Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 2: Most probable number method

This part of ISO 9308 specifies a method for the enumeration of E. coli and coliform bacteria in water. The method is based on the growth of target organisms in a liquid medium and calculation of the "Most Probable Number" (MPN) of organisms by reference to MPN tables. This method can be applied to all types of water, including those containing an appreciable amount of suspended matter and high background counts of heterotrophic bacteria. However, it must not be used for the enumeration of coliform bacteria in marine water. When using for the enumeration of E. coli in marine waters, a 1?10 dilution in sterile water is typically required, although the method has been shown to work well with some marine waters that have a lower than normal concentration of salts. In the absence of data to support the use of the method without dilution, a 1?10 dilution is used. This method relies upon the detection of E. coli based upon expression of the enzyme β-D-glucuronidase and consequently does not detect many of the enterohaemorhagic strains of E. coli, which do not typically express this enzyme. Additionally, there are a small number of other E. coli strains that do not express β-D-glucuronidase. The choice of tests used in the detection and confirmation of the coliform group of bacteria, including E. coli, can be regarded as part of a continuous sequence. The extent of confirmation with a particular sample depends partly on the nature of the water and partly on the reasons for the examination. The test described in this part of ISO 9308 provides a confirmed result with no requirement for further confirmation of positive wells.

Qualité de l'eau - Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes - Partie 2: Méthode du nombre le plus probable

L'ISO 9308-2:2012 sp�cifie une m�thode de d�nombrement des Escherichia coli et des bact�ries coliformes dans l'eau. La m�thode est bas�e sur la croissance d'organismes cibles dans un milieu liquide et sur le calcul du �nombre le plus probable� d'organismes en fonction de tables NPP. Cette m�thode peut �tre appliqu�e � tous les types d'eau, y compris ceux contenant une quantit� appr�ciable de mati�re en suspension et des nombres importants de bact�ries h�t�rotrophes. Cependant, elle ne doit pas �tre utilis�e pour d�nombrer les bact�ries coliformes dans l'eau de mer. Lorsqu'elle est utilis�e pour d�nombrer Escherichia coli dans l'eau de mer, une dilution 1→10 dans de l'eau st�rile est g�n�ralement requise, bien que la m�thode ait d�montr� son efficacit� avec certaines eaux de mer ayant une concentration en sel inf�rieure � la normale. En l'absence de donn�es �tayant l'utilisation de la m�thode sans dilution, une dilution 1→10 est utilis�e.
Cette m�thode repose sur la d�tection des Escherichia coli en fonction de l'expression de l'enzyme β-D-glucuronidase et, par cons�quent, ne permet pas de d�tecter les souches ent�roh�morragiques des Escherichia coli, qui n'expriment g�n�ralement pas cette enzyme. De plus, il existe un petit nombre d'autres souches d'Escherichia coli qui n'expriment pas la β-D-glucuronidase.
Le choix des essais utilis�s lors de la d�tection et de la confirmation du groupe de bact�ries coliformes, notamment Escherichia coli, peut �tre consid�r� comme faisant partie int�grante d'une s�quence continue. Le niveau de confirmation avec un �chantillon particulier d�pend d'une part de la nature de l'eau et d'autre part des raisons de l'examen. L'essai d�crit dans l'ISO 9308-2:2012 fournit un r�sultat confirm� sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.

Kakovost vode - Ugotavljanje števila Escherichia coli in koliformnih bakterij - 2. del: Metoda najverjetnejšega števila

Ta del ISO 9308 določa metodo za ugotavljanje števila Escherichia coli in koliformnih bakterij v vodi. Ta metoda temelji na rasti ciljnih organizmov v tekočem mediju in izračunu „najverjetnejšega števila“ (MPN) organizmov z referenco na tabele MPN. To metodo je mogoče uporabiti za vse vrste vode, vključno s tistimi, ki vsebujejo znatno količino lebdečih snovi in visoko število heterotrofnih bakterij v ozadju. Vendar se te metode ne sme uporabljati za ugotavljanje števila koliformnih bakterij v morski vodi. Pri ugotavljanju števila Escherichia coli v morskih vodah je običajno treba izvesti redčenje 1:10 v sterilni vodi, čeprav ta metoda dobro deluje tudi pri nekaterih morskih vodah z nižjo vsebnostjo koncentracije soli, kot je običajna. Ker ni podatkov, ki bi podpirali uporabo te metode brez redčenja, se uporablja razredčina v razmerju 1:10. Ta metoda upošteva zaznavanje Escherichia coli na podlagi izražanja encima β-D-glukuronidaza, zato posledično ne zazna številnih enterohemoragičnih sevov Eschericha coli, ki tega encima običajno ne izražajo. Poleg tega obstaja majhno število drugih sevov Escherichia coli, ki ne izražajo encima β-D-glukuronidaza. Izbiro preskusov, uporabljenih za zaznavanje in potrjevanje koliformne skupine bakterij, vključno z Escherichia coli, je mogoče upoštevati kot del nepretrganega zaporedja. Obseg potrditve z določenim vzorcem je delno odvisen od lastnosti vode in delno od vzrokov za preskus. Preskus, opisan v tem delu ISO 9308, podaja potrjen rezultat brez potrebe po nadaljnjem potrjevanju pozitivnih izvorov.

General Information

Status
Published
Public Enquiry End Date
28-Feb-2013
Publication Date
07-Jul-2013
Technical Committee
Current Stage
6060 - National Implementation/Publication (Adopted Project)
Start Date
14-Jun-2013
Due Date
19-Aug-2013
Completion Date
08-Jul-2013

RELATIONS

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ISO 9308-2:2012 - Water quality -- Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9308-2
Second edition
2012-07-01
Water quality — Enumeration of
Escherichia coli and coliform bacteria —
Part 2:
Most probable number method
Qualité de l'eau — Dénombrement des Escherichia coli et des
organismes coliformes —
Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
Reference number
ISO 9308-2:2012(E)
ISO 2012
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ISO 9308-2:2012(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2012

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,

electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or

ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56  CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved
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ISO 9308-2:2012(E)
Contents Page

Foreword ............................................................................................................................................................ iv

Introduction ......................................................................................................................................................... v

1  Scope ...................................................................................................................................................... 1

2  Normative references ............................................................................................................................ 1

3  Terms and definitions ........................................................................................................................... 2

4  Principle ................................................................................................................................................. 2

5  Apparatus and glassware ..................................................................................................................... 2

6  Culture media and reagents ................................................................................................................. 3

7  Sampling ................................................................................................................................................ 3

8  Procedure ............................................................................................................................................... 3

9  Expression of results ............................................................................................................................ 4

10  Test report .............................................................................................................................................. 4

11  Quality assurance .................................................................................................................................. 4

Annex A (informative) Further microbiological information on coliform bacteria ....................................... 5

Annex B (normative) The Quanti-Tray Sealer and calculation of results .................................................. 6

Annex C (informative) Composition of the Colilert-18 medium ................................................................... 42

Annex D (informative) Validation of Colilert-18/Quanti-Tray for the enumeration of E.coli and

coliform bacteria from water .............................................................................................................. 44

Bibliography ...................................................................................................................................................... 46

© ISO 2012 – All rights reserved iii
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ISO 9308-2:2012(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

ISO 9308-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,

Microbiological methods.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 9308-2:1990), which has been technically

revised.

ISO 9308 consists of the following parts, under the general title Water quality — Enumeration of Escherichia

coli and coliform bacteria:

 Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora

 Part 2: Most probable number method

 Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) for the detection and enumeration of E. coli in

surface and waste water
iv © ISO 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 9308-2:2012(E)
Introduction

The presence and extent of faecal pollution is an important factor in assessing the quality of a body of water

and the risk to human health from infection. Examination of water samples for the presence of Escherichia coli

(E. coli), which normally inhabits the bowel of man and other warm-blooded animals, provides an indication of

such pollution. Examination for coliform bacteria can be more difficult to interpret because some coliform

bacteria live in soil and surface fresh water and are not always intestinal. Therefore, the presence of coliform

bacteria, although not a proof of faecal contamination, may indicate a failure in treatment or ingress of water

into the distribution system.

The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that

compliance with this document may involve the use of patents concerning Colilert-18 and Quanti-Tray and

Quanti-Tray 2000 given in this document.

ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of these patent rights.

The holder of this patent right has assured the ISO that he/she is willing to negotiate licences either free of

charge or under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants throughout the world.

In this respect, the statement of the holder of this patent right is registered with ISO. Information may be

obtained from:
IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine 04092 USA

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent

rights.

ISO (http://www.iso.org/patents) and IEC (http://patents.iec.ch) maintain on-line databases of patents relevant

to their standards. Users are encouraged to consult the databases for the most up to date information

concerning patents.
© ISO 2012 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 9308-2:2012(E)
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria —
Part 2:
Most probable number method

WARNING – Persons using this part of ISO 9308 should be familiar with normal laboratory practice.

This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated

with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and

to ensure compliance with any national regulatory conditions.

IMPORTANT – It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this part of ISO 9308

be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope

This part of ISO 9308 specifies a method for the enumeration of E. coli and coliform bacteria in water. The

method is based on the growth of target organisms in a liquid medium and calculation of the “Most Probable

Number” (MPN) of organisms by reference to MPN tables. This method can be applied to all types of water,

including those containing an appreciable amount of suspended matter and high background counts of

heterotrophic bacteria. However, it must not be used for the enumeration of coliform bacteria in marine water.

When using for the enumeration of E. coli in marine waters, a 1→10 dilution in sterile water is typically

required, although the method has been shown to work well with some marine waters that have a lower than

normal concentration of salts. In the absence of data to support the use of the method without dilution, a

1→10 dilution is used.

This method relies upon the detection of E. coli based upon expression of the enzyme -D-glucuronidase and

consequently does not detect many of the enterohaemorhagic strains of E. coli, which do not typically express

this enzyme. Additionally, there are a small number of other E. coli strains that do not express

-D-glucuronidase.

The choice of tests used in the detection and confirmation of the coliform group of bacteria, including E. coli,

can be regarded as part of a continuous sequence. The extent of confirmation with a particular sample

depends partly on the nature of the water and partly on the reasons for the examination. The test described in

this part of ISO 9308 provides a confirmed result with no requirement for further confirmation of positive wells.

NOTE While this method describes the use of an enumeration device that is commercially available, the medium

described here can also be used in a standard MPN format.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,

the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture

ISO/IEC Guide 2:2004, Standardization and related activities — General vocabulary

© ISO 2012 – All rights reserved 1
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ISO 9308-2:2012(E)
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
3 Terms and definitions

For the purpose of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following apply.

3.1
coliform bacterium
member of the Enterobacteriaceae that express the enzyme -D-galactosidase
3.2
Escherichia coli

member of the Enterobacteriaceae that expresses both -D-galactosidase and -D-glucuronidase enzymes

4 Principle

A snap pack of dehydrated medium is added to a sample of water (100 ml), or a dilution of a sample made up

to 100 ml. Sample plus medium is gently shaken to ensure adequate mixing and to afford dissolution of the

medium. The sample plus medium is then aseptically poured into a Quanti-Tray or Quanti-Tray/2000 to

enumerate up to 201 organisms or 2 419 organisms per 100 ml, respectively. Trays are sealed with a

Quanti-Tray Sealer and then incubated at (36 ± 2) °C for 18 h to 22 h.

After incubation, sample wells that have a yellow colour of equal or greater intensity than that of the

comparator wells are considered positive for coliform bacteria. Yellow wells that also exhibit any degree of

fluorescence are considered positive for E. coli.

By means of statistical tables, or a simple computer program, the most probable number (MPN) of coliform

bacteria and E. coli in 100 ml of the sample can be determined.

NOTE The yellow colouration can be seen with the naked eye and results from the cleavage of ortho-nitrophenol

galactoside by the enzyme -D-galactosidase. The fluorescence is demonstrable under ultraviolet light (365 nm) and

originates from the cleavage of the molecule 4-methylumbelliferyl glucuronide (MUG) by the enzyme -D-glucuronidase to

produce the fluorescent compound methyl umbelliferone.
5 Apparatus and glassware
Use microbiological laboratory equipment and, in particular, the following:
5.1 Apparatus for sterilization by steam (autoclave)

Apparatus and glassware not supplied sterile shall be sterilized according to the instructions given in

ISO 8199.
5.2 Hot air oven, for dry heat sterilization.
5.3 Incubator, thermostatically controlled at (36 ± 2) °C.
5.4 Quanti-Tray sealer.
5.5 Sterile wide mouthed vessels of at least 110 ml.

1) Quanti-Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States

and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not

constitute an endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2012 – All rights reserved
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ISO 9308-2:2012(E)
5.6 Quanti-Tray comparator.
5.7 Ultraviolet lamp, 365 nm.
2) 2)
5.8 Quanti-Tray or Quanti-Tray 2000 , see Annex B.
6 Culture media and reagents
6.1 Basic materials

The method utilises Colilert -18 a medium based on the Defined Substrate Technology available for a 100 ml

sample as a ready to use powder dispensed in snap packs. Each snap pack contains sufficient medium

(2,8 g) for a single test. Medium is stored under ambient conditions (2 °C to 25 °C) out of direct sunlight and

should be used before the expiry date listed on the snap pack.

The medium is composed of two components to give the final concentrations as shown in Annex C.

6.2 Diluent

For dilutions to be used with Colilert -18, use only sterile, non-inhibitory, oxidant-free water (deionized or tap).

The use of buffered, saline or peptone-containing diluents interferes with the performance of the test.

6.3 Antifoam B
Antifoam B is a 10 % active, water soluble suspension of silicone.
7 Sampling

Take the samples and deliver them to the laboratory in accordance with ISO 19458.

8 Procedure
8.1 Preparation of the sample

Samples should be transported and stored at (5  3) °C in accordance with ISO 19458 and analysis

commenced on the day of collection or within 18 h. Under exceptional circumstances, the samples may be

kept at (5 ± 3) °C for up to 24 h prior to examination.
8.2 Inoculation of media

Aseptically add a single snap pack of Colilert -18 medium (2,8 g) to each 100 ml volume of sample or dilution.

When the medium has completely dissolved, the sample plus medium is aseptically poured into either a

2) Quanti-Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States

and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not

constitute an endorsement by ISO of this product.

3) Colilert is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States and/or

other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not constitute an

endorsement by ISO of this product.

4) Colilert and Quanti-Tray are trademarks or registered trademarks of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the

United States and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and

does not constitute an endorsement by ISO of this product.
© ISO 2012 – All rights reserved 3
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ISO 9308-2:2012(E)
4) 4) 4)

Quanti-Tray or Quanti-Tray /2000 and then sealed with the Quanti-Tray Sealer. Marine water samples

should generally be diluted 1→10 with sterile water. In order to minimize air bubbles within wells, samples can

be prepared in pre-sterilized bottles containing antifoam B. Alternatively, antifoam B can be added to each

bottle using a dropper bottle. The use of either form of antifoam is optional. Alternatively, the water sample in

which the Colilert -18 has been dissolved can be distributed into sterile tubes for determination of the MPN

using a more traditional MPN format (e.g. 1  50 ml and 5  10 ml). If a single 100 ml volume is incubated,

then the method can be used as a presence/absence test for the detection of coliform bacteria and E. coli. If

either of these latter two approaches are used, then the tubes should be pre-warmed to (36  2) °C for 20 min

prior to the start of incubation.

While it is recommended that marine water samples be diluted 1→10 in sterile deionized water prior to

examination, it has been noted that in some geographical areas that the salt concentration of marine water is

sufficiently low to allow culture without dilution. If this procedure is to be used, then validation data should be

available. The salinity of marine water varies considerably and it is the responsibility of the laboratory to

determine if marine water samples require dilution.
8.3 Incubation and differentiation

Incubate the inoculated Quanti-Trays for 18 h to 22 h at (36  2) °C for coliform bacteria and E. coli.

8.4 Examination of results
4) 4)

Examine the Quanti-Tray or Quanti-Tray /2000 after incubation for 18 h to 22 h and regard as positive

reactions for coliform bacteria those wells that have a yellow colouration equal to or greater than the

colouration of the Quanti-Tray comparator. Examine the trays under UV light (365 nm) in a dark room or in a

chamber that obscures ambient light. Regard any yellow wells that also exhibit any degree of fluorescence, as

positive for E. coli. If results are equivocal after 18 h (i.e. the yellow colouration is less than that of the

comparator), incubation should be extended up to 22 h. Positive results for both coliform bacteria and E. coli

observed before 18 h of incubation as well as negative results observed after 22 h are also valid.

9 Expression of results

From the number of wells on a Quanti-Tray that are positive, the MPN/100 ml for both coliform bacteria and

E. coli can be calculated by reference to statistical tables or by using a computer MPN generator program, see

Tables B.1 and B.2.
10 Test report
This test report shall contain at least the following information:
a) the test method used, together with a reference to this part of ISO 9308;
b) all information required for the complete identification of the sample;
c) the results expressed in accordance with Clause 9;

d) any particular occurrence(s) observed during the course of the analysis and any operation(s) not

specified in this part of ISO 9308 which may have influenced the results.
11 Quality assurance

The laboratory shall have a clearly defined quality control system to ensure that the apparatus, reagents and

techniques are suitable for the test. The use of positive controls, negative controls and blanks is part of the

test.
4 © ISO 2012 – All rights reserved
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ISO 9308-2:2012(E)
Annex A
(informative)
Further microbiological information on coliform bacteria

In addition to expressing -D-galactosidase, coliform bacteria are typically Gram-negative non-sporeforming,

oxidase-negative, rod-shaped bacteria, which are capable of aerobic and facultatively anaerobic growth in the

presence of bile-salts (or other surface-active agents with similar growth-inhibiting properties), and which are

usually able to ferment lactose with the production of acid and aldehyde within 48 h when incubated at a

temperature of (36 ± 2) °C. In addition to expressing -D-glucuronidase, E. coli are coliform bacteria that are

able to produce indole from tryptophan within (21  3) h at (44,0 ± 0,5) °C. They give a positive result in the

methyl red test and can decarboxylate l-glutamic acid but are not able to produce acetyl methyl carbinol,

utilise citrate as the sole source of carbon or grow in KCN broth.

Some strains of Escherichia coli which are -D-glucuronidase negative, such as Escherichia coli O157, will not

be detected as E. coli. As they are -D-galactosidase positive, they will appear as coliform bacteria.

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ISO 9308-2:2012(E)
Annex B
(normative)
The Quanti-Tray Sealer and calculation of results
B.1 General

The Quanti-Tray Sealer is a thermal sealing unit that forms a seal between wells in the Quanti-Tray. The

sealer automatically distributes liquid into the wells of the Quanti-Tray or Quanti-Tray/2000. The Quanti-Tray is

used when anticipated counts are below 200 cfu/100 ml. The Quanti-Tray/2000 can be used to calculate MPN

values up to 2419 cfu/100 ml. When calculating MPN, the tables supplied with the trays are the reference for

all counts. A simple statistical program can also be used to calculate results. If required, the MPN can be

calculated manually according to the procedures given below.
B.2 Calculation of the most probable number
B.2.1 Calculation of MPN for IDEXX Quanti-Tray and Quanti-Tray/2000
B.2.1.1 Quanti-Tray (51-well)

Quanti-Tray MPN was originally developed at Yale University; an additional, good example of this serial

dilution MPN can be found at the U.S. Food and Drug Association in the Bacteriological Analytical Manual

(available on BAM Appendix 2: Most Probable Number from Serial Dilutions, October 2010).

Each sample well has an approximate volume of 1,96 ml.
The overflow well will hold a minimum of 8,5 ml.
For the calculation of the Quanti-Tray MPN (Table B.1), see Equation (B.1).
N = N · ln [N/(N  X)] (B.1)
MPN
where
N is the MPN;
MPN
N is the total number of wells (tubes) used in a test;
X is the number of positive wells (tubes) observed in a test.
B.2.1.2 Quanti-Tray /2000 (97-well)
Quanti-Tray/2000 MPN was originally derived as described by Reference [1].
Small wells have a mean volume of 0,186 ml.

Large wells have a mean volume of approximately 1,86 ml (ten times larger than the small wells).

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and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not

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ISO 9308-2:2012(E)
Overflow well will hold approximately 11 ml.

For the calculation of the Quanti-Tray /2000 MPN (Table B.2), see Equation (B.2):

Vd P
ii i
 Vd n (B.2)
Vd N ii i
ii mpn
1e
ii11
where
d is the dilution factor at level i (e.g. 0,1 for 1→10 dilution);
K is the number of dilution levels;
n is the number of wells at level i;
N is the MPN;
mpn
P is the number of positive wells at level i;
V is the volume of the wells at level i.
The 95 % confidence intervals can be found at :
T  (ln N  1,96)  (ln N )
mpn mpn
T  (ln N  1,96)  (ln N )
mpn mpn
where
T is the lower confidence interval;
T is the upper confidence interval;
 is the standard error; and
22 2
Vd n
2 ii i
 lnNN (B.3)
 
mpn mpn Vd N
ii mpn
e1
i1

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ISO 9308-2:2012(E)
Table B.1 — 51-Well Quanti-Tray MPN

No. of wells giving positive reaction Most probable number 95 % Confidence limits

(MPN)
per 100 ml sample
Lower Upper
0 0,0 3,7
< 1
1 1 0,3 5,6
2 2 0,6 7,3
3 3,1 1,1 9
4 4,2 1,7 10,7
5 5,3 2,3 12,3
6 6,4 3 13,9
7 7,5 3,7 15,5
8 8,7 4,5 17,1
9 9,9 5,3 18,8
10 11,1 6,1 20,5
11 12,4 7 22,1
12 13,7 7,9 23,9
13 15 8,8 25,7
14 16,4 9,8 27,5
15 17,8 10,8 29,4
16 19,2 11,9 31,3
17 20,7 13 33,3
18 22,2 14,1 35,2
19 23,8 15,3 37,3
20 25,4 16,5 39,4
21 27,1 17,7 41,6
22 28,8 19 43,9
23 30,6 20,4 46,3
24 32,4 21,8 48,7
25 34,4 23,3 51,2
26 36,4 24,7 53,9
27 38,4 26,4 56,6
28 40,6 28 59,5
29 42,9 29,7 62,5
30 45,3 31,5 65,6
31 47,8 33,4 69
32 50,4 35,4 72,5
33 53,1 37,5 76,2
34 56 39,7 80,1
8 © ISO 2012 – All rights reserved
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ISO 9308-2:2012(E)
Table B.1 (continued)

No. of wells giving positive reaction Most probable number 95 % Confidence limits

(MPN)
per 100 ml sample
Lower Upper
35 59,1 42 84,4
36 62,4 44,6 88,8
37 65,9 47,2 93,7
38 69,7 50 99
39 73,8 53,1 104,8
40 78,2 56,4 111,2
41 83,1 59,9 118,3
42 88,5 63,9 126,2
43 94,5 68,2 135,4
44 101,3 73,1 146
45 109,1 78,6 158,7
46 118,4 85 174,5
47 129,8 92,7 195
48 144,5 102,3 224,1
49 165,2 115,2 272,2
50 200,5 135,8 387,6
51 > 200,5 146,1 infinite

A value of < 1 means that there were no target bacteria detected in the test. For undiluted samples this can

be reported as zero. However, if dilutions of the sample have been made, then the appropriate multiplication

factor must be used. For example, if a 1→10 dilution has been made and no bacteria are detected then the

result should be reported as < 10.

Table B.2 — 97-Well Quanti Tray (Quanti-Tray/2000) MPN with 95 % confidence limits

Positive Positive MPN 95% Confidence Positive Positive MPN 95% Confidence
large wells small wells large wells small wells
Lower Upper Lower Upper
limit limit limit limit
0 0 0,0 3,7 25 0 33,6 22,0 48,9
0 1 1,0 0,0 3,7 25 1 35,0 22,9 51,2
0 2 2,0 0,3 5,6 25 2 36,4 23,8 52,6
0 3 3,0 0,6 7,3 25 3 37,9 25,5 54,0
0 4 4,0 1,1 8,9 25 4 39,3 26,5 55,9
0 5 5,0 1,7 10,5 25 5 40,8 28,3 57,3
0 6 6,0 2,3 12,1 25 6 42,2 29,3 59,0
0 7 7,0 2,9 13,7 25 7 43,7 30,3 60,7
0 8 8,0 3,7 15,3 25 8 45,2 31,3 62,5
0 9 9,0 4,5 15,8 25 9 46,7 33,3 64,2
0 10 10,0 5,2 16,9 25 10 48,2 34,4 66,0
© ISO 2012 – All rights reserved 9
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ISO 9308-2:2012(E)
Table B.2 (continued)
Positive Positive MPN 95% Confidence Positive Positive MPN 95% Confidence
large wells small wells large wells small wells
Lower Upper Lower Upper
limit limit limit limit
0 11 11,0 5,9 18,5 25 11 49,7 35,4 67,3
0 12 12,0 6,9 20,1 25 12 51,2 36,5 69,0
0 13 13,0 7,8 21,2 25 13 52,7 37,6 70,7
0 14 14,1 8,6 21,9 25 14 54,3 39,7 72,4
0 15 15,1 9,0 23,4 25 15 55,8 40,9 74,0
0 16 16,1 9,6 24,9 25 16 57,3 42,0 75,9
0 17 17,1 10,5 25,7 25 17 58,9 43,1 77,6
0 18 18,1 11,5 26,9 25 18 60,5 45,5 79,5
0 19 19,1 12,5 28,6 25 19 62,0 46,7 81,2
0 20 20,2 13,2 29,3 25 20 63,6 47,8 83,0
0 21 21,2 13,9 30,5 25 21 65,2 49,0 84,6
0 22 22,2 14,5 31,8 25 22 66,8 50,2 86,2
0 23 23,3 15,7 33,1 25 23 68,4 51,5 87,4
0 24 24,3 16,4 34,2 25 24 70,0 54,0 89,5
0 25 25,3 17,6 35,2 25 25 71,7 55,3 91,6
0 26 26,4 18,3 36,5 25 26 73,3 56,6 93,9
0 27 27,4 19,5 37,7 25 27 75,0 57,8 94,6
0 28 28,4 19,7 38,6 25 28 76,6 59,1 96,1
0 29 29,5 21,0 39,9 25 29 78,3 60,4 98,6
0 30 30,5 21,7 41,2 25 30 80,0 61,7 101,0
0 31 31,5 22,5 42,3 25 31 81,7 64,6 101,6
0 32 32,6 23,9 43,4 25 32 83,3 65,9 103,6
0 33 33,6 24,6 44,4 25 33 85,1 67,3 106,2
0 34 34,7 25,4 45,7 25 34 86,8 68,6 107,3
0 35 35,7 26,2 46,8 25 35 88,5 70,0 109,1
0 36 36,8 27,7 48,0 25 36 90,2 71,4 111,4
0 37 37,8 28,5 49,0 25 37 92,0 72,8 112,8
0 38 38,9 29,2 50,3 25 38 93,7 74,2 114,9
0 39 40,0 30,0 51,2 25 39 95,5 77,4 116,4
0 40 41,0 30,8 52,8 25 40 97,3 78,9 118,3
0 41 42,1 31,6 53,7 25 41 99,1 80,3 120,4
0 42 43,1 33,3 54,7 25 42 100,9 81,8 121,9
0 43 44,2 34,1 56,1 25 43 102,7 83,2 124,2
0 44 45,3 34,9 57,1 25 44 104,5 84,7 126,0
0 45 46,3 35,7 58,1 25 45 106,3 86,2 128,0
0 46 47,4 37,5 59,5 25 46 108,2 89,8 130,2
0 47 48,5 38,3 60,7 25 47 110,0 91,3 132,1
0 48 49,5 39,2 61,6 25 48 111,9 92,9 133,7
10 © ISO 2012 – All rights reserved
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ISO 9308-2:2012(E)
Table B.2 (continued)
Positive Positive MPN 95% Confidence Positive Positive MPN 95% Confidence
large wells small wells large wells small wells
Lower Upper Lower Upper
limit limit limit limit
1 0 1,0 0,1 5,5 26 0 35,5 23,2 52,0
1 1 2,0 0,3 5,9 26 1 36,9 24,9 53,7
1 2 3,0 0,6 7,3 26 2 38,4 25,9 55,4
1 3 4,0 1,1 8,9 26 3 39,9 26,9 56,5
1 4 5,0 1,7 10,5 26 4 41,4 27,9 58,6
1 5 6,0 2,3 12,1 26 5 42,8 29,7 60,1
1 6 7,1 3,0 13,7 26 6 44,3 30,7 61,8
1 7 8,1 3,7 15,3 26 7 45,9 31,8 63,5
1 8 9,1 4,3 16,2 26 8 47,4 32,8 65,4
1 9 10,1 5,2 17,2 26 9 48,9 34,9 66,6
1 10 11,1 6,0 18,5 26 10 50,4 36,0 68,5
1 11 12,1 6,8 20,1 26 11 52,0 37,1 70,4
1 12 13,2 7,6 21,7 26 12 53,5 38,2 72,2
1 13 14,2 8,7 22,2 26 13 55,1 40,4 73,7
1 14 15,2 9,4 23,6 2
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 9308-2:2013
01-september-2013
1DGRPHãþD
SIST ISO 9308-2:1998

Kakovost vode - Ugotavljanje števila Escherichia coli in koliformnih bakterij - 2.

del: Metoda najverjetnejšega števila

Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 2: Most

probable number method

Qualité de l'eau - Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes -

Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 9308-2:2012
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
SIST ISO 9308-2:2013 en,fr

2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 9308-2:2013
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SIST ISO 9308-2:2013
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9308-2
Second edition
2012-07-01
Water quality — Enumeration of
Escherichia coli and coliform bacteria —
Part 2:
Most probable number method
Qualité de l'eau — Dénombrement des Escherichia coli et des
organismes coliformes —
Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
Reference number
ISO 9308-2:2012(E)
ISO 2012
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SIST ISO 9308-2:2013
ISO 9308-2:2012(E)
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© ISO 2012

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,

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ISO's member body in the country of the requester.
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Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved
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SIST ISO 9308-2:2013
ISO 9308-2:2012(E)
Contents Page

Foreword ............................................................................................................................................................ iv

Introduction ......................................................................................................................................................... v

1  Scope ...................................................................................................................................................... 1

2  Normative references ............................................................................................................................ 1

3  Terms and definitions ........................................................................................................................... 2

4  Principle ................................................................................................................................................. 2

5  Apparatus and glassware ..................................................................................................................... 2

6  Culture media and reagents ................................................................................................................. 3

7  Sampling ................................................................................................................................................ 3

8  Procedure ............................................................................................................................................... 3

9  Expression of results ............................................................................................................................ 4

10  Test report .............................................................................................................................................. 4

11  Quality assurance .................................................................................................................................. 4

Annex A (informative) Further microbiological information on coliform bacteria ....................................... 5

Annex B (normative) The Quanti-Tray Sealer and calculation of results .................................................. 6

Annex C (informative) Composition of the Colilert-18 medium ................................................................... 42

Annex D (informative) Validation of Colilert-18/Quanti-Tray for the enumeration of E.coli and

coliform bacteria from water .............................................................................................................. 44

Bibliography ...................................................................................................................................................... 46

© ISO 2012 – All rights reserved iii
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SIST ISO 9308-2:2013
ISO 9308-2:2012(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

ISO 9308-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,

Microbiological methods.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 9308-2:1990), which has been technically

revised.

ISO 9308 consists of the following parts, under the general title Water quality — Enumeration of Escherichia

coli and coliform bacteria:

 Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora

 Part 2: Most probable number method

 Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) for the detection and enumeration of E. coli in

surface and waste water
iv © ISO 2012 – All rights reserved
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SIST ISO 9308-2:2013
ISO 9308-2:2012(E)
Introduction

The presence and extent of faecal pollution is an important factor in assessing the quality of a body of water

and the risk to human health from infection. Examination of water samples for the presence of Escherichia coli

(E. coli), which normally inhabits the bowel of man and other warm-blooded animals, provides an indication of

such pollution. Examination for coliform bacteria can be more difficult to interpret because some coliform

bacteria live in soil and surface fresh water and are not always intestinal. Therefore, the presence of coliform

bacteria, although not a proof of faecal contamination, may indicate a failure in treatment or ingress of water

into the distribution system.

The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that

compliance with this document may involve the use of patents concerning Colilert-18 and Quanti-Tray and

Quanti-Tray 2000 given in this document.

ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of these patent rights.

The holder of this patent right has assured the ISO that he/she is willing to negotiate licences either free of

charge or under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants throughout the world.

In this respect, the statement of the holder of this patent right is registered with ISO. Information may be

obtained from:
IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine 04092 USA

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent

rights.

ISO (http://www.iso.org/patents) and IEC (http://patents.iec.ch) maintain on-line databases of patents relevant

to their standards. Users are encouraged to consult the databases for the most up to date information

concerning patents.
© ISO 2012 – All rights reserved v
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SIST ISO 9308-2:2013
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SIST ISO 9308-2:2013
INTERNATIONAL STANDARD ISO 9308-2:2012(E)
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria —
Part 2:
Most probable number method

WARNING – Persons using this part of ISO 9308 should be familiar with normal laboratory practice.

This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated

with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and

to ensure compliance with any national regulatory conditions.

IMPORTANT – It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this part of ISO 9308

be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope

This part of ISO 9308 specifies a method for the enumeration of E. coli and coliform bacteria in water. The

method is based on the growth of target organisms in a liquid medium and calculation of the “Most Probable

Number” (MPN) of organisms by reference to MPN tables. This method can be applied to all types of water,

including those containing an appreciable amount of suspended matter and high background counts of

heterotrophic bacteria. However, it must not be used for the enumeration of coliform bacteria in marine water.

When using for the enumeration of E. coli in marine waters, a 1→10 dilution in sterile water is typically

required, although the method has been shown to work well with some marine waters that have a lower than

normal concentration of salts. In the absence of data to support the use of the method without dilution, a

1→10 dilution is used.

This method relies upon the detection of E. coli based upon expression of the enzyme -D-glucuronidase and

consequently does not detect many of the enterohaemorhagic strains of E. coli, which do not typically express

this enzyme. Additionally, there are a small number of other E. coli strains that do not express

-D-glucuronidase.

The choice of tests used in the detection and confirmation of the coliform group of bacteria, including E. coli,

can be regarded as part of a continuous sequence. The extent of confirmation with a particular sample

depends partly on the nature of the water and partly on the reasons for the examination. The test described in

this part of ISO 9308 provides a confirmed result with no requirement for further confirmation of positive wells.

NOTE While this method describes the use of an enumeration device that is commercially available, the medium

described here can also be used in a standard MPN format.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,

the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture

ISO/IEC Guide 2:2004, Standardization and related activities — General vocabulary

© ISO 2012 – All rights reserved 1
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SIST ISO 9308-2:2013
ISO 9308-2:2012(E)
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
3 Terms and definitions

For the purpose of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following apply.

3.1
coliform bacterium
member of the Enterobacteriaceae that express the enzyme -D-galactosidase
3.2
Escherichia coli

member of the Enterobacteriaceae that expresses both -D-galactosidase and -D-glucuronidase enzymes

4 Principle

A snap pack of dehydrated medium is added to a sample of water (100 ml), or a dilution of a sample made up

to 100 ml. Sample plus medium is gently shaken to ensure adequate mixing and to afford dissolution of the

medium. The sample plus medium is then aseptically poured into a Quanti-Tray or Quanti-Tray/2000 to

enumerate up to 201 organisms or 2 419 organisms per 100 ml, respectively. Trays are sealed with a

Quanti-Tray Sealer and then incubated at (36 ± 2) °C for 18 h to 22 h.

After incubation, sample wells that have a yellow colour of equal or greater intensity than that of the

comparator wells are considered positive for coliform bacteria. Yellow wells that also exhibit any degree of

fluorescence are considered positive for E. coli.

By means of statistical tables, or a simple computer program, the most probable number (MPN) of coliform

bacteria and E. coli in 100 ml of the sample can be determined.

NOTE The yellow colouration can be seen with the naked eye and results from the cleavage of ortho-nitrophenol

galactoside by the enzyme -D-galactosidase. The fluorescence is demonstrable under ultraviolet light (365 nm) and

originates from the cleavage of the molecule 4-methylumbelliferyl glucuronide (MUG) by the enzyme -D-glucuronidase to

produce the fluorescent compound methyl umbelliferone.
5 Apparatus and glassware
Use microbiological laboratory equipment and, in particular, the following:
5.1 Apparatus for sterilization by steam (autoclave)

Apparatus and glassware not supplied sterile shall be sterilized according to the instructions given in

ISO 8199.
5.2 Hot air oven, for dry heat sterilization.
5.3 Incubator, thermostatically controlled at (36 ± 2) °C.
5.4 Quanti-Tray sealer.
5.5 Sterile wide mouthed vessels of at least 110 ml.

1) Quanti-Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States

and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not

constitute an endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2012 – All rights reserved
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SIST ISO 9308-2:2013
ISO 9308-2:2012(E)
5.6 Quanti-Tray comparator.
5.7 Ultraviolet lamp, 365 nm.
2) 2)
5.8 Quanti-Tray or Quanti-Tray 2000 , see Annex B.
6 Culture media and reagents
6.1 Basic materials

The method utilises Colilert -18 a medium based on the Defined Substrate Technology available for a 100 ml

sample as a ready to use powder dispensed in snap packs. Each snap pack contains sufficient medium

(2,8 g) for a single test. Medium is stored under ambient conditions (2 °C to 25 °C) out of direct sunlight and

should be used before the expiry date listed on the snap pack.

The medium is composed of two components to give the final concentrations as shown in Annex C.

6.2 Diluent

For dilutions to be used with Colilert -18, use only sterile, non-inhibitory, oxidant-free water (deionized or tap).

The use of buffered, saline or peptone-containing diluents interferes with the performance of the test.

6.3 Antifoam B
Antifoam B is a 10 % active, water soluble suspension of silicone.
7 Sampling

Take the samples and deliver them to the laboratory in accordance with ISO 19458.

8 Procedure
8.1 Preparation of the sample

Samples should be transported and stored at (5  3) °C in accordance with ISO 19458 and analysis

commenced on the day of collection or within 18 h. Under exceptional circumstances, the samples may be

kept at (5 ± 3) °C for up to 24 h prior to examination.
8.2 Inoculation of media

Aseptically add a single snap pack of Colilert -18 medium (2,8 g) to each 100 ml volume of sample or dilution.

When the medium has completely dissolved, the sample plus medium is aseptically poured into either a

2) Quanti-Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States

and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not

constitute an endorsement by ISO of this product.

3) Colilert is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States and/or

other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not constitute an

endorsement by ISO of this product.

4) Colilert and Quanti-Tray are trademarks or registered trademarks of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the

United States and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and

does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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SIST ISO 9308-2:2013
ISO 9308-2:2012(E)
4) 4) 4)

Quanti-Tray or Quanti-Tray /2000 and then sealed with the Quanti-Tray Sealer. Marine water samples

should generally be diluted 1→10 with sterile water. In order to minimize air bubbles within wells, samples can

be prepared in pre-sterilized bottles containing antifoam B. Alternatively, antifoam B can be added to each

bottle using a dropper bottle. The use of either form of antifoam is optional. Alternatively, the water sample in

which the Colilert -18 has been dissolved can be distributed into sterile tubes for determination of the MPN

using a more traditional MPN format (e.g. 1  50 ml and 5  10 ml). If a single 100 ml volume is incubated,

then the method can be used as a presence/absence test for the detection of coliform bacteria and E. coli. If

either of these latter two approaches are used, then the tubes should be pre-warmed to (36  2) °C for 20 min

prior to the start of incubation.

While it is recommended that marine water samples be diluted 1→10 in sterile deionized water prior to

examination, it has been noted that in some geographical areas that the salt concentration of marine water is

sufficiently low to allow culture without dilution. If this procedure is to be used, then validation data should be

available. The salinity of marine water varies considerably and it is the responsibility of the laboratory to

determine if marine water samples require dilution.
8.3 Incubation and differentiation

Incubate the inoculated Quanti-Trays for 18 h to 22 h at (36  2) °C for coliform bacteria and E. coli.

8.4 Examination of results
4) 4)

Examine the Quanti-Tray or Quanti-Tray /2000 after incubation for 18 h to 22 h and regard as positive

reactions for coliform bacteria those wells that have a yellow colouration equal to or greater than the

colouration of the Quanti-Tray comparator. Examine the trays under UV light (365 nm) in a dark room or in a

chamber that obscures ambient light. Regard any yellow wells that also exhibit any degree of fluorescence, as

positive for E. coli. If results are equivocal after 18 h (i.e. the yellow colouration is less than that of the

comparator), incubation should be extended up to 22 h. Positive results for both coliform bacteria and E. coli

observed before 18 h of incubation as well as negative results observed after 22 h are also valid.

9 Expression of results

From the number of wells on a Quanti-Tray that are positive, the MPN/100 ml for both coliform bacteria and

E. coli can be calculated by reference to statistical tables or by using a computer MPN generator program, see

Tables B.1 and B.2.
10 Test report
This test report shall contain at least the following information:
a) the test method used, together with a reference to this part of ISO 9308;
b) all information required for the complete identification of the sample;
c) the results expressed in accordance with Clause 9;

d) any particular occurrence(s) observed during the course of the analysis and any operation(s) not

specified in this part of ISO 9308 which may have influenced the results.
11 Quality assurance

The laboratory shall have a clearly defined quality control system to ensure that the apparatus, reagents and

techniques are suitable for the test. The use of positive controls, negative controls and blanks is part of the

test.
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ISO 9308-2:2012(E)
Annex A
(informative)
Further microbiological information on coliform bacteria

In addition to expressing -D-galactosidase, coliform bacteria are typically Gram-negative non-sporeforming,

oxidase-negative, rod-shaped bacteria, which are capable of aerobic and facultatively anaerobic growth in the

presence of bile-salts (or other surface-active agents with similar growth-inhibiting properties), and which are

usually able to ferment lactose with the production of acid and aldehyde within 48 h when incubated at a

temperature of (36 ± 2) °C. In addition to expressing -D-glucuronidase, E. coli are coliform bacteria that are

able to produce indole from tryptophan within (21  3) h at (44,0 ± 0,5) °C. They give a positive result in the

methyl red test and can decarboxylate l-glutamic acid but are not able to produce acetyl methyl carbinol,

utilise citrate as the sole source of carbon or grow in KCN broth.

Some strains of Escherichia coli which are -D-glucuronidase negative, such as Escherichia coli O157, will not

be detected as E. coli. As they are -D-galactosidase positive, they will appear as coliform bacteria.

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SIST ISO 9308-2:2013
ISO 9308-2:2012(E)
Annex B
(normative)
The Quanti-Tray Sealer and calculation of results
B.1 General

The Quanti-Tray Sealer is a thermal sealing unit that forms a seal between wells in the Quanti-Tray. The

sealer automatically distributes liquid into the wells of the Quanti-Tray or Quanti-Tray/2000. The Quanti-Tray is

used when anticipated counts are below 200 cfu/100 ml. The Quanti-Tray/2000 can be used to calculate MPN

values up to 2419 cfu/100 ml. When calculating MPN, the tables supplied with the trays are the reference for

all counts. A simple statistical program can also be used to calculate results. If required, the MPN can be

calculated manually according to the procedures given below.
B.2 Calculation of the most probable number
B.2.1 Calculation of MPN for IDEXX Quanti-Tray and Quanti-Tray/2000
B.2.1.1 Quanti-Tray (51-well)

Quanti-Tray MPN was originally developed at Yale University; an additional, good example of this serial

dilution MPN can be found at the U.S. Food and Drug Association in the Bacteriological Analytical Manual

(available on BAM Appendix 2: Most Probable Number from Serial Dilutions, October 2010).

Each sample well has an approximate volume of 1,96 ml.
The overflow well will hold a minimum of 8,5 ml.
For the calculation of the Quanti-Tray MPN (Table B.1), see Equation (B.1).
N = N · ln [N/(N  X)] (B.1)
MPN
where
N is the MPN;
MPN
N is the total number of wells (tubes) used in a test;
X is the number of positive wells (tubes) observed in a test.
B.2.1.2 Quanti-Tray /2000 (97-well)
Quanti-Tray/2000 MPN was originally derived as described by Reference [1].
Small wells have a mean volume of 0,186 ml.

Large wells have a mean volume of approximately 1,86 ml (ten times larger than the small wells).

Quanti-Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States

and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not

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ISO 9308-2:2012(E)
Overflow well will hold approximately 11 ml.

For the calculation of the Quanti-Tray /2000 MPN (Table B.2), see Equation (B.2):

Vd P
ii i
 Vd n (B.2)
Vd N ii i
ii mpn
1e
ii11
where
d is the dilution factor at level i (e.g. 0,1 for 1→10 dilution);
K is the number of dilution levels;
n is the number of wells at level i;
N is the MPN;
mpn
P is the number of positive wells at level i;
V is the volume of the wells at level i.
The 95 % confidence intervals can be found at :
T  (ln N  1,96)  (ln N )
mpn mpn
T  (ln N  1,96)  (ln N )
mpn mpn
where
T is the lower confidence interval;
T is the upper confidence interval;
 is the standard error; and
22 2
Vd n
2 ii i
 lnNN (B.3)
 
mpn mpn Vd N
ii mpn
e1
i1

6) Quanti-Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States

and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not

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Table B.1 — 51-Well Quanti-Tray MPN

No. of wells giving positive reaction Most probable number 95 % Confidence limits

(MPN)
per 100 ml sample
Lower Upper
0 0,0 3,7
< 1
1 1 0,3 5,6
2 2 0,6 7,3
3 3,1 1,1 9
4 4,2 1,7 10,7
5 5,3 2,3 12,3
6 6,4 3 13,9
7 7,5 3,7 15,5
8 8,7 4,5 17,1
9 9,9 5,3 18,8
10 11,1 6,1 20,5
11 12,4 7 22,1
12 13,7 7,9 23,9
13 15 8,8 25,7
14 16,4 9,8 27,5
15 17,8 10,8 29,4
16 19,2 11,9 31,3
17 20,7 13 33,3
18 22,2 14,1 35,2
19 23,8 15,3 37,3
20 25,4 16,5 39,4
21 27,1 17,7 41,6
22 28,8 19 43,9
23 30,6 20,4 46,3
24 32,4 21,8 48,7
25 34,4 23,3 51,2
26 36,4 24,7 53,9
27 38,4 26,4 56,6
28 40,6 28 59,5
29 42,9 29,7 62,5
30 45,3 31,5 65,6
31 47,8 33,4 69
32 50,4 35,4 72,5
33 53,1 37,5 76,2
34 56 39,7 80,1
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Table B.1 (continued)

No. of wells giving positive reaction Most probable number 95 % Confidence limits

(MPN)
per 100 ml sample
Lower Upper
35 59,1 42 84,4
36 62,4 44,6 88,8
37 65,9 47,2 93,7
38 69,7 50 99
39 73,8 53,1 104,8
40 78,2 56,4 111,2
41 83,1 59,9 118,3
42 88,5 63,9 126,2
43 94,5 68,2 135,4
44 101,3 73,1 146
45 109,1 78,6 158,7
46 118,4 85 174,5
47 129,8 92,7 195
48 144,5 102,3 224,1
49 165,2 115,2 272,2
50 200,5 135,8 387,6
51 > 200,5 146,1 infinite

A value of < 1 means that there were no target bacteria detected in the test. For undiluted samples this can

be reported as zero. However, if dilutions of the sample have been made, then the appropriate multiplication

factor must be used. For example, if a 1→10 dilution has been made and no bacteria are detected then the

result should be reported as < 10.

Table B.2 — 97-Well Quanti Tray (Quanti-Tray/2000) MPN with 95 % confidence limits

Positive Positive MPN 95% Confidence Positive Positive MPN 95% Confidence
large wells small wells large wells small wells
Lower Upper Lower Upper
limit limit limit limit
0 0 0,0 3,7 25 0 33,6 22,0 48,9
0 1 1,0 0,0 3,7 25 1 35,0 22,9 51,2
0 2 2,0 0,3 5,6 25 2 36,4 23,8 52,6
0 3 3,0 0,6 7,3 25 3 37,9 25,5 54,0
0 4 4,0 1,1 8,9 25 4 39,3 26,5 55,9
0 5 5,0 1,7 10,5 25 5 40,8 28,3 57,3
0 6 6,0 2,3 12,1 25 6 42,2 29,3 59,0
0 7 7,0 2,9 13,7 25 7 43,7 30,3 60,7
0 8 8,0 3,7 15,3 25 8 45,2 31,3 62,5
0 9 9,0 4,5 15,8 25 9 46,7 33,3 64,2
0 10 10,0 5,2 16,9 25 10 48,2 34,4 66,0
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ISO 9308-2:2012(E)
Table B.2 (continued)
Positive Positive MPN 95% Confidence Positive Positive MPN 95% Confidence
large wells small wells large wells small wells
Lower Upper Lower Upper
limit limit limit limit
0 11 11,0 5,9 18,5 25 11 49,7 35,4 67,3
0 12 12,0 6,9 20,1 25 12 51,2 36,5 69,0
0 13 13,0 7,8 21,2 25 13 52,7 37,6 70,7
0 14 14,1 8,6 21,9 25 14 54,3 39,7 72,4
0 15 15,1 9,0 23,4 25 15 55,8 40,9 74,0
0 16 16,1 9,6 24,9 25 16 57,3 42,0 75,9
0 17 17,1 10,5 25,7 25 17 58,9 43,1 77,6
0 18 18,1 11,5 26,9 25 18 60,5 45,5 79,5
0 19 19,1 12,5 28,6 25 19 62,0 46,7 81,2
0 20 20,2 13,2 29,3 25 20 63,6 47,8 83,0
0 21 21,2 13,9 30,5 25 21 65,2 49,0 84,6
0 22 22,2 14,5 31,8 25 22 66,8 50,2 86,2
0 23 23,3 15,7 33,1 25 23 68,4 51,5 87,4
0 24 24,3 16,4 34,2 25 24 70,0 54,0 89,5
0 25 25,3 17,6 35,2 25 25 71,7 55,3 91,6
0 26 26,4 18,3 36,5 25 26 73,3 56,6 93,9
0 27 27,4 19,5 37,7 25 27 75,0 57,8 94,6
0 28 28,4 19,7 38,6 25 28 76,6 59,1 96,1
0 29 29,5 21,0 39,9 25 29 78,3 60,4 98,6
0 30 30,5 21,7 41,2 25 30 80,0 61,7 101,0
0 31 31,5 22,5 42,3 25 31 81,7 64,6 101,6
0 32 32,6 23,9 43,4 25 32 83,3 65,9 103,6
0 33 33,6 24,6 44,4 25 33 85,1 67,3 106,2
0 34 34,7 25,4 45,7 25 34 86,8 68,6 107,3
0 35 35,7 26,2 46,8 25 35 88,5 70,0 109,1
0 36 36,8 27,7 48,0 25 36 90,2 71,4 111,4
0 37 37,8 28,5 49,0 25 37 92,0 72,8 112,8
0 38 38,9 29,2 50,3 25 38 93,7 74,2 114,9
0 39 40,0 30,0 51,2 25 39 95,5 77,4 116,4
0 40 41,0 30,8 52,8 25 40 97,3 78
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 9308-2
Deuxième édition
2012-07-01
Qualité de l’eau — Dénombrement
des Escherichia coli et des bactéries
coliformes —
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria —
Part 2: Most probable number method
Numéro de référence
ISO 9308-2:2012(F)
ISO 2012
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ISO 9308-2:2012(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2012

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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Version française parue en 2013
Publié en Suisse
ii © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 9308-2:2012(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 2

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Appareillage et verrerie ................................................................................................................................................................................ 2

6 Milieux de culture et réactifs ................................................................................................................................................................... 3

6.1 Substances de base .............................................................................................................................................................................. 3

6.2 Diluant ............................................................................................................................................................................................................ 3

6.3 Antimousse B ............................................................................................................................................................................................ 3

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 3

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

8.1 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 3

8.2 Ensemencement des milieux ...................................................................................................................................................... 3

8.3 Incubation et différenciation ...................................................................................................................................................... 4

8.4 Examen des résultats ......................................................................................................................................................................... 4

9 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 4

10 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 4

11 Assurance qualité ................................................................................................................................................................................................ 5

Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur les

bactéries coliformes ......................................................................................................................................................................................... 6

Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats ................................................................................. 7

Annexe C (informative) Composition du milieu Colilert-18 ......................................................................................................40

Annexe D (informative) Validation de Colilert-18/Quanti-Tray pour le dénombrement des E. coli

et des bactéries coliformes présentes dans l’eau ............................................................................................................42

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................43

© ISO 2012 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 9308-2:2012(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives

ISO/CEI, Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de

Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.

Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités

membres votants.

L’ISO 9308-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 4,

Méthodes microbiologiques.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 9308-2:1990), qui a fait l’objet d’une

révision technique.

L’ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau —

Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes:

— Partie 1: Méthode par filtration sur membrane dans des eaux contenant peu de flore bactérienne de fond

— Partie 2: Méthode du nombre le plus probable

— Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour la recherche et le dénombrement des

E. coli dans les eaux de surface et les eaux résiduaires
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 9308-2:2012(F)
Introduction

La présence et l’étendue de la pollution fécale est un facteur important dans l’évaluation de la qualité d’une

masse d’eau ainsi que du risque infectieux représenté pour la santé humaine. L’examen d’échantillons

d’eau pour y rechercher des Escherichia coli (E. coli), normalement présents dans les intestins de l’homme

et des animaux homéothermes, fournit une indication sur ce type de pollution. Les résultats de l’examen

des bactéries coliformes peuvent s’avérer plus difficiles à interpréter en raison du fait que certains

coliformes vivent également dans le sol et dans les eaux douces de surface, et ne sont donc pas toujours

d’origine intestinale. La présence de bactéries coliformes peut donc, bien que ce ne soit pas la preuve

d’une contamination d’origine fécale, indiquer une défaillance du traitement ou une infiltration d’eau

dans le système de distribution de l’eau.

L’Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l’attention sur le fait que la conformité au

présent document peut impliquer l’utilisation de brevets concernant Colilert-18, Quanti-Tray et Quanti-

Tray 2000 donnés dans le présent document.

L’ISO ne prend pas position en ce qui concerne la preuve, la validité et le domaine d’application du droit

de propriété industrielle concerné.

Le titulaire de ce brevet a assuré à l’ISO qu’il était disposé à négocier les licences, à titre gracieux ou

dans des conditions raisonnables et non discriminatoires, avec des demandeurs du monde entier. À cet

égard, la déclaration du titulaire de ce brevet est enregistrée auprès de l’ISO. Il est possible d’obtenir des

informations aux adresses suivantes:
IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine 04092 États-Unis

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle autres que ceux identifiés ci-dessus. L’ISO ne saurait être tenue pour

responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L’ISO (http://www.iso.org/patents) et le CEI (http://patents.iec.ch) tiennent à jour des bases de données

en ligne des brevets correspondant à leurs normes. Les utilisateurs sont encouragés à consulter les bases

de données afin d’obtenir les informations les plus récentes sur les brevets.
© ISO 2012 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 9308-2:2012(F)
Qualité de l’eau — Dénombrement des Escherichia coli et
des bactéries coliformes —
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable

AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente partie de l’ISO 9308 connaisse bien

les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale ne prétend pas traiter

tous les éventuels problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir

des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer de la conformité à

la réglementation nationale en vigueur.

IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente partie de l’ISO 9308

soient effectués par un personnel adéquatement qualifié.
1 Domaine d’application

La présente partie de l’ISO 9308 spécifie une méthode de dénombrement des Escherichia coli et des

bactéries coliformes dans l’eau. La méthode est basée sur la croissance d’organismes cibles dans un

milieu liquide et sur le calcul du « nombre le plus probable » d’organismes en fonction de tables NPP. Cette

méthode peut être appliquée à tous les types d’eau, y compris ceux contenant une quantité appréciable

de matière en suspension et des nombres importants de bactéries hétérotrophes. Cependant, elle ne doit

pas être utilisée pour dénombrer les bactéries coliformes dans l’eau de mer. Lorsqu’elle est utilisée pour

dénombrer Escherichia coli dans l’eau de mer, une dilution 1→10 dans de l’eau stérile est généralement

requise, bien que la méthode ait démontré son efficacité avec certaines eaux de mer ayant une

concentration en sel inférieure à la normale. En l’absence de données étayant l’utilisation de la méthode

sans dilution, une dilution 1→10 est utilisée.

Cette méthode repose sur la détection des Escherichia coli en fonction de l’expression de l’enzyme β-D-

glucuronidase et, par conséquent, ne permet pas de détecter les souches entérohémorragiques des

Escherichia coli, qui n’expriment généralement pas cette enzyme. De plus, il existe un petit nombre

d’autres souches d’Escherichia coli qui n’expriment pas la β-D-glucuronidase.

Le choix des essais utilisés lors de la détection et de la confirmation du groupe de bactéries coliformes,

notamment Escherichia coli, peut être considéré comme faisant partie intégrante d’une séquence

continue. Le niveau de confirmation avec un échantillon particulier dépend d’une part de la nature de

l’eau et d’autre part des raisons de l’examen. L’essai décrit dans la présente partie de l’ISO 9308 fournit

un résultat confirmé sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.

NOTE Bien que cette méthode décrive l’utilisation d’un dispositif de dénombrement disponible dans le

commerce, le milieu décrit ici peut également être utilisé dans un format NPP standard.

2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 8199, Qualité de l’eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur

milieu de culture
Guide ISO/CEI 2:2004, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
© ISO 2012 – Tous droits réservés 1
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ISO 9308-2:2012(F)
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants et ceux donnés dans le

Guide ISO/CEI 2 s’appliquent.
3.1
bactérie coliforme
membre de la famille des Entérobactéries qui exprime l’enzyme β-D-galactosidase
3.2
Escherichia coli

membre de la famille des Entérobactéries qui exprime les enzymes β-D-galactosidase et β-D-glucuronidase

4 Principe

Un sachet de milieu déshydraté est ajouté à un échantillon d’eau (100 ml), ou à une dilution d’un échantillon

complété à 100 ml. L’échantillon contenant le milieu est doucement agité pour garantir un mélange

adéquat et pour dissoudre le milieu. L’échantillon contenant le milieu est versé dans des conditions

1) 1)

aseptiques dans un Quanti-Tray ou un Quanti-Tray/2000 pour dénombrer jusqu’à 201 organismes ou

2 419 organismes pour 100 ml, respectivement. Les plateaux sont étanchéifiés à l’aide d’une scelleuse

Quanti-Tray puis incubés à (36 ± 2) °C pendant 18 h à 22 h.

Après l’incubation, les puits d’échantillon de couleur jaune dont l’intensité est identique ou plus prononcée

que celle des puits du comparateur sont considérés comme étant positifs pour les bactéries coliformes.

Les puits jaunes présentant également un certain degré de fluorescence sont considérés comme étant

positifs pour E. coli.

À l’aide de tables statistiques ou d’un simple programme informatique, le nombre le plus probable (NPP)

de bactéries coliformes et d’E. coli dans 100 ml d’échantillon peut être déterminé.

NOTE La coloration jaune peut être observée à l’œil nu et résulte de l’hydrolyse de l’orthonitrophénol-

galactoside par l’enzyme β-D-galactosidase. La fluorescence peut être démontrée sous une lampe à rayons

ultraviolets (365 nm) et résulte de l’hydrolyse de la molécule 4-méthylumbelliféryl-glucuronide (MUG) par

l’enzyme β-D-glucuronidase pour produire le composé fluorescent méthylumbelliférone.

5 Appareillage et verrerie

Utiliser un matériel microbiologique de laboratoire et, en particulier, ce qui suit:

5.1 Appareil de stérilisation à la vapeur (autoclave)

Tout appareil ou toute verrerie fourni(e) non stérile doit être stérilisé(e) conformément aux instructions

de l’ISO 8199.
5.2 Four à air chaud, pour la stérilisation à la vapeur.
5.3 Incubateur, contrôlé par thermostat réglable à (36 ± 2) °C.
5.4 Scelleuse Quanti-Tray
5.5 Récipients stériles à col large d’au moins 110 ml

1) Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une marque déposée d’IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses

filiales aux États-Unis et/ou dans d’autres pays. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la

présente partie de l’ISO 9308 et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.

2 © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 9308-2:2012(F)
5.6 Comparateur Quanti-Tray
5.7 Lampe à rayons ultraviolets, 365 nm.
2) / 2)
5.8 Quanti-Tray ou Quanti-Tray 2000 , voir l’Annexe B.
6 Milieux de culture et réactifs
6.1 Substances de base

La méthode utilise Colilert -18, un milieu basé sur la technologie Defined Substrate Technology

disponible pour un échantillon de 100 ml sous la forme d’une poudre prête à l’emploi répartie dans

des sachets. Chaque sachet contient suffisamment de milieu (2,8 g) pour un seul essai. Le milieu est

conservé dans des conditions ambiantes (2 °C à 25 °C) à l’abri de la lumière directe du soleil et il convient

de l’utiliser avant la date de péremption indiquée sur le sachet.

Le milieu est constitué de deux composants de façon à obtenir les concentrations finales données dans

l’Annexe C.
6.2 Diluant

Pour les dilutions à employer avec Colilert -18, n’utiliser que de l’eau stérile, non inhibitrice et exempte

d’oxydants (eau déminéralisée ou eau du robinet). L’utilisation de diluants à base d’eau saline ou peptonée

tamponnée interfère avec les performances de l’essai.
6.3 Antimousse B
L’antimousse B est une suspension de silicone hydrosoluble active à 10 %.
7 Échantillonnage

Prélever les échantillons et les livrer au laboratoire conformément à l’ISO 19458.

8 Mode opératoire
8.1 Préparation de l’échantillon

Il convient de transporter et de conserver les échantillons à (5 ± 3) °C conformément à l’ISO 19458 et de

commencer l’analyse le jour du prélèvement ou dans les 18 h qui le suivent. Dans certains cas exceptionnels,

les échantillons peuvent être conservés à (5 ± 3) °C pendant 24 h jusqu’à ce qu’ils soient examinés.

8.2 Ensemencement des milieux

Dans des conditions aseptiques, ajouter un seul sachet de milieu Colilert -18 (2,8 g) à chaque échantillon

ou dilution de 100 ml. Une fois que le milieu s’est complètement dissous, l’échantillon contenant le milieu

2) Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une marque déposée d’IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses

filiales aux États-Unis et/ou dans d’autres pays. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la

présente partie de l’ISO 9308 et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.

3) Colilert est une appellation commerciale ou une marque déposée d’IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses filiales

aux États-Unis et/ou dans d’autres pays. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente

partie de l’ISO 9308 et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.

4) Colilert et Quanti-Tray sont des appellations commerciales ou des marques déposées d’IDEXX Laboratories, Inc.

ou de ses filiales aux États-Unis et/ou dans d’autres pays. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs

de la présente partie de l’ISO 9308 et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.

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ISO 9308-2:2012(F)
4) 4)

est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray ou Quanti-Tray /2000 puis étanchéifié

à l’aide de la scelleuse Quanti-Tray . En général, il convient de diluer les échantillons d’eau de mer à

1→10 avec de l’eau stérile. Pour réduire au minimum la formation de bulles d’air dans les puits, les

échantillons peuvent être préparés dans des flacons préalablement stérilisés contenant l’antimousse B.

L’antimousse B peut aussi être ajouté dans chaque flacon à l’aide d’un flacon compte-gouttes. L’utilisation

d’antimousse est facultative. L’échantillon d’eau dans lequel le Colilert -18 a été dissous peut également

être réparti dans des tubes stériles pour déterminer le NPP selon un format NPP plus classique (par

exemple, 1 × 50 ml et 5 × 10 ml). Si un volume de 100 ml volume est incubé, alors la méthode peut être

utilisée comme test qualitatif de type présence/absence pour la détection des bactéries coliformes et

E. coli. Si l’une de ces deux dernières approches est utilisée, il convient alors de réchauffer au préalable

les tubes à (36 ± 2) °C pendant 20 min avant le début de l’incubation.

Même s’il est recommandé de diluer les échantillons d’eau de mer à 1→10 dans de l’eau déminéralisée

avant de les examiner, il faut noter que dans certaines régions du monde, la concentration en sel de l’eau

de mer est suffisamment faible pour effectuer une culture sans dilution. Si ce mode opératoire doit être

utilisé, il convient de disposer de données de validation. La salinité de l’eau de mer varie considérablement

et il incombe au laboratoire de déterminer si les échantillons d’eau de mer doivent être dilués ou non.

8.3 Incubation et différenciation

Incuber les Quanti-Tray ensemencés pendant 18 h à 22 h à (36 ± 2) °C pour détecter les bactéries

coliformes et E. coli.
8.4 Examen des résultats
4) 4)

Examiner le Quanti-Tray ou le Quanti-Tray /2000 après une incubation de 18 h à 22 h et considérer

que les réactions aux bactéries coliformes sont positives si les puits ont une couleur jaune identique ou

plus prononcée que la coloration du comparateur Quanti-Tray. Examiner les plateaux sous une lampe

à rayons ultraviolets (365 nm) dans une pièce sombre ou dans une chambre dont la lumière ambiante

est tamisée. Considérer comme positifs à E. coli tous les puits jaunes présentant un certain degré de

fluorescence. Si les résultats sont équivoques après 18 h (c’est-à-dire que la coloration jaune est moins

prononcée que celle du comparateur), il convient de prolonger l’incubation jusqu’à 22 h. Les résultats

positifs aux bactéries coliformes et à E. coli observés avant 18 h d’incubation et les résultats négatifs

observés après 22 h sont également valides.
9 Expression des résultats

D’après le nombre de puits positifs présents sur un Quanti-Tray , le NPP/100 ml des bactéries coliformes

et des E. coli peut être calculé en référence aux tables statistiques ou à l’aide d’un programme informatique

de génération de NPP, voir les Tableaux B.1 et B.2.
10 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit contenir au moins les informations suivantes:

a) la méthode d’essai utilisée faisant référence à la présente partie de l’ISO 9308;

b) toutes les informations nécessaires à l’identification complète de l’échantillon;

c) les résultats exprimés conformément à l’Article 9;

d) tout phénomène particulier observé au cours de l’analyse et toute opération non spécifiée dans la

présente partie de l’ISO 9308 ayant pu influencer les résultats.
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ISO 9308-2:2012(F)
11 Assurance qualité

Le laboratoire doit être doté d’un système de contrôle de la qualité clairement défini garantissant que

l’appareillage, les réactifs et les techniques sont adaptés à l’essai. L’utilisation de contrôles positifs, de

contrôles négatifs et de blancs fait partie de l’essai.
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ISO 9308-2:2012(F)
Annexe A
(informative)
Informations microbiologiques complémentaires sur les
bactéries coliformes

En plus d’exprimer la β-D-galactosidase, les bactéries coliformes sont généralement des bactéries à Gram

négatif, en forme de bâtonnets, ne formant pas de spores, présentant une réaction négative à l’oxydase,

pouvant croître en aérobiose et éventuellement en anaérobiose en présence de sels biliaires (ou d’autres

agents tensioactifs présentant des propriétés d’inhibition de croissance similaires), et habituellement

capables de faire fermenter le lactose avec production d’acide et d’aldéhyde en 48 h lorsqu’on les fait

incuber à une température de (36 ± 2) °C. Outre le fait qu’elles expriment la β-D-glucuronidase, les E.

coli sont des bactéries coliformes qui sont capables de produire de l’indole à partir du tryptophane dans

les (21 ± 3) h à (44 ± 0,5) °C. Elles réagissent positivement à l’essai au rouge de méthyle et peuvent

décarboxyler l’acide L-glutamique, mais ne sont pas capables de produire de l’acétylméthylcarbinol,

d’utiliser le citrate comme seule source de carbone ou de croître dans un bouillon au cyanure de

potassium (KCN).

Certaines souches d’Escherichia coli négatives à la β-D-glucuronidase, telles qu’Escherichia coli O157,

ne sont pas détectées en tant qu’E. coli. Comme elles sont positives à la β-D-galactosidase, elles sont

considérées comme des bactéries coliformes.
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ISO 9308-2:2012(F)
Annexe B
(normative)
Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats
B.1 Généralités

La scelleuse Quanti-Tray est une scelleuse thermique qui forme un joint entre les puits du Quanti-Tray.

La scelleuse distribue automatiquement le liquide dans les puits du Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000.

Le Quanti-Tray est utilisé lorsque l’on prévoit des dénombrements inférieurs à 200 ufc/100 ml. Le

Quanti-Tray/2000 peut être utilisé pour calculer des valeurs NPP pouvant atteindre 2 419 ufc/100 ml. Lors

du calcul du NPP, les tables fournies avec les plateaux servent de référence pour tous les dénombrements.

Un simple programme statistique peut aussi être utilisé pour calculer les résultats. Si nécessaire, le NPP

peut être calculé manuellement à l’aide des modes opératoires donnés ci-après.
B.2 Calcul du nombre le plus probable
B.2.1 Calcul du NPP pour IDEXX Quanti-Tray et Quanti-Tray/2000
B.2.1.1 Quanti-Tray (51 puits)

Le NPP de Quanti-Tray a été calculé pour la première fois à l’Université de Yale; un autre exemple

d’utilisation de la dilution en série NPP est disponible auprès de la Food and Drug Administration des

États-Unis, dans l’ouvrage intitulé Bacteriological Analytical Manual (disponible sur BAM Appendix 2:

Most Probable Number from Serial Dilutions, October 2010).
Chaque puits d’échantillon contient un volume d’environ 1,96 ml.
Le trop-plein peut contenir au moins 8,5 ml.
Pour calculer le NPP du Quanti-Tray (Tableau B.1), voir l’Équation (B.1):
N = N · ln [N/(N − X)]
NPP
(B.1)
N est le nombre le plus probable;
NPP
N est le nombre total de puits (tubes) utilisés lors d’un essai;
X est le nombre de puits (tubes) positifs observés lors d’un essai.
B.2.1.2 Quanti-Tray /2000 (97 puits)

Le NPP du Quanti-Tray/2000 a été calculé pour la première fois conformément à la description donnée

dans la Référence [1].
Les petits puits ont un volume moyen de 0,186 ml.

5) Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une marque déposée d’IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses

filiales aux États-Unis et/ou dans d’autres pays. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la

présente partie de l’ISO 9308 et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.

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Les grands puits ont un volume moyen d’environ 1,86 ml (dix fois plus grands que les petits puits).

Le trop-plein peut contenir environ 11 ml.
Pour calculer le NPP du Quanti-Tray /2000 (Tableau B.2), voir l’Équation (B.2):
K K
Vd P
ii i
= Vd n (B.2)
∑∑ ii i
−Vd N
ii npp
1−e
i==11i

d est le facteur de dilution au niveau i (par exemple, 0,1 pour une dilution 1→10);

K est le nombre de niveaux de dilution;
n est le nombre de puits au niveau i;
N est le nombre le plus probable;
npp
P est le nombre de puits positifs au niveau i;
V est le volume des puits au niveau i.
Les limites de confiance à 95 % peuvent être calculées ainsi:
T = (ln N − 1,96) × ε(ln N )
0 npp npp
T = (ln N + 1,96) × ε(ln N )
1 npp npp
T est la limite de confiance inférieure;
T est la limite de confiance supérieure;
ε est l’erreur-type; et
22 2
Vd n
ii i
ε InNN= (B.3)
nppnpp ∑
−Vd N
ii npp
e −1
i=1

6) Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une marque déposée d’IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses

filiales aux États-Unis et/ou dans d’autres pays. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la

présente partie de l’ISO 9308 et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.

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ISO 9308-2:2012(F)
Tableau B.1 — NPP du Quanti-Tray à 51 puits

Nb de puits donnant une réaction Nombre le plus probable Limites de confiance à 95 %

positive (NPP) par échantillon de
100 ml
Inférieure Supérieure
0 < 1 0,0 3,7
1 1 0,3 5,6
2 2 0,6 7,3
3 3,1 1,1 9
4 4,2 1,7 10,7
5 5,3 2,3 12,3
6 6,4 3 13,9
7 7,5 3,7 15,5
8 8,7 4,5 17,1
9 9,9 5
...

Questions, Comments and Discussion

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