ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023
(Amendment)Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique — Amendment 1: Inclusion of methods for molecular confirmation and identification of thermotolerant Campylobacter spp. and changes in the performance testing of culture media
Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique — Amendment 1: Inclusion of methods for molecular confirmation and identification of thermotolerant Campylobacter spp. and changes in the performance testing of culture media
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. — Partie 2: Technique par comptage des colonies — Amendment 1: Ajout de méthodes pour la confirmation et l’identification moléculaires de Campylobacter spp. thermotolérants, et modification des essais de performance des milieux de culture
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STANDARD 10272-2
First edition
2017-06
AMENDMENT 1
2023-01
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for detection and
enumeration of Campylobacter spp. —
Part 2:
Colony-count technique
AMENDMENT 1: Inclusion of methods
for molecular confirmation and
identification of thermotolerant
Campylobacter spp. and changes in the
performance testing of culture media
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. —
Partie 2: Technique par comptage des colonies
AMENDEMENT 1: Ajout de méthodes pour la confirmation et
l’identification moléculaires de Campylobacter spp. thermotolérants,
et modification des essais de performance des milieux de culture
Reference number
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Microbiology of the food chain — Horizontal method for
detection and enumeration of Campylobacter spp. —
Part 2:
Colony-count technique
AMENDMENT 1: Inclusion of methods for molecular
confirmation and identification of thermotolerant
Campylobacter spp. and changes in the performance testing of
culture media
3.1
Replace the text with the following:
3.1
Campylobacter
genus of microorganisms of the family Campylobacteraceae, forming characteristic colonies on solid
selective media, such as modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate (mCCD) agar, when incubated
in a microaerobic atmosphere at 41,5 °C and displaying certain characteristics with biochemical
confirmation tests and by microscopy
Note 1 to entry: Microscopy, the biochemical confirmation tests and the characteristics of Campylobacter are
described in 9.4.
Note 2 to entry: This document targets the thermotolerant Campylobacter species relevant to human health.
The most frequently encountered and relevant to human health are Campylobacter jejuni and Campylobacter coli.
However, other species have been described (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis and others).
Note 3 to entry: Campylobacter is usually capable of growth in the selective enrichment media Bolton broth and
Preston broth.
9.4.1
Add the following text after the last paragraph:
NOTE PCR tests for confirmation and species identification are described in Annexes D and E. The results
for the ILS study are described in Annex F.
9.5.1, second sentence
Replace the text with the following:
However, other species have been described (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis and
others); the characteristics given in Table 2 permit their differentiation from Campylobacter jejuni and
Campylobacter coli.
1
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9.5.1
Add the following text as the second paragraph:
Additionally, Annex E describes molecular methods for identification of thermotolerant Campylobacter
species, which can be used as an alternative to the biochemical identification described in 9.5.2 to 9.5.5.
9.5.4, second paragraph
Replace the text with the following:
If the indoxyl acetate is hydrolysed, a colour change to blue occurs within 5 min to 10 min. If there is an
unclear result after 10 min, a better result can be obtained after waiting for another 20 min. No colour
change indicates hydrolysis has not taken place.
9.5.5, Table 2
Replace the table with the following:
b b
Characteristic C. jejuni C. coli C. lari C. upsaliensis
Catalase (9.5.2) + + + – or weak
a
Hydrolysis of hippurate (9.5.3) + – – –
c
Indoxyl acetate (9.5.4) + + – +
Key
+ = positive
– = negative
a
Some hippurate-negative C. jejuni strains have been reported.
b
The same characteristics can appear also for other Campylobacter spp.
c
Indoxyl acetate negative C. upsaliensis strains have been reported.
11.1
Add the following text after the first sentence:
The results have been published, see Reference [12].
Clause B.2
Replace the text with the following:
See the ISO 6887 series.
Clause B.9, Table B.1
Replace the table with the following:
2
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Table B.1 — Performance testing of culture media for Campylobacter
Characteristic
Refer- Method
Control WDCM reactions of
b
Medium Function Incubation ence of Criteria
a
strains numbers target
media control
microorganism
Campylobacter 00156 or
Greyish, flat and
c
jejuni 00005
Blood Quantita- moist, sometimes
Productivity P ≥ 0,5
R
agar tive with metallic
Campylobacter 00004 or
sheen
c
coli 00072
(44 ± 4) h/
(41,5 ± 1) °C
Total or
mCCD
Escherichia 00012 or Qualita- partial No characteristic
agar
microaerobic —
c
coli 00013 tive inhibition colonies
atmosphere
(0 to 1)
Selectivity
Total
Staphylococcus 00032 or Qualita-
— inhibition —
c
aureus 00034 tive
(0)
Campylobacter 00156 or
24 h to 48 h/
d
Columbia jejuni 00005
(41,5 ± 1) °C
Confirma- Qualita- Good
blood or or — —
tion tive growth (2)
microaerobic
agar Campylobacter 00004 or
d
atmosphere
coli 00072
a
WDCM: World Data Centre for Microorganisms. Refer to the reference strain catalogue available at www .wfcc .info for information on
[10]
culture strain numbers and contact details.
b
Growth is categorized as 0: no growth; 1: weak growth; 2: good growth, P = productivity ratio (see ISO 11133).
R
c
Strain free of choice, one of the strains has to be used as a minimum.
d
Strain free of choice, one of the Campylobacter strains has to be used as a minimum.
After Annex C
Add the following as Annexes D, E and F:
3
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Annex D
(informative)
Multiplex real-time PCR assay for confirmation of thermotolerant
Campylobacter spp.
D.1 General
This annex describes a probe-based multiplex real-time PCR for confirmation of thermotolerant
Campylobacter spp. (C. jejuni, C. coli, C. lari).
D.2 Principle
A specific fragment of the 16S rRNA of thermotolerant Campylobacter spp. C. jejuni, C. coli, C. lari is
amplified by multiplex real-time PCR. The PCR product is detected by measuring fluorescence of the
hydrolysed probe.
D.3 Reagents
[13]
For quality of reagents used, see ISO 22174 . Ready-to-use reagents can be commercially available.
The manufacturer’s instructions for use should be considered.
D.3.1 Reagents for nucleic acid extraction
D.3.1.1 NaCl, 0,9 % (mass fraction).
D.3.1.2 PCR grade water.
D.3.1.3 TE-buffer.
D.3.2 Reagents for real-time PCR
D.3.2.1 PCR grade water.
D.3.2.2 PCR buffer solution, 10×.
NOTE 10× means 10-fold, i.e. the concentration of the PCR buffer.
The PCR buffer solution is usually delivered with the DNA polymerase, which may or may not include
MgCl in a concentration specified by the manufacturer. The final MgCl concentration is method
2 2
specific and therefore listed in Table D.2 (see D.5.2).
D.3.2.3 MgCl solution.
2
D.3.2.4 Thermostable Taq DNA polymerase (for hot-start PCR).
D.3.2.5 dNTP solution.
D.3.2.6 Oligonucleotides.
Sequences of the oligonucleotides are listed in Table D.1.
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D.3.2.7 IPC-ntb2 plasmid.
A vector plasmid carrying a 125-bp sequence of the gene rbcMT-T encoding Ribulose-1,5-bisphosphate
[14]
carboxylase/oxygenase N-methyltransferase from Nicotiana tabacum. The plasmid is used as an
1)
internal amplification control.
Table D.1 — Sequences of oligonucleotides
Gene Primer/probe Sequence (5′ — 3′)
Jos-F1 (forward) CCT GCT TAA CAC AAG TTG AGT AGG
16S rRNA Jos-R1 (reverse) TTC CTT AGG TAC CGT CAG AAT TC
a b
Jos-P (probe) FAM - TGT CAT CCT CCA CGC GGC GTT GCT GC-NFQ
IPC-ntb2-fw (forward) ACC ACA ATG CCA GAG TGA CAA C
Internal amplification
IPC-ntb2-re (reverse) TAC CTG GTC TCC AGC TTT CAG TT
control (IAC)
a b
IPC-ntb2-probe (probe) ROX -CAC GCG CAT GAA GTT AGG GGA CCA-NFQ
a
Equivalent reporter dyes and/or quencher dyes may be used for the probes if they can be shown to yield similar
or better results. The alternative combinations FAM-HEX, FAM-TAMRA, FAM-JOE and FAM-Cy5 have been used with
equivalent result in the validation of the method.
b
NFQ: Non-fluorescence quencher (dark quencher).
D.4 Apparatus
Appropriate equipment according to the method and, in particular, the following shall be used.
D.4.1 Equipment used for nucleic acid extraction
D.4.1.1 Microcentrifuge tubes, of capacities of 1,5 ml and 2,0 ml.
D.4.1.2 Thermo block, obtaining a temperature of 95 °C.
D.4.1.3 Pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 µl and 1 000 µl.
D.4.1.4 Centrifuge, for microcentrifuge tubes having a capacity of 1,5 ml and 2,0 ml, e.g.
microcentrifuge, capable of achieving an acceleration of up to 12 000g. In some steps a refrigerated
centrifuge is required.
D.4.2 Equipment used for real-time PCR
D.4.2.1 Pipettes and pipette filter tips, having a capacity between 1 µl and 1 000 µl.
D.4.2.2 Microcentrifuge tubes, having a capacity of 1,5 ml and 2,0 ml.
D.4.2.3 Thin-walled PCR microtubes, 0,2 ml or 0,5 ml reaction tubes, multi-well PCR microplates or
other suitable consumables.
D.4.2.4 Real-time PCR instrument.
1) The plasmid IPC-ntb2 was used as an internal amplification control in the validation study of the PCR system.
This information is given for convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
of the product named. Alternative internal amplification control systems may be used if they can be shown to give
equivalent or better results. If necessary, adapt the amounts of the reagents and the temperature-time programme.
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D.5 Procedure
D.5.1 Nucleic acid extraction
One 1 µl-loop of suspected colonies (see 9.5.2) is suspended in 1 ml of 0,9 % NaCl solution and DNA is
extracted with a thermal lysis step (15 min at 95 °C). After an additional centrifugation step for 3 min
at 10 000g, 5 µl of the supernatant is used as DNA template. If the DNA will be stored, TE-buffer should
be used instead of 0,9 % NaCl. Other methods for DNA extraction can be used if they have been shown
to be suitable. Before addition to the PCR mastermix, the template should be 100-fold diluted in sterile
water.
D.5.2 PCR set-up
The method is described for a total PCR volume of 25 µl per reaction with the reagents as listed in
Table D.2. The PCR can also be carried out in a larger volume if the solutions are adjusted appropriately.
The final concentrations of reagents as outlined in Table D.2 have proven to be suitable.
Table D.2 — Reagents
Reagent Final concentration Volume per sample
µl
Template DNA (1:100 dilution) maximum 250 ng 2,5 µl
a
Taq DNA Polymerase 1 IU as required
b
PCR-buffer (without MgCl ) 1× as required
2
MgCl solution 2,5 mM as required
2
dNTP solution 0,2 mM of each dNTP as required
PCR primers (according to Table D.1) 500 nM each primer as required
PCR probes (according to Table D.1) 100 nM each probe as required
PCR grade water — as required
IPC-ntb2 plasmid 25 copies per reaction as required
Total volume — 25
a
Hot Start Taq DNA Polymerase was used in the validation of the method.
b
If the PCR buffer solution already contains MgCl , the final concentration of MgCl in the reaction mixture is adjusted
2 2
to 2,5 mM.
D.5.3 PCR controls
[13]
In accordance with ISO 22174 the following controls are necessary:
a) Negative PCR control: PCR grade water is used as negative control.
b) Positive PCR control: DNA from C. jejuni, C. coli or C. lari is used as positive control.
c) Amplification control: The system contains an internal amplification control (see D.3.2.7).
D.5.4 Temperature-time programme
The temperature-time programme as outlined in Table D.3 has been used in the validation of the method
using thermal cyclers Applied Biosystem 7500 Fast, Stratagene MX3000P, Biorad CFX 96 and iCycler
2)
iQ5 . The use of other thermal cyclers can make an adaptation necessary. The time for activation/
initial denaturation depends on the polymerase used.
2) Applied Biosystem 7500 Fast, Stratagene MX3000P, Biorad CFX 96 and iCycler iQ5 are examples of suitable
products available commercially from ThermoFisher Scientific, Agilent Technologies and Bio-Rad. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these
products. Equivalent products may be used if they can be shown to give the same results.
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Table D.3 — Temperature-time programme
Steps Temperature-time combination
Activation/initial denaturation 3 min/95 °C
Number of cycles (amplification) 45
15 s/95 °C
Amplification 60 s/60 °C
30 s/72 °C
D.6 Interpretation of the results
The threshold value to determine the cycle of threshold (Cq) shall be defined by the analyst or by the
cycler-specific software. A positive sample generates an amplification plot with at least the exponential
[15]
phase of a typical amplification curve, see ISO 22119 . The amplification curve of these samples
crosses the defined threshold setting after a certain number of cycles. A sample with a fluorescence
signal above the threshold is considered positive. In the validation of the method, all true positive
samples generated Cq values below 38.
D.7 Performance characteristics of the method
D.7.1 General
The method (including inhouse validation data) has been published, see References [16] and [17].
Additionally, the performance characteristics of the method were determined in a method comparison
study conducted in two different laboratories and in an interlaboratory study in accordance with
[18]
ISO 16140-6 , see Reference [19]. The data of the interlaboratory study are summarized in Annex F.
D.7.2 Theoretical evaluation of the method
In silico evaluation was done by performing a sequence similarity search against the GenBank/EMBL/
® 3)
DDBJ database (NCBI Blast search , EMBL database, 22 September 2015). The result of the search
confirmed a 100 % similarity only with the expected target sequences.
NOTE A 100 % similarity only with the expected target sequences does not exclude the presence of false-
positive and/or false-negative results. These are addressed in the original publications and in Table D.4.
D.7.3 Inclusivity and exclusivity
The inclusivity of the method was tested in the method comparison study with 104 C. jejuni, 105 C. coli
and 56 C. lari strains (in total 265 strains of thermotolerant Campylobacter spp.). The strains showed
the expected results in comparison with the reference method (see also Table D.4).
The exclusivity of the method was tested in the method comparison study with 66 non-target
Campylobacter spp., and 76 strains other than Campylobacter spp. (in total 142 strains). The strains
showed the expected results in comparison with the reference method (see also Table D.4).
Table D.4 — Inclusivity and exclusivity
Inclusivity/ Number of strains Inclusivity Inclusivity Exclusivity Exclusivity
exclusivity agreement deviation agreement deviation
Inclusivity 265 265 0 Not applicable Not applicable
Exclusivity 142 Not applicable Not applicable 142 0
®
3) NCBI Blast search is an example of a suitable product freely available under https:// blast .ncbi .nlm .nih
.gov/ Blast .cgi. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if they can be shown to give the same results.
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NOTE Table D.4 shows a comparison of the results of the reference method with the results of the PCR method
described in Annex D. Considering the real identity of the strains, false-positive results were obtained with both
the reference method and the Annex D PCR method for 2 C. upsaliensis, 1 C. peloridis and 1 C. insulaenigrae strains,
but the latter did not grow on the selective media at 41,5 °C. The reference method was not able to distinguish
between the target organisms of the Annex D PCR method (C. jejuni, C. coli and C. lari), and other Campylobacter
spp. able to grow on the selective media at 41,5 °C.
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Annex E
(informative)
PCR methods for molecular confirmation and identification of
thermotolerant Campylobacter spp.
E.1 General
This annex describes both a gel-based multiplex PCR assay and a probe-based multiplex real-time PCR
assay for confirmation and identification of thermotolerant Campylobacter spp.
E.2 Gel-based multiplex PCR assay for confirmation and identification of
thermotolerant Campylobacter spp.
E.2.1 General
This clause describes a method for the amplification and detection of genes specific for different
species of thermotolerant Campylobacter (C. jejuni, C. coli, C. lari, and C. upsaliensis) using agarose gel
electrophoresis.
E.2.2 Principle
Specific DNA fragments of the genes specific for the different Campylobacter spp. are amplified by
multiplex PCR using five primer pairs. The detection of the PCR products is done using agarose gel-
electrophoresis.
E.2.3 Reagents
[13]
For quality of reagents used, see ISO 22174 . Ready-to-use reagents may be commercially available.
The manufacturer’s instructions for use should be considered.
E.2.3.1 Reagents for nucleic acid extraction
E.2.3.1.1 NaCl, 0,9 % (mass fraction).
E.2.3.1.2 TE-buffer.
E.2.3.2 Reagents for PCR
E.2.3.2.1 PCR grade water.
E.2.3.2.2 PCR buffer solution, 10×.
The PCR buffer solution is usually delivered with the DNA polymerase, which may include MgCl in
2
a concentration specified by the manufacturer. The final MgCl concentration is method specific and
2
therefore listed in Table E.2 (see E.2.5.2).
E.2.3.2.3 MgCl solution.
2
E.2.3.2.4 Thermostable Taq DNA polymerase.
E.2.3.2.5 dNTP solution.
E.2.3.2.6 Oligonucleotides.
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Sequences of the oligonucleotides are listed in Table E.1.
Table E.1 — Sequences of oligonucleotides
Species (gene) Primer Sequence (5′ — 3′) Amplicon size
bp
[20]
C. jejuni (hipO) CJF (forward) ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC 323
CJR (reverse) GCC ACA ACA AGT AAA GAA GC
[20]
C. coli (glyA) CCF (forward) GTA AAA CCA AAG CTT ATC GTG 126
CCR (reverse) TCC AGC AAT GTG TGC AAT G
[21]
C. lari (cpn60) JH0015 (forward) TCT GCA AAT TCA GAT GAG AAA A 180
JH0016 (reverse) TTT TTC AGT ATT TGT AAT GAA ATA TGG
C. upsaliensis (glyA) CUF (forward) AAT TGA AAC TCT TGC TAT CC 204
[20]
CUR (reverse) TCA TAC ATT TTA CCC GAG CT
Campylobacter spp. 23SF (forward) TAT ACC GGT AAG GAG TGC TGG AG 650
[20]
(23S rRNA)
23SR (reverse) ATC AAT TAA CCT TCG AGC ACC G
NOTE The system detecting Campylobacter spp. (23S rRNA) can also be used as an internal amplification
control (IAC) for Campylobacter. The method comparison study showed that this system (23S rRNA) also targets
Arcobacter and Helicobacter spp.
E.2.3.3 Reagents for gel electrophoresis
The agarose gel electrophoresis may be carried out with TAE buffer or TBE buffer. Solutions as
described in this method do not usually need to be autoclaved.
E.2.3.3.1 Agarose, suitable for DNA electrophoresis and for the intended size separation of the DNA
fragments.
E.2.3.3.2 Boric acid (H BO ), for electrophoresis with TBE buffer system only.
3 3
E.2.3.3.3 Bromophenol blue (C H Br O SNa) and/or xylene cyanole FF (C H N O S Na).
19 9 4 5 25 27 2 6 2
E.2.3.3.4 DNA molecular mass standard, e.g. a commercial preparation containing DNA fragments
from very high to very low molecular mass (but to be at least 100 bp).
E.2.3.3.5 Glacial acetic acid (CH COOH), for electrophoresis with the TAE buffer system only.
3
E.2.3.3.6 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na -EDTA) (C H N O Na ).
2 10 14 2 8 2
E.2.3.3.7 Ethidium bromide (EtBr) (C H N Br) or other appropriate DNA intercalating dyes.
21 20 3
Take care when using ethidium bromide solution as it is mutagenic/teratogenic. Other intercalating
dyes can be used, but refer to the manufacturer's material safety data sheet.
E.2.3.3.8 Glycerol (C H O ).
3 8 3
E.2.3.3.9 Sodium acetate (C H O Na), for electrophoresis with TAE buffer only.
2 3 2
E.2.3.3.10 Hydrochloric acid, w (HCl) = 37 % (volume fraction).
E.2.3.3.11 Sodium hydroxide (NaOH).
E.2.3.3.12 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) (C H NO ).
4 11 3
E.2.3.3.13 TAE buffer solution (1×), c (Tris) = 0,050 mol/l, c (C H O Na) = 20 mmol/l, c (Na -
2 3 2 2
EDTA) = 0,001 mol/l.
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Adjust the pH to 8,0 with glacial acetic acid or NaOH at 25 °C. It is advisable to prepare the TAE buffer
solution as a concentrated stock solution (maximum 50-fold concentrated). Discard it if a precipitate is
visible. Dilution of the concentrated electrophoresis buffer can be carried out, immediately before its
use, with non-sterile, (mono)-distilled or deionized water.
E.2.3.3.14 TBE buffer solution (0,5×), c (Tris) = 0,055 mol/l, c (boric acid) = 0,055 mol/l,
c (Na EDTA) = 0,001 mol/l.
2
Adjust the pH to 8,0 with HCl or NaOH at 25 °C. It is advisable to prepare the TBE buffer solution as
a concentrated stock solution (maximum 10-fold concentrated). Discard it if precipitation is visible.
Dilution of the concentrated electrophoresis buffer can be carried out, immediately before its use, with
non-sterile, (mono)-distilled or deionized water.
When using TBE take care that it is toxic to reproduction and teratogenic. The TAE buffer is preferable.
E.2.3.3.15 Sample loading buffer solution (5×), c (glycerol) = 50 % (volume fraction), ρ
(bromophenol blue) = 2,5 g/l and/or c (xylene cyanol) = 2,5 g/l, dissolved in electrophoresis
buffer solution.
NOTE Other concentrations of loading buffer solution can also be used.
E.2.4 Apparatus
Appropriate equipment according to the method and, in particular, the following shall be used.
E.2.4.1 Equipment used for thermal lysis
E.2.4.1.1 Microcentrifuge tubes, of capacities of 1,5 ml and 2,0 ml.
E.2.4.1.2 Thermo block, with a temperature capacity up to +95 °C.
E.2.4.1.3 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 µl and 1 000 µl.
E.2.4.1.4 Centrifuge, for microcentrifuge tubes having a capacity of 1,5 ml and 2,0 ml, e.g.
microcentrifuge, capable of achieving an acceleration of up to 12 000g. In some steps a refrigerated
centrifuge is required.
E.2.4.1.5 Mixer, e.g. type vortex.
E.2.4.2 Equipment used for PCR
E.2.4.2.1 Pipettes and pipette filter tips, having a capacity between 1 µl and 1 000 µl.
E.2.4.2.2 Microcentrifuge tubes, having a capacity of 1,5 ml and 2,0 ml.
E.2.4.2.3 Thin-walled PCR microtubes, 0,2 ml or 0,5 ml reaction tubes, multi-well PCR microplates
or other suitable equipment.
E.2.4.2.4 Thermal cycler.
E.2.4.3 Equipment used for detection of the PCR product
E.2.4.3.1 Microwave oven or boiling water bath.
E.2.4.3.2 Horizontal gel system.
E.2.4.3.3 Power supply.
E.2.4.3.4 UV transilluminator or UV light box.
E.2.4.3.5 Gel documentation system.
11
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ISO 10272-2:2017/Amd.1:2023(E)
E.2.5 Procedure
E.2.5.1 Nucleic acid (DNA) extraction
One 1 µl-loop of suspected colonies (see 9.5.2) is suspended in 1 ml of 0,9 % NaCl solution and DNA is
extracted with a thermal lysis step (15 min at 95 °C). After an additional centrifugation step for 3 min
at 10 000g 2,5 µl of the supernatant is used as DNA template. If the DNA will be stored, TE-buffer should
be used instead of 0,9 % NaCl. Other methods for DNA extraction can be used if they have been shown
to be suitable.
E.2.5.2 PCR set-up
The method is described for a total PCR volume of 25 µl per reaction, containing 2,5 µl of template
DNA, with the reagents as listed in Table E.2. The PCR can also be carried out in a larger volume if the
solutions are adjusted accordingly. The final concentrations of reagents as outlined in Table E.2 have
proven to be suitable.
Table E.2 — Reagents
Reagent Final concentration Volume per sample
µl
Template DNA maximum 250 ng 2,5
Taq DNA polymerase 1,25 IU as required
a
PCR-buffer (without MgCl ) 1× as required
2
MgCl solution 2 mM as required
2
dNTP solution 0,2 mM of each as required
PCR primers C. jejuni and C. lari (according 0,5 µM each as required
to Table E.1)
PCR primers C. coli (according to Table E.1) 1 µM each as required
PCR primers C. upsaliensis (according to Table E.1) 2 µM each as required
PCR primers 23S rRNA (according to Table E.1) 0,2 µM each as required
PCR grade water — as required
Total volume — 25
a
If the PCR buffer solution already contains MgCl , the final concentration of MgCl in the reaction mixture is adjusted
2 2
to 2 mM.
E.2.5.3 PCR controls
[13]
In accordance with ISO 22174 the following controls are necessary:
a) Negative PCR control: PCR grade water is used as negative control.
b) Positive PCR control: DNA from Campylobacter spp., positive for all target sequences (C. jejuni, C.
coli, C. lari and C. upsaliensis) is used as positive control.
c) Amplification control: The primer-system for detection of 23S rRNA of Campylobacter genus is used
as internal amplification control.
E.2.5.4 Temperature-time programme
The temperature-time programme as outlined in Table E.3 has been used in the validation of the
®
method using thermal cyclers Eppendorf Mastercycler Gradient, Bio-Rad S1000 and T100, Analytic
12
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ISO 10272-2:2017/Amd.1:2023(E)
4)
Jena Biometra, Applied Biosystems Veriti and Simpli Amp . The use of other thermal cyclers can make
an adaptation necessary. The time for activation/initial denaturation depends on the polymerase used.
Table E.3 — Temperature-time programme
Steps Temperature-time combination
Activation/initial denaturation 3 min/95 °C
30 s/95 °C
Amplification 30 s/59 °C
30 s/72 °C
Number of cycles (amplification) 30
Final exten
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10272-2
Première édition
2017-06
AMENDEMENT 1
2023-01
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le dénombrement
de Campylobacter spp. —
Partie 2:
Technique par comptage des colonies
AMENDEMENT 1: Ajout de méthodes
pour la confirmation et l’identification
moléculaires de Campylobacter spp.
thermotolérants, et modification des
essais de performance des milieux de
culture
Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection
and enumeration of Campylobacter spp. —
Part 2: Colony-count technique
AMENDMENT 1: Inclusion of methods for molecular confirmation and
identification of thermotolerant Campylobacter spp. and changes in
the performance testing of culture media
Numéro de référence
ISO 10272-2:2017/Amd.1:2023(F)
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Publié en Suisse
ii
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
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Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
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engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne
alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 10272 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iii
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ISO 10272-2:2017/Amd.1:2023(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement de
Campylobacter spp. —
Partie 2:
Technique par comptage des colonies
AMENDEMENT 1: Ajout de méthodes pour la confirmation
et l’identification moléculaires de Campylobacter spp.
thermotolérants, et modification des essais de performance des
milieux de culture
3.1
Remplacer le texte par le suivant:
3.1
Campylobacter
genre de micro-organismes appartenant à la famille Campylobacteraceae, formant des colonies
caractéristiques sur un milieu sélectif solide, tel que la gélose modifiée à la céfopérazone, au charbon et
au désoxycholate (mCCD), lorsqu’il est incubé dans une atmosphère microaérobie à 41,5 °C et présentant
certaines caractéristiques avec des essais de confirmation biochimique et de microscopie
Note 1 à l'article: La microscopie, les essais de confirmation biochimique et les caractéristiques de Campylobacter
sont décrits en 9.4.
Note 2 à l'article: Le présent document vise les espèces thermotolérantes du genre Campylobacter d’intérêt en
santé humaine. Les espèces le plus souvent rencontrées et d’intérêt en santé humaine sont Campylobacter jejuni
et Campylobacter coli. Cependant, d’autres espèces ont été décrites (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis,
et autres).
Note 3 à l'article: Le Campylobacter est généralement capable de se développer dans les milieux d’enrichissement
sélectif, à savoir le bouillon de Bolton et le bouillon de Preston.
9.4.1
Ajouter le texte suivant après le dernier alinéa:
NOTE Les essais PCR pour la confirmation et l’identification des espèces sont décrits aux Annexes D et E.
Les résultats de l’étude interlaboratoires sont décrits à l’Annexe F.
9.5.1, deuxième phrase
Remplacer le texte par le suivant:
D’autres espèces ont toutefois été décrites (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis, et autres); les
caractéristiques fournies dans le Tableau 2 permettent de les différencier du Campylobacter jejuni et
Campylobacter coli.
1
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ISO 10272-2:2017/Amd.1:2023(F)
9.5.1
Ajouter le texte suivant en tant que deuxième alinéa:
En outre, l’Annexe E décrit les méthodes moléculaires d’identification d’espèces thermotolérantes du
genre Campylobacter, qui peuvent être utilisées comme alternative à l’identification biochimique décrite
en 9.5.2 à 9.5.5.
9.5.4, deuxième alinéa
Remplacer le texte par le suivant:
Si l’acétate d’indoxyle est hydrolysé, la couleur devient bleue dans les 5 min à 10 min. Si le résultat n’est
pas clair après 10 min, un meilleur résultat peut être obtenu après 20 min d’attente. En l’absence de
changement de couleur, l’hydrolyse n’a pas eu lieu.
9.5.5, Tableau 2
Remplacer le tableau par le suivant:
b b
Caractéristique C. jejuni C. coli C. lari C. upsaliensis
Catalase (9.5.2) + + + – ou faible
a
Hydrolyse de l’hippurate (9.5.3) + – – –
c
Acétate d’indoxyle (9.5.4) + + – +
Légende
+ = positif
– = négatif
a
Il existe des souches de C. jejuni présentant un résultat négatif au test de l’hippurate.
b
Les mêmes caractéristiques peuvent également apparaître pour d’autres Campylobacter spp.
c
Il existe des souches de C. upsaliensis présentant un résultat négatif à l’essai d’acétate d’indoxyle.
11.1
Ajouter le texte suivant après la première phrase:
Les résultats ont été publiés, voir Référence [12].
Article B.2
Remplacer le texte par le suivant:
Voir la série ISO 6887.
Article B.9, Tableau B.1.
Remplacer le tableau par le suivant:
2
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ISO 10272-2:2017/Amd.1:2023(F)
Tableau B.1 — Essais de performance des milieux de culture de Campylobacter
Réactions
Milieux
Souches de Numéros Méthode caractéristiques
b
Milieu Fonction Incubation de réfé- Critères
a
contrôle WDCM de contrôle du micro-orga-
rence
nisme cible
Colonies gri-
Campylobacter 00156 ou
c
sâtres, plates et
jejuni 00005
Gélose Quantita-
Productivité P ≥ 0,5 humides, parfois
R
au sang tive
Campylobacter 00004 ou
avec un reflet
c
coli 00072
métallique
(44 ± 4) h/
(41,5 ± 1) °C
Gélose Inhibition
mCCD Escherichia 00012 ou partielle Aucune colonie
en atmosphère
— Qualitative
c
coli 00013 ou totale caractéristique
microaérobie
(0 à 1)
Sélectivité
Inhibition
Staphylococcus 00032 ou
— Qualitative totale —
c
aureus 00034
(0)
Campylobacter 00156 ou
24 h à 48 h/
d
Gélose au jejuni 00005 Bonne
(41,5 ± 1) °C
Confirma-
sang ou ou — Qualitative crois- —
tion
en atmosphère
Columbia Campylobacter 00004 ou sance (2)
microaérobie d
coli 00072
a
WDCM: World Data Centre for Microorganisms. Pour plus d’informations sur les numéros d’identification des souches de culture et
[10]
pour les coordonnées, se référer au catalogue de souches de référence disponible à l’adresse www .wfcc .info .
b
La croissance est classée en 0: croissance nulle; 1: croissance faible; 2: croissance marquée; P = ratio de productivité (voir
R
l’ISO 11133).
c
Libre choix de la souche, mais au moins l’une des souches doit être utilisée.
d
Libre choix de la souche, mais au moins l’une des souches de Campylobacter doit être utilisée.
Après l’Annexe C
Ajouter ce qui suit comme Annexes D, E et F:
3
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ISO 10272-2:2017/Amd.1:2023(F)
Annexe D
(informative)
PCR multiplex en temps réel pour la confirmation des
Campylobacter spp. thermotolérants
D.1 Généralités
La présente annexe décrit une PCR multiplex en temps réel basée sur l’utilisation de sondes pour la
confirmation des Campylobacter spp. thermotolérants (C. jejuni, C. coli, C. lari).
D.2 Principe
Un fragment spécifique de l’ARNr 16S des Campylobacter spp. thermotolérants C. jejuni, C. coli, C. lari est
amplifié par PCR multiplex en temps réel. Le produit PCR est détecté en mesurant la fluorescence de la
sonde hydrolysée.
D.3 Réactifs
[13]
Pour la qualité des réactifs utilisés, voir l’ISO 22174 . Des réactifs prêts à l’emploi peuvent être
disponibles dans le commerce. Il convient de se conformer aux instructions d’utilisation des fabricants.
D.3.1 Réactifs pour l’extraction de l’acide nucléique
D.3.1.1 NaCl, 0,9 % (fraction massique).
D.3.1.2 Eau de qualité PCR.
D.3.1.3 Solution tampon TE.
D.3.2 Réactifs pour PCR en temps réel
D.3.2.1 Eau de qualité PCR.
D.3.2.2 Solution tampon pour PCR, 10×.
NOTE 10× signifie 10 fois, c’est-à-dire la concentration du tampon pour PCR.
La solution tampon pour PCR est généralement livrée avec l’ADN polymérase, laquelle peut contenir ou
non du MgCl à une concentration spécifiée par le fabricant. La concentration finale en MgCl est propre
2 2
à chaque méthode et est, par conséquent, indiquée dans le Tableau D.2 (voir D.5.2).
D.3.2.3 Solution de MgCl .
2
D.3.2.4 ADN Taq polymérase thermostable (pour PCR avec induction thermique).
D.3.2.5 Solution dNTP.
D.3.2.6 Oligonucléotides.
Les séquences des oligonucléotides sont répertoriées dans le Tableau D.1.
D.3.2.7 Plasmide IPC-ntb2.
4
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Un vecteur plasmidique transportant une séquence de 125 pb du gène rbcMT-T encodant la Ribulose-
[14]
1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase N-méthyltransférase de Nicotiana tabacum . Le plasmide
1)
est utilisé comme témoin interne d’amplification.
Tableau D.1 — Séquences des oligonucléotides
Gène Amorce/sonde Séquence (5′ — 3′)
Jos-F1 (sens) CCT GCT TAA CAC AAG TTG AGT AGG
ARNr 16S Jos-R1 (antisens) TTC CTT AGG TAC CGT CAG AAT TC
a b
Jos-P (sonde) FAM - TGT CAT CCT CCA CGC GGC GTT GCT GC-NFQ
IPC-ntb2-fw (sens) ACC ACA ATG CCA GAG TGA CAA C
Témoin interne
IPC-ntb2-re (antisens) TAC CTG GTC TCC AGC TTT CAG TT
d’amplification (TIA)
a b
IPC-ntb2-P (sonde) ROX -CAC GCG CAT GAA GTT AGG GGA CCA-NFQ
a
Des fluorophores et/ou quenchers équivalents peuvent être utilisés pour les sondes s’il peut être démontré qu’ils
offrent des résultats similaires ou meilleurs. Les combinaisons alternatives FAM-HEX, FAM-TAMRA, FAM-JOE et FAM-Cy5
ont été utilisées avec des résultats équivalents dans le cadre de la validation de la méthode.
b
NFQ: quencher non fluorescent (quencher sombre).
D.4 Appareillage
Un équipement approprié selon la méthode doit être utilisé et, en particulier, ce qui suit.
D.4.1 Équipement destiné à l’extraction de l’acide nucléique
D.4.1.1 Tubes de micro-centrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml et de 2,0 ml.
D.4.1.2 Bloc thermique, pouvant atteindre une température de 95 °C.
D.4.1.3 Pipettes et pointes à filtre, pour des volumes compris entre 1 µl et 1 000 µl.
D.4.1.4 Centrifugeuse, pour tubes de micro-centrifugeuse d’une capacité de 1,5 ml et de 2,0 ml,
par exemple, une micro-centrifugeuse, capable d’atteindre une accélération allant jusqu’à 12 000g. Dans
certaines étapes, une centrifugeuse réfrigérée est nécessaire.
D.4.2 Équipement destiné à la PCR en temps réel
D.4.2.1 Pipettes et pointes à filtre, d’une capacité comprise entre 1 µl et 1 000 µl.
D.4.2.2 Tubes de micro-centrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml et de 2,0 ml.
D.4.2.3 Microtubes PCR à paroi mince, tubes de réaction de 0,2 ml ou 0,5 ml, microplaques PCR
multi-puits ou autres consommables adaptés.
D.4.2.4 Instrument de PCR en temps réel.
D.5 Mode opératoire
D.5.1 Extraction de l’acide nucléique
Une anse de 1 µl de colonies suspectes (voir 9.5.2) est mise en suspension dans 1 ml de solution de
NaCl à 0,9 % et l’ADN est extrait grâce à une étape de lyse thermique (15 min à 95 °C). Après une étape
1) Le plasmide IPC-ntb2 a été utilisé comme témoin interne d’amplification dans l’étude de validation du système
PCR. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que
l’ISO approuve ou recommande l’emploi du produit désigné. D’autres systèmes de témoins internes d’amplification
peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils offrent des résultats équivalents ou meilleurs. Si nécessaire, adapter les
quantités de réactifs et le programme de réglage de la température et de la durée.
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de centrifugation supplémentaire pendant 3 min à 10 000 g, 5 µl du surnageant sont utilisés comme
solution d’ADN cible. Si l’ADN est destiné à être conservé, il convient d’utiliser un tampon TE au lieu de
NaCl à 0,9 %. D’autres méthodes d’extraction de l’ADN peuvent être utilisées si elles se sont révélées
appropriées. Avant d’être ajoutée au mélange réactionnel de la PCR, il convient de diluer 100 fois la
solution d’ADN cible dans de l’eau stérile.
D.5.2 Configuration de la PCR
La méthode est décrite pour un volume total de 25 µl par réaction PCR avec les réactifs listés dans
le Tableau D.2. La PCR peut également être effectuée avec un volume plus élevé si les solutions sont
ajustées de manière appropriée. Les concentrations finales des réactifs données dans le Tableau D.2 se
sont révélées appropriées.
Tableau D.2 — Réactifs
Réactif Concentration finale Volume par échantillon
µl
Solution d’ADN cible (dilution 1:100) 250 ng maximum 2,5 µl
a
ADN Taq polymérase 1 UI Tel que requis
b
Tampon pour PCR (sans MgCl ) 1× Tel que requis
2
Solution de MgCl 2,5 mM Tel que requis
2
Solution dNTP 0,2 mM de chaque dNTP Tel que requis
Amorces PCR (selon le Tableau D.1) 500 nM de chaque amorce Tel que requis
Sondes PCR (selon le Tableau D.1) 100 nM de chaque sonde Tel que requis
Eau de qualité PCR — Tel que requis
Plasmide IPC-ntb2 25 copies par réaction Tel que requis
Volume total — 25
a
De l’ADN Taq polymérase à induction thermique a été utilisé dans le cadre de la validation de la méthode.
b
Si la solution tampon pour PCR contient déjà du MgCl , la concentration finale en MgCl dans le mélange réactionnel est
2 2
ajustée à 2,5 mM.
D.5.3 Témoins de PCR
[13]
Conformément à l’ISO 22174 , les témoins suivants sont nécessaires:
a) témoin négatif de PCR: l’eau de qualité PCR est utilisée comme témoin négatif;
b) témoin positif de PCR: l’ADN de C. jejuni, C. coli ou C. lari est utilisé comme témoin positif;
c) témoin d’amplification: le système contient un témoin interne d’amplification (voir D.3.2.7).
D.5.4 Programme de réglage de la température et de la durée
Le programme de réglage de la température et de la durée, présenté dans le Tableau D.3, a été utilisé
dans le cadre de la validation de la méthode avec les thermocycleurs Applied Biosystem, 7500 Fast,
2)
Stratagene MX3000P, Biorad CFX 96 et iCycler iQ5 . L’utilisation d’autres thermocycleurs peut
nécessiter une adaptation. La durée de l’activation/dénaturation initiale dépend de la polymérase
utilisée.
2) Applied Biosystem 7500 Fast, Stratagene MX3000P, Biorad CFX 96 et iCycler iQ5 sont des exemples de
produits appropriés disponibles dans le commerce auprès de ThermoFisher Scientific, Agilent Technologies et
Bio-Rad. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement
que l’ISO approuve ou recommande l’emploi de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils donnent les mêmes résultats.
6
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ISO 10272-2:2017/Amd.1:2023(F)
Tableau D.3 — Programme de réglage de la température et de la durée
Étapes Combinaison durée/température
Activation/Dénaturation initiale 3 min/95 °C
Nombre de cycles (amplification) 45
15 s/95 °C
Amplification 60 s/60 °C
30 s/72 °C
D.6 Interprétation des résultats
La valeur seuil pour déterminer le cycle de seuil (Cq) doit être définie par l’analyste ou par le logiciel
propre au thermocycleur. Un échantillon positif génère une courbe d’amplification présentant au moins
[15]
la phase exponentielle d’une courbe d’amplification type, voir l’ISO 22119 . La courbe d’amplification
de ces échantillons coupe le seuil défini après un certain nombre de cycles. Un échantillon avec un
signal de fluorescence au-dessus du seuil est considéré comme étant positif. Lors de la validation de la
méthode, tous les échantillons vrais positifs ont généré des valeurs Cq en dessous de 38.
D.7 Caractéristiques de performance de la méthode
D.7.1 Généralités
La méthode (incluant les données de validation interne) a été publiée, voir Références [16] et [17].
De plus, les caractéristiques de performance de la méthode ont été déterminées dans le cadre d’une
étude de comparaison des méthodes menée dans deux laboratoires différents et dans le cadre d’une
[18]
étude interlaboratoires conformément à l’ISO 16140-6 , voir Référence [19]. L’Annexe F résume les
données de l’étude interlaboratoires.
D.7.2 Évaluation théorique de la méthode
Une évaluation in silico a été réalisée en effectuant une recherche de similarité des séquences par
®3)
rapport à la base de données GenBank/EMBL/DDBJ (recherche NCBI Blast , base de données EMBL,
22 septembre 2015). Le résultat de la recherche a confirmé une similarité à 100 % uniquement avec les
séquences ciblées attendues.
NOTE Une similarité à 100 % uniquement avec les séquences ciblées attendues n'exclut pas la présence
de résultats faux positifs et/ou faux négatifs. Ceux-ci sont traités dans les publications originales et dans le
Tableau D.4.
D.7.3 Inclusivité et exclusivité
L’inclusivité de la méthode a été soumise à essai dans l’étude de comparaison des méthodes avec
104 souches de C. jejuni, 105 souches de C. coli et 56 souches de C. lari (265 souches en tout de
Campylobacter spp. thermotolérants). Les souches ont donné les résultats attendus en comparaison
avec la méthode de référence (voir également le Tableau D.4).
L’exclusivité de la méthode a été soumise à essai dans l’étude de comparaison des méthodes avec
66 souches de Campylobacter dont l’espèce n’était pas ciblée et 76 souches autres que Campylobacter spp.
(142 souches en tout). Les souches ont donné les résultats attendus en comparaison avec la méthode de
référence (voir également le Tableau D.4).
®
3) La recherche NCBI Blast est un exemple de produit approprié disponible gratuitement sur https:// blast
.ncbi .nlm .nih .gov/ Blast .cgi. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne
signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi de ce produit. Des produits équivalents peuvent être
utilisés s’il est démontré qu’ils donnent les mêmes résultats.
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Tableau D.4 — Inclusivité et exclusivité
Inclusivité/ Nombre de Accord Écart Accord Écart
exclusivité souches d’inclusivité d’inclusivité d’exclusivité d’exclusivité
Inclusivité 265 265 0 Non applicable Non applicable
Exclusivité 142 Non applicable Non applicable 142 0
NOTE Le Tableau D.4 présente une comparaison entre les résultats de la méthode de référence et les
résultats de la méthode de PCR décrite à l’Annexe D. Compte tenu de l’identité réelle des souches, des résultats
faux positifs ont été obtenus aussi bien avec la méthode de référence qu’avec la méthode de PCR de l’Annexe D
pour 2 souches de C. upsaliensis, 1 souche de C. peloridis et 1 souche de C. insulaenigrae, mais cette dernière ne s’est
pas développée sur le milieu sélectif à 41,5 °C. La méthode de référence n’a pas pu différencier les organismes
cibles de la méthode de PCR de l’Annexe D (C. jejuni, C. coli et C. lari) d’autres espèces de Campylobacter capables
de se développer sur le milieu sélectif à 41,5 °C.
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Annexe E
(informative)
Méthodes PCR pour la confirmation et l’identification
moléculaires de Campylobacter spp. thermotolérants
E.1 Généralités
La présente annexe décrit à la fois une PCR multiplex sur gel et une PCR multiplex en temps réel basée sur
l’utilisation de sondes pour la confirmation et l’identification de Campylobacter spp. thermotolérants.
E.2 PCR multiplex sur gel pour la confirmation et l’identification de
Campylobacter spp.
E.2.1 Généralités
Le présent article décrit une méthode d’amplification et de détection de gènes spécifiques pour
différentes espèces thermotolérantes du genre Campylobacter (C. jejuni, C. coli, C. lari et C. upsaliensis)
utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose.
E.2.2 Principe
Des fragments d’ADN des gènes spécifiques aux différents Campylobacter spp. sont amplifiés par
PCR multiplex en utilisant cinq paires d’amorces. La détection des produits PCR est réalisée par
électrophorèse sur gel d’agarose.
E.2.3 Réactifs
[13]
Pour la qualité des réactifs utilisés, voir l’ISO 22174 . Des réactifs prêts à l’emploi peuvent être
disponibles dans le commerce. Il convient de se conformer aux instructions d’utilisation des fabricants.
E.2.3.1 Réactifs pour l’extraction de l’acide nucléique
E.2.3.1.1 NaCl, 0,9 % (fraction massique).
E.2.3.1.2 Solution tampon TE.
E.2.3.2 Réactifs pour PCR
E.2.3.2.1 Eau de qualité PCR.
E.2.3.2.2 Solution tampon pour PCR, 10×.
La solution tampon pour PCR est généralement livrée avec l’ADN polymérase, laquelle peut contenir
du MgCl à une concentration spécifiée par le fabricant. La concentration finale en MgCl est propre à
2 2
chaque méthode et est, par conséquent, indiquée dans le Tableau E.2 (voir E.2.5.2).
E.2.3.2.3 Solution de MgCl .
2
E.2.3.2.4 ADN Taq polymérase thermostable.
E.2.3.2.5 Solution dNTP.
E.2.3.2.6 Oligonucléotides.
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Les séquences des oligonucléotides sont répertoriées dans le Tableau E.1.
Tableau E.1 — Séquence des oligonucléotides
Espèce (gène) Amorce Séquence (5′ — 3′) Taille de
l’amplicon
pb
[20]
C. jejuni (hipO) CJF (sens) ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC 323
CJR (antisens) GCC ACA ACA AGT AAA GAA GC
[20]
C. coli (glyA) CCF (sens) GTA AAA CCA AAG CTT ATC GTG 126
CCR (antisens) TCC AGC AAT GTG TGC AAT G
[21]
C. lari (cpn60) JH0015 (sens) TCT GCA AAT TCA GAT GAG AAA A 180
JH0016 (antisens) TTT TTC AGT ATT TGT AAT GAA ATA TGG
C. upsaliensis (glyA) CUF (sens) AAT TGA AAC TCT TGC TAT CC 204
[20]
CUR (antisens) TCA TAC ATT TTA CCC GAG CT
Campylobacter spp. 23SF (sens) TAT ACC GGT AAG GAG TGC TGG AG 650
[20]
(23S rRNA)
23SR (antisens) ATC AAT TAA CCT TCG AGC ACC G
NOTE Le système permettant de détecter Campylobacter spp. (ARNr 23S) peut également être utilisé en tant
que témoin interne d’amplification (TIA) de Campylobacter. L’étude de comparaison des méthodes a montré que
ce système (ARNr 23S) ciblait également Arcobacter et Helicobacter.
E.2.3.3 Réactifs pour l’électrophorèse sur gel
L’électrophorèse sur gel d’agarose peut être effectuée à l’aide d’un tampon TAE ou d’un tampon TBE. Les
solutions décrites dans la présente méthode n’ont généralement pas besoin d’être autoclavées.
E.2.3.3.1 Agarose, adaptée à l’électrophorèse d’ADN et à la séparation de taille attendue des fragments
d’ADN.
E.2.3.3.2 Acide borique (H BO ), pour l’électrophorèse avec le tampon TBE uniquement.
3 3
E.2.3.3.3 Bleu de bromophénol (C H Br O SNa) et/ou xylène cyanole FF (C H N O S Na).
19 9 4 5 25 27 2 6 2
E.2.3.3.4 Étalon de masse moléculaire d’ADN, par exemple une préparation commerciale contenant
des fragments d’ADN de masse moléculaire très élevée à très faible (mais devant être d’au moins 100 pb).
E.2.3.3.5 Acide acétique glacial (CH COOH), pour l’électrophorèse avec le tampon TAE uniquement.
3
E.2.3.3.6 Acide éthylène diamine tétra-acétique disodique (Na -EDTA) (C H N O Na ).
2 10 14 2 8 2
E.2.3.3.7 Bromure d’éthidium (EtBr) (C H N Br) ou d’autres colorants intercalants d’ADN
21 20 3
appropriés.
Prendre les précautions nécessaires lors de l’utilisation de la solution de bromure d’éthidium en raison
de sa nature mutagène/tératogène. D’autres colorants intercalants peuvent être utilisés, mais pour cela
se référer à la fiche technique de sécurité du fabricant.
E.2.3.3.8 Glycérol (C H O ).
3 8 3
E.2.3.3.9 Acétate de sodium (C H O Na), pour l’électrophorèse avec le tampon TAE uniquement.
2 3 2
E.2.3.3.10 Acide chlorhydrique, w (HCl) = 37 % (fraction volumique).
E.2.3.3.11 Hydroxyde de sodium (NaOH).
E.2.3.3.12 Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane (Tris) (C H NO ).
4 11 3
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E.2.3.3.13 Solution tampon TAE (1×), c (Tris) = 0,050 mol/l, c (C H O Na) = 20 mmol/l, c (Na -
2 3 2 2
EDTA) = 0,001 mol/l.
Ajuster le pH à 8,0 en utilisant de l’acide acétique glacial ou du NaOH à 25 °C. Il est recommandé de
préparer la solution tampon TAE sous forme de solution mère concentrée (concentrée 50 fois maximum).
Jeter la solution en cas de précipité visible. La dilution du tampon d’électrophorèse concentré peut être
effectuée, immédiatement avant son utilisation, avec de l’eau non stérile, (mono) distillée ou désionisée.
E.2.3.3.14 Solution tampon TBE (0,5×), c (Tris) = 0,055 mol/l, c (acide borique) = 0,055 mol/l,
c (Na EDTA) = 0,001 mol/l.
2
Ajuster le pH à 8,0 en utilisant de l’acide chlorhydrique HCl ou du NaOH à 25 °C. Il est recommandé de
préparer la solution tampon TAE sous la forme d’une solution mère concentrée (concentration 10 fois
au maximum). Jeter la solution en cas de précipité visible. La dilution du tampon d’électrophorèse
concentré peut être effectuée, immédiatement avant son utilisation, avec de l’eau non stérile, (mono)
distillée ou désionisée.
Lors de l’utilisation du TBE, prendre les précautions nécessaires en raison de sa nature toxique pour la
reproduction et tératogène. Il est préférable d’utiliser un tampon TAE.
E.2.3.3.15 Solution tampon de charge des échantillons (5×), c (glycérol) = 50 % (fraction
volumique), ρ (bleu de bromophénol) = 2,5 g/l et/ou c (xylène cyanole) = 2,5 g/l, dissoute dans la
solution tampon d’électrophorèse.
NOTE D’autres concentrations de solution tampon de charge sont également possibles.
E.2.4 Appareillage
Un équipement approprié selon la méthode doit être utilisé et, en particulier, ce qui suit.
E.2.4.1 Équipement utilisé pour la lyse thermique
E.2.4.1.1 Tubes de micro-centrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml et de 2,0 ml.
E.2.4.1.2 Bloc thermique, avec une capacité de température jusqu’à +95 °C.
E.2.4.1.3 Pipettes graduées et pointes à filtre, pour des volumes compris entre 1 µl et 1 000 µl.
E.2.4.1.4 Centrifugeuse, pour tubes de micro-centrifugeuse d’une capacité de 1,5 ml et de 2,0 ml,
par exemple, une micro-centrifugeuse, capable d’atteindre une accélération allant jusqu’à 12 000 g.
Dans certaines étapes, une centrifugeuse réfrigérée est nécessaire.
E.2.4.1.5 Agitateur, par exemple de type Vortex.
E.2.4.2 Équipement utilisé pour la PCR
E.2.4.2.1 Pipettes et pointes à filtres, d’une capacité comprise entre 1 µl et 1 000 µl.
E.2.4.2.2 Tubes de micro-centrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml et de 2,0 ml.
E.2.4.2.3 M
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.