu d’enrichissement (masse ou volume) pour obtenir une dilution au 1:10. Cependant, pour certains
types d’échantillons (par exemple les pédi-chiffonnettes ou les écouvillons de prélèvement), il peut être
nécessaire d’utiliser un autre rapport.
Le présent document a été validé pour des prises d’essai de 10 g (ou ml), à l’exception des échantillons
cæcaux. Une prise d’essai plus petite peut être utilisée, sans nécessiter de validation/vérification
supplémentaire, à condition de maintenir un rapport identique entre le bouillon d’enrichissement et
la prise d’essai. Une plus grande prise d’essai que celle validée initialement peut être utilisée, si une
étude de validation/vérification a montré que cela n’entraîne aucun effet indésirable sur la recherche de
Campylobacter.
NOTE La validation peut être effectuée conformément aux documents pertinents de l’ISO 16140 (toutes les
parties). La vérification du regroupement des échantillons peut être effectuée conformément au protocole décrit
dans l’Annexe D de l’ISO 6887-1:2017 (protocole de vérification du regroupement des échantillons pour les essais
qualitatifs).
9.2.2 Mode opératoire de recherche A
En général, pour préparer la suspension mère, mélanger une quantité de 10 g ou 10 ml de la prise d’essai
avec 90 ml du milieu d’enrichissement, à savoir le bouillon de Bolton (B.2), de façon à obtenir une
dilution de 1 pour 10, puis homogénéiser (voir l’ISO 7218).
9.2.3 Mode opératoire de recherche B
En général, pour préparer la suspension mère, mélanger une quantité de 10 g ou 10 ml de la prise d’essai
avec 90 ml du milieu d’enrichissement, à savoir le bouillon de Preston (B.3), de façon à obtenir une
dilution de 1 pour 10, puis homogénéiser (voir l’ISO 7218).
9.2.4 Mode opératoire de recherche C
9.2.4.1 Pour les échantillons cæcaux ou fécaux, utiliser une anse (6.3) ou un écouvillon stérile
afin de placer une partie de la prise d’essai bien mélangée dans la première moitié de la boîte de
gélose mCCD (B.4). Utiliser une autre anse pour procéder à l’ensemencement en stries sur la seconde
moitié de la boîte.
9.2.4.2 Pour tous les autres échantillons, ajouter un volume approprié de liquide (eau peptonnée ou
bouillon de Preston), par exemple selon un rapport de 1 sur 2 (fraction volumique), bien mélanger, puis
ensemencer en stries sur la gélose à l’aide d’une anse (6.3) ou ajouter un volume approprié et l’étendre
sur la boîte de gélose mCCD (B.4).
NOTE L’utilisation d’un second milieu d’ensemencement (B.5) avec des agents sélectifs différents de ceux
de la gélose mCCD pourrait optimiser la recherche de Campylobacter, notamment en présence d’une flore annexe
résistante aux ß-lactamines de 3e génération comme la céfopérazone.
9.3 Enrichissement
9.3.1 Mode opératoire de recherche A
Incuber la suspension mère (9.2.2) en atmosphère microaérophile (6.5) à 37 °C (6.1) pendant 4 h à 6 h,
puis à 41,5 °C (6.1) pendant 44 h ± 4 h.
9.3.2 Mode opératoire de recherche B
Incuber la suspension mère (9.2.3) en atmosphère microaérophile (6.5) à 41,5 °C (6.1) pendant 24 h ± 2 h.
9.4 Isolement
9.4.1 Mode opératoire de recherche A
Utiliser la culture obtenue dans le milieu d’enrichissement (9.3.1) pour ensemencer à l’aide d’une anse
stérile de 10 µl (6.3) la surface du premier milieu d’isolement sélectif, c’est-à-dire la gélose mCCD (B.4).
Procéder de même avec le second milieu d’isolement sélectif choisi (B.5).
9.4.2 Mode opératoire de recherche B
Utiliser la culture obtenue dans le milieu d’enrichissement (9.3.2) pour ensemencer à l’aide d’une anse
stérile de 10 µl (6.3) la surface du milieu d’isolement, c’est-à-dire la gélose mCCD (B.4).
9.4.3 Modes opératoires de recherche A, B et C
Incuber les boîtes (9.2.4, 9.4.1 et 9.4.2) à 41,5 °C (6.1) en atmosphère microaérophile (6.5).
Après 44 h ± 4 h d’incubation, examiner les boîtes afin de rechercher la présence de colonies
caractéristiques et/ou suspectes de Campylobacter.
Sur la gélose mCCD, les colonies caractéristiques sont grisâtres, souvent avec un reflet métallique, plates
et humides, avec une tendance à s’étaler. Les colonies ont tendance à moins s’étaler sur des surfaces de
gélose plus sèches. D’autres formes de colonies peuvent apparaître.
NOTE La reconnaissance des colonies de Campylobacter est, dans une large mesure, une question
d’expérience et leur apparence peut varier quelque peu, non seulement d’une souche à l’autre, mais également
entre deux lots du milieu de culture sélectif utilisé.
9.5 Confirmation de Campylobacter
9.5.1 Généralités
Les Campylobacter s’altérant rapidement à l’air libre, suivre sans tarder le mode opératoire décrit
de 9.5.2 à 9.5.5.
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Pour pouvoir distinguer clairement une réaction de confirmation positive d’une réaction de
confirmation négative, il est utile de vérifier ce point avec des souches de contrôles positif et négatif bien
caractérisées, en utilisant, par exemple, les souches de contrôle appropriées suivantes: Campylobacter
[17]
jejuni WDCM 00005 (contrôle positif) et Escherichia coli WDCM 00013 (contrôle négatif).
Pour remplacer ou bien venir en complément des essais de confirmation et d’identification décrits dans
le présent document, d’autres essais (analyses PCR, méthodes sérologiques, spectrométrie de masse à
temps de vol avec désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice (MALDI-TOF-MS), etc.)
peuvent être utilisés, à condition de vérifier l’applicabilité de cet autre mode opératoire (voir l’ISO 7218).
9.5.2 Sélection des colonies à confirmer
9.5.2.1 Sélectionner au moins une colonie caractéristique ou suspecte de Campylobacter (9.4.3) et
l’isoler puis procéder à une confirmation. Un isolat confirmé par échantillon est suffisant. Si la première
colonie donne un résultat négatif, sélectionnez jusqu’à quatre autres colonies suspectes.
Si nécessaire, conserver les boîtes d’isolement d’origine (9.4.3) de préférence en conditions
microaérophiles à 5 °C (6.7) en vue d’une utilisation pour une confirmation et/ou une identification
ultérieure.
9.5.2.2 Ensemencer en stries chacune des colonies sélectionnées sur une gélose au sang non sélective,
par exemple une gélose au sang Columbia (B.6) de façon à obtenir des colonies bien isolées. Incuber
les boîtes en atmosphère microaérophile (6.5) à 41,5 °C (6.1) pendant 24 h à 48 h. Utiliser les colonies
nouvellement obtenues, bien isolées, pour examiner la morphologie et la mobilité (9.5.3), constater
l’absence de croissance aérobie à 25 °C (9.5.4) et la présence d’une activité de l’oxydase (9.5.5).
NOTE Il est possible d’examiner au préalable la colonie suspecte pour observer une morphologie et une
motilité caractéristiques avant ensemencement en stries sur la gélose au sang.
9.5.3 Examen de la morphologie et de la mobilité
9.5.3.1 Examiner au microscope (6.4) la morphologie et la mobilité d’une colonie nouvellement
obtenue sur gélose au sang (9.5.2.2).
9.5.3.2 Conserver, pour les observations ultérieures, toutes les cultures (9.5.2.2) dans lesquelles se
trouvent des bacilles incurvés, dont le mouvement de déplacement en vrille est caractéristique (9.5.3.1).
9.5.4 Étude de la croissance aérobie à 25 °C
À partir des colonies isolées en 9.5.2.2, ensemencer à l’aide d’une anse (6.3) la surface d’une gélose au
sang non sélective, par exemple une gélose au sang Columbia (B.6).
Incuber la boîte à 25 °C (6.1) en atmosphère aérobie pendant 44 h ± 4 h.
Examiner la boîte afin de s’assurer de l’absence de tout développement de colonies.
9.5.5 Recherche de l’activité de l’oxydase
À l’aide d’une anse (6.3), prélever une partie d’une colonie bien isolée sur la gélose au sang (9.5.2.2) et
la déposer sur un papier filtre imbibé de réactif de l’oxydase (B.7); l’apparition d’une coloration mauve,
violette ou bleu foncé après environ 10 s indique une réaction positive. Si un kit commercial pour la
recherche de l’oxydase est utilisé, suivre les instructions du fabricant.
9.5.6 Interprétation
Les Campylobacter donnent les résultats fournis dans le Tableau 1.
Des Campylobacter sont présents si une colonie au moins présente les caractéristiques.
Tableau 1 — Caractéristiques des Campylobacter
a
Morphologie (9.5.3) Petits bacilles incurvés
a
Mobilité (9.5.3) Mouvement caractéristique de déplacement en vrille
Croissance en conditions aérobies à 25 °C (9.5.4) −
Activité de l’oxydase (9.5.5) +
+ Positif.
–  Négatif.
a
Les cultures plus anciennes peuvent perdre rapidement leur morphologie et leur mobilité caractéristiques, les bacilles
adoptant une forme coccoïde et devenant moins mobiles.
9.6 Identification de l’espèce de Campylobacter (facultative)
9.6.1 Généralités
Parmi les Campylobacter spp. se développant à 41,5 °C, les espèces les plus fréquemment rencontrées sont
Campylobacter jejuni et Campylobacter coli. D’autres espèces ont toutefois été décrites (Campylobacter
lari, Campylobacter upsaliensis, et autres); les caractéristiques fournies dans le Tableau 2 permettent de
les différencier.
9.6.2 Recherche de l’activité de la catalase
Pour chaque colonie sélectionnée en 9.5.2.2, déposer une anse de culture dans une goutte de solution de
peroxyde d’hydrogène (B.8) sur une lame porte-objet propre.
Le test est positif si des bulles apparaissent dans les 30 s.
Confirmer les résultats à l’aide de contrôles positifs et négatifs en utilisant, par exemple, les souches de
contrôle appropriées suivantes: Campylobacter jejuni WDCM 00005 (contrôle positif) et Enterococcus
faecalis WDCM 00087 (contrôle négatif).
9.6.3 Recherche de l’hydrolyse de l’hippurate
Pour chaque colonie sélectionnée en 9.5.2.2, préparer à l’aide d’une anse (6.3) de 10 µl une suspension
avec un inoculum important dans un tube de taille adaptée contenant 0,4 ml d’hippurate de
sodium (B.9.1), en prenant garde de ne pas ajouter de gélose.
Agiter pour homogénéiser complètement et incuber 2 h ± 5 min dans un bain d’eau réglé à 37 °C (6.2)
ou 4 h ± 5 min dans une étuve réglée à 37 °C (6.1).
Ajouter avec précaution 0,2 ml de la solution de ninhydrine (B.9.2) à la surface de la solution d’hippurate
de sodium. Ne pas agiter.
Interpréter après incubation entre 5 et 10 min à 37 °C (6.2 ou 6.1).
Une couleur violet foncé indique une réaction positive.
Une couleur violet pâle ou l’absence de changement de couleur indique une réaction négative.
Confirmer les résultats à l’aide de contrôles positifs et négatifs en utilisant par exemple les souches de
contrôle appropriées suivantes: Campylobacter jejuni WDCM 00005 (contrôle positif) et Campylobacter
coli WDCM 00004 (contrôle négatif).
9.6.4 Recherche de l’hydrolyse de l’acétate d’indoxyle
Déposer une anse de 1 µl bien chargée de colonie (9.5.2.2) sur un disque imprégné d’acétate
d’indoxyle (B.10), puis ajouter une goutte d’eau distillée stérile.
8 © ISO 2017 – Tous droits réservés

Si l’acétate d’indoxyle est hydrolysé, un changement de couleur vers le bleu foncé intervient dans
les 5 min à 10 min. L’absence de changement de couleur indique qu’il n’y a pas eu d’hydrolyse.
Confirmer les résultats à l’aide de contrôles positifs et négatifs en utilisant par exemple les souches de
contrôle appropriées suivantes: Campylobacter jejuni WDCM 00005 (contrôle positif) et Campylobacter
lari WDCM 00204 (contrôle négatif).
Si des disques imprégnés d’acétate d’indoxyle du commerce sont utilisés, suivre les instructions du
fabricant.
9.6.5 Interprétation
Les espèces de Campylobacter présentant une croissance à 41,5 °C peuvent faire l’objet d’un diagnostic
d’espèce d’après le Tableau 2.
Tableau 2 — Caractéristiques des espèces de Campylobacter
Caractéristique C. jejuni C. coli C. lari C. upsaliensis
Activité de la catalase (9.6.2) + + + – ou faible
a
Hydrolyse de l’hippurate (9.6.3) + − − −
Hydrolyse de l’acétate d’indoxyle (9.6.4) + + − +
+ Positif.
–  Négatif.
a
Il existe des souches de C. jejuni présentant un résultat négatif au test de l’hippurate.
10 Expression des résultats
Selon l’interprétation des résultats, indiquer la détection ou la non-détection de Campylobacter dans la
prise d’essai examinée.
11 Caractéristiques de performance de la méthode
11.1 Étude interlaboratoires
Les caractéristiques de performance de la méthode ont été établies dans le cadre d’études
interlaboratoires, afin de déterminer la spécificité, la sensibilité et le LOD de la méthode. Les données
sont résumées à l’Annexe C. Les valeurs dérivées de l’étude interlaboratoires peuvent ne pas être
[13]
applicables aux types d’aliments ou aux souches autres que ceux mentionnés à l’Annexe C .
11.2 Sensibilité
La sensibilité correspond au nombre d’échantillons positifs détectés divisé par le nombre d’échantillons
vrais positifs soumis à essai à un niveau donné de contamination. Les résultats dépendent donc du
niveau de contamination de l’échantillon.
11.3 Spécificité
La spécificité correspond au nombre d’échantillons négatifs détectés divisé par le nombre d’échantillons
vrais négatifs (ou blancs) soumis à essai.
11.4 LOD
Le niveau de détection relatif à 50 % (LOD ) correspond à la concentration (ufc/prise d’essai) pour
laquelle la probabilité de détection est de 50 %.
12 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit indiquer:
— la méthode d’analyse utilisée, avec une référence au présent document, c’est-à-dire l’ISO 10272-1;
— la méthode d’échantillonnage utilisée, si elle est connue;
— la quantité de la prise d’essai et/ou la nature des objets examinés;
— tous les détails opératoires non spécifiés dans le présent document, ou considérés comme facultatifs,
ainsi que les détails sur tout incident éventuel susceptible d’avoir un impact sur le(s) résultat(s)
d’analyse;
— tout écart concernant les milieux ou les conditions d’incubation utilisées;
— tous les renseignements nécessaires à l’identification complète de l’échantillon;
— le(s) résultat(s) d’analyse obtenu(s).
10 © ISO 2017 – Tous droits réservés

Annexe A
(normative)
Représentation schématique des modes opératoires
Figure A.1 — Représentation schématique des modes opératoires de recherche des
Campylobacter dans la chaîne alimentaire
Annexe B
(normative)
Milieux de culture et réactifs
B.1 Généralités
Les spécifications générales de l’ISO 11133 sont applicables à la préparation et aux essais de performance
des milieux de culture décrits dans la présente annexe. Si les milie
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