ISO 10253:2016
(Main)Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum
Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum
ISO 10253:2016 specifies a method for the determination of the inhibition of growth of the unicellular marine algae Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum by substances and mixtures contained in sea water or by environmental water samples (effluents, elutriates, etc.). The method can be used for testing substances that are readily soluble in water and are not significantly degraded or eliminated in any other way from the test medium.
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance des algues marines avec Skeletonema sp. et Phaeodactylum tricornutum
ISO 10253:2016 spécifie une méthode de détermination de l'inhibition de la croissance des algues marines unicellulaires Skeletonema sp. et Phaeodactylum tricornutum provoquée par des substances et des mélanges présents dans l'eau de mer (effluents, élutriats, etc.). Cette méthode peut être utilisée pour soumettre à l'essai des substances facilement solubles dans l'eau et qui ne sont pas sensiblement dégradées ou éliminées d'autre manière du milieu d'essai.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10253
Third edition
2016-11-15
Water quality — Marine algal
growth inhibition test with
Skeletonema sp. and Phaeodactylum
tricornutum
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition de la croissance des algues
marines avec Skeletonema sp. et Phaeodactylum tricornutum
Reference number
ISO 10253:2016(E)
©
ISO 2016
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ISO 10253:2016(E)
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Materials . 3
5.1 Test organisms . 3
5.2 Reagents. 4
6 Apparatus . 5
7 Procedure. 6
7.1 Preparation of growth medium . 6
7.2 Preparation of pre-culture and inoculum . 6
7.3 Choice of test concentrations . 6
7.4 Preparation of test substance stock solutions . 6
7.5 Preparation of test and control batches . 7
7.6 Incubation . 7
7.7 Measurements . 7
8 Validity criteria . 8
9 Interpretation of data . 8
9.1 Plotting growth curves . 8
9.2 Calculation of percentage inhibition . 8
9.3 Determination of EC(r) .
x 9
10 Expression of results . 9
11 Interpretation of results . 9
12 Test report . 9
Annex A (informative) Preparation of dilution series of mixtures in sea water(effluents
or elutriates) .11
Annex B (informative) Test procedure starting from stored algal inocula, and with direct
measurement of algal growth in spectrophotometric cells .12
Annex C (informative) Performance data .18
Bibliography .19
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ISO 10253:2016(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www.iso.org/iso/foreword.html.
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 10253:2006), which has been technically
revised.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10253:2016(E)
Water quality — Marine algal growth inhibition test with
Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this document be
carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This document specifies a method for the determination of the inhibition of growth of the unicellular
marine algae Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum by substances and mixtures contained in
sea water or by environmental water samples (effluents, elutriates, etc.).
The method can be used for testing substances that are readily soluble in water and are not significantly
degraded or eliminated in any other way from the test medium.
NOTE With modifications, as described in ISO 14442 and ISO 5667–16, the inhibitory effects of poorly
soluble organic and inorganic materials, volatile compounds, metal compounds, effluents, marine water samples
and elutriates of sediments can be tested.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 14442, Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials,
volatile compounds, metals and waste water
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: available at http://www.iso.org/obp
3.1
cell density
number of cells per unit volume of medium
Note 1 to entry: The cell density is expressed as x cells/ml.
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ISO 10253:2016(E)
3.2
specific growth rate
µ
proportional rate of increase in cell density per unit of time:
1 dx
μ =× (/1 day)
x dt
where
x is the cell density, expressed in cells per millilitre;
t is the time, expressed in days.
−1
Note 1 to entry: Specific growth rate is expressed in inverse days (day ).
3.3
growth medium
mixture of sea water and nutrients which is used for pre-cultures and controls
3.4
test medium
mixture of sea water, nutrients [growth medium (3.3)] and test material in which algal cells are
incubated
3.5
test batch
mixture of sea water, nutrients and test material [test medium (3.4)] inoculated with algae
3.6
control
mixture of sea water, nutrients [growth medium (3.3)] without test material, inoculated with algae
3.7
effective concentration
EC(r)
x
concentration of test substance which results in an x % reduction in specific growth rate relative to the
controls
4 Principle
Mono-specific algal strains are cultured for several generations in a defined medium containing a
range of concentrations of the test substance, prepared by mixing appropriate quantities of nutrient
concentrate, sea water, stock solutions of the test substance, and an inoculum of exponentially growing
algal cells. The test solutions are incubated for a period of (72 ± 2) h, during which the cell density
in each is measured at intervals of at least every (24 ± 2) h. Inhibition is measured as a reduction in
specific growth rate, relative to control cultures grown under identical conditions.
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ISO 10253:2016(E)
5 Materials
5.1 Test organisms
Use either of the following marine algae:
1)
a) Skeletonema sp. (CCAP 1077/1C, NIVA BAC 1); or
b) Phaeodactylum tricornutum Bohlin (CCAP 1052/1A, SAG 1090-1a, NIVA BAC 2).
These algae are important and widely distributed phytoplankton species (phylum Bacillariophyta) in
estuarine and coastal areas.
The recommended algae are available in unialgal, non-axenic cultures from the following sources.
NIVA
Norwegian Institute for Water Research
Gaustadaléen 21
N 0349 Oslo
Norway
CCAP
Dunstaffnage Marine Laboratory
P O Box 3 Oban
Argyll PA37 1QA
United Kingdom
SAG
Collection of Algal Cultures
University of Göttingen
Albrecht-von-Haller Institute for Plant Science
Untere Karspüle 2
37073 Göttingen
Germany
Stock cultures may be maintained in the medium described in 7.1. Regular subculturing is necessary.
Weekly intervals may be necessary for Skeletonema sp., every two or three weeks may be sufficient
for Phaeodactylum tricornutum. The stock cultures may also be maintained for extended periods on
richer algal media such as those recommended by the culture collection. It is recommended to keep the
1) The previous editions of this document suggested the use of two strains of Skeletonema costatum. Following a
taxonomic review of the Skeletonema genus, several strains originally identified as S. costatum may in fact be other
species. In light of this and to enable continuity in the use of previously accepted strains, the present revision of this
document has changed the reference from Skeletonema costatum to Skeletonema sp. to avoid non-compliance for
labs that may be using different strains.
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ISO 10253:2016(E)
stock culture in the medium described in 7.1 and in an exponential growth phase immediately before
preparing the pre-culture for testing as described in 7.2.
NOTE Concentrated cultures of the diatom Phaeodactylum tricornutum can also be stored for several
months without losing their viability. Stock cultures for the toxicity tests can easily be prepared from the stored
2)
concentrated cultures .
5.2 Reagents
5.2.1 Water
All water used in the preparation of the synthetic sea water, growth medium and test substance
solutions shall be deionized or of equivalent purity. Take special care to avoid contamination of the
water by inorganic or organic substances during preparation and storage. Equipment made of copper
shall not be used.
5.2.2 Sea water
For culturing and testing Phaeodactylum tricornutum, the growth medium (7.1) is made up by
adding nutrients to either natural [salinity = (30 ± 5) g/kg] or synthetic sea water (approximate
salinity = 33 g/kg). For Skeletonema sp., the use of natural sea water may be necessary for the long-term
maintenance of cultures and may also be necessary for the test medium, because a synthetic sea water
medium may not always support sufficient growth to meet the test quality criteria. If natural sea water
is used, care shall be taken to ensure that it is not polluted.
Prepare synthetic sea water with the composition given in Table 1 (approximate salinity = 33 g/kg). All
the chemicals used shall be of analytical grade.
Table 1 — Synthetic sea water
Concentration of salt in synthetic sea water
Salt
g/l
NaCl 22
MgCl ⋅6H O 9,7
2 2
Na SO (anhydrous) 3,7
2 4
CaCl (anhydrous) 1,0
2
KCl 0,65
NaHCO 0,20
3
H BO 0,023
3 3
Filter the sea water (synthetic as well as natural one) through a 0,45 µm membrane filter in order to
remove particulate material and algae.
5.2.3 Nutrients
Prepare three nutrient stock solutions in water, with the compositions given in Table 2.
2) Concentrated Phaeodactylum tricornutum cultures can be supplied by MicroBioTests Inc. Mariakerke-Gent,
Belgium. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same
results.
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ISO 10253:2016(E)
Table 2 — Nutrient stock solutions
Nutrient Concentration in stock solution Final concentration in test solution
Stock solution 1
FeCl ⋅6H O 48 mg/l 149 µg/l (Fe)
3 2
MnCl ⋅4H O 144 mg/l 605 µg/l (Mn)
2 2
ZnSO ⋅7H O 45 mg/l 150 µg/l (Zn)
4 2
CuSO ⋅5H O 0,157 mg/l 0,6 µg/l (Cu)
4 2
CoCl ⋅6H O 0,404 mg/l 1,5 µg/l (Co)
2 2
H BO 1 140 mg/l 3,0 mg/l (B)
3 3
Na EDTA 1 000 mg/l 15,0 mg/l
2
Stock solution 2
Thiamin hydrochloride 50 mg/l 25 µg/l
Biotin 0,01 mg/l 0,005 µg/l
Vitamin B (cyanocobalamin) 0,10 mg/l 0,05 µg/l
12
Stock solution 3
K PO 3,0 g/l 3,0 mg/l; 0,438 mg/l P
3 4
NaNO 50,0 g/l 50,0 mg/l; 8,24 mg/l N
3
Na SiO ⋅5H O 14,9 g/l 14,9 mg/l; 1,97 mg/l Si
2 3 2
These stock solutions have to be diluted (see 7.1 and Annex A) to obtain the final nutrient concentrations
in the test solutions.
All the chemicals used shall be of reagent grade quality.
Sterilize stock solutions by filtration through a 0,2 µm membrane filter. Stock solutions 1 and 3 may
also be sterilized by autoclaving at 120 °C for at least 15 min.
Store the stock solutions in the dark at 4 °C for a maximum of two months.
6 Apparatus
All equipment which comes into contact with the test medium shall be made of glass or a chemically
inert material.
Use normal laboratory apparatus and in addition the following.
6.1 Temperature-controlled cabinet or room, with a white fluorescent light providing continuous
even illumination, suitable for the lighting requirements specified for the test in 7.6.
6.2 Apparatus for measuring algal cell density, preferably a particle counter or a microscope with a
counting chamber.
Alternatively, determine the state of growth of the algal cultures by an indirect procedure using for
instance a fluorimeter [e.g. in vitro fluorescence (Reference [4])], when sufficiently sensitive and if
shown to be sufficiently well correlated with the cell density. The apparatus used shall be capable of
accurately measuring cell densities as low as the inoculum cell density and to distinguish between algal
growth and disturbing effects, for example, the presence of particulate matter and colour of the sample.
4
Spectrophotometers may be sufficiently sensitive to measure 10 algal cells/ml providing a sufficient
path length (up to 10 cm) can be used. However, this technique is particularly sensitive to interferences
from suspended material and coloured substances at low cell densities.
Annex B describes a procedure to perform the spectrophotometric measurements of the algal cell
density.
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ISO 10253:2016(E)
6.3 Culture flasks, e.g. conical flasks of capacity 250 ml, with air-permeable stoppers.
6.4 Apparatus for membrane filtration, filters of mean pore diameter 0,2 µm and 0,45 µm.
6.5 Autoclave.
6.6 pH-meter.
7 Procedure
7.1 Preparation of growth medium
Add 15 ml of nutrient stock solution 1, 0,5 ml of nutrient stock solution 2 and 1 ml of nutrient stock
solution 3 (see Table 2) to approximately 900 ml of natural or synthetic sea water (5.2.2) and then make
up to 1 l with the same sea water.
Adjust the pH to 8,0 ± 0,2 by adding dilute hydrochloric acid or sodium hydroxide solution.
NOTE Complexing of heavy metals by the relatively high concentration of EDTA present in the nutrient
medium can preclude the testing of effluents containing heavy metals. For guidance, see ISO 14442.
7.2 Preparation of pre-culture and inoculum
A pre-culture shall be started two to four days before the beginning of the test (see Note in 5.1).
Add sufficient cells from the algal stock culture to the growth medium (7.1) to obtain a sufficiently low
3 4
cell density of, e.g. 2 × 10 algal cells/ml to 10 algal cells/ml for three days pre-culturing, in order to
maintain exponential growth until the start of the test. The pre-culture shall be incubated under the
same conditions as those in the test. Measure the cell density in the pre-culture immediately before
use, in order to calculate the required inoculum volume.
7.3 Choice of test concentrations
Algae should be exposed to concentrations of the test substance in a geometric series with a ratio not
exceeding 3,2 (e.g. 1,0 mg/l, 1,8 mg/l, 3,2 mg/l, 5,6 mg/l and 10 mg/l).
The concentrations should be chosen to obtain at least one inhibition below and one inhibition above
the intended EC(r) parameter. Additionally, at least two levels of inhibition between 10 % and 90 %
x
should be included in order to provide data for regression analysis.
NOTE A suitable concentration range is best determined by carrying out a preliminary range-finding test
covering several orders of magnitude of difference between test concentrations. Replication of test concentrations
is not a requirement in the preliminary test.
7.4 Preparation of test substance stock solutions
Prepare stock solutions by dissolving the test substance in growth medium (7.1). Modifications
are necessary when the test substance does not readily dissolve in the test medium, as described in
ISO 14442 and ISO 5667-16.
When testing water samples (effluent, elutriates, etc.), spike them with the nutrient stock solutions
(5.2.3) and, if appropriate, to avoid growth inhibition due to a too low salinity, with sea water salts
(5.2.2) to bring the salinity of the sample up to the salinity of the growth medium. An example of a
dilution scheme for sea water samples is given in Annex A.
Normally, carry out the test without adjusting the pH after addition of the test substance. However,
some substances may exert a toxic effect due to extreme acidity or alkalinity. In order to determine the
toxicity of a substance independent of pH, adjust the pH of the master stock solution (before the dilution
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ISO 10253:2016(E)
in series) to 8,0 ± 0,2, using either hydrochloric acid or sodium hydroxide solution. The concentration of
acid or base should be such as the volume change is as small as possible.
7.5 Preparation of test and control batches
Prepare the test batches by mixing the appropriate volumes of test substance stock solutions (7.4),
growth medium (7.1) and inoculum (7.2) in the test vessels. The total volume, concentration of added
growth medium nutrients and cell density shall be the same in all test batches.
The initial cell density shall be sufficiently low to allow exponential growth in the control culture
throughout the test duration, or for at least the time required to achieve a factor 16 increase of cell
density, without a pH drift of more than 1,0 pH units (see Clause 8). Therefore, the initial cell densities
4
shall not exceed 10 algal cells/ml.
A lower initial cell density (three to fivefold lower) is recommended for Skeletonema sp. due to its
higher cell volume and growth rate. Take into account the chain-formation of Skeletonema sp. when
determining the initial cell density.
Prepare at least three replicates for each test substance concentration. To a further six vessels, add only
growth medium and inoculum with no test substance. These vessels serve as controls.
If appropriate (e.g. environmental, coloured or turbid samples), prepare a concentration series,
single vessels only, of the test substance without algae to serve as a background for the cell density
determinations.
The test design may be altered, based on statistical consideration, to increase the number of
concentrations and reduce the number of replicates per concentration.
Measure the pH of samples of each concentration of the test solution and of the controls.
7.6 Incubation
The test vessels shall be sufficiently covered to avoid airborne contamination and to reduce water
evaporation, but they shall not be airtight in order to allow CO to enter the vessels. Incubate the test
2
vessels at a nominal temperature of 20 °C, under continuous white light. The temperature shall not vary
by more than 2 °C during the test. The photon fluence rate at the average level of the test solutions shall
2 2
be uniform and in the range 60 µmol/m s to 120 µmol/m s, when measured in the photosynthetically
effective wavelength range of 400 nm to 700 nm using an appropriate receptor.
It is important to note that the method of measurement, and in particular the type of receptor
(collector), affects the measured value. Spherical receptors (which respond to direct and reflected light
from all angles above and below the plane of measurement) and “cosine” receptors (which respond to
light from all angles above the measurement plane) are preferred to unidirectional receptors and give
higher readings for a multi-point light source of the type described in Note 1.
NOTE 1 The light intensity specified above could be obtained using between four to seven fluorescent lamps
(power rating 30 W) of the universal white, natural type, i.e. a rated colour of standard colour 2 (a colour temperature
of 4 300 K) according to IEC 60081 at a distance of approximately 0,35 m from the algal culture medium.
NOTE 2 For light-measuring instruments calibrated in lx, an equivalent range of 6 000 lx to 10 000 lx is
acceptable for the test.
Continuously and gently shake the cultures in order to keep the cells in free suspension and to facilitate
CO mass transfer from air to water, and in turn, reduce pH shift.
2
7.7 Measurements
Measure the cell density in each test vessel, including the controls, at least every (24 ± 2) h. These
measurements are usually made on small volumes which are removed from the test solution and not
replaced. Before measurement, the test batches should be mixed thoroughly.
© ISO 2016 – All rights reserved 7
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ISO 10253:2016(E)
The test shall last for (72 ± 2) h. At the end of the test, measure the pH of each test batch (7.5) and of the
controls (7.5). Confirm the appearance of the cells and the identity of the test organism by microscopy.
8 Validity criteria
Consider the test valid if the following conditions are met.
a) The control cell density shall have increased by a factor of more than 16 in 72 h. This increase
−1
corresponds to a specific growth rate (9.2) of 0,9 d .
NOTE The growth rate of the algae under the specified conditions may vary among different strains
−1
of the species. Results from interlaboratory tests indicate that growth rates above 1,0 d are normally
obtained with both species.
b) The variation coefficient of the control specific growth rates should not exceed 7 %.
c) The control pH shall not have increased by more than 1,0 during the test.
Variations in pH during the test can have a significant influence on the results and therefore a limit
of ±1,0 unit is set. These variations however should always be kept as low as possible, for example, by
performing continuous shaking during the test.
9 Interpretation of data
9.1 Plotting growth curves
Tabulate the cell density measurements, or other parameters correlated with cell density in the test
media, according to the concentration of test sample and the time of measurement.
Plot a growth curve for each test concentration and control, as a graph of the logarithm of the mean
cell density against time. A linear growth curve indicates exponential growth, whereas a levelling off
indicates that cultures have entered the stationary phase.
If the control cultures show declining growth rate towards the end of the exposure period, inhibited
cultures may tend to catch up with the controls, falsely indicating a decreased growth inhibiting
effect. In this case, perform the calculations of growth rate and growth inhibition based on the last
measurement within the exponential growth period in the control cultures.
9.2 Calculation of percentage inhibition
Calculate first the average specific growth rate, μ, for each test culture, using Formula (1):
lnNN− ln
L0
μ = (1)
tt−
L 0
where
t is the time of test start;
0
t is the time of test termination or the time of the last measurement within the exponential
L
growth period in the control (9.1);
N is the nominal initial cell density;
0
N is the measured cell density at time t .
L L
Altern
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10253
Troisième édition
2016-11-15
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition
de la croissance des algues marines
avec Skeletonema sp. et
Phaeodactylum tricornutum
Water quality — Marine algal growth inhibition test with
Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum
Numéro de référence
ISO 10253:2016(F)
©
ISO 2016
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Matériels . 3
5.1 Organismes d’essai . 3
5.2 Réactifs . 4
5.2.1 Eau . . . 4
5.2.2 Eau de mer . 4
5.2.3 Nutriments . 4
6 Appareillage . 5
7 Mode opératoire. 6
7.1 Préparation du milieu de croissance. 6
7.2 Préparation de la préculture et de l’inoculum . 6
7.3 Sélection des concentrations de l’essai . 6
7.4 Préparation des solutions mères de substance d’essai . 6
7.5 Préparation des lots d’essai et des témoins . 7
7.6 Incubation . 7
7.7 Mesurages . 8
8 Critères de validité . 8
9 Interprétation des données . 8
9.1 Tracé des courbes de croissance . 8
9.2 Calcul du pourcentage d’inhibition . 9
9.3 Détermination des valeurs de EC(r) .
x 9
10 Expression des résultats.10
11 Interprétation des résultats .10
12 Rapport d’essai .10
Annexe A (informative) Préparation des gammes de dilution des mélanges en eau de mer
(effluents ou élutriats) .12
Annexe B (informative) Mode opératoire d’essai à partir d’inocula algaux de conservation,
avec mesurage direct de la croissance algale en cuve spectrophotométrique .13
Annexe C (informative) Données de performance .19
Bibliographie .20
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ISO 10253:2016(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, Sous-comité 5,
Méthodes biologiques.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 10253:2006), qui a fait l’objet de la
révision technique suivante:
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NORME INTERNATIONALE ISO 10253:2016(F)
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition de la croissance des
algues marines avec Skeletonema sp. et Phaeodactylum
tricornutum
AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document ne prétend pas couvrir tous les problèmes de
sécurité potentiels associés à son utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur de mettre
en place des pratiques d’hygiène et de sécurité adéquates et de s’assurer de la conformité avec
toutes les dispositions réglementaires nationales.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés conformément au présent document le
soient par du personnel qualifié.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détermination de l’inhibition de la croissance des algues
marines unicellulaires Skeletonema sp. et Phaeodactylum tricornutum provoquée par des substances et
des mélanges présents dans l’eau de mer (effluents, élutriats, etc.).
Cette méthode peut être utilisée pour soumettre à l’essai des substances facilement solubles dans l’eau
et qui ne sont pas sensiblement dégradées ou éliminées d’autre manière du milieu d’essai.
NOTE Avec les modifications telles que décrites dans l’ISO 14442 et l’ISO 5667-16, il est possible d’évaluer
par cet essai les effets inhibiteurs des matières organiques et inorganiques peu solubles, des composés volatils,
des composés métalliques, des effluents, des échantillons d’eaux marines et des élutriats de sédiments.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO 14442, Qualité de l’eau — Lignes directrices pour essais d’inhibition de la croissance algale avec des
matières peu solubles, des composés volatils, des métaux et des eaux résiduaires
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp
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ISO 10253:2016(F)
3.1
densité cellulaire
nombre de cellules par unité de volume du milieu
Note 1 à l’article: La densité cellulaire est exprimée en x cellules/ml.
3.2
taux de croissance spécifique
µ
taux proportionnel de l’augmentation de la densité cellulaire par unité de temps:
1 dx
μ =× (/1 jour)
x dt
où
x est la densité cellulaire, exprimée en cellules par millilitre;
t est le temps, exprimé en jours.
−1
Note 1 à l’article: Le taux de croissance spécifique est exprimé en inverse de jours (j ).
3.3
milieu de croissance
mélange d’eau de mer et de nutriments utilisé pour les précultures et les témoins
3.4
milieu d’essai
mélange d’eau de mer, de nutriments [milieu de croissance (3.3)] et de matériel d’essai dans lequel sont
incubées les cellules algales
3.5
lot d’essai
mélange d’eau de mer, de nutriments et de matériel d’essai [milieu d’essai (3.4)] inoculé avec les algues
3.6
témoin
mélange d’eau de mer, de nutriments [milieu de croissance (3.3)] sans matériel d’essai, inoculé avec
les algues
3.7
concentration efficace
EC(r)
x
concentration de la substance d’essai qui entraîne une réduction de x % du taux de croissance spécifique
par rapport à celui des témoins
4 Principe
Des souches monospécifiques d’algues sont cultivées pendant plusieurs générations dans un milieu
défini contenant une plage de concentrations de la substance d’essai, préparées en mélangeant des
quantités adéquates de concentré de nutriments, d’eau de mer et de solutions mères de la substance
d’essai, et un inoculum de cellules algales à croissance exponentielle. Les solutions d’essai sont incubées
pendant une période de (72 ± 2) h, pendant laquelle la densité cellulaire est mesurée dans chacune
des solutions à intervalles réguliers au moins toutes les (24 ± 2) h. L’inhibition est mesurée en tant
que réduction du taux de croissance spécifique, par rapport aux cultures témoins cultivées dans des
conditions identiques.
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ISO 10253:2016(F)
5 Matériels
5.1 Organismes d’essai
Utiliser l’une quelconque des algues marines suivantes:
1)
a) Skeletonema sp. (CCAP 1077/1C, NIVA BAC 1); ou
b) Phaeodactylum tricornutum Bohlin (CCAP 1052/1A, SA G 1090-1a, NIVA BAC 2).
Ces algues sont des espèces importantes et largement représentées du phytoplancton (phylum
Bacillariophyta) dans les zones estuariennes et côtières.
Les algues recommandées sont disponibles sous la forme de cultures algales monospécifiques, non
axéniques auprès des sources suivantes.
NIVA
Norwegian Institute for Water Research
Gaustadaléen 21
N 0349 Oslo
Norvège
CCAP
Dunstaffnage Marine Laboratory
P O Box 3 Oban
Argyll PA37 1QA
Royaume-Uni
SAG
Collection of Algal Cultures
University of Göttingen
Albrecht-von-Haller Institute for Plant Science
Untere Karspüle 2
37073 Göttingen
Allemagne
Les cultures mères peuvent être conservées dans le milieu décrit en 7.1. Il est nécessaire de procéder
à des repiquages réguliers. Des intervalles hebdomadaires peuvent s’avérer nécessaires dans le cas
de Skeletonema sp., alors que des intervalles de deux ou trois semaines peuvent suffire dans le cas de
Phaeodactylum tricornutum. Les cultures mères peuvent aussi être conservées pendant des périodes
plus longues dans des milieux algaux plus riches tels que ceux recommandés par la collection de
1) Les éditions précédentes du présent document suggéraient l’emploi de deux souches de Skeletonema costatum.
Une étude taxonomique du genre Skeletonema indique que plusieurs souches identifiées à l’origine comme
S. costatum pourraient en réalité appartenir à d’autres espèces. À la lumière de cette étude, et dans le but d’assurer
une continuité par rapport aux souches acceptées jusqu’ici, la présente révision du présent document a remplacé la
référence Skeletonema costatum par Skeletonema sp. afin d’éviter la non-conformité des laboratoires utilisant des
souches différentes.
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ISO 10253:2016(F)
souches. Il est recommandé de conserver la culture mère dans le milieu décrit en 7.1 et dans une phase
de croissance exponentielle, juste avant de préparer la préculture pour essai comme décrit en 7.2.
NOTE Il est possible de conserver des cultures concentrées de la diatomée Phaeodactylum tricornutum
pendant plusieurs mois sans qu’elle perde sa viabilité. Les cultures mères pour les essais de toxicité peuvent
2)
aisément être préparées à partir des cultures concentrées ainsi conservées .
5.2 Réactifs
5.2.1 Eau
Toute eau utilisée pour la préparation de l’eau de mer synthétique, du milieu de croissance et des solutions
de substance d’essai doit être déionisée ou d’une pureté équivalente. Veiller tout particulièrement à
éviter la contamination de l’eau par des substances inorganiques ou organiques pendant la préparation
et la conservation. Il ne faut pas utiliser de matériel fabriqué avec du cuivre.
5.2.2 Eau de mer
Pour la culture et l’essai de Phaeodactylum tricornutum, le milieu de culture (7.1) est obtenu en
ajoutant des nutriments à de l’eau de mer naturelle [salinité = (30 ± 5) g/kg] ou synthétique (salinité
approximative = 33 g/kg). Dans le cas de Skeletonema sp., l’utilisation d’eau de mer naturelle peut
s’avérer nécessaire pour la perpétuation des souches à long terme et peut aussi s’avérer nécessaire
pour le milieu d’essai, car un milieu d’eau de mer synthétique peut ne pas toujours assurer la croissance
minimale satisfaisant aux critères de qualité de l’essai. Si de l’eau de mer naturelle est utilisée, il faut
faire attention à garantir qu’elle n’est pas polluée.
Préparer l’eau de mer synthétique d’après la composition indiquée dans le Tableau 1 (salinité
approximative = 33 g/kg). Tous les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique.
Tableau 1 — Eau de mer synthétique
Concentration de sel dans l’eau de mer synthétique
Sel
g/l
NaCl 22
MgCl ⋅6H O 9,7
2 2
Na SO (anhydre) 3,7
2 4
CaCl (anhydre) 1,0
2
KCl 0,65
NaHCO 0,20
3
H BO 0,023
3 3
Filtrer l’eau de mer (qu’elle soit synthétique ou naturelle) sur une membrane filtrante de 0,45 μm pour
éliminer les particules et les algues.
5.2.3 Nutriments
Préparer trois solutions mères nutritives avec de l’eau, selon les compositions indiquées dans le
Tableau 2.
2) Des cultures concentrées de Phaeodactylum tricornutum peuvent être obtenues auprès de MicroBioTests Inc.
Mariakerke-Gent, Belgique. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et
ne signifie nullement que l’ISO approuve ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il peut être
démontré qu’ils permettent d’obtenir les mêmes résultats.
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ISO 10253:2016(F)
Tableau 2 — Solutions mères nutritives
Nutriment Concentration dans la solution Concentration finale dans la solution
mère d’essai
Solution mère 1
FeCl ⋅6H O 48 mg/l 149 µg/l (Fe)
3 2
MnCl ⋅4H O 144 mg/l 605 µg/l (Mn)
2 2
ZnSO ⋅7H O 45 mg/l 150 µg/l (Zn)
4 2
CuSO ⋅5H O 0 157 mg/l 0,6 µg/l (Cu)
4 2
CoCl ⋅6H O 0 404 mg/l 1,5 µg/l (Co)
2 2
H BO 1 140 mg/l 3,0 mg/l (B)
3 3
Na EDTA 1 000 mg/l 15,0 mg/l
2
Solution mère 2
Chlorhydrate de thiamine 50 mg/l 25 µg/l
Biotine 0,01 mg/l 0 005 µg/l
Vitamine B (cyanocobala-
12
0,10 mg/l 0,05 µg/l
mine)
Solution mère 3
K PO 3,0 g/l 3,0 mg/l; 0,438 mg/l P
3 4
NaNO 50,0 g/l 50,0 mg/l; 8,24 mg/l N
3
Na SiO ⋅5H O 14,9 g/l 14,9 mg/l; 1,97 mg/l Si
2 3 2
Ces solutions mères doivent être diluées (voir 7.1 et l’Annexe A) afin d’obtenir les concentrations finales
des nutriments dans les solutions d’essai.
Tous les produits chimiques utilisés doivent être des réactifs de qualité reconnue.
Stériliser les solutions mères par filtration sur membrane de 0,2 μm. Il est aussi possible de stériliser
les solutions mères 1 et 3 en autoclave à 120 °C pendant au moins 15 min.
Conserver les solutions mères à l’abri de la lumière à 4 °C pendant deux mois au maximum.
6 Appareillage
Tout le matériel entrant en contact avec le milieu d’essai doit être fabriqué en verre ou à partir d’un
matériau chimiquement inerte.
Utiliser l’appareillage normal de laboratoire en sus de ce qui suit.
6.1 Enceinte ou pièce à température contrôlée, avec un tube fluorescent blanc fournissant un
éclairage uniforme continu, convenant aux exigences de luminosité spécifiées pour l’essai en 7.6.
6.2 Appareillage pour le mesurage de la densité cellulaire des algues, de préférence un compteur
de particules ou un microscope sur cellule de comptage.
Sinon, déterminer l’état de la croissance des cultures algales par un mode opératoire indirect, en
utilisant par exemple un fluorimètre [par exemple fluorescence in vitro (voir la Référence [4])],
lorsqu’il est suffisamment sensible et s’il est démontré que sa corrélation avec la densité cellulaire
est suffisamment élevée. L’appareillage utilisé doit être capable de mesurer exactement les densités
cellulaires aussi faibles que la densité cellulaire de l’inoculum et de faire la distinction entre la croissance
algale et les effets perturbateurs, par exemple présence de particules et couleur de l’échantillon. Des
4
spectrophotomètres peuvent être suffisamment sensibles pour mesurer 10 cellules d’algue/ml à
condition qu’une longueur de trajet suffisante (jusqu’à 10 cm) puisse être utilisée. Cependant, cette
technique est particulièrement sensible aux interférences des matières en suspension et des substances
colorées à de faibles densités cellulaires.
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ISO 10253:2016(F)
L’Annexe B décrit un mode opératoire pour le mesurage spectrophotométrique de la densité cellulaire
des algues.
6.3 Flacons de culture, par exemple des flacons coniques d’une capacité de 250 ml, avec des bouchons
perméables à l’air.
6.4 Appareillage pour filtration sur membrane, filtres de diamètre moyen de pore de 0,2 µm et
0,45 µm.
6.5 Autoclave.
6.6 pH-mètre.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation du milieu de croissance
Ajouter 15 ml de solution mère nutritive 1, 0,5 ml de solution mère nutritive 2 et 1 ml de solution mère
nutritive 3 (voir le Tableau 2) à environ 900 ml d’eau de mer naturelle ou synthétique (5.2.2); puis
compléter à 1 l avec la même eau de mer.
Ajuster le pH à 8,0 ± 0,2 en ajoutant une solution diluée d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium.
NOTE La complexation de métaux lourds par une concentration relativement élevée d’EDTA présente dans
le milieu nutritif peut empêcher l’essai sur les effluents contenant des métaux lourds. Pour des lignes directrices,
voir l’ISO 14442.
7.2 Préparation de la préculture et de l’inoculum
Il est nécessaire de démarrer une préculture deux à quatre jours avant le début de l’essai (voir la Note
en 5.1).
Ajouter suffisamment de cellules de la culture mère au milieu de croissance (7.1) pour obtenir une
3 4
densité cellulaire suffisamment faible de, par exemple, 2 × 10 cellules d’algue/ml à 10 cellules
d’algue/ml pour trois jours de préculture, afin de conserver la croissance exponentielle jusqu’au début
de l’essai. Incuber la préculture dans les mêmes conditions que celles de l’essai. Mesurer la densité
cellulaire de la préculture juste avant l’utilisation, pour calculer le volume adéquat de l’inoculum.
7.3 Sélection des concentrations de l’essai
Il convient d’exposer les algues aux concentrations de la substance d’essai dans une suite géométrique
de raison inférieure ou égale à 3,2 (par exemple 1,0 mg/l, 1,8 mg/l, 3,2 mg/l, 5,6 mg/l et 10 mg/l).
Il convient de choisir les concentrations de manière à obtenir au moins une inhibition au-dessous et une
inhibition au-dessus de la valeur prévue pour le paramètre EC(r) . De plus, il convient d’inclure au moins
x
deux niveaux d’inhibition entre 10 % et 90 % pour fournir des données pour l’analyse de régression.
NOTE La meilleure façon de déterminer une plage de concentrations adéquate consiste à effectuer un essai
préliminaire de détection de plage, couvrant plusieurs ordres de grandeur de différence entre les concentrations
d’essai. La répétition des concentrations d’essai n’est pas exigée pour l’essai préliminaire.
7.4 Préparation des solutions mères de substance d’essai
Préparer les solutions mères en dissolvant la substance d’essai dans le milieu de croissance (7.1).
Certaines modifications sont nécessaires lorsque la substance d’essai ne se dissout pas facilement dans
le milieu d’essai, comme décrit dans l’ISO 14442 et l’ISO 5667-16.
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ISO 10253:2016(F)
Si les essais portent sur des échantillons d’eau (effluent, élutriats, etc.), doper ceux-ci avec des solutions
mères nutritives (5.2.3) et, le cas échéant, afin d’éviter toute inhibition de la croissance en raison d’une
salinité trop faible, avec des sels d’eau de mer (5.2.2) afin d’amener la salinité de l’échantillon à la salinité
du milieu de croissance. L’Annexe A fournit un exemple de protocole de dilution pour les échantillons
d’eau de mer.
Effectuer l’essai normalement sans ajuster le pH après addition de la substance d’essai. Cependant,
certaines substances peuvent avoir un effet toxique en raison d’une acidité ou d’une basicité extrême.
Afin de déterminer la toxicité d’une substance indépendamment du pH, ajuster le pH de la solution mère
générale (avant la gamme de dilution) à 8,0 ± 0,2, au moyen d’une solution d’acide chlorhydrique ou
d’hydroxyde de sodium. Il convient que la concentration en acide ou en base soit telle que le changement
de volume soit le plus petit possible.
7.5 Préparation des lots d’essai et des témoins
Préparer les lots d’essai en mélangeant des volumes adéquats de solutions mères de substance
d’essai (7.4), de milieu de croissance (7.1) et d’inoculum (7.2) dans les récipients d’essai. Le volume total,
la concentration en nutriments ajoutés au milieu de croissance et la densité cellulaire doivent être les
mêmes dans tous les lots d’essai.
La densité cellulaire initiale doit être suffisamment faible pour permettre une croissance exponentielle
dans la culture témoin pendant toute la durée de l’essai, ou a minima pendant le laps de temps requis
pour atteindre une augmentation d’un facteur 16 de la densité cellulaire, sans dérive du pH supérieure
à 1,0 unité de pH (voir l’Article 8). Par conséquent, les densités cellulaires initiales ne doivent pas
4
dépasser 10 cellules d’algue/ml.
Une plus faible densité cellulaire initiale (de trois à cinq fois inférieure) est recommandée pour
Skeletonema sp. en raison de son volume cellulaire plus important et de son taux de croissance plus
élevé. Prendre en considération la formation de chaînes par Skeletonema sp. lors de la détermination de
la densité cellulaire initiale.
Préparer trois réplicats au moins pour chaque concentration de substance d’essai. Ajouter, à six autres
récipients, uniquement du milieu de croissance et de l’inoculum sans substance d’essai. Ces récipients
servent de témoins.
Le cas échéant (par exemple, échantillons environnementaux, colorés ou turbides), préparer une seule
gamme de concentrations de la substance d’essai, un seul récipient à chaque fois, sans algue pour servir
de fond pour les déterminations de la densité cellulaire.
Le plan d’essai peut être modifié, sur la base de considérations statistiques, pour augmenter le nombre
de concentrations et réduire le nombre de réplicats par concentration.
Mesurer le pH des échantillons de chaque concentration de la solution d’essai et des témoins.
7.6 Incubation
Les récipients d’essai doivent être suffisamment recouverts pour éviter toute contamination aérienne
et pour réduire l’évaporation de l’eau; ils ne doivent cependant pas être étanches, pour permettre le
passage du CO vers l’intérieur des récipients. Incuber les récipients d’essai à une température nominale
2
de 20 °C, sous une lumière blanche continue. La température ne doit pas varier de plus de 2 °C au cours
de l’essai. Le débit de fluence des photons au niveau moyen des solutions d’essai doit être uniforme
2 2
et se trouver dans la plage de 60 µmol/m ⋅s à 120 µmol/m ⋅s, lorsqu’il est mesuré dans la gamme
des longueurs d’onde efficaces du point de vue photosynthétique de 400 nm à 700 nm au moyen d’un
récepteur approprié.
Il est important de noter que la méthode de mesure, en particulier le type de récepteur (détecteur),
influe sur la valeur mesurée. Les récepteurs sphériques (qui réagissent à la lumière directe et réfléchie
en provenance de tous les angles au-dessus et au-dessous du plan de mesurage) et les récepteurs
«cosinus» (qui réagissent à la lumière en provenance de tous les angles au-dessus du plan de mesurage)
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...
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