ISO 16654:2001
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Escherichia coli O157
La présente Norme internationale spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Escherichia coli sérogroupe O157. Soumise aux restrictions énoncées dans l'introduction, la présente Norme internationale est applicable aux produits destinés à la consommation humaine ou aux produits alimentaires.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16654
First edition
2001-05-01
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
detection of Escherichia coli O157
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des
Escherichia coli O157
Reference number
©
ISO 2001
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Contents Page
Foreword.iv
Introduction.v
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Term and definition .1
4 Principle.2
5 Culture media, reagents and antisera .2
6 Apparatus and glassware .7
7 Sampling.8
8 Preparation of test sample.8
9 Procedure (see annex A).8
9.1 Test portion and initial suspension .8
9.2 Enrichment .8
9.3 Immunomagnetic separation (IMS).8
9.4 Plating out onto selective agars and identification of E. coli O157 colonies.9
9.5 Confirmation.10
9.6 Further characterization.11
10 Quality assurance.11
10.1 Test strains for quality assurance purposes.11
10.2 Culture method .11
11 Expression of results .11
12 Test report .11
Annex A (normative) Diagram of procedure .12
Bibliography.13
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 16654 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 9, Microbiology.
Annex A forms a normative part of this International Standard.
iv © ISO 2001 – All rights reserved
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods specific to these products may be used if absolutely
necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt should be made to apply this horizontal
method as far as possible.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this method in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is hoped
that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this International Standard so that
eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for well-established
technical reasons.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16654:2001(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the detection of Escherichia coli O157
WARNING — Escherichia coli O157 can cause severe life-threatening illness and has a low infective dose.
Laboratory-acquired infections have been reported.
In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that the whole of this method be
carried out only by skilled personnel using good laboratory practices and preferably working in a
containment facility. Relevant national Health and Safety Regulations relating to this organism must be
adhered to.
Care must be taken in the disposal of all infectious materials.
1 Scope
This International Standard specifies a horizontal method for the detection of Escherichia coli serogroup O157.
Subject to the limitations discussed in the introduction, this International Standard is applicable to products
intended for human consumption or for animal feeding stuffs.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations.
3 Term and definition
For the purposes of this International Standard, the following term and definition applies.
3.1
Escherichia coli O157
E. coli O157
microorganisms which form typical colonies on the surface of the plating-out medium used in this International
Standard, and which produce indole and agglutinate specifically with antiserum against the O157 antigen
NOTE 1 Sorbitol-positive E. coli O157 strains are not detected on CT-SMAC (5.2) media.
NOTE 2 Some indole-negative mutations have been found.
4Principle
The detection of Escherichia coli O157 necessitates four successive stages (see annex A).
a) Enrichment of the test portion homogenized in modified tryptone soya broth containing novobiocin (mTSB + N)
with incubation at 41,5 °C � 1 °C for 6 h and subsequently for a further 12 h to 18h.
b) Separation and concentration of microorganisms by means of immunomagnetic particles coated with
antibodies to E. coli O157.
c) Isolation by subculture of the immunomagnetic particles with adhering bacteria onto cefixime tellurite sorbitol
MacConkey agar (CT-SMAC) and the user's choice of a second selective isolation agar.
d) Confirmation of sorbitol-negative colonies from CT-SMAC and colonies typical of E. coli O157 on the second
isolation agar, by indole production and agglutination with E. coli O157 antiserum.
NOTE Further characterization, by for example pathogenic markers, of the positive isolates can be obtained by forwarding
them to an appropriate reference laboratory.
5 Culture media, reagents and antisera
For current laboratory practices, see ISO 7218.
5.1 Enrichment medium: Modified tryptone soya broth with novobiocin (mTSB + N)
See reference [1].
5.1.1 Modified tryptone soya broth (mTSB)
5.1.1.1 Composition
Enzymatic digest of casein 17,0 g
Enzymatic digest of soya 3,0 g
D(+)-glucose 2,5 g
Bile salts No. 3 1,5 g
Sodium chloride 5,0 g
Dipotassium hydrogen phosphate (K HPO ) 4,0 g
2 4
Water 1000 ml
5.1.1.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, by heating if necessary. Adjust the pH,
using the pH-meter (6.6), if necessary, so that after sterilization it is 7,4 � 0,2 at 25 °C.
Dispense the medium in appropriate amounts in flasks or bottles (6.7).
Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1) set at 121 °C.
2 © ISO 2001 – All rights reserved
5.1.2 Novobiocin solution
5.1.2.1 Composition
Novobiocin 0,45 g
Water 100 ml
5.1.2.2 Preparation
Dissolve the novobiocin in the water and sterilize by membrane filtration.
Prepare on the day of use.
5.1.2.3 Preparation of the complete medium
Immediately before use, add 1 ml or 4 ml of novobiocin solution (5.1.2) to either 225 ml or 900 ml of cooled mTSB
(5.1.1).
The final concentration of novobiocin is 20 mg per litre of mTSB.
5.2 First selective isolation medium: Cefixime tellurite sorbitol MacConkey agar (CT-SMAC)
See reference [2].
5.2.1 Base medium
5.2.1.1 Composition
Enzymatic digest of casein 17,0 g
Enzymatic digest of animal tissues 3,0 g
Sorbitol 10,0 g
Bile salts No. 3 1,5 g
Sodium chloride 5,0 g
Neutral Red 0,03 g
Crystal Violet 0,001 g
a
Agar
9gto18 g
Water 1000 ml
a
Depending on the gel strength of the agar.
5.2.1.2 Preparation
Dissolve the basic components or the complete dehydrated base in the water by boiling. Adjust the pH (6.6), if
necessary, so that after sterilization it is 7,1 � 0,2 at 25 °C.
Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1) set at 121 °C.
5.2.2 Potassium tellurite solution
5.2.2.1 Composition
Potassium tellurite for bacteriological use 0,25 g
Water 100 ml
5.2.2.2 Preparation
Dissolve the potassium tellurite in the water and sterilize by membrane filtration.
This solution may be stored at room temperature for up to 1 month, but discard it if a white precipitate forms.
5.2.3 Cefixime solution
5.2.3.1 Composition
Cefixime 5,0 mg
Water 100,0 ml
5.2.3.2 Preparation
Dissolve the cefixime in the water and sterilize by membrane filtration.
NOTE Cefixime may need to be dissolved in ethanol.
This solution may be stored at 3 °C � 2 °C for 1 week.
5.2.4 Complete medium
5.2.4.1 Composition
Base medium (5.2.1) 1 000 ml
Potassium tellurite solution (5.2.2) 1,0 ml
Cefixime solution (5.2.3) 1,0 ml
5.2.4.2 Preparation
Either cool the freshly sterilized base medium (5.2.1) to between 44 �C and 47 �C (6.5), or melt it by steaming the
previously sterilized and solidified base medium, then cool to between 44 �C and 47 �C.
Add 1 ml of the tellurite solution and 1 ml of the cefixime solution to 1000 ml of the base medium. Mix and pour
about 15 ml amounts into sterile Petri dishes (6.15). Allow to solidify.
The final concentration of tellurite is 2,5 mg/l and cefixime 0,05 mg/l.
Immediately before use, dry the agar plates, preferably with the lids removed and with the agar surfaces facing
downwards, in an oven set at a temperature between 25 °C and 50 °C (6.2), until the droplets have disappeared
from the surface of the medium. Do not dry them any further. The agar plates may also be dried in a laminar-flow
safety cabinet for 30 min with half-open lids, or overnight with the lids in place.
If prepared in advance, the undried plates may be stored in the dark in plastic bags or other moisture-retentive
containers, in a refrigerator at 3 °C � 2 °C for up to 2 weeks.
5.3 Second selective isolation medium
Use any other solid selective medium, at the choice of the laboratory, complementary to CT-SMAC agar and
especially appropriate for the isolation of Escherichia coli O157.
Immediately before use, dry the agar plates, preferably with the lids removed and with the agar surfaces facing
downwards, in an oven set at a temperature between 25 °C and 50 °C (6.2), until the droplets have disappeared
4 © ISO 2001 – All rights reserved
from the surface of the medium. Do not dry them any further. The agar plates may also be dried in a laminar-flow
safety cabinet for 30 min with half-open lids, or overnight with the lids in place.
If prepared in advance, the undried plates may be stored in the dark in plastic bags or other moisture-retentive
containers, in a refrigerator at 3 °C � 2 °C for a time that causes no change to its performance.
5.4 Nutrient agar
5.4.1 Composition
Meat extract 3,0 g
Peptone 5,0 g
a
Agar
9gto18 g
Water 1 000 ml
a
Depending on the gel strength of the agar.
5.4.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, by heating if necessary. Adjust the pH,
if necessary, so that after sterilization it is 7,0 � 0,2 at 25 °C.
Transfer the medium into flasks or bottles (6.7) of appropriate capacity.
Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1) set at 121 °C.
5.4.3 Preparation of nutrient agar plates
Transfer about 15 ml of the molten, cooled medium (5.4.2) at between 44 °C and 47 °C (6.5) to Petri dishes and
allow to solidify.
Immediately before use, dry the agar plates, preferably with the lids removed and with the agar surfaces facing
downwards, in an oven set at a temperature between 25 °C and 50
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16654
Première édition
2001-05-01
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche des
Escherichia coli O157
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
detection of Escherichia coli O157
Numéro de référence
©
ISO 2001
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Imprimé en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos.iv
Introduction.v
1 Domaine d'application.1
2Références normatives .1
3 Terme et définition.1
4 Principe.2
5 Milieux de culture, réactifs et antisérum .2
6 Appareillage et verrerie.8
7 Échantillonnage .9
8Préparation de l'échantillon pour essai.9
9 Mode opératoire (voir l'annexe A).9
9.1 Prise d'essai et suspension mère .9
9.2 Enrichissement .9
9.3 Séparation immunomagnétique (IMS) .9
9.4 Ensemencement sur les géloses sélectives et identification des colonies d'E. coli O157 .10
9.5 Confirmation.11
9.6 Identification complémentaire.12
10 Assurance qualité.12
10.1 Souches de contrôle pour l'assurance qualité.12
10.2 Méthode de culture.12
11 Expression des résultats .12
12 Rapport d'essai .12
Annexe A (normative) Diagramme du mode opératoire.13
Bibliographie .14
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiéeaux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude aledroit de faire partie ducomité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments delaprésente/du présent Norme internationale
peuvent faire l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 16654 a étéélaboréepar le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 9, Microbiologie.
L’annexe A de la présente Norme internationale est donnée uniquement à titre d’information.
iv © ISO 2001 – Tous droits réservés
Introduction
En raison de la grande diversité des aliments destinés à la consommation humaine ou animale, la présente
méthode horizontale peut ne pas être appropriée pour certains produits. Dans ce cas, différentes méthodes
spécifiques à cesproduitspeuvent être utilisées lorsque cela s'avère absolument nécessaire pour des raisons
techniques justifiées. Néanmoins, la méthode horizontale devra être appliquée aussi souvent que possible.
Lorsque la présente Norme internationale sera révisée, il sera tenu compte de tous les renseignements disponibles
à ce moment là, à savoir dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie et les raisons justifiant
toute dérogation dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation des méthodes d'essai ne peut pas être immédiate et il existe peut-être déjà des normes
internationales et/ou des normes nationales pour certains groupes de produits, lesquelles ne sont pas conformes à
cette méthode horizontale. Il est souhaitable que lors de leur révision, ces normes soient modifiées afin de se
conformer à la présente norme internationale de sorte que les seules divergences éventuelles restantes soient
celles nécessaires pour des raisons techniques bien établies.
NORME INTERNATIONALE ISO 16654:2001(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche des Escherichia coli O157
AVERTISSEMENT — Les Escherichia coli O157 peuvent provoquer des maladies mortelles et la dose
infectante est faible. Des infections contractées en laboratoire ont été rapportées.
Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que cette méthode soit réalisée
entièrement par du personnel qualifié, avec des pratiques de laboratoire appropriées et travaillant de
préférence dans un laboratoire confiné.Les réglementations nationales au niveau santé et sécurité
concernant ce microorganisme doivent être appliquées.
Attention lors de l'élimination de tous les matériaux contagieux.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Escherichia coli
sérogroupe O157.
Soumise aux restrictions énoncées dans l'introduction, la présente Norme internationale est applicable aux produits
destinés à la consommation humaine ou aux produits alimentaires.
2Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions
décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension
mère et des dilutions décimales.
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques.
3 Terme et définition
Pour les besoins de la présente Norme internationale, le terme et la définition suivant s'applique.
3.1
Escherichia coli O157
E. coli O157
microorganismes formant des colonies caractéristiques à la surface du milieu différentiel sélectif utilisé dans la
présente Norme internationale, produisant de l'indole et s'agglutinant spécifiquement avec un antisérum contre les
antigènes O157
NOTE 1 Les souches d’E. coli O157 sorbitol positives ne sont pas détectées dans un milieu à base de CT-SMAC (5.2).
NOTE 2 Des souches mutantes indole négatif ont été trouvées.
4Principe
La recherche d'Escherichia coli O157 implique quatre étapes successives (voir annexe A).
a) Enrichissement de la prise d'essai homogénéisée dans un bouillon tryptone de soja modifié contenant de la
novobiocine (mTSB + N) avec une incubation à 41,5 �C � 1 �C pendant 6 h puis renouvelé 12 h à 18 h.
b) Séparation et concentration des microorganismes au moyen de billes immunomagnétiques revêtues
d'anticorps anti E. coli O157.
c) Isolement par cultures secondaires des billes immunomagnétiques ayant capté des bactéries sur une gélose
MacConkey au sorbitol cefixime tellurite (CT-SMAC) et, au choix des utilisateurs, sur une seconde gélose
d'isolement sélective.
d) Confirmation des colonies sorbitol négatives isolées sur CT-SMAC et des colonies caractéristiques d'E. coli
O157 isolées sur le second milieu d'isolement, par la recherche de la production d'indole et une agglutination
du sérum anti E. coli O157.
NOTE Une caractérisation complémentaire, par exemple par des marqueurs de pathogénicité, des isolats positifs peut être
obtenue en les transmettant à un laboratoire de référence approprié.
5 Milieux de culture, réactifs et antisérum
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l'ISO 7218.
5.1 Milieu d'enrichissement: Bouillon tryptone de soja modifiéà la novobiocine (mTSB + N)
Voir référence [1].
5.1.1 Bouillon tryptone de soja modifié (mTSB)
5.1.1.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 17,0 g
Digestat enzymatique de soja 3,0 g
D(+) glucose 2,5 g
Sels biliaires N°31,5g
Chlorure de sodium 5,0 g
Di-Potassium hydrogénophosphate (K HPO)4,0g
2 4
Eau 1000 ml
2 © ISO 2001 – Tous droits réservés
5.1.1.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau en chauffant, si nécessaire. Ajuster le pH à
l'aide du pH-mètre (6.6), si nécessaire, de sorte qu'aprèsstérilisation, il soit de 7,4 � 0,2 à 25 °C.
Répartir les milieux par quantités appropriées dans des flacons ou des bouteilles (6.7).
Stériliser à l'autoclave (6.1) régléà 121 °C pendant 15 min.
5.1.2 Solution de novobiocine
5.1.2.1 Composition
Novobiocine 0,45 g
Eau 100 ml
5.1.2.2 Préparation
Dissoudre la novobiocine dans l'eau et stériliser par filtration sur membrane.
Préparer le jour de l'utilisation.
5.1.2.3 Préparation du milieu complet
Juste avant utilisation, ajouter 1 ml ou 4 ml de solution de novobiocine (5.1.2) à 225 ml ou 900 ml de milieu mTSB
(5.1.1) refroidi.
La concentration finale de novobiocine est de 20 mg par litre de mTSB.
5.2 Premier milieu d'isolement sélectif: gélose MacConkey au sorbitol cefixime tellurite
(CT-SMAC)
Voir référence [2].
5.2.1 Milieu de base
5.2.1.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 17,0 g
Digestat enzymatique de viande 3,0 g
Sorbitol 10,0 g
Sels biliaires N°31,5g
Chlorure de sodium 5,0 g
Rouge neutre 0,03 g
Violet de méthyl 0,001 g
a
Agar
9g à 18 g
Eau 1 000 ml
a
En fonction du pouvoir de gélification de l'agar.
5.2.1.2 Préparation
Dissoudre les composants de base ou la base déshydratée complète dans l'eau en chauffant jusqu’à ébullition.
Ajuster le pH (6.6), si nécessaire, de sorte qu'aprèsstérilisation il soit de 7,1 � 0,2 à 25 °C.
Stériliser à l’autoclave (6.1) à 121 �C pendant 15 min.
5.2.2 Solution de tellurite de potassium
5.2.2.1 Composition
Tellurite de potassium à usage bactériologique 0,25 g
Eau 100 ml
5.2.2.2 Préparation
Dissoudre le tellurite de potassium dans l'eau et stériliser par filtration sur membrane.
Cette solution peut être stockée à température ambiante pendant un mois au maximum, mais ne doit pas être
utilisée en cas de formation de précipités blancs.
5.2.3 Solution de cefixime
5.2.3.1 Composition
Cefixime 5,0 mg
Eau 100,0 ml
5.2.3.2 Préparation
Dissoudre la cefixime dans l'eau et stériliser par filtration sur membrane.
NOTE On peut avoir à dissoudre la cefixime dans de l’éthanol.
Cette solution peut être stockée à 3 �C � 2 �C pendant une semaine.
5.2.4 Milieu complet
5.2.4.1 Composition
Milieu de base (5.2.1) 1 000 ml
Solution de tellurite de potassium (5.2.2) 1,0 ml
Solution de cefixime (5.2.3) 1,0 ml
5.2.4.2 Préparation
Refroidir le milieu de base nouvellement stérilisé (5.2.1) entre 44 �Cet47 �C (6.5), ou faire fondre par chauffage à
la vapeur le milieu de base préalablement stérilisé et solidifié, puis le refroidir entre 44 �Cet 47 �C.
4 © ISO 2001 – Tous droits réservés
Ajouter 1 ml de solution de tellurite et 1 ml de solution de cefixime à 1000 ml de milieu de base. Mélanger et verser
par quantités d'environ 15 ml dans des boîtes de Petri stériles (6.15). Laisser solidifier.
La concentration finale est de 2,5 mg/l pour le tellurite et 0,05 mg/l pour le cefixime.
Immédiatement avant utilisation, sécher les plaques de gélose, de préférence sans leurs couvercles et avec la
surfacedela gélose tournée vers le bas, dans une étuve de séchage réglée entre 25 �Cet 50 �C (6.2), jusqu'à ce
que la surface de la gélose soit exempte de gouttes d'eau. Ne pas les sécher plus longtemps. Les plaques de
gélose peuvent aussi être séchées sous une hotte à flux laminaire, avec la surface de la gélose tournéeversle
haut, pendant 30 min couvercles à demi-ouverts, ou durant une nuit, couvercles fermés.
Si elles sont préparées à l'avance, les plaques non séchées peuvent être stockées à l'abri de la lumière dans des
sacs en plastique ou d'autres emballages évitant le dessèchement, dans un réfrigérateur à 3 �C � 2 °C pendant
une durée allant jusqu'à deux semaines.
5.3 Second milieu d'isolement sélectif
Utiliser une autre gélose sélective, laissée au choix du laboratoire, complémentaire de la gélose CT-SMAC et
spécifiquement appropriée pour l’isolement des Escherichia coli O157.
Immédiatement avant utilisation, sécher les plaques de gélose, de préférence sans leurs couvercles et avec la
surfacedela gélose tournée vers le bas, dans une étuve de séchage réglée entre 25 �Cet 50 �C (6.2), jusqu'à ce
que la surface de la gélose soit exempte de gouttes d'eau. Ne pas les sécher plus longtemps. Les plaques de
gélose peuvent aussi être séchées sous une hotte à flux laminaire, avec la surface de la gélose tournéeversle
haut, pendant 30 min couvercles à demi-ouverts, ou durant une nuit, couvercles fermés.
Si elles sont préparées à l'avance, les plaques non séchées peuvent être stockées à l'abri de la lumière dans des
sacs en plastique ou d'autres emballages évitant le dessèchement, dans un réfrigérateur à 3 �C � 2 �C pendant
une duréen'entraînant aucune variation de sa performance.
5.4 Gélose nutritive
5.4.1 Composition
Extrait de viande 3,0 g
Peptone 5,0 g
a
Agar
9g à 18 g
Eau 1 000 ml
a
En fonction du pouvoir de gélification de l'agar.
5.4.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau en chauffant, si nécessaire. Ajuster le pH, si
nécessaire, de sorte qu'aprèsstérilisation il soit de 7,0 � 0,2 à 25 �C.
Transférer le liquide dans des flacons ou bouteilles (6.7) de contenance appropriée.
Stériliser à l'autoclave (6.1) régléà 121 �C pendant 15 min.
5.4.3 Préparation de plaques de gélose nutritive
Transférer environ 15 ml du milieu fondu refroidi (5.4.2) entre 44 �Cet47 �C (6.5) dans des boîtes de Petri et
laisser solidifier.
Immédiatement avant l'utilisation, sécher les plaques de gélose avec précaution, sans leurs couvercles et avec la
surfacedela gélose tournée vers le bas, dans une étuve de séchage réglée entre 25 �Cet 50 �C (6.2) jusqu'à ce
que la surface de la gélose soit exempte de gouttes d'eau. Ne pas les sécher plus longtemps. Les plaques de
gélose peuvent aussi être séchées sous une hotte à flux laminaire, avec la surface de la gélose dirigéevers lehaut
pendant 30 min, avec couvercles à demi-
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