Water quality -- Determination of acute toxicity of water samples and chemicals to a fish gill cell line (RTgill-W1)

This document specifies a method for the determination of fish acute toxicity using the permanent cell line from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) gill, RTgill-W1. Cells in confluent monolayers in 24-well tissue culture plates are exposed to water samples, such as surface waters or different kinds of effluents, or to chemicals for 24 h and, thereafter, cell viability is assessed based on fluorescent cell viability indicator dyes (see 4.1). Data are then expressed as a percentage of unexposed control and toxicity quantified based on the percentage of cell viability versus the percentage of effluent or the chemical concentration in response curves (see Clause 9).

Qualité de l'eau -- Détermination de la toxicité aiguë d'échantillons d'eau et de produits chimiques vis-à-vis de la lignée cellulaire de branchies de poissons (RTgill-W1)

Le présent document spécifie une méthode de détermination de la toxicité aiguë sur les poissons ŕ l'aide de la lignée cellulaire permanente établie ŕ partir de branchies de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), RTgill-W1. Les cellules en monocouche confluente cultivées dans des plaques de culture tissulaire de 24 puits sont exposées ŕ des échantillons d'eau, tels que des eaux de surface ou différents types d'effluents, ou ŕ des produits chimiques pendant 24 h. Ensuite, la viabilité cellulaire est évaluée ŕ l'aide d'indicateurs colorés fluorescents de la viabilité cellulaire (voir 4.1). Les données sont ensuite exprimées sous forme du pourcentage d'un témoin non exposé et la toxicité est quantifiée d'aprčs la courbe concentration-effet du pourcentage de viabilité cellulaire en fonction du pourcentage de concentration en effluent ou en produit chimique (voir l'Article 9).

General Information

Status
Published
Publication Date
31-Mar-2019
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
23-Feb-2019
Completion Date
01-Apr-2019
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ISO 21115:2019 - Water quality -- Determination of acute toxicity of water samples and chemicals to a fish gill cell line (RTgill-W1)
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ISO 21115:2019 - Qualité de l'eau -- Détermination de la toxicité aiguë d'échantillons d'eau et de produits chimiques vis-a-vis de la lignée cellulaire de branchies de poissons (RTgill-W1)
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21115
First edition
2019-04
Water quality — Determination
of acute toxicity of water samples
and chemicals to a fish gill cell line
(RTgill-W1)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë d'échantillons
d'eau et de produits chimiques vis-à-vis de la lignée cellulaire de
branchies de poissons (RTgill-W1)
Reference number
ISO 21115:2019(E)
ISO 2019
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ISO 21115:2019(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2019

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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

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Published in Switzerland
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ISO 21115:2019(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

4.1 Cell viability assay ................................................................................................................................................................................ 2

4.2 Key differences in water sample and chemical testing procedure ............................................................. 3

5 Interferences ............................................................................................................................................................................................................ 3

5.1 Matrix effects by effluent samples ......................................................................................................................................... 3

5.2 Interferences of water constituents or chemicals with fluorescent dye assays ............................. 4

6 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 4

6.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

6.2 Ready-for-use purchased reagents ........................................................................................................................................ 4

6.3 Freshly prepared solutions ........................................................................................................................................................... 6

7 Apparatus and material ................................................................................................................................................................................ 8

7.1 General equipment .............................................................................................................................................................................. 8

7.2 Whole-water sample/ex preparation .................................................................................................................................. 9

7.3 Cell seeding and plate dosing ..................................................................................................................................................... 9

7.4 Preparation/dosing of stock solutions ............................................................................................................................... 9

7.5 Sampling for chemical analysis ..............................................................................................................................................10

7.6 Detection of cytotoxicity ..............................................................................................................................................................10

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................10

8.1 Cell line used ..........................................................................................................................................................................................10

8.2 Seeding cells into 24-well plates ..........................................................................................................................................10

8.2.1 General...................................................................................................................................................................................10

8.2.2 Preparation of working materials and solutions for cell seeding .......................................10

8.2.3 Seeding cells: step-by-step performance .................................................................................................11

8.3 Cell exposure..........................................................................................................................................................................................12

8.3.1 General...................................................................................................................................................................................12

8.3.2 Exposure of cells to water samples ...............................................................................................................13

8.3.3 Exposure of cells to chemicals ..........................................................................................................................18

8.4 Determination of cytotoxicity .................................................................................................................................................21

8.4.1 General...................................................................................................................................................................................21

8.4.2 Visual control of cell damage .............................................................................................................................22

8.4.3 Preparation of working materials and solutions for cytotoxicity measurement ..23

8.4.4 Measuring cytotoxicity — Step-by-step performance ..................................................................23

8.4.5 Parameters for the fluorescence measurement .................................................................................24

8.4.6 Chemical analyses of the test samples .......................................................................................................24

9 Preparation and expression of results .......................................................................................................................................24

10 Validity criteria of the test .......................................................................................................................................................................25

10.1 No cells-control wells .....................................................................................................................................................................25

10.2 Positive control in L-15/ex ........................................................................................................................................................25

10.3 Positive control in w-ws/ex ......................................................................................................................................................26

10.4 Solvent control .....................................................................................................................................................................................26

Annex A (informative) Routine cell culture of RTgill-W1 .............................................................................................................27

Annex B (informative) Performance of the RTgill-W1 cell line assay ..............................................................................32

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................38

© ISO 2019 – All rights reserved iii
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ISO 21115:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,

Biological methods.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21115:2019(E)
Introduction

Millions of fish are used annually to test the acute toxicity of water samples, such as effluents or

chemicals. Using an alternative model of testing would not only reduce the need for animals, but would

have added benefits, such as much faster testing, using smaller volumes and creating less waste. Using

embryos of zebrafish prior to independent feeding has partly filled this need for alternative fish acute

toxicity testing.

This document describes a procedure that assesses fish acute toxicity using a permanent fish cell line.

Comparative work with both the zebrafish embryo and the cell line has shown that they are expected to

yield similar results, i.e. within approximately a 10-fold range based on measured concentrations. They

also have a common limitation, i.e. a limited ability to detect neurotoxic compounds. Resource needs,

however, differ. For example, while the use of the cell line omits any need for fish and the time from

exposure to obtaining the test results is reduced, it does require sterile culture techniques. Thus, the

choice of the assay may be guided by the available resources and needs.
[1]

The fish cell line in the procedure described in this document is the RTgill-W1 cell line established

from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) gill. It is commercially available as ATCC® CRL-2523™ . Two

similarly structured procedures are described: one for water samples, such as effluents, and one for

chemical testing.
[2] [3]

The standards ISO 15088 and OECD 236 are also related to prediction of waste water or chemical

fish acute toxicity, relying on zebrafish embryos.

1) ATCC® CRL-2523™ is the trademark of a product supplied by ATCC, US. This information is given for the

convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.

Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

© ISO 2019 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21115:2019(E)
Water quality — Determination of acute toxicity of water
samples and chemicals to a fish gill cell line (RTgill-W1)

WARNING — Working with chemicals or water samples requires precautionary safety measures

for handling. This document does not purport to address the safety problems associated with its

use. It is the responsibility of the user to establish appropriate health and safety practices.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document

be carried out by suitably trained staff.
1 Scope

This document specifies a method for the determination of fish acute toxicity using the permanent

cell line from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) gill, RTgill-W1. Cells in confluent monolayers in 24-

well tissue culture plates are exposed to water samples, such as surface waters or different kinds of

effluents, or to chemicals for 24 h and, thereafter, cell viability is assessed based on fluorescent cell

viability indicator dyes (see 4.1). Data are then expressed as a percentage of unexposed control and

toxicity quantified based on the percentage of cell viability versus the percentage of effluent or the

chemical concentration in response curves (see Clause 9).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org ./obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
L-15/ex

protein-free medium, containing the same amounts of salts, galactose and pyruvate as Leibovitz L-15

[4]

medium , used for exposure (“/ex”) of RTgill-W1 cells to chemicals or water samples

Note 1 to entry: See 6.3.7.
3.2
whole-water sample/ex
w-ws/ex

water sample with adjusted osmolality due to the addition of salts, galactose and pyruvate similar to

L-15/ex (3.1)
Note 1 to entry: See 6.3.8, 6.3.9 and 8.3.2.3.
3.3
negative control
exposure medium L-15/ex (3.1) without test chemical
© ISO 2019 – All rights reserved 1
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ISO 21115:2019(E)
3.4
positive control

well-characterized reference substance that, when evaluated by a specific test method, demonstrates

the suitability of the test system to yield a reproducible, appropriate response

Note 1 to entry: The protocols presented in this document were validated using 3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA) as

[2] [3]

a positive control because it is easy to handle, and were used as positive control in ISO 15088 and OECD 236

(see Introduction). Other substances can be suitable as positive control, as long as they yield a reproducible,

appropriate response in the test system.
3.5
solvent control

exposure medium [L-15/ex (3.1)] plus the respective concentration of the used co-solvent, e.g. dimethyl

sulfoxide (DMSO), if required

Note 1 to entry: Solvent control applies in case a co-solvent, such as DMSO, is required.

3.6
w-ws/ex solvent control

whole-water sample/ex (3.2) plus the respective concentration of the used solvent, for example dimethyl

sulfoxide (DMSO), for dosing the positive control (3.4) chemical, if required
3.7
no cells-control

two wells per test plate without cells, one receiving L-15/ex (3.1) and the other receiving either 100 %

whole-water sample/ex (3.2) or L-15/ex (3.1) with the highest concentration of the test chemical, to

determine background fluorescence
Note 1 to entry: See 5.2.
3.8
effective concentration

concentration of the test material that causes an x percentage change in cell viability compared to the

negative (3.3) or solvent control (3.5) during a specified time interval

Note 1 to entry: EC is the concentration at which the cell viability is 50 % compared to the (solvent) control (see

Clause 9).
4 Principle
4.1 Cell viability assay

Water samples and chemicals may cause toxic effects to cell cultures. The assay described in this

document allows the detection of three different toxicity end points on the same set of cells. The assay

is evaluated photometrically by measuring fluorescence of dyes indicating the toxicity and the results

are expressed as percentage-cell viability in comparison to an untreated control group.

The assay is based on the combination of three fluorescent indicator dyes: alamarBlue, CFDA-AM

and neutral red, which measure, respectively, metabolic activity, integrity of the cell membrane and

[5]
integrity of the lysosomal membrane, see Figure 1 .
2 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21115:2019(E)
Key
1 metabolic activity
2 integrity of cell membrane
3 integrity of lysosomal membrane
4 nucleus

Figure 1 — Three fluorescent dyes measuring cytotoxicity based on different targets

2) [6]

alamarBlue™ is a commercial preparation of the dye resazurin and all procedures in this document

are based on alamarBlue. Other comparable resazurin-based dyes are commercially available, such as

PrestoBlue® , which can be used interchangeably without any adaptations. Resazurin enters the cells

in its non-fluorescent form and is converted to the fluorescent product, resorufin, by mitochondrial,

microsomal or cytoplasmic oxidoreductases. A reduction in alamarBlue-fluorescence indicates a

decline in cellular metabolism, including disruption of mitochondrial membranes.

5-carboxyfluorescein diacetate acetoxy methyl ester (CFDA-AM) rapidly diffuses into the cells and is

converted by non-specific esterases of the plasma membrane of living cells to the fluorescent product,

[4]

5-carboxyfluorescein. The product diffuses out of intact fish cells slowly . Therefore, a decline in

CFDA-AM fluorescence indicates disturbance of plasma membrane integrity.
[7]

Neutral red diffuses into the cells and accumulates in lysosomes . Disruption of lysosomes therefore

results in a decrease in neutral red fluorescence.
4.2 Key differences in water sample and chemical testing procedure

In the case of testing water samples, first osmolality is adjusted to ensure isotonic exposure conditions

when diluting the water sample in cell exposure medium. Thereafter, the sample is filtered in order to

avoid interferences by microorganims (see 8.3.2.3). Cell viability is then quantified as described in 4.1.

In the case of chemical testing, the cell exposure medium is sampled at the onset and the end of the

exposure period and chemical concentrations quantified to determine actual exposure concentrations.

A reliable analytical method for the quantification of the test chemical with reported accuracy and

limit of detection should be available. This allows derivation of effective concentrations causing 50 % of

effects (EC value) based on measured concentrations.
5 Interferences
5.1 Matrix effects by effluent samples

The undefined matrix of an effluent (or generally water) sample may limit the capability of the cell line

assay to detect toxicants (i.e. if the toxicant is masked by the matrix). For this reason, each effluent

2) alamarBlue™ is the trademark of a product supplied by Thermo Fisher Scientific, USA. This information is given

for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.

Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

3) PrestoBlue® is the trademark of a product supplied by Thermo Fisher Scientific, USA. This information is given

for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.

Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

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ISO 21115:2019(E)

sample is tested simultaneously in the presence of a reference chemical as positive control and as the

effluent alone. For effluent testing with the positive control, the reference chemical, i.e. 3,4-DCA, is

spiked to the effluent in a concentration range that is expected to yield a full concentration response

curve and EC values as indicated in Clause 10.

If the effluent itself is toxic, with a clear concentration-response curve, the positive control effluent

with 3,4-DCA would also not result in a clear concentration-response curve and is, therefore, obsolete

(e.g. see B.2, Table B.2 and Figure B.1, B, sample 6/site E). However, as many effluents are not acutely

toxic, obtaining a concentration-response curve with 3,4-DCA will indicate proper functioning of the

assay procedure if little or no toxicity stems from the effluent. A shift of the 3,4-DCA concentration

response curve in the effluent matrix compared to L-15/ex to the right (i.e. lower part of curve

is missing — 0 % cell viability can no longer be observed) would indicate that the matrix lowers

availability of the chemical to the cells but that the assay procedure worked (e.g. see B.2, Table B.2 and

Figure B.1, A, sample 3/site B). A shift of the concentration-response curve to the left (i.e. upper part of

the curve is missing — 100 % cell viability can no longer be observed) would indicate that the assay

procedure worked but that the effluent by itself elicits a certain toxicity to the cells that is enhanced by

the additional stress of the 3,4-DCA (e.g. see B.2, Table B.2 and Figure B.1, D, sample 17/site O).

In some cases, precipitates may form upon addition of salts (see 8.3.2.3). This by itself does not preclude

testing of the water sample as the formation of precipitates does not per se interfere with the assay (see

also Reference [8]). If cell viability is affected by such a water sample, however, whether the effect is

caused solely by the precipitates or linked to toxicants in the samples cannot be clearly distinguished.

5.2 Interferences of water constituents or chemicals with fluorescent dye assays

Two no cells-control wells per 24-well test plate are necessary to quantify the background fluorescence

of the dyes. These cell-free wells are treated in the same way as the wells containing cells. To one of

the two no cells-control wells, 2 ml of L-15/ex are added. Inasmuch as undefined water constituents or

also chemicals can yield a background fluorescence, a second no-cells control well is included for either

water sample or chemical testing to detect possible interferences between whole-water sample/ex or

test chemical and the fluorescent dyes. To this well, 2 ml of 100 % whole-water sample/ex or the highest

chemical concentration is added (see 8.3.2.6, 8.3.2.9 and 8.3.3.5). If an interference is detected (i.e. a

fluorescence higher/lower by 20 % as compared to the other no cells-control well), a no cells-control

reference plate is required in an additional test with this particular water sample or chemical including

all dilutions (cell free plate treated in the same way as the exposure plate). Such interference has, as of

yet, not been detected, thus appears rare. If no interference is detected, both no cells-control wells are

treated as no cells-control values (see Clause 9).
6 Reagents
6.1 General
As far as available, use only cell culture tested grade chemicals.
6.2 Ready-for-use purchased reagents
6.2.1 Bovine serum, fetal bovine serum (FBS).
Do not heat inactivate the FBS.
6.2.2 Gentamicin, 10 mg/ml (C H N O , 496,56 g/mol, CAS-No: 49863-47-0).
20 40 4 10
2+ 2+

6.2.3 Trypsin, 0,25 % in Phosphate Buffered Saline (PBS) w/o, Ca , Mg (CAS-No: 9002-07-7).

6.2.4 Versene, 0,2 g/l EDTA(Na4) in PBS (C H N Na O , 398,19 g/mol, CAS-No: 194491-31-1).

10 14 2 4 9
4 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21115:2019(E)
6.2.5 Leibovitz L-15 medium, with glutamine and without phenolred.
6.2.6 Formaldehyde, 37 % (w/v) (CH O, 30,03 g/mol, CAS-No: 50-00-0).
6.2.7 Acetic acid, ≥ 99,5 % (C H O , 60,05 g/mol, CAS-No: 64-19-7).
2 4 2

6.2.8 alamarBlue solution, DAL1100; Invitrogen or PrestoBlue, A13262; Invitrogen (Resazurin:

C H NO , 229,19 g/mol, CAS-No: 550-82.3) .
12 7 4
6.2.9 CFDA-AM, (C H O , 532,46 g/mol, CAS-No: 124412-00-6).
28 20 11
6.2.10 Neutral red solution, (C H IN , 288,78 g/mol, CAS-No: 553-24-2).
16 17 4
2+ 2+
6.2.11 Dulbecco’s PBS (PBS), 10x, with Ca and Mg .

6.2.12 Dimethyl sulfoxide (DMSO), ≥ 99,9 % (C H SO, 78,13 g/mol, CAS-No: 67-68-5).

2 6
6.2.13 Ethanol, absolute, for analysis (C H O, 46,07 g/mol, CAS-No: 64-17-5).
2 6
6.2.14 Calcium chloride, ≥ 96 % (CaCl , 110,98 g/mol, CAS-No: 10043-52-4).
6.2.15 Sodium chloride, ≥ 99 % (NaCl, 58,44 g/mol, CAS-No: 7647-14-5).
6.2.16 Potassium chloride, ≥ 99 % (KCl, 74,55 g/mol, CAS-No: 7447-40-7).
6.2.17 Magnesium sulfate, ≥ 98 % (MgSO , 120,37 g/mol, CAS-No: 7487-88-9).
6.2.18 Magnesium chloride, ≥ 97 % (MgCl , 95,21 g/mol, CAS-No: 7786-30-3).
6.2.19 Galactose, ≥ 96 % (C H O , 180,16 g/mol, CAS-No: 59-23-4).
6 12 6
6.2.20 Sodium pyruvate, ≥ 99 % (C H O Na, 110,04 g/mol, CAS-No: 113-24-6).
3 3 3

6.2.21 Sodium phosphate dibasic, ≥ 99 % (Na HPO , 141,96 g/mol, CAS-No: 7558-79-4).

2 4

6.2.22 Potassium phosphate monobasic, ≥ 99 % (KH PO 136,09 g/mol, CAS-No: 7778-77-0).

2 4,
6.2.23 Deionized water, resistivity: ≤ 18,2 MΩ*cm.
6.2.24 3,4-Dichloroaniline (C H Cl N, 162,02 g/mol, CAS-No: 95-76-1).
6 5 2
Use only analytical standard grade.

4) These are examples of suppliers able to provide suitable chemicals for the assay performance. This information

is given for the convenience of the users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this

supplier. Similar products from other providers are available.
© ISO 2019 – All rights reserved 5
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ISO 21115:2019(E)
6.3 Freshly prepared solutions
6.3.1 L-15 complete culture medium.
Add to 500 ml L-15:
— 25 ml FBS;
— 2,5 ml Gentamicin.
The storage time should not exceed three months at (4 ± 1) °C.
6.3.2 20x salt solution A (for L-15/ex and w-ws/ex).
— 80 g NaCl;
— 4,0 g KCl;
— 0,98 g MgSO ;
— 0,94 g MgCl .
Fill up with deionized water to 300 ml and autoclave.
The storage time should not exceed six months at room temperature.
6.3.3 30x salt solution B (for L-15/ex and w-ws/ex).
— 1,4 g CaCl .
Fill up with deionized water to 33,33 ml and autoclave.
The storage time should not exceed six months at room temperature.
6.3.4 30x salt solution C (for L-15/ex and w-ws/ex).
— 1,9 g Na HPO ;
2 4
— 0,6 g KH PO .
2 4
Fill up with deionized water to 100 ml and autoclave.
The storage time should not exceed six months at room temperature.
6.3.5 30x galactose solution (for L-15/ex and w-ws/ex).
— 9,0 g galactose.
Fill up with deionized water to 33,33 ml.
Filter-sterilize (0,2 µm) and prepare 3,33 ml aliquots.
The storage time should not exceed six months at (–20 ± 1) °C.
6.3.6 30x sodium pyruvate solution (for L-15/ex and w-ws/ex).
— 5,5 g sodium pyruvate.
Fill up with deionized water to 33,33 ml.
Filter-sterilize (0,2 µm) and prepare 3,33 ml aliquots.
6 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21115:2019(E)
The storage time should not exceed six months at (–20 ± 1) °C.
6.3.7 L-15/ex (prepare aseptically).
— 30 ml 20x salt solution A;
— 3,33 ml 30x salt solution B;
— 10 ml 30x salt
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21115
Première édition
2019-04
Qualité de l'eau — Détermination de
la toxicité aiguë d'échantillons d'eau
et de produits chimiques vis-à-vis de
la lignée cellulaire de branchies de
poissons (RTgill-W1)
Water quality — Determination of acute toxicity of water samples
and chemicals to a fish gill cell line (RTgill-W1)
Numéro de référence
ISO 21115:2019(F)
ISO 2019
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ISO 21115:2019(F)
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ISO 21115:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

4.1 Essai de viabilité cellulaire ........................................................................................................................................................... 2

4.2 Principales différences du mode opératoire de l’essai sur échantillons d’eau et sur

produits chimiques ............................................................................................................................................................................. 3

5 Interférences ............................................................................................................................................................................................................ 4

5.1 Effets de matrice dus aux échantillons d’effluent ..................................................................................................... 4

5.2 Interférences des constituants de l’eau ou des produits chimiques avec les essais

utilisant un indicateur coloré fluorescent ....................................................................................................................... 4

6 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 5

6.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 5

6.2 Réactifs prêts à l’emploi .................................................................................................................................................................. 5

6.3 Solutions préparées extemporanément ............................................................................................................................ 6

7 Appareillage et matériel ............................................................................................................................................................................... 8

7.1 Équipement général ........................................................................................................................................................................... 8

7.2 Préparation de l’échantillon d’eau complet/ex........................................................................................................... 9

7.3 Ensemencement des cellules sur plaque .......................................................................................................................... 9

7.4 Préparation/distribution des solutions mères ........................................................................................................10

7.5 Échantillonnage pour l’analyse chimique .....................................................................................................................10

7.6 Détection de la cytotoxicité .......................................................................................................................................................10

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................10

8.1 Lignée cellulaire utilisée ..............................................................................................................................................................10

8.2 Ensemencement des cellules dans des plaques de 24 puits .........................................................................11

8.2.1 Généralités .........................................................................................................................................................................11

8.2.2 Préparation du matériel et des solutions d’ensemencement des cellules ..................11

8.2.3 Ensemencement des cellules: déroulement étape par étape .................................................11

8.3 Exposition des cellules ..................................................................................................................................................................13

8.3.1 Généralités .........................................................................................................................................................................13

8.3.2 Exposition des cellules aux échantillons d’eau ...................................................................................13

8.3.3 Exposition des cellules à des produits chimiques ............................................................................18

8.4 Détermination de la cytotoxicité ..........................................................................................................................................22

8.4.1 Généralités .........................................................................................................................................................................22

8.4.2 Contrôle visuel des dommages cellulaires .............................................................................................22

8.4.3 Préparation du matériel et des solutions de mesure de la cytotoxicité ........................23

8.4.4 Mesurage de la cytotoxicité: déroulement étape par étape .....................................................23

8.4.5 Paramètres applicables au mesurage de la fluorescence...........................................................24

8.4.6 Analyses chimiques des échantillons pour essai ..............................................................................24

9 Préparation et expression des résultats ...................................................................................................................................24

10 Critères de validité de l’essai ................................................................................................................................................................25

10.1 Puits «témoins sans cellules» ..................................................................................................................................................25

10.2 Témoin positif dans le L-15/ex ..............................................................................................................................................26

10.3 Témoin positif dans w-ws/ex: .................................................................................................................................................26

10.4 Témoin solvant .....................................................................................................................................................................................26

Annexe A (informative) Culture cellulaire de routine de RTgill-W1 .................................................................................27

Annexe B (informative) Performance de l’essai sur la lignée cellulaire RTgill-W1 ..........................................33

© ISO 2019 – Tous droits réservés iii
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ISO 21115:2019(F)

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................40

iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 21115:2019(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, de la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de

l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les

obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité

SC 5, Méthodes biologiques.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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ISO 21115:2019(F)
Introduction

Des millions de poissons sont utilisés chaque année pour évaluer la toxicité d’échantillons d’eau, tels

que les effluents, ou de produits chimiques. Utiliser un autre modèle d’essai réduirait non seulement

les besoins en animaux, mais permettrait également d’accélérer les essais tout en réduisant les volumes

utilisés et la production de déchets. L’utilisation d’embryons de poisson-zèbre avant l’alimentation

autonome comble partiellement le besoin d’essais alternatifs de toxicité aiguë sur les poissons.

Le présent document décrit un mode opératoire qui évalue la toxicité aiguë sur les poissons à l’aide d’une

lignée cellulaire permanente de poisson. Les travaux comparatifs utilisant les embryons de poisson-

zèbre et la ligne cellulaire ont montré qu’ils sont censés produire des résultats similaires, c’est-à-dire

dans une gamme d’environ un facteur 10 reposant sur les concentrations mesurées. Ils ont également

un inconvénient commun: une capacité limitée à détecter les composés neurotoxiques. Cependant, les

besoins en ressources diffèrent. Par exemple, bien que l’utilisation de la lignée cellulaire permette de

ne pas utiliser de poissons du tout et de réduire la durée entre l’exposition et l’obtention des résultats

d’essai, elle exige des techniques de culture en milieu stérile. Ainsi, le choix de l’essai peut être guidé par

les ressources disponibles et les besoins.

Dans le mode opératoire décrit dans le présent document, la lignée cellulaire de poisson est la lignée

[1]

cellulaire RTgill-W1 établie à partir de branchies de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Elle est

disponible dans le commerce auprès de l’ATCC® CRL-2523™ . Deux modes opératoires de structure

similaire sont décrits: un pour les échantillons d’eau, tels que les effluents, et un pour les essais sur

produits chimiques.
[2] [3]

La norme ISO 15088 et la ligne directrice de l’OCDE 236 concernent également la prédiction de la

toxicité aiguë des eaux résiduaires et des produits chimiques sur les poissons, à partir d’embryons de

poisson-zèbre.

1) ATCC® CRL-2523™ est l’appellation commerciale d’un produit fourni par ATCC, États-Unis. Cette information

est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un

engagement de l'ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils

conduisent aux mêmes résultats.
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NORME INTERNATIONALE ISO 21115:2019(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë
d'échantillons d'eau et de produits chimiques vis-à-vis de
la lignée cellulaire de branchies de poissons (RTgill-W1)

AVERTISSEMENT — Travailler avec des produits chimiques ou des échantillons d’eau requiert

des mesures de sécurité lors de leur manipulation. Le présent document n'a pas pour but de

traiter tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir des

pratiques d’hygiène et de sécurité appropriées.

IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon le présent document soient

effectués par un personnel convenablement formé.
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode de détermination de la toxicité aiguë sur les poissons à l’aide

de la lignée cellulaire permanente établie à partir de branchies de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus

mykiss), RTgill-W1. Les cellules en monocouche confluente cultivées dans des plaques de culture

tissulaire de 24 puits sont exposées à des échantillons d’eau, tels que des eaux de surface ou différents

types d’effluents, ou à des produits chimiques pendant 24 h. Ensuite, la viabilité cellulaire est évaluée

à l’aide d’indicateurs colorés fluorescents de la viabilité cellulaire (voir 4.1). Les données sont ensuite

exprimées sous forme du pourcentage d’un témoin non exposé et la toxicité est quantifiée d’après

la courbe concentration-effet du pourcentage de viabilité cellulaire en fonction du pourcentage de

concentration en effluent ou en produit chimique (voir l'Article 9).
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online Browsing Platform (OBP): disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
L-15/ex

milieu exempt de protéine, contenant les mêmes quantités de sels, galactose et pyruvate que le milieu

[4]

Leibovitz L-15 , utilisé pour l’exposition («/ex») des cellules RTgill-W1 aux produits chimiques ou aux

échantillons d’eau
Note 1 à l'article: Voir 6.3.7.
3.2
échantillon d’eau complet/ex
échantillon d’eau complet/ex

échantillon d’eau dont l’osmolalité a été ajustée par l’ajout de sels, galactose et pyruvate pour être

similaire au milieu L-15/ex (3.1)
Note 1 à l'article: Voir 6.3.8, 6.3.9 et 8.3.2.3.
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ISO 21115:2019(F)
3.3
témoin négatif
milieu d’exposition L-15/ex (3.1) exempt de produit chimique d’essai
3.4
témoin positif

substance de référence adéquatement caractérisée qui, lorsqu’elle est évaluée par une méthode d’essai

spécifique, démontre la capacité du système d’essai à produire une réponse appropriée reproductible

Note 1 à l'article: Les protocoles présentés dans le présent document ont été validés en utilisant la

3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA) comme témoin positif car elle est facile à manipuler et a été utilisée comme

[2] [3]

témoin positif dans l’ISO 15088 et dans la ligne directrice de l’OCDE 236 (voir Introduction). D’autres

substances peuvent être appropriées comme témoin positif à condition qu’elles produisent une réponse adéquate

reproductible dans le système d’essai.
3.5
témoin solvant

milieu d’exposition [L-15/ex (3.1)] supplémenté avec la concentration respective du co-solvant utilisé,

par exemple le diméthylsulfoxyde (DMSO), si nécessaire

Note 1 à l'article: Le témoin solvant s’applique seulement si un co-solvant tel que le DMSO est requis.

3.6
témoin solvant w-ws/ex

échantillon d’eau complet/ex (3.2) supplémenté avec la concentration respective du solvant utilisé, par

exemple le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour l’exposition au produit chimique témoin positif (3.4), si

nécessaire
3.7
témoin sans cellules

deux puits par plaque d’essai sans cellules, l’un recevant le milieu L-15/ex (3.1) et l’autre recevant soit

100 % d’échantillon d’eau complet/ex (3.2) soit le milieu L-15/ex (3.1) avec la plus forte concentration en

produit chimique d’essai, pour déterminer le bruit de fond de la fluorescence
Note 1 à l'article: Voir 5.2.
3.8
concentration efficace

concentration en matériau d’essai qui provoque x pourcent de changement de viabilité cellulaire par

rapport au témoin négatif (3.3) ou au témoin solvant (3.5) pendant un intervalle de temps spécifié

Note 1 à l'article: La CE est la concentration pour laquelle la viabilité cellulaire est de 50 % par rapport au

témoin (solvant) (voir l'Article 9).
4 Principe
4.1 Essai de viabilité cellulaire

Les échantillons d’eau et les produits chimiques peuvent exercer des effets toxiques sur les cultures

cellulaires. L’essai décrit dans le présent document permet de détecter trois critères de toxicité

différents sur le même groupe de cellules. L’essai est effectué par photométrie en mesurant la

fluorescence d’indicateurs colorés de toxicité et les résultats sont exprimés en pourcentage de viabilité

cellulaire par rapport à un groupe témoin non traité.

L’essai repose sur la combinaison de trois indicateurs colorés fluorescents: alamarBlue, CFDA-AM et le

rouge neutre, qui mesurent, respectivement, l’activité métabolique, l’intégrité de la membrane cellulaire

[5]
et l’intégrité de la membrane lysosomale, voir Figure 1 .
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
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Légende
1 activité métabolique
2 intégrité de la membrane cellulaire
3 intégrité de la membrane lysosomale
4 noyau

Figure 1 — Trois indicateurs colorés fluorescents mesurant la cytotoxicité d’après

différentes cibles
2) [6]

L’alamarBlue™ est une préparation commerciale du colorant résazurine et tous les modes

opératoires du présent document utilisent l’alamarBlue. D’autres indicateurs colorés comparables, à

base de résazurine, sont disponibles dans le commerce, notamment le PrestoBlue® , et peuvent être

utilisés de manière interchangeable sans adaptation. La résazurine pénètre dans les cellules sous sa

forme non fluorescente et est convertie en produit fluorescent, la résorufine, par les oxydoréductases

des membranes mitochondriales, microsomales ou cytoplasmiques. Une réduction de la fluorescence de

l’alamarBlue indique une diminution du métabolisme cellulaire, y compris une rupture des membranes

mitochondriales.

Le 5-carboxyfluorescéine diacétate acétoxy méthyl ester (CFDA-AM) diffuse rapidement dans les

cellules et est converti par les estérases non spécifiques de la membrane plasmique des cellules

vivantes en un produit fluorescent, la 5-carboxyfluorescéine. Le produit diffuse lentement à l’extérieur

[4]

des cellules intactes de poisson . Ainsi, une diminution de la fluorescence du CFDA-AM indique une

perturbation de l’intégrité de la membrane plasmique.
[7]

Le rouge neutre diffuse dans les cellules et s’accumule dans les lysosomes . La rupture des lysosomes

entraîne donc une diminution de la fluorescence du rouge neutre.

4.2 Principales différences du mode opératoire de l’essai sur échantillons d’eau et sur

produits chimiques

Si les essais portent sur des échantillons d’eau, l’osmolalité est d’abord ajustée pour s’assurer que les

conditions d’exposition sont isotoniques lors de la dilution de l’échantillon dans le milieu d’exposition

cellulaire. L’échantillon est ensuite filtré afin d’éviter les interférences dues aux micro-organismes (voir

8.3.2.3). La viabilité cellulaire est ensuite quantifiée comme décrit en 4.1.

Si les essais portent sur des produits chimiques, le milieu d’exposition cellulaire est prélevé au début

et à la fin de la période d’exposition et les concentrations en produits chimiques sont quantifiées pour

déterminer les concentrations d’exposition réelles. Il convient de disposer d’une méthode analytique

fiable pour la quantification du produit chimique d’essai avec une exactitude et une limite de détection

2) alamarBlue™ est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Thermo Fisher Scientific, États-Unis. Cette

information est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait

constituer un engagement de l'ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est

démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.

3) PrestoBlue® est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Thermo Fisher Scientific, États-Unis. Cette

information est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait

constituer un engagement de l'ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est

démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
© ISO 2019 – Tous droits réservés 3
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ISO 21115:2019(F)

indiquées. Cela permet d’obtenir les concentrations efficaces provoquant 50 % des effets (valeur CE )

sur la base des concentrations mesurées.
5 Interférences
5.1 Effets de matrice dus aux échantillons d’effluent

La matrice indéfinie d’un échantillon d’effluent (ou d’eau plus généralement) peut limiter la performance

de l’essai sur lignée cellulaire à détecter des substances toxiques (la substance toxique pouvant

être masquée par la matrice). Pour cette raison, chaque échantillon d’effluent est soumis à essai

simultanément seul et en présence d’un produit chimique de référence comme témoin positif. Pour les

essais sur effluents avec le témoin positif, le produit chimique de référence, c’est-à-dire la 3,4-DCA, est

ajouté à l’effluent dans une gamme de concentration censée produire une courbe concentration-effet

intégrale et des valeurs CE telles qu’indiquées à l’Article 10.

Si l’effluent est intrinsèquement toxique, avec une courbe concentration-effet interprétable, l’effluent

témoin positif contenant la 3,4-DCA ne conduira pas à une courbe concentration-effet interprétable et

est donc obsolète (par exemple, voir B.2, Tableau B.2 et Figure B.1, B, échantillon 6/site E). Cependant,

étant donné que de nombreux effluents ne présentent pas de toxicité aiguë, l’obtention d’une courbe

concentration-effet avec la 3,4-DCA indiquera que le mode opératoire d’essai se déroule correctement en

cas de toxicité réduite ou inexistante de l’effluent. Un décalage vers la droite de la courbe concentration-

effet avec la 3,4-DCA dans la matrice d’effluent par rapport au L-15/ex (ce qui signifie que la partie

inférieure de la courbe est manquante — une viabilité cellulaire de 0 % ne peut plus être observée)

indique que la matrice réduit la disponibilité du produit chimique pour les cellules mais que le mode

opératoire d’essai a fonctionné (par exemple, voir B.2, Tableau B.2 et Figure B.1, A, échantillon 3/site B).

Un décalage vers la gauche de la courbe concentration-effet (ce qui signifie que la partie supérieure

de la courbe est manquante — une viabilité cellulaire de 100 % ne peut plus être observée) indique

que le mode opératoire d’essai a fonctionné mais que l’effluent provoque intrinsèquement une certaine

toxicité pour les cellules qui est favorisée par la contrainte supplémentaire de la 3,4-DCA (par exemple,

voir B.2, Tableau B.2 et Figure B.1, D, échantillon 17/site O).

Dans certains cas, des précipités peuvent se former lorsque des sels sont ajoutés (voir 8.3.2.3). Cela

n’exclut en rien de soumettre à essai l’échantillon d’eau car la formation de précipités n’interfère pas

intrinsèquement avec l’essai (voir également Référence [8]). Cependant, si la viabilité cellulaire est

affectée par ce type d’échantillon d’eau, il est difficile de savoir si l’effet est uniquement provoqué par

les précipités ou s’il est lié aux substances toxiques présentes dans les échantillons.

5.2 Interférences des constituants de l’eau ou des produits chimiques avec les essais

utilisant un indicateur coloré fluorescent

Deux puits témoins sans cellules par plaque d’essai de 24 puits sont nécessaires pour quantifier le bruit

de fond de la fluorescence des indicateurs colorés. Ces puits sans cellules sont traités de la même manière

que les puits contenant des cellules. 2 ml de L-15/ex sont ajoutés dans l’un des deux puits témoins

sans cellules. Dans la mesure où les constituants indéfinis de l’eau ou les produits chimiques peuvent

produire un bruit de fond de fluorescence, un deuxième puits témoin sans cellules est inclus pour les

essais sur échantillons d’eau ou sur produits chimiques afin de détecter les éventuelles interférences

entre l’échantillon d’eau complet ou le produit chimique d’essai et les indicateurs colorés fluorescents.

2 ml de 100 % d’échantillon d’eau complet/ex ou la plus forte concentration en produits chimiques est

ajoutée dans ce puits (voir 8.3.2.6, 8.3.2.9 et 8.3.3.5). Si une interférence est détectée (c’est-à-dire, une

fluorescence supérieure/inférieure de 20 % par rapport à l’autre puits témoin sans cellules), une plaque

de référence témoin sans cellules est requise lors d’un essai supplémentaire avec cet échantillon d’eau

ou ce produit chimique particulier incluant toutes les dilutions (plaque sans cellules traitée de la même

manière que la plaque d’exposition). Ce type d’interférence n’a encore jamais été détecté et semble donc

rare. Si aucune interférence n’est détectée, les deux puits témoins sans cellules sont traités comme des

valeurs témoins sans cellules (voir l'Article 9).
4 © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 21115:2019(F)
6 Réactifs
6.1 Généralités

Dans la mesure du possible, utiliser uniquement des produits chimiques pour culture cellulaire.

6.2 Réactifs prêts à l’emploi
6.2.1 Sérum bovin, sérum fœtal bovin (FBS).
Ne pas inactiver thermiquement le FBS.
6.2.2 Gentamicine, 10 mg/ml (C H N O , 496,56 g/mol, CAS n°: 49863-47-0).
20 40 4 10
2+ 2+

6.2.3 Trypsine, 0,25 % dans le tampon phosphate (PBS) sans Ca , Mg (CAS n°: 9002-07-7).

6.2.4 Versène, 0,2 g/l d’EDTA(Na4) dans le PBS (C H N Na O , 398,19 g/mol, CAS n°: 194491-31-1).

10 14 2 4 9
6.2.5 Milieu L-15 de Leibovitz, avec glutamine et sans rouge de phénol.
6.2.6 For
...

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