ISO 10272-2:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique
Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique
ISO 10272-2:2017 specifies a horizontal method for the enumeration of Campylobacter spp. It is applicable to - products intended for human consumption, - products intended for animal feeding, - environmental samples in the area of food and feed production, handling, and - samples from the primary production stage such as animal faeces, dust, and swabs.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. — Partie 2: Technique par comptage des colonies
L'ISO 10272-2:2017 spécifie une méthode horizontale de dénombrement de Campylobacter spp. Il s'applique: - aux produits destinés à la consommation humaine; - aux produits destinés à l'alimentation des animaux; - aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention des aliments; et - aux échantillons au stade de la production primaire tels que les matières fécales des animaux, la poussière et les prélèvements de surface.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10272-2
First edition
2017-06
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for detection and
enumeration of Campylobacter spp. —
Part 2:
Colony-count technique
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. —
Partie 2: Technique par comptage des colonies
Reference number
ISO 10272-2:2017(E)
©
ISO 2017
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ISO 10272-2:2017(E)
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ISO 10272-2:2017(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Preparation of dilutions . 2
4.3 Enumeration . 2
4.4 Confirmation . 2
5 Culture media and reagents . 2
6 Equipment and consumables . 3
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample . 3
9 Procedure. 4
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions . 4
9.2 Inoculation and incubation . 4
9.3 Enumeration of characteristic colonies . 4
9.4 Confirmation of Campylobacter . 4
9.4.1 General. 4
9.4.2 Selection of colonies for confirmation . 5
9.4.3 Examination of morphology and motility . 5
9.4.4 Study of aerobic growth at 25 °C . 5
9.4.5 Detection of oxidase activity . 5
9.4.6 Interpretation . 5
9.5 Identification of Campylobacter species (optional) . 6
9.5.1 General. 6
9.5.2 Detection of catalase activity. 6
9.5.3 Detection of hippurate hydrolysis . 6
9.5.4 Detection of indoxyl acetate hydrolysis . 6
9.5.5 Interpretation . 7
10 Expression of results . 7
11 Performance characteristics of the method . 7
11.1 Interlaboratory study . 7
11.2 Repeatability limit . 7
11.3 Reproducibility limit . 8
12 Test report . 9
Annex A (normative) Diagram of procedure .10
Annex B (normative) Culture media and reagents .11
Annex C (informative) Method validation studies and performance characteristics .16
Bibliography .19
© ISO 2017 – All rights reserved iii
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ISO 10272-2:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www . i so .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN), Technical
Committee CEN/TC 275, Food Analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition cancels and replaces ISO/TS 10272-2:2006, which has been technically revised with
the following main changes:
— samples from the primary production stage have been added to the scope;
— serial dilutions are plated in single instead of in duplicate, to be in line with ISO 7218;
— the confirmation tests on study of microaerobic growth at 25 °C and aerobic growth at 41,5 °C were
replaced by the study of aerobic growth at 25 °C;
— performance testing for the quality assurance of the culture media has been added to Annex B;
— performance characteristics have been added to Annex C.
A list of all parts in the ISO 10272 series can be found on the ISO website.
iv © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 10272-2:2017(E)
Introduction
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO/TS 10272-
2:2006 are considered as minor (see ISO 17468).
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate
in every detail for certain products, and for some other products, it may be necessary to use different
methods. Nevertheless, it is hoped that in all cases, every attempt will be made to apply this horizontal
method as far as possible and that deviations from this will only be made if absolutely necessary for
technical reasons.
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this
in the case of particular products. The harmonization of test methods cannot be immediate and, for
certain group of products, International Standards and/or national standards may already exist that do
not comply with this horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed, they will
be changed to comply with this document, so that eventually, the only remaining departures from this
horizontal method will be those necessary for well-established technical reasons.
© ISO 2017 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10272-2:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
detection and enumeration of Campylobacter spp. —
Part 2:
Colony-count technique
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
enumeration of Campylobacter are only undertaken in properly equipped laboratories, under
the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials. Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice. This
document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its use. It
is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the enumeration of Campylobacter spp. It is applicable to
— products intended for human consumption,
— products intended for animal feeding,
— environmental samples in the area of food and feed production, handling, and
— samples from the primary production stage such as animal faeces, dust, and swabs.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www.e lectropedia. org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www. iso. org/o bp
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ISO 10272-2:2017(E)
3.1
Campylobacter
microorganism forming characteristic colonies on solid selective media when incubated in a
microaerobic atmosphere at 41,5 °C, and which possesses the characteristic morphology and motility
and biochemical and growth properties described when the tests are conducted in accordance with
this document
Note 1 to entry: This document targets the thermotolerant Campylobacter species relevant to human health.
The most frequently encountered and relevant to human health are Campylobacter jejuni and Campylobacter coli.
However, other species have been described (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis and others).
3.2
enumeration of Campylobacter
determination of the number of colony-forming units (cfu) of Campylobacter (3.1) found per gram, per
millilitre, per square centimetre or per sampling device when the test is conducted in accordance with
this document
4 Principle
4.1 General
The enumeration of Campylobacter requires three successive stages as specified in Annex A.
4.2 Preparation of dilutions
For the preparation of decimal dilutions from the test portion, see ISO 6887.
4.3 Enumeration
The solid selective medium modified Charcoal Cefoperozone Deoxycholate agar (mCCD agar) is
inoculated with a specified quantity of the test portion if the product is liquid or of the initial suspension
in the case of other products.
Other plates are prepared under the same conditions, using decimal dilutions of the test portion or of
the initial suspension.
The plates are incubated at 41,5 °C in a microaerobic atmosphere and examined after 44 h to record the
number of suspect Campylobacter colonies.
4.4 Confirmation
The suspect Campylobacter colonies are examined for morphology and motility using a microscope
and sub-cultured on a non-selective blood agar, and then confirmed by detection of oxidase activity
and an aerobic growth test at 25 °C. Optionally, the Campylobacter species are identified by specific
biochemical tests and/or molecular methods.
The number of colony-forming units (cfu) of Campylobacter per unit of the test portion is calculated
from the number of confirmed typical colonies per plate.
5 Culture media and reagents
For current laboratory practice, see ISO 7218 and ISO 11133.
Composition of culture media and reagents and their preparation are described in Annex B.
For performance testing of culture media, see Annex B.
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ISO 10272-2:2017(E)
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Incubators, capable of operating at 25 °C ± 1 °C, 37 °C ± 1 °C and 41,5 °C ± 1 °C.
6.2 Water bath, capable of operating at 37 °C ± 1 °C.
6.3 Sterile loops, of 10 μl volume and of 1 μl volume, and inoculation needle or wire.
A nickel/chromium loop is not suitable for use in the oxidase test (see 9.4.5).
6.4 Microscope, preferably with phase contrast (for observing the characteristic morphology and
motility of Campylobacter).
6.5 Appropriate apparatus for achieving a microaerobic atmosphere with oxygen content of
5 % ± 2 %, carbon dioxide 10 % ± 3 %, optional hydrogen ≤10 %, with the balance nitrogen.
The appropriate microaerobic atmosphere can be obtained using gastight jars and gas-generating kits,
following precisely the manufacturer’s instructions. Alternatively, the jar or incubator may be filled
with an appropriate gas mixture prior to incubation.
6.6 Sterile Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm and (optional) large size (diameter
approximately 140 mm), preferably with vents to facilitate microaerobic incubation.
6.7 Refrigerators, capable of operating at 3 °C ± 2 °C and at 5 °C ± 3 °C.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. See the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing with the
sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an agreement
on this subject.
A recommended sampling method is given in ISO/TS 17728 for food and animal feed, in ISO 13307 for
sampling at the primary production stage, in ISO 17604 for sampling of carcasses, and in ISO 18593 for
sampling of surfaces.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative and the sample should not
have been damaged or changed during transport or storage.
Since Campylobacter is very sensitive to freezing but survives best at low temperatures, samples to be
tested should not be frozen, but stored at 3 °C (6.7) and subjected to analysis as rapidly as possible.
Also, take care to prevent the samples from drying.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International
Standard dealing with the product concerned; see ISO 6887 (all parts). If there is no specific International
Standard, it is recommended that the parties concerned come to an agreement on this subject.
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ISO 10272-2:2017(E)
9 Procedure
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
See ISO 6887 and the specific International Standard dealing with the product concerned.
Prepare a single decimal dilution series from the test portion if the product is liquid or from the initial
suspension in the case of other products.
9.2 Inoculation and incubation
9.2.1 Using a sterile pipette, transfer 0,1 ml of the initial suspension (or sample if liquid) (9.1) to the
mCCD agar plate (B.3). Repeat the procedure using further decimal dilutions if necessary. If only the
initial suspension is used, prepare duplicate plates using an additional agar plate.
When, for certain products, it is necessary to estimate low numbers of Campylobacter, the limit of
enumeration may be lowered by a factor of 10 by examining 1,0 ml of the initial suspension. Distribute
the 1,0 ml of inoculum either on the surface of the agar medium in a large Petri dish (140 mm) or three
regular plates (90 mm). In both cases, prepare duplicates by using two large plates or six regular plates.
9.2.2 Evenly spread the inoculum, as quickly as possible, over the surface of the agar plate, using a
sterile spreader. Avoid touching the sides of the Petri dish with the spreader.
NOTE Drying of the plates is critical to produce countable plates. Each laboratory has to use its own
standardised way to dry the plates in a proper way.
9.2.3 Incubate the plates (9.2.2) at 41,5 °C (6.1) in a microaerobic atmosphere (6.5).
9.3 Enumeration of characteristic colonies
9.3.1 After 44 h ± 4 h of incubation, examine the plates (9.2.3) for typical and/or suspect colonies of
Campylobacter.
Typical colonies are greyish on mCCD agar, often with a metallic sheen, and are flat and moist, with a
tendency to spread. Colonies tend to spread less on drier agar surfaces. Other forms of colonies may occur.
NOTE The recognition of colonies of Campylobacter is to a large extent a matter of experience and their
appearance can vary somewhat, not only from strain to strain, but also from batch to batch of the selective
culture medium used.
9.3.2 Select the plates (9.3.1) containing less than 150 typical or suspect colonies; count these colonies
and record their number as presumptive colonies per dish. Then choose at random five such colonies for
subculturing for the confirmation tests (9.4).
9.4 Confirmation of Campylobacter
9.4.1 General
As Campylobacter rapidly loses culturability in air, follow the procedure described in 9.4.2 to 9.4.5
without delay.
For a clear distinction between positive and negative confirmation reactions, it is helpful to verify this
with well-characterized positive and negative control strains. Examples of suitable control strains are
[10]
Campylobacter jejuni WDCM 00005 (positive control) and Escherichia coli WDCM 00013 (negative
control).
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ISO 10272-2:2017(E)
As an alternative, or in addition, to the confirmation and identification tests described in this document,
other tests (PCR tests, serological methods, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-
flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) analysis, etc.) can be used, providing the suitability of the
alternative procedure is verified (see ISO 7218).
9.4.2 Selection of colonies for confirmation
9.4.2.1 For confirmation, take five presumptive colonies from each dish retained for enumeration
(9.3.2).
9.4.2.2 Streak each of the selected colonies onto a non-selective blood agar plate, e.g. Columbia
blood agar (B.4) in order to allow the development of well-isolated colonies. Incubate the plates in a
microaerobic atmosphere (6.5) at 41,5 °C (6.1) for 24 h to 48 h. Use well-isolated freshly grown colonies
for examination of morphology and motility (9.4.3), absence of aerobic growth at 25 °C (9.4.4) and the
presence of oxidase activity (9.4.5).
NOTE The suspect colony could be previewed for characteristic morphology and motility before streaking
on blood agar.
9.4.3 Examination of morphology and motility
9.4.3.1 Examine a freshly grown colony from each individual plate (9.4.2.2) for morphology and
motility using a microscope (6.4).
9.4.3.2 Retain for further examination all cultures (9.4.2.2) in which curved bacilli with a spiralling
“corkscrew” motility are found (9.4.3.1).
9.4.4 Study of aerobic growth at 25 °C
Using the colonies isolated in 9.4.2.2, inoculate with the aid of a loop (6.3) the surface of a non-selective
blood agar plate, e.g. Columbia blood agar (B.4).
Incubate the plate at 25 °C (6.1) aerobically for 44 h ± 4 h.
Examine the plate for absence of growth of colonies.
9.4.5 Detection of oxidase activity
Using a loop (6.3), take a portion of a well-isolated colony from each individual plate (9.4.2.2) and streak
it onto a filter paper moistened with the oxidase reagent (B.5); the appearance of a mauve, violet or
deep blue colour within 10 s indicates a positive reaction. If a commercially available oxidase test kit is
used, follow the manufacturer’s instructions.
9.4.6 Interpretation
Campylobacter gives results in accordance with Table 1.
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ISO 10272-2:2017(E)
Table 1 — Characteristics of Campylobacter
a
Morphology (9.4.3) Small curved bacilli
a
Motility (9.4.3) Characteristic corkscrew darting
Aerobic growth at 25 °C (9.4.4) −
Oxidase activity (9.4.5) +
+ Positive.
– Negative.
a
Older cultures may rapidly lose their characteristic shape and motility and turn into less motile
coccoid- forms.
9.5 Identification of Campylobacter species (optional)
9.5.1 General
Among the Campylobacter spp. growing at 41,5 °C, the most frequently encountered species
are Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Other species have, however, been described
(Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis and others); the characteristics given in Table 2 permit
their differentiation.
9.5.2 Detection of catalase activity
For each colony selected in 9.4.2.2, deposit a loop of culture into a drop of hydrogen peroxide solution
(B.6) on a clean microscope slide.
The test is positive if bubbles appear within 30 s.
Confirm the results using positive and negative controls. Examples of suitable control strains are
Campylobacter jejuni WDCM 00005 (positive control) and Enterococcus faecalis WDCM 00087 (negative
control).
9.5.3 Detection of hippurate hydrolysis
For each colony selected in 9.4.2.2, use a 10 μl loop (6.3) with a heavy inoculum to prepare a suspension
in a tube of appropriate size containing 0,4 ml of a sodium hippurate solution (B.7.1), taking care not to
incorporate any agar.
Shake in order to mix thoroughly and incubate for 2 h ± 5 min in a water bath at 37 °C (6.2) or 4 h ± 5 min
in an incubator at 37 °C (6.1).
Carefully add 0,2 ml of a ninhydrin solution (B.7.2) on top of the sodium hippurate solution. Do not shake.
Interpret after incubation of 5 min to 10 min at 37 °C (6.2 or 6.1).
A dark violet colour indicates a positive reaction.
A pale violet colour or no colour change indicates a negative reaction.
Confirm the results using positive and negative controls. Examples of suitable control strains are
Campylobacter jejuni WDCM 00005 (positive control) and Campylobacter coli WDCM 00004 (negative
control).
9.5.4 Detection of indoxyl acetate hydrolysis
Place a 1 μl loopful of colony material (9.4.2.2) on an indoxyl acetate disc (B.8) and add a drop of sterile
distilled water.
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ISO 10272-2:2017(E)
If the indoxyl acetate is hydrolysed, a colour change to dark blue occurs within 5 min to 10 min. No
colour change indicates hydrolysis has not taken place.
Confirm the results using positive and negative controls. Examples of suitable control strains are
Campylobacter jejuni WDCM 00005 (positive control) and Campylobacter lari WDCM 00204 (negative
control).
If commercially available indoxyl acetate discs are used, follow the manufacturer’s instructions.
9.5.5 Interpretation
Campylobacter species growing at 41,5 °C may be identified at species level according to Table 2.
Table 2 — Characteristics of Campylobacter species
Characteristic C. jejuni C. coli C. lari C. upsaliensis
Catalase activity (9.5.2) + + + – or weak
a
Hippurate hydrolysis (9.5.3) + – – –
Indoxyl acetate hydrolysis (9.5.4) + + – +
+ Positive.
– Negative.
a
Some hippurate-negative C. jejuni strains have been reported.
10 Expression of results
See ISO 7218. Calculate and report the result as the number of Campylobacter in cfu per gram, per
millilitre, per square
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10272-2
Première édition
2017-06
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le
dénombrement de Campylobacter spp.
—
Partie 2:
Technique par comptage des colonies
Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection
and enumeration of Campylobacter spp. —
Part 2: Colony-count technique
Numéro de référence
ISO 10272-2:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 10272-2:2017(F)
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ISO 10272-2:2017(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Préparation des dilutions . 2
4.3 Dénombrement . 2
4.4 Confirmation . 2
5 Milieux de culture et réactifs . 2
6 Matériel et consommables . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 3
9 Mode opératoire. 4
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 4
9.2 Ensemencement et incubation . 4
9.3 Dénombrement des colonies caractéristiques . 4
9.4 Confirmation de Campylobacter . 4
9.4.1 Généralités . 4
9.4.2 Sélection des colonies à confirmer . 5
9.4.3 Examen de la morphologie et de la mobilité . 5
9.4.4 Étude de la croissance aérobie à 25 °C . 5
9.4.5 Recherche de l’activité de l’oxydase . 5
9.4.6 Interprétation . 5
9.5 Identification de l’espèce de Campylobacter (facultative) . 6
9.5.1 Généralités . 6
9.5.2 Recherche de l’activité de la catalase . 6
9.5.3 Recherche de l’hydrolyse de l’hippurate . 6
9.5.4 Recherche de l’hydrolyse de l’acétate d’indoxyle . 6
9.5.5 Interprétation . 7
10 Expression des résultats. 7
11 Caractéristiques de performance de la méthode . 7
11.1 Étude interlaboratoires . 7
11.2 Limite de répétabilité . 7
11.3 Limite de reproductibilité . 8
12 Rapport d’essai . 9
Annexe A (normative) Représentation schématique du mode opératoire .10
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs .11
Annexe C (informative) Études de validation des méthodes et caractéristiques de performance .16
Bibliographie .19
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ISO 10272-2:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ foreword .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires
— Méthodes horizontales du Comité européen de normalisation (CEN), en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’accord de
coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 10272-2:2006, qui a fait l’objet d’une révision
technique. Les modifications suivantes ont été apportées:
— ajout des échantillons provenant de l’étape de production primaire au domaine d’application;
— ensemencement unique des dilutions en série plutôt qu’en double, pour respecter l’ISO 7218;
— remplacement des essais de confirmation de l’étude de la croissance microaérophile à 25 °C et de la
croissance aérobie à 41,5 °C par l’étude de la croissance aérobie à 25 °C;
— ajout à l’Annexe B d’essais de performance relatifs à l’assurance qualité des milieux de culture;
— ajout des caractéristiques de performance à l’Annexe C.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 10272 est disponible sur le site Internet de l’ISO.
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ISO 10272-2:2017(F)
Introduction
Les principaux changements énumérés dans l’avant-propos qui ont été apportés au présent document
par rapport à l’ISO/TS 10272-2:2006 sont considérés comme mineurs (voir l’ISO 17468).
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il se peut que la présente méthode horizontale
ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, à certains d’entre eux et que, pour certains autres,
il puisse être nécessaire d’employer d’autres méthodes. Néanmoins, il est à espérer que tous les efforts
seront entrepris dans tous les cas afin d’appliquer, dans la mesure du possible, la présente méthode
horizontale et qu’il n’y aura d’écarts par rapport à celle-ci qu’en cas d’absolue nécessité et pour des
raisons techniques.
Lors du prochain réexamen périodique du présent document, il sera tenu compte de toutes les évolutions
intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure cette méthode horizontale aura
été suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers. L’harmonisation
des méthodes d’essai ne peut être instantanée et, pour certains groupes de produits, des Normes
internationales et/ou nationales ne concordant pas avec la présente méthode horizontale existent
peut-être déjà. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait souhaitable de les aligner
avec les spécifications du présent document et de ne conserver que les seules divergences justifiées
indispensables pour des raisons techniques.
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NORME INTERNATIONALE ISO 10272-2:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement de
Campylobacter spp. —
Partie 2:
Technique par comptage des colonies
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de dénombrement de Campylobacter ne soient effectués que dans des laboratoires
correctement équipés, sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand
soin soit apporté à l’élimination de tous les matériaux incubés. Il convient que les personnes qui
utilisent le présent document connaissent les pratiques classiques de laboratoire. Le présent
document n’a pas pour but de traiter tous les aspects de la sécurité (s’il y en a) qui sont liés à son
utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques d’hygiène et de sécurité appropriées.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale de dénombrement de Campylobacter spp. Il
s’applique:
— aux produits destinés à la consommation humaine;
— aux produits destinés à l’alimentation des animaux;
— aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention
des aliments; et
— aux échantillons au stade de la production primaire tels que les matières fécales des animaux, la
poussière et les prélèvements de surface.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ ;
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ISO 10272-2:2017(F)
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp.
3.1
Campylobacter
microorganismes formant des colonies caractéristiques sur des milieux sélectifs solides lorsqu’ils
sont incubés en atmosphère microaérophile à 41,5 °C et possédant la mobilité et la morphologie
caractéristiques, ainsi que les propriétés biochimiques et de croissance décrites lorsque les essais sont
réalisés conformément au présent document
Note 1 à l’article: Le présent document vise les espèces Campylobacter thermotolérantes pertinentes pour
la santé humaine. Les espèces le plus souvent rencontrées et les plus pertinentes pour la santé humaine sont
Campylobacter jejuni et Campylobacter coli. D’autres espèces ont toutefois été décrites (Campylobacter lari,
Campylobacter upsaliensis, et autres).
3.2
dénombrement de Campylobacter
détermination du nombre d’unités formant colonies (ufc) de Campylobacter (3.1) par gramme,
par millilitre, par centimètre carré ou par dispositif d’échantillonnage lorsque l’essai est réalisé
conformément au présent document
4 Principe
4.1 Généralités
Le dénombrement de Campylobacter exige trois étapes successives telles que spécifiées dans l’Annexe A.
4.2 Préparation des dilutions
Pour la préparation des dilutions décimales de la prise d’essai, voir l’ISO 6887.
4.3 Dénombrement
Ensemencement du milieu sélectif solide à base de gélose modifiée à la céfopérazone, au charbon et au
désoxycholate (gélose mCCD) par une quantité spécifiée de prise d’essai si le produit est liquide, ou de la
suspension mère dans le cas d’autres produits.
Préparation d’autres géloses dans les mêmes conditions à partir de dilutions décimales de la prise
d’essai ou de la suspension mère.
Incubation des boîtes en atmosphère microaérophile à 41,5 °C et examen au bout de 44 h afin de
consigner le nombre de colonies présumées de Campylobacter.
4.4 Confirmation
Examen au microscope de la morphologie et de la mobilité des colonies présumées de Campylobacter,
repiquage de ces colonies sur un milieu non sélectif (gélose au sang), puis confirmation par recherche
de l’activité de l’oxydase et test de croissance aérobie à 25 °C. Identification facultative des espèces de
Campylobacter par des tests biochimiques et/ou des méthodes moléculaires spécifiques.
Calcul du nombre d’unités formant colonies (ufc) de Campylobacter par unité de prise d’essai à partir du
nombre confirmé de colonies caractéristiques par boîte.
5 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l’ISO 7218 et l’ISO 11133.
La composition des milieux de culture et des réactifs ainsi que leur préparation sont décrites à
l’Annexe B.
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ISO 10272-2:2017(F)
Pour les essais de performance des milieux de culture, voir l’Annexe B.
6 Matériel et consommables
Le matériel jetable est une alternative acceptable à la verrerie réutilisable si ses spécifications sont
appropriées.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et en particulier ce qui suit.
6.1 Étuves, réglables à 25 °C ± 1 °C, 37 °C ± 1 °C et 41,5 °C ± 1 °C.
6.2 Bain d’eau, réglable à 37 °C ± 1 °C.
6.3 Anses stériles, de 10 µl et 1 µl de volume, et aiguille ou fil à ensemencer.
L’anse en nickel-chrome ne convient pas au test de l’oxydase (voir 9.4.5).
6.4 Microscope, de préférence à contraste de phase, pour observer la morphologie et le mouvement
caractéristiques des Campylobacter.
6.5 Appareillage approprié à la culture en atmosphère microaérophile, permettant de maintenir
tout au long de l’incubation une teneur de 5 % ± 2 % en oxygène, de 10 % ± 3 % en dioxyde de carbone,
≤10 % en hydrogène (facultatif) et le complément en azote.
Une atmosphère microaérophile appropriée peut être obtenue en utilisant des jarres étanches aux gaz et
des sachets générateurs de gaz (suivre rigoureusement les instructions du fabricant). Alternativement,
il est possible d’injecter dans la jarre ou l’étuve, avant l’incubation, un mélange gazeux avec les
proportions des différents gaz appropriés.
6.6 Boîtes de Petri stériles, d’un diamètre de 90 mm environ et (facultatif) de grande taille (diamètre
d’environ 140 mm), de préférence dotées d’aérations pour faciliter l’incubation microaérophile.
6.7 Réfrigérateurs, réglables à 3 °C ± 2 °C et 5 °C ± 3 °C.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Voir la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées se
mettent d’accord à ce sujet.
Une méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO/TS 17728 pour les aliments,
dans l’ISO 13307 pour l’échantillonnage au stade de production primaire, dans l’ISO 17604 pour
l’échantillonnage sur les carcasses et dans l’ISO 18593 pour l’échantillonnage des surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, et il convient que l’échantillon
n’ait pas été endommagé ou altéré lors du transport ou du stockage.
Étant donné que les Campylobacter sont très sensibles à la congélation, mais qu’ils survivent bien à basse
température, il convient de ne pas congeler les échantillons à analyser, mais de les conserver à 3 °C (6.7)
et de les analyser le plus rapidement possible. Par ailleurs, éviter la déshydratation des échantillons.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire, conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné: voir l’ISO 6887 (toutes les parties). En l’absence de
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Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à
ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
Voir l’ISO 6887 et la Norme internationale spécifique du produit concerné.
Préparer une seule série de dilutions décimales à partir de la prise d’essai si le produit est liquide et à
partir de la suspension mère dans le cas des autres produits.
9.2 Ensemencement et incubation
9.2.1 À l’aide d’une pipette stérile, transférer 0,1 ml de suspension mère (ou de l’échantillon si le
produit est liquide) (9.1) sur la gélose mCCD (B.3). Répéter l’opération autant de fois que nécessaire pour
les autres dilutions décimales. Si seule la suspension mère est utilisée, préparer également des géloses
en double en utilisant une boîte de gélose supplémentaire.
Si, pour certains produits, il est nécessaire d’estimer de faibles nombres de Campylobacter, la limite
de dénombrement peut être abaissée d’un facteur de 10 en examinant 1,0 ml de suspension mère.
Répartir 1,0 ml d’inoculum à la surface du milieu gélosé soit dans une grande boîte de Petri (140 mm),
ou dans trois boîtes de gélose de taille standard (90 mm). Dans les deux cas, préparer le tout en double
en utilisant deux grandes boîtes ou six boîtes de taille standard.
9.2.2 À l’aide d’un étaleur stérile, étaler uniformément l’inoculum aussi rapidement que possible à la
surface de la boîte de gélose, sans toucher les parois de la boîte de Petri avec l’étaleur.
NOTE Le séchage des boîtes est critique pour l’obtention de boîtes pouvant être dénombrées. Chaque
laboratoire doit utiliser sa propre méthode normalisée pour obtenir un séchage correct des boîtes.
9.2.3 Incuber les boîtes (9.2.2) à 41,5 °C (6.1) en atmosphère microaérophile (6.5).
9.3 Dénombrement des colonies caractéristiques
9.3.1 Après 44 h ± 4 h d’incubation, examiner les boîtes (9.2.3) afin de rechercher la présence de
colonies caractéristiques et/ou suspectes de Campylobacter.
Sur la gélose mCCD, les colonies caractéristiques sont grisâtres, souvent avec un reflet métallique, plates
et humides, avec une tendance à s’étaler. Les colonies ont tendance à moins s’étaler sur des surfaces de
gélose plus sèches. D’autres formes de colonies peuvent apparaître.
NOTE La reconnaissance des colonies de Campylobacter est, dans une large mesure, une question
d’expérience et leur apparence peut varier quelque peu, non seulement d’une souche à l’autre, mais également
entre deux lots du milieu de culture sélectif utilisé.
9.3.2 Sélectionner les boîtes (9.3.1) contenant moins de 150 colonies caractéristiques ou suspectes;
compter les colonies et consigner le nombre de colonies présumées par boîte. Sélectionner ensuite au
hasard cinq colonies pour les repiquer aux fins des tests de confirmation (9.4).
9.4 Confirmation de Campylobacter
9.4.1 Généralités
Les Campylobacter s’altérant rapidement à l’air libre, suivre sans tarder le mode opératoire décrit
de 9.4.2 à 9.4.5.
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Pour pouvoir distinguer clairement une réaction de confirmation positive d’une réaction de
confirmation négative, il est utile de vérifier ce point avec des souches de contrôles positif et négatif bien
caractérisées, en utilisant, par exemple, les souches de contrôle appropriées suivantes: Campylobacter
[10]
jejuni WDCM 00005 (contrôle positif) et Escherichia coli WDCM 00013 (contrôle négatif).
Pour remplacer ou bien venir en complément des essais de confirmation et d’identification décrits dans
le présent document, d’autres essais (analyses PCR, méthodes sérologiques, spectrométrie de masse à
temps de vol avec désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice (MALDI-TOF-MS), etc.)
peuvent être utilisés, à condition de vérifier l’applicabilité de cet autre mode opératoire (voir l’ISO 7218).
9.4.2 Sélection des colonies à confirmer
9.4.2.1 Pour les tests de confirmation, sélectionner cinq colonies présumées de chaque boîte retenue
pour le dénombrement (9.3.2).
9.4.2.2 Ensemencer en stries chacune des colonies sélectionnées sur une gélose au sang non sélective,
par exemple une gélose au sang Columbia (B.4) de façon à obtenir des colonies bien isolées. Incuber
les boîtes en atmosphère microaérophile (6.5) à 41,5 °C (6.1) pendant 24 h à 48 h. Utiliser les colonies
nouvellement obtenues, bien isolées, pour examiner la morphologie et la mobilité (9.4.3), constater
l’absence de croissance aérobie à 25 °C (9.4.4) et la présence d’une activité de l’oxydase (9.4.5).
NOTE Il est possible d’examiner au préalable la colonie suspecte à la recherche d’une morphologie et d’une
motilité caractéristiques avant ensemencement en stries sur la gélose au sang.
9.4.3 Examen de la morphologie et de la mobilité
9.4.3.1 Examiner au microscope (6.4) la morphologie et la mobilité d’une colonie nouvellement
obtenue sur chacune des boîtes individuelles (9.4.2.2).
9.4.3.2 Conserver, pour les observations ultérieures, toutes les cultures (9.4.2.2) dans lesquelles se
trouvent des bacilles incurvés, dont le mouvement de déplacement en vrille est caractéristique (9.4.3.1).
9.4.4 Étude de la croissance aérobie à 25 °C
À partir des colonies isolées en 9.4.2.2, ensemencer à l’aide d’une anse (6.3) la surface d’une gélose au
sang non sélective, par exemple une gélose au sang Columbia (B.4).
Incuber la boîte à 25 °C (6.1) en atmosphère aérobie pendant 44 h ± 4 h.
Examiner la boîte afin de s’assurer de l’absence de tout développement de colonies.
9.4.5 Recherche de l’activité de l’oxydase
À l’aide d’une anse (6.3), prélever une partie d’une colonie bien isolée sur chacune des boîtes
individuelles (9.4.2.2) et la déposer sur un papier filtre imbibé de réactif de l’oxydase (B.5); l’apparition
d’une coloration mauve, violette ou bleu foncé après environ 10 s indique une réaction positive. Si un kit
commercial pour la recherche de l’oxydase est utilisé, suivre les instructions du fabricant.
9.4.6 Interprétation
Les Campylobacter donnent les résultats fournis dans le Tableau 1.
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ISO 10272-2:2017(F)
Tableau 1 — Caractéristiques des Campylobacter
a
Morphologie (9.4.3) Petits bacilles incurvés
a
Mobilité (9.4.3) Mouvement caractéristique de déplacement en vrille
Croissance en conditions aérobies à 25 °C (9.4.4) −
Activité de l’oxydase (9.4.5) +
+ Positif.
– Négatif.
a
Les cultures plus anciennes peuvent perdre rapidement leur morphologie et leur mobilité caractéristiques, les bacilles
adoptant une forme coccoïde et devenant moins mobiles.
9.5 Identification de l’espèce de Campylobacter (facultative)
9.5.1 Généralités
Parmi les Campylobacter spp. se développant à 41,5 °C, les espèces les plus fréquemment rencontrées sont
Campylobacter jejuni et Campylobacter coli. D’autres espèces ont toutefois été décrites (Campylobacter
lari, Campylobacter upsaliensis, et autres); les caractéristiques fournies par le Tableau 2 permettent de
les différencier.
9.5.2 Recherche de l’activité de la catalase
Pour chaque colonie sélectionnée en 9.4.2.2, déposer une anse de culture dans une goutte de solution de
peroxyde d’hydrogène (B.6) sur une lame porte-objet propre.
Le test est positif
...
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