Water quality -- Marine algal growth inhibition test with Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum

ISO 10253:2016 specifies a method for the determination of the inhibition of growth of the unicellular marine algae Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum by substances and mixtures contained in sea water or by environmental water samples (effluents, elutriates, etc.). The method can be used for testing substances that are readily soluble in water and are not significantly degraded or eliminated in any other way from the test medium.

Qualité de l'eau -- Essai d'inhibition de la croissance des algues marines avec Skeletonema sp. et Phaeodactylum tricornutum

ISO 10253:2016 spécifie une méthode de détermination de l'inhibition de la croissance des algues marines unicellulaires Skeletonema sp. et Phaeodactylum tricornutum provoquée par des substances et des mélanges présents dans l'eau de mer (effluents, élutriats, etc.). Cette méthode peut ętre utilisée pour soumettre ŕ l'essai des substances facilement solubles dans l'eau et qui ne sont pas sensiblement dégradées ou éliminées d'autre maničre du milieu d'essai.

General Information

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Published
Publication Date
03-Nov-2016
Current Stage
9020 - International Standard under periodical review
Start Date
15-Oct-2021
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10253
Third edition
2016-11-15
Water quality — Marine algal
growth inhibition test with
Skeletonema sp. and Phaeodactylum
tricornutum
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition de la croissance des algues
marines avec Skeletonema sp. et Phaeodactylum tricornutum
Reference number
ISO 10253:2016(E)
ISO 2016
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ISO 10253:2016(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2016, Published in Switzerland

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ISO 10253:2016(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Materials ....................................................................................................................................................................................................................... 3

5.1 Test organisms ........................................................................................................................................................................................ 3

5.2 Reagents........................................................................................................................................................................................................ 4

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 5

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 6

7.1 Preparation of growth medium ................................................................................................................................................ 6

7.2 Preparation of pre-culture and inoculum ........................................................................................................................ 6

7.3 Choice of test concentrations ..................................................................................................................................................... 6

7.4 Preparation of test substance stock solutions ............................................................................................................. 6

7.5 Preparation of test and control batches ............................................................................................................................ 7

7.6 Incubation ................................................................................................................................................................................................... 7

7.7 Measurements ......................................................................................................................................................................................... 7

8 Validity criteria ...................................................................................................................................................................................................... 8

9 Interpretation of data ...................................................................................................................................................................................... 8

9.1 Plotting growth curves ..................................................................................................................................................................... 8

9.2 Calculation of percentage inhibition .................................................................................................................................... 8

9.3 Determination of EC(r) ...................................................................................................................................................................

x 9

10 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 9

11 Interpretation of results ............................................................................................................................................................................... 9

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9

Annex A (informative) Preparation of dilution series of mixtures in sea water(effluents

or elutriates) ..........................................................................................................................................................................................................11

Annex B (informative) Test procedure starting from stored algal inocula, and with direct

measurement of algal growth in spectrophotometric cells ..................................................................................12

Annex C (informative) Performance data .....................................................................................................................................................18

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................19

© ISO 2016 – All rights reserved iii
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ISO 10253:2016(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,

as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the

Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www.iso.org/iso/foreword.html.

The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological

methods.

This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 10253:2006), which has been technically

revised.
iv © ISO 2016 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10253:2016(E)
Water quality — Marine algal growth inhibition test with
Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum

WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.

This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its

use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to

ensure compliance with any national regulatory conditions.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this document be

carried out by suitably trained staff.
1 Scope

This document specifies a method for the determination of the inhibition of growth of the unicellular

marine algae Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum by substances and mixtures contained in

sea water or by environmental water samples (effluents, elutriates, etc.).

The method can be used for testing substances that are readily soluble in water and are not significantly

degraded or eliminated in any other way from the test medium.

NOTE With modifications, as described in ISO 14442 and ISO 5667–16, the inhibitory effects of poorly

soluble organic and inorganic materials, volatile compounds, metal compounds, effluents, marine water samples

and elutriates of sediments can be tested.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples

ISO 14442, Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials,

volatile compounds, metals and waste water
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: available at http://www.iso.org/obp
3.1
cell density
number of cells per unit volume of medium
Note 1 to entry: The cell density is expressed as x cells/ml.
© ISO 2016 – All rights reserved 1
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ISO 10253:2016(E)
3.2
specific growth rate
proportional rate of increase in cell density per unit of time:
1 dx
μ =× (/1 day)
x dt
where
x is the cell density, expressed in cells per millilitre;
t is the time, expressed in days.
Note 1 to entry: Specific growth rate is expressed in inverse days (day ).
3.3
growth medium
mixture of sea water and nutrients which is used for pre-cultures and controls
3.4
test medium

mixture of sea water, nutrients [growth medium (3.3)] and test material in which algal cells are

incubated
3.5
test batch

mixture of sea water, nutrients and test material [test medium (3.4)] inoculated with algae

3.6
control

mixture of sea water, nutrients [growth medium (3.3)] without test material, inoculated with algae

3.7
effective concentration
EC(r)

concentration of test substance which results in an x % reduction in specific growth rate relative to the

controls
4 Principle

Mono-specific algal strains are cultured for several generations in a defined medium containing a

range of concentrations of the test substance, prepared by mixing appropriate quantities of nutrient

concentrate, sea water, stock solutions of the test substance, and an inoculum of exponentially growing

algal cells. The test solutions are incubated for a period of (72 ± 2) h, during which the cell density

in each is measured at intervals of at least every (24 ± 2) h. Inhibition is measured as a reduction in

specific growth rate, relative to control cultures grown under identical conditions.

2 © ISO 2016 – All rights reserved
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ISO 10253:2016(E)
5 Materials
5.1 Test organisms
Use either of the following marine algae:
a) Skeletonema sp. (CCAP 1077/1C, NIVA BAC 1); or
b) Phaeodactylum tricornutum Bohlin (CCAP 1052/1A, SAG 1090-1a, NIVA BAC 2).

These algae are important and widely distributed phytoplankton species (phylum Bacillariophyta) in

estuarine and coastal areas.

The recommended algae are available in unialgal, non-axenic cultures from the following sources.

NIVA
Norwegian Institute for Water Research
Gaustadaléen 21
N 0349 Oslo
Norway
CCAP
Dunstaffnage Marine Laboratory
P O Box 3 Oban
Argyll PA37 1QA
United Kingdom
SAG
Collection of Algal Cultures
University of Göttingen
Albrecht-von-Haller Institute for Plant Science
Untere Karspüle 2
37073 Göttingen
Germany

Stock cultures may be maintained in the medium described in 7.1. Regular subculturing is necessary.

Weekly intervals may be necessary for Skeletonema sp., every two or three weeks may be sufficient

for Phaeodactylum tricornutum. The stock cultures may also be maintained for extended periods on

richer algal media such as those recommended by the culture collection. It is recommended to keep the

1) The previous editions of this document suggested the use of two strains of Skeletonema costatum. Following a

taxonomic review of the Skeletonema genus, several strains originally identified as S. costatum may in fact be other

species. In light of this and to enable continuity in the use of previously accepted strains, the present revision of this

document has changed the reference from Skeletonema costatum to Skeletonema sp. to avoid non-compliance for

labs that may be using different strains.
© ISO 2016 – All rights reserved 3
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ISO 10253:2016(E)

stock culture in the medium described in 7.1 and in an exponential growth phase immediately before

preparing the pre-culture for testing as described in 7.2.

NOTE Concentrated cultures of the diatom Phaeodactylum tricornutum can also be stored for several

months without losing their viability. Stock cultures for the toxicity tests can easily be prepared from the stored

concentrated cultures .
5.2 Reagents
5.2.1 Water

All water used in the preparation of the synthetic sea water, growth medium and test substance

solutions shall be deionized or of equivalent purity. Take special care to avoid contamination of the

water by inorganic or organic substances during preparation and storage. Equipment made of copper

shall not be used.
5.2.2 Sea water

For culturing and testing Phaeodactylum tricornutum, the growth medium (7.1) is made up by

adding nutrients to either natural [salinity = (30 ± 5) g/kg] or synthetic sea water (approximate

salinity = 33 g/kg). For Skeletonema sp., the use of natural sea water may be necessary for the long-term

maintenance of cultures and may also be necessary for the test medium, because a synthetic sea water

medium may not always support sufficient growth to meet the test quality criteria. If natural sea water

is used, care shall be taken to ensure that it is not polluted.

Prepare synthetic sea water with the composition given in Table 1 (approximate salinity = 33 g/kg). All

the chemicals used shall be of analytical grade.
Table 1 — Synthetic sea water
Concentration of salt in synthetic sea water
Salt
g/l
NaCl 22
MgCl ⋅6H O 9,7
2 2
Na SO (anhydrous) 3,7
2 4
CaCl (anhydrous) 1,0
KCl 0,65
NaHCO 0,20
H BO 0,023
3 3

Filter the sea water (synthetic as well as natural one) through a 0,45 µm membrane filter in order to

remove particulate material and algae.
5.2.3 Nutrients

Prepare three nutrient stock solutions in water, with the compositions given in Table 2.

2) Concentrated Phaeodactylum tricornutum cultures can be supplied by MicroBioTests Inc. Mariakerke-Gent,

Belgium. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an

endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same

results.
4 © ISO 2016 – All rights reserved
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ISO 10253:2016(E)
Table 2 — Nutrient stock solutions
Nutrient Concentration in stock solution Final concentration in test solution
Stock solution 1
FeCl ⋅6H O 48 mg/l 149 µg/l (Fe)
3 2
MnCl ⋅4H O 144 mg/l 605 µg/l (Mn)
2 2
ZnSO ⋅7H O 45 mg/l 150 µg/l (Zn)
4 2
CuSO ⋅5H O 0,157 mg/l 0,6 µg/l (Cu)
4 2
CoCl ⋅6H O 0,404 mg/l 1,5 µg/l (Co)
2 2
H BO 1 140 mg/l 3,0 mg/l (B)
3 3
Na EDTA 1 000 mg/l 15,0 mg/l
Stock solution 2
Thiamin hydrochloride 50 mg/l 25 µg/l
Biotin 0,01 mg/l 0,005 µg/l
Vitamin B (cyanocobalamin) 0,10 mg/l 0,05 µg/l
Stock solution 3
K PO 3,0 g/l 3,0 mg/l; 0,438 mg/l P
3 4
NaNO 50,0 g/l 50,0 mg/l; 8,24 mg/l N
Na SiO ⋅5H O 14,9 g/l 14,9 mg/l; 1,97 mg/l Si
2 3 2

These stock solutions have to be diluted (see 7.1 and Annex A) to obtain the final nutrient concentrations

in the test solutions.
All the chemicals used shall be of reagent grade quality.

Sterilize stock solutions by filtration through a 0,2 µm membrane filter. Stock solutions 1 and 3 may

also be sterilized by autoclaving at 120 °C for at least 15 min.
Store the stock solutions in the dark at 4 °C for a maximum of two months.
6 Apparatus

All equipment which comes into contact with the test medium shall be made of glass or a chemically

inert material.
Use normal laboratory apparatus and in addition the following.

6.1 Temperature-controlled cabinet or room, with a white fluorescent light providing continuous

even illumination, suitable for the lighting requirements specified for the test in 7.6.

6.2 Apparatus for measuring algal cell density, preferably a particle counter or a microscope with a

counting chamber.

Alternatively, determine the state of growth of the algal cultures by an indirect procedure using for

instance a fluorimeter [e.g. in vitro fluorescence (Reference [4])], when sufficiently sensitive and if

shown to be sufficiently well correlated with the cell density. The apparatus used shall be capable of

accurately measuring cell densities as low as the inoculum cell density and to distinguish between algal

growth and disturbing effects, for example, the presence of particulate matter and colour of the sample.

Spectrophotometers may be sufficiently sensitive to measure 10 algal cells/ml providing a sufficient

path length (up to 10 cm) can be used. However, this technique is particularly sensitive to interferences

from suspended material and coloured substances at low cell densities.

Annex B describes a procedure to perform the spectrophotometric measurements of the algal cell

density.
© ISO 2016 – All rights reserved 5
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ISO 10253:2016(E)

6.3 Culture flasks, e.g. conical flasks of capacity 250 ml, with air-permeable stoppers.

6.4 Apparatus for membrane filtration, filters of mean pore diameter 0,2 µm and 0,45 µm.

6.5 Autoclave.
6.6 pH-meter.
7 Procedure
7.1 Preparation of growth medium

Add 15 ml of nutrient stock solution 1, 0,5 ml of nutrient stock solution 2 and 1 ml of nutrient stock

solution 3 (see Table 2) to approximately 900 ml of natural or synthetic sea water (5.2.2) and then make

up to 1 l with the same sea water.

Adjust the pH to 8,0 ± 0,2 by adding dilute hydrochloric acid or sodium hydroxide solution.

NOTE Complexing of heavy metals by the relatively high concentration of EDTA present in the nutrient

medium can preclude the testing of effluents containing heavy metals. For guidance, see ISO 14442.

7.2 Preparation of pre-culture and inoculum

A pre-culture shall be started two to four days before the beginning of the test (see Note in 5.1).

Add sufficient cells from the algal stock culture to the growth medium (7.1) to obtain a sufficiently low

3 4

cell density of, e.g. 2 × 10 algal cells/ml to 10 algal cells/ml for three days pre-culturing, in order to

maintain exponential growth until the start of the test. The pre-culture shall be incubated under the

same conditions as those in the test. Measure the cell density in the pre-culture immediately before

use, in order to calculate the required inoculum volume.
7.3 Choice of test concentrations

Algae should be exposed to concentrations of the test substance in a geometric series with a ratio not

exceeding 3,2 (e.g. 1,0 mg/l, 1,8 mg/l, 3,2 mg/l, 5,6 mg/l and 10 mg/l).

The concentrations should be chosen to obtain at least one inhibition below and one inhibition above

the intended EC(r) parameter. Additionally, at least two levels of inhibition between 10 % and 90 %

should be included in order to provide data for regression analysis.

NOTE A suitable concentration range is best determined by carrying out a preliminary range-finding test

covering several orders of magnitude of difference between test concentrations. Replication of test concentrations

is not a requirement in the preliminary test.
7.4 Preparation of test substance stock solutions

Prepare stock solutions by dissolving the test substance in growth medium (7.1). Modifications

are necessary when the test substance does not readily dissolve in the test medium, as described in

ISO 14442 and ISO 5667-16.

When testing water samples (effluent, elutriates, etc.), spike them with the nutrient stock solutions

(5.2.3) and, if appropriate, to avoid growth inhibition due to a too low salinity, with sea water salts

(5.2.2) to bring the salinity of the sample up to the salinity of the growth medium. An example of a

dilution scheme for sea water samples is given in Annex A.

Normally, carry out the test without adjusting the pH after addition of the test substance. However,

some substances may exert a toxic effect due to extreme acidity or alkalinity. In order to determine the

toxicity of a substance independent of pH, adjust the pH of the master stock solution (before the dilution

6 © ISO 2016 – All rights reserved
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ISO 10253:2016(E)

in series) to 8,0 ± 0,2, using either hydrochloric acid or sodium hydroxide solution. The concentration of

acid or base should be such as the volume change is as small as possible.
7.5 Preparation of test and control batches

Prepare the test batches by mixing the appropriate volumes of test substance stock solutions (7.4),

growth medium (7.1) and inoculum (7.2) in the test vessels. The total volume, concentration of added

growth medium nutrients and cell density shall be the same in all test batches.

The initial cell density shall be sufficiently low to allow exponential growth in the control culture

throughout the test duration, or for at least the time required to achieve a factor 16 increase of cell

density, without a pH drift of more than 1,0 pH units (see Clause 8). Therefore, the initial cell densities

shall not exceed 10 algal cells/ml.

A lower initial cell density (three to fivefold lower) is recommended for Skeletonema sp. due to its

higher cell volume and growth rate. Take into account the chain-formation of Skeletonema sp. when

determining the initial cell density.

Prepare at least three replicates for each test substance concentration. To a further six vessels, add only

growth medium and inoculum with no test substance. These vessels serve as controls.

If appropriate (e.g. environmental, coloured or turbid samples), prepare a concentration series,

single vessels only, of the test substance without algae to serve as a background for the cell density

determinations.

The test design may be altered, based on statistical consideration, to increase the number of

concentrations and reduce the number of replicates per concentration.

Measure the pH of samples of each concentration of the test solution and of the controls.

7.6 Incubation

The test vessels shall be sufficiently covered to avoid airborne contamination and to reduce water

evaporation, but they shall not be airtight in order to allow CO to enter the vessels. Incubate the test

vessels at a nominal temperature of 20 °C, under continuous white light. The temperature shall not vary

by more than 2 °C during the test. The photon fluence rate at the average level of the test solutions shall

2 2

be uniform and in the range 60 µmol/m s to 120 µmol/m s, when measured in the photosynthetically

effective wavelength range of 400 nm to 700 nm using an appropriate receptor.

It is important to note that the method of measurement, and in particular the type of receptor

(collector), affects the measured value. Spherical receptors (which respond to direct and reflected light

from all angles above and below the plane of measurement) and “cosine” receptors (which respond to

light from all angles above the measurement plane) are preferred to unidirectional receptors and give

higher readings for a multi-point light source of the type described in Note 1.

NOTE 1 The light intensity specified above could be obtained using between four to seven fluorescent lamps

(power rating 30 W) of the universal white, natural type, i.e. a rated colour of standard colour 2 (a colour temperature

of 4 300 K) according to IEC 60081 at a distance of approximately 0,35 m from the algal culture medium.

NOTE 2 For light-measuring instruments calibrated in lx, an equivalent range of 6 000 lx to 10 000 lx is

acceptable for the test.

Continuously and gently shake the cultures in order to keep the cells in free suspension and to facilitate

CO mass transfer from air to water, and in turn, reduce pH shift.
7.7 Measurements

Measure the cell density in each test vessel, including the controls, at least every (24 ± 2) h. These

measurements are usually made on small volumes which are removed from the test solution and not

replaced. Before measurement, the test batches should be mixed thoroughly.
© ISO 2016 – All rights reserved 7
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ISO 10253:2016(E)

The test shall last for (72 ± 2) h. At the end of the test, measure the pH of each test batch (7.5) and of the

controls (7.5). Confirm the appearance of the cells and the identity of the test organism by microscopy.

8 Validity criteria
Consider the test valid if the following conditions are met.

a) The control cell density shall have increased by a factor of more than 16 in 72 h. This increase

corresponds to a specific growth rate (9.2) of 0,9 d .

NOTE The growth rate of the algae under the specified conditions may vary among different strains

of the species. Results from interlaboratory tests indicate that growth rates above 1,0 d are normally

obtained with both species.

b) The variation coefficient of the control specific growth rates should not exceed 7 %.

c) The control pH shall not have increased by more than 1,0 during the test.

Variations in pH during the test can have a significant influence on the results and therefore a limit

of ±1,0 unit is set. These variations however should always be kept as low as possible, for example, by

performing continuous shaking during the test.
9 Interpretation of data
9.1 Plotting growth curves

Tabulate the cell density measurements, or other parameters correlated with cell density in the test

media, according to the concentration of test sample and the time of measurement.

Plot a growth curve for each test concentration and control, as a graph of the logarithm of the mean

cell density against time. A linear growth curve indicates exponential growth, whereas a levelling off

indicates that cultures have entered the stationary phase.

If the control cultures show declining growth rate towards the end of the exposure period, inhibited

cultures may tend to catch up with the controls, falsely indicating a decreased growth inhibiting

effect. In this case, perform the calculations of growth rate and growth inhibition based on the last

measurement within the exponential growth period in the control cultures.
9.2 Calculation of percentage inhibition

Calculate first the average specific growth rate, μ, for each test culture, using Formula (1):

lnNN− ln
μ = (1)
tt−
L 0
where
t is the time of test start;

t is the time of test termination or the time of the last measurement within the exponential

growth period in the control (9.1);
N is the nominal initial cell density;
N is the measured cell density at time t .
L L
Altern
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 10253
Troisième édition
2016-11-15
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition
de la croissance des algues marines
avec Skeletonema sp. et
Phaeodactylum tricornutum
Water quality — Marine algal growth inhibition test with
Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum
Numéro de référence
ISO 10253:2016(F)
ISO 2016
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ISO 10253:2016(F)
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ISO 10253:2016(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Matériels ....................................................................................................................................................................................................................... 3

5.1 Organismes d’essai .............................................................................................................................................................................. 3

5.2 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................... 4

5.2.1 Eau .................. ......................................................................................................................... ..................................................... 4

5.2.2 Eau de mer ............................................................................................................................................................................ 4

5.2.3 Nutriments ............................................................................................................................................................................ 4

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 5

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 6

7.1 Préparation du milieu de croissance.................................................................................................................................... 6

7.2 Préparation de la préculture et de l’inoculum ............................................................................................................. 6

7.3 Sélection des concentrations de l’essai .............................................................................................................................. 6

7.4 Préparation des solutions mères de substance d’essai ........................................................................................ 6

7.5 Préparation des lots d’essai et des témoins ................................................................................................................... 7

7.6 Incubation ................................................................................................................................................................................................... 7

7.7 Mesurages ................................................................................................................................................................................................... 8

8 Critères de validité ............................................................................................................................................................................................. 8

9 Interprétation des données ...................................................................................................................................................................... 8

9.1 Tracé des courbes de croissance ............................................................................................................................................. 8

9.2 Calcul du pourcentage d’inhibition ....................................................................................................................................... 9

9.3 Détermination des valeurs de EC(r) ....................................................................................................................................

x 9

10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................10

11 Interprétation des résultats ..................................................................................................................................................................10

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................10

Annexe A (informative) Préparation des gammes de dilution des mélanges en eau de mer

(effluents ou élutriats) ................................................................................................................................................................................12

Annexe B (informative) Mode opératoire d’essai à partir d’inocula algaux de conservation,

avec mesurage direct de la croissance algale en cuve spectrophotométrique .................................13

Annexe C (informative) Données de performance ..............................................................................................................................19

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................20

© ISO 2016 – Tous droits réservés iii
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ISO 10253:2016(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, Sous-comité 5,

Méthodes biologiques.

Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 10253:2006), qui a fait l’objet de la

révision technique suivante:
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 10253:2016(F)
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition de la croissance des
algues marines avec Skeletonema sp. et Phaeodactylum
tricornutum

AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques

courantes de laboratoire. Le présent document ne prétend pas couvrir tous les problèmes de

sécurité potentiels associés à son utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur de mettre

en place des pratiques d’hygiène et de sécurité adéquates et de s’assurer de la conformité avec

toutes les dispositions réglementaires nationales.

IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés conformément au présent document le

soient par du personnel qualifié.
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode de détermination de l’inhibition de la croissance des algues

marines unicellulaires Skeletonema sp. et Phaeodactylum tricornutum provoquée par des substances et

des mélanges présents dans l’eau de mer (effluents, élutriats, etc.).

Cette méthode peut être utilisée pour soumettre à l’essai des substances facilement solubles dans l’eau

et qui ne sont pas sensiblement dégradées ou éliminées d’autre manière du milieu d’essai.

NOTE Avec les modifications telles que décrites dans l’ISO 14442 et l’ISO 5667-16, il est possible d’évaluer

par cet essai les effets inhibiteurs des matières organiques et inorganiques peu solubles, des composés volatils,

des composés métalliques, des effluents, des échantillons d’eaux marines et des élutriats de sédiments.

2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 5667-16, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques

des échantillons

ISO 14442, Qualité de l’eau — Lignes directrices pour essais d’inhibition de la croissance algale avec des

matières peu solubles, des composés volatils, des métaux et des eaux résiduaires
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp
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ISO 10253:2016(F)
3.1
densité cellulaire
nombre de cellules par unité de volume du milieu
Note 1 à l’article: La densité cellulaire est exprimée en x cellules/ml.
3.2
taux de croissance spécifique

taux proportionnel de l’augmentation de la densité cellulaire par unité de temps:

1 dx
μ =× (/1 jour)
x dt
x est la densité cellulaire, exprimée en cellules par millilitre;
t est le temps, exprimé en jours.

Note 1 à l’article: Le taux de croissance spécifique est exprimé en inverse de jours (j ).

3.3
milieu de croissance

mélange d’eau de mer et de nutriments utilisé pour les précultures et les témoins

3.4
milieu d’essai

mélange d’eau de mer, de nutriments [milieu de croissance (3.3)] et de matériel d’essai dans lequel sont

incubées les cellules algales
3.5
lot d’essai

mélange d’eau de mer, de nutriments et de matériel d’essai [milieu d’essai (3.4)] inoculé avec les algues

3.6
témoin

mélange d’eau de mer, de nutriments [milieu de croissance (3.3)] sans matériel d’essai, inoculé avec

les algues
3.7
concentration efficace
EC(r)

concentration de la substance d’essai qui entraîne une réduction de x % du taux de croissance spécifique

par rapport à celui des témoins
4 Principe

Des souches monospécifiques d’algues sont cultivées pendant plusieurs générations dans un milieu

défini contenant une plage de concentrations de la substance d’essai, préparées en mélangeant des

quantités adéquates de concentré de nutriments, d’eau de mer et de solutions mères de la substance

d’essai, et un inoculum de cellules algales à croissance exponentielle. Les solutions d’essai sont incubées

pendant une période de (72 ± 2) h, pendant laquelle la densité cellulaire est mesurée dans chacune

des solutions à intervalles réguliers au moins toutes les (24 ± 2) h. L’inhibition est mesurée en tant

que réduction du taux de croissance spécifique, par rapport aux cultures témoins cultivées dans des

conditions identiques.
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ISO 10253:2016(F)
5 Matériels
5.1 Organismes d’essai
Utiliser l’une quelconque des algues marines suivantes:
a) Skeletonema sp. (CCAP 1077/1C, NIVA BAC 1); ou
b) Phaeodactylum tricornutum Bohlin (CCAP 1052/1A, SA G 1090-1a, NIVA BAC 2).

Ces algues sont des espèces importantes et largement représentées du phytoplancton (phylum

Bacillariophyta) dans les zones estuariennes et côtières.

Les algues recommandées sont disponibles sous la forme de cultures algales monospécifiques, non

axéniques auprès des sources suivantes.
NIVA
Norwegian Institute for Water Research
Gaustadaléen 21
N 0349 Oslo
Norvège
CCAP
Dunstaffnage Marine Laboratory
P O Box 3 Oban
Argyll PA37 1QA
Royaume-Uni
SAG
Collection of Algal Cultures
University of Göttingen
Albrecht-von-Haller Institute for Plant Science
Untere Karspüle 2
37073 Göttingen
Allemagne

Les cultures mères peuvent être conservées dans le milieu décrit en 7.1. Il est nécessaire de procéder

à des repiquages réguliers. Des intervalles hebdomadaires peuvent s’avérer nécessaires dans le cas

de Skeletonema sp., alors que des intervalles de deux ou trois semaines peuvent suffire dans le cas de

Phaeodactylum tricornutum. Les cultures mères peuvent aussi être conservées pendant des périodes

plus longues dans des milieux algaux plus riches tels que ceux recommandés par la collection de

1) Les éditions précédentes du présent document suggéraient l’emploi de deux souches de Skeletonema costatum.

Une étude taxonomique du genre Skeletonema indique que plusieurs souches identifiées à l’origine comme

S. costatum pourraient en réalité appartenir à d’autres espèces. À la lumière de cette étude, et dans le but d’assurer

une continuité par rapport aux souches acceptées jusqu’ici, la présente révision du présent document a remplacé la

référence Skeletonema costatum par Skeletonema sp. afin d’éviter la non-conformité des laboratoires utilisant des

souches différentes.
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ISO 10253:2016(F)

souches. Il est recommandé de conserver la culture mère dans le milieu décrit en 7.1 et dans une phase

de croissance exponentielle, juste avant de préparer la préculture pour essai comme décrit en 7.2.

NOTE Il est possible de conserver des cultures concentrées de la diatomée Phaeodactylum tricornutum

pendant plusieurs mois sans qu’elle perde sa viabilité. Les cultures mères pour les essais de toxicité peuvent

aisément être préparées à partir des cultures concentrées ainsi conservées .
5.2 Réactifs
5.2.1 Eau

Toute eau utilisée pour la préparation de l’eau de mer synthétique, du milieu de croissance et des solutions

de substance d’essai doit être déionisée ou d’une pureté équivalente. Veiller tout particulièrement à

éviter la contamination de l’eau par des substances inorganiques ou organiques pendant la préparation

et la conservation. Il ne faut pas utiliser de matériel fabriqué avec du cuivre.
5.2.2 Eau de mer

Pour la culture et l’essai de Phaeodactylum tricornutum, le milieu de culture (7.1) est obtenu en

ajoutant des nutriments à de l’eau de mer naturelle [salinité = (30 ± 5) g/kg] ou synthétique (salinité

approximative = 33 g/kg). Dans le cas de Skeletonema sp., l’utilisation d’eau de mer naturelle peut

s’avérer nécessaire pour la perpétuation des souches à long terme et peut aussi s’avérer nécessaire

pour le milieu d’essai, car un milieu d’eau de mer synthétique peut ne pas toujours assurer la croissance

minimale satisfaisant aux critères de qualité de l’essai. Si de l’eau de mer naturelle est utilisée, il faut

faire attention à garantir qu’elle n’est pas polluée.

Préparer l’eau de mer synthétique d’après la composition indiquée dans le Tableau 1 (salinité

approximative = 33 g/kg). Tous les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique.

Tableau 1 — Eau de mer synthétique
Concentration de sel dans l’eau de mer synthétique
Sel
g/l
NaCl 22
MgCl ⋅6H O 9,7
2 2
Na SO (anhydre) 3,7
2 4
CaCl (anhydre) 1,0
KCl 0,65
NaHCO 0,20
H BO 0,023
3 3

Filtrer l’eau de mer (qu’elle soit synthétique ou naturelle) sur une membrane filtrante de 0,45 μm pour

éliminer les particules et les algues.
5.2.3 Nutriments

Préparer trois solutions mères nutritives avec de l’eau, selon les compositions indiquées dans le

Tableau 2.

2) Des cultures concentrées de Phaeodactylum tricornutum peuvent être obtenues auprès de MicroBioTests Inc.

Mariakerke-Gent, Belgique. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et

ne signifie nullement que l’ISO approuve ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il peut être

démontré qu’ils permettent d’obtenir les mêmes résultats.
4 © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO 10253:2016(F)
Tableau 2 — Solutions mères nutritives
Nutriment Concentration dans la solution Concentration finale dans la solution
mère d’essai
Solution mère 1
FeCl ⋅6H O 48 mg/l 149 µg/l (Fe)
3 2
MnCl ⋅4H O 144 mg/l 605 µg/l (Mn)
2 2
ZnSO ⋅7H O 45 mg/l 150 µg/l (Zn)
4 2
CuSO ⋅5H O 0 157 mg/l 0,6 µg/l (Cu)
4 2
CoCl ⋅6H O 0 404 mg/l 1,5 µg/l (Co)
2 2
H BO 1 140 mg/l 3,0 mg/l (B)
3 3
Na EDTA 1 000 mg/l 15,0 mg/l
Solution mère 2
Chlorhydrate de thiamine 50 mg/l 25 µg/l
Biotine 0,01 mg/l 0 005 µg/l
Vitamine B (cyanocobala-
0,10 mg/l 0,05 µg/l
mine)
Solution mère 3
K PO 3,0 g/l 3,0 mg/l; 0,438 mg/l P
3 4
NaNO 50,0 g/l 50,0 mg/l; 8,24 mg/l N
Na SiO ⋅5H O 14,9 g/l 14,9 mg/l; 1,97 mg/l Si
2 3 2

Ces solutions mères doivent être diluées (voir 7.1 et l’Annexe A) afin d’obtenir les concentrations finales

des nutriments dans les solutions d’essai.

Tous les produits chimiques utilisés doivent être des réactifs de qualité reconnue.

Stériliser les solutions mères par filtration sur membrane de 0,2 μm. Il est aussi possible de stériliser

les solutions mères 1 et 3 en autoclave à 120 °C pendant au moins 15 min.

Conserver les solutions mères à l’abri de la lumière à 4 °C pendant deux mois au maximum.

6 Appareillage

Tout le matériel entrant en contact avec le milieu d’essai doit être fabriqué en verre ou à partir d’un

matériau chimiquement inerte.
Utiliser l’appareillage normal de laboratoire en sus de ce qui suit.

6.1 Enceinte ou pièce à température contrôlée, avec un tube fluorescent blanc fournissant un

éclairage uniforme continu, convenant aux exigences de luminosité spécifiées pour l’essai en 7.6.

6.2 Appareillage pour le mesurage de la densité cellulaire des algues, de préférence un compteur

de particules ou un microscope sur cellule de comptage.

Sinon, déterminer l’état de la croissance des cultures algales par un mode opératoire indirect, en

utilisant par exemple un fluorimètre [par exemple fluorescence in vitro (voir la Référence [4])],

lorsqu’il est suffisamment sensible et s’il est démontré que sa corrélation avec la densité cellulaire

est suffisamment élevée. L’appareillage utilisé doit être capable de mesurer exactement les densités

cellulaires aussi faibles que la densité cellulaire de l’inoculum et de faire la distinction entre la croissance

algale et les effets perturbateurs, par exemple présence de particules et couleur de l’échantillon. Des

spectrophotomètres peuvent être suffisamment sensibles pour mesurer 10 cellules d’algue/ml à

condition qu’une longueur de trajet suffisante (jusqu’à 10 cm) puisse être utilisée. Cependant, cette

technique est particulièrement sensible aux interférences des matières en suspension et des substances

colorées à de faibles densités cellulaires.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 5
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ISO 10253:2016(F)

L’Annexe B décrit un mode opératoire pour le mesurage spectrophotométrique de la densité cellulaire

des algues.

6.3 Flacons de culture, par exemple des flacons coniques d’une capacité de 250 ml, avec des bouchons

perméables à l’air.

6.4 Appareillage pour filtration sur membrane, filtres de diamètre moyen de pore de 0,2 µm et

0,45 µm.
6.5 Autoclave.
6.6 pH-mètre.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation du milieu de croissance

Ajouter 15 ml de solution mère nutritive 1, 0,5 ml de solution mère nutritive 2 et 1 ml de solution mère

nutritive 3 (voir le Tableau 2) à environ 900 ml d’eau de mer naturelle ou synthétique (5.2.2); puis

compléter à 1 l avec la même eau de mer.

Ajuster le pH à 8,0 ± 0,2 en ajoutant une solution diluée d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium.

NOTE La complexation de métaux lourds par une concentration relativement élevée d’EDTA présente dans

le milieu nutritif peut empêcher l’essai sur les effluents contenant des métaux lourds. Pour des lignes directrices,

voir l’ISO 14442.
7.2 Préparation de la préculture et de l’inoculum

Il est nécessaire de démarrer une préculture deux à quatre jours avant le début de l’essai (voir la Note

en 5.1).

Ajouter suffisamment de cellules de la culture mère au milieu de croissance (7.1) pour obtenir une

3 4

densité cellulaire suffisamment faible de, par exemple, 2 × 10 cellules d’algue/ml à 10 cellules

d’algue/ml pour trois jours de préculture, afin de conserver la croissance exponentielle jusqu’au début

de l’essai. Incuber la préculture dans les mêmes conditions que celles de l’essai. Mesurer la densité

cellulaire de la préculture juste avant l’utilisation, pour calculer le volume adéquat de l’inoculum.

7.3 Sélection des concentrations de l’essai

Il convient d’exposer les algues aux concentrations de la substance d’essai dans une suite géométrique

de raison inférieure ou égale à 3,2 (par exemple 1,0 mg/l, 1,8 mg/l, 3,2 mg/l, 5,6 mg/l et 10 mg/l).

Il convient de choisir les concentrations de manière à obtenir au moins une inhibition au-dessous et une

inhibition au-dessus de la valeur prévue pour le paramètre EC(r) . De plus, il convient d’inclure au moins

deux niveaux d’inhibition entre 10 % et 90 % pour fournir des données pour l’analyse de régression.

NOTE La meilleure façon de déterminer une plage de concentrations adéquate consiste à effectuer un essai

préliminaire de détection de plage, couvrant plusieurs ordres de grandeur de différence entre les concentrations

d’essai. La répétition des concentrations d’essai n’est pas exigée pour l’essai préliminaire.

7.4 Préparation des solutions mères de substance d’essai

Préparer les solutions mères en dissolvant la substance d’essai dans le milieu de croissance (7.1).

Certaines modifications sont nécessaires lorsque la substance d’essai ne se dissout pas facilement dans

le milieu d’essai, comme décrit dans l’ISO 14442 et l’ISO 5667-16.
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ISO 10253:2016(F)

Si les essais portent sur des échantillons d’eau (effluent, élutriats, etc.), doper ceux-ci avec des solutions

mères nutritives (5.2.3) et, le cas échéant, afin d’éviter toute inhibition de la croissance en raison d’une

salinité trop faible, avec des sels d’eau de mer (5.2.2) afin d’amener la salinité de l’échantillon à la salinité

du milieu de croissance. L’Annexe A fournit un exemple de protocole de dilution pour les échantillons

d’eau de mer.

Effectuer l’essai normalement sans ajuster le pH après addition de la substance d’essai. Cependant,

certaines substances peuvent avoir un effet toxique en raison d’une acidité ou d’une basicité extrême.

Afin de déterminer la toxicité d’une substance indépendamment du pH, ajuster le pH de la solution mère

générale (avant la gamme de dilution) à 8,0 ± 0,2, au moyen d’une solution d’acide chlorhydrique ou

d’hydroxyde de sodium. Il convient que la concentration en acide ou en base soit telle que le changement

de volume soit le plus petit possible.
7.5 Préparation des lots d’essai et des témoins

Préparer les lots d’essai en mélangeant des volumes adéquats de solutions mères de substance

d’essai (7.4), de milieu de croissance (7.1) et d’inoculum (7.2) dans les récipients d’essai. Le volume total,

la concentration en nutriments ajoutés au milieu de croissance et la densité cellulaire doivent être les

mêmes dans tous les lots d’essai.

La densité cellulaire initiale doit être suffisamment faible pour permettre une croissance exponentielle

dans la culture témoin pendant toute la durée de l’essai, ou a minima pendant le laps de temps requis

pour atteindre une augmentation d’un facteur 16 de la densité cellulaire, sans dérive du pH supérieure

à 1,0 unité de pH (voir l’Article 8). Par conséquent, les densités cellulaires initiales ne doivent pas

dépasser 10 cellules d’algue/ml.

Une plus faible densité cellulaire initiale (de trois à cinq fois inférieure) est recommandée pour

Skeletonema sp. en raison de son volume cellulaire plus important et de son taux de croissance plus

élevé. Prendre en considération la formation de chaînes par Skeletonema sp. lors de la détermination de

la densité cellulaire initiale.

Préparer trois réplicats au moins pour chaque concentration de substance d’essai. Ajouter, à six autres

récipients, uniquement du milieu de croissance et de l’inoculum sans substance d’essai. Ces récipients

servent de témoins.

Le cas échéant (par exemple, échantillons environnementaux, colorés ou turbides), préparer une seule

gamme de concentrations de la substance d’essai, un seul récipient à chaque fois, sans algue pour servir

de fond pour les déterminations de la densité cellulaire.

Le plan d’essai peut être modifié, sur la base de considérations statistiques, pour augmenter le nombre

de concentrations et réduire le nombre de réplicats par concentration.

Mesurer le pH des échantillons de chaque concentration de la solution d’essai et des témoins.

7.6 Incubation

Les récipients d’essai doivent être suffisamment recouverts pour éviter toute contamination aérienne

et pour réduire l’évaporation de l’eau; ils ne doivent cependant pas être étanches, pour permettre le

passage du CO vers l’intérieur des récipients. Incuber les récipients d’essai à une température nominale

de 20 °C, sous une lumière blanche continue. La température ne doit pas varier de plus de 2 °C au cours

de l’essai. Le débit de fluence des photons au niveau moyen des solutions d’essai doit être uniforme

2 2

et se trouver dans la plage de 60 µmol/m ⋅s à 120 µmol/m ⋅s, lorsqu’il est mesuré dans la gamme

des longueurs d’onde efficaces du point de vue photosynthétique de 400 nm à 700 nm au moyen d’un

récepteur approprié.

Il est important de noter que la méthode de mesure, en particulier le type de récepteur (détecteur),

influe sur la valeur mesurée. Les récepteurs sphériques (qui réagissent à la lumière directe et réfléchie

en provenance de tous les angles au-dessus et au-dessous du plan de mesurage) et les récepteurs

«cosinus» (qui réagissent à la lumière en provenance de tous les angles au-dessus du plan de mesurage)

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