SIST ISO 10260:2001

Water quality -- Measurement of biochemical parameters -- Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration

The procedure specified can be applied for phytoplankton in natural surface waters and for testing algal growth in bio-assays. Using appropriate sampling it can also be applied to phytobenthic communities. The principle is collection of algae by filtration, extraction of algal pigments, spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration in the extract, evaluation of the chlorophyll-a and phaeopigment concentration from the difference of absorbance at 665 nm prior to and after acidification of the extract.

Qualité de l'eau -- Mesurage des paramètres biochimiques -- Dosage spectrométrique de la chlorophylle a

Kakovost vode - Merjenje biokemijskih parametrov - Spektrometrično določevanje koncentracije klorofila

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 30-Nov-2001
• ICS: 13.060.50 - Examination of water for chemical substances
• Technical Committee: KAV - Water quality
• Current Stage: 6060 - National Implementation/Publication (Adopted Project)
• Start Date: 01-Dec-2001
• Due Date: 01-Dec-2001
• Completion Date: 01-Dec-2001
• Directive: 2009-01-0312 - Pravilnik o monitoringu stanja površinskih voda
• Ref Project: ISO 10260:1992 - Water quality - Measurement of biochemical parameters - Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration

Overview

SIST ISO 10260:2001 specifies a standardized method for the spectrometric determination of chlorophyll-a concentration in natural surface waters. Recognized globally, this International Standard outlines a precise procedure to measure key biochemical parameters reflecting water quality, especially focusing on the presence and quantity of phytoplankton and algae. The method uses filtration to collect algae, followed by ethanol extraction of pigments and spectrometric analysis at specific wavelengths (notably 665 nm before and after acidification), enabling accurate chlorophyll-a and phaeopigment quantification.

This methodology serves as an essential tool for environmental monitoring, assessing trophic states of aquatic ecosystems, and evaluating algal growth in bio-assays. Its application extends to phytobenthic communities with appropriate sampling techniques.

Key Topics

• Measurement Principle
  Algae are collected by filtration, and their pigments are extracted using hot ethanol. The chlorophyll-a concentration is determined spectrometrically by measuring absorbance at 665 nm, corrected by readings at 750 nm to adjust for turbidity. Acidification of extracts distinguishes chlorophyll-a from phaeopigments, allowing calculation of pigment concentrations based on absorbance differences.

• Sampling and Storage
  Samples are collected following ISO 5667-1 and ISO 5667-2 standards for water quality sampling. To prevent pigment degradation, exposure to light and oxygen must be minimized. Samples should be processed promptly or stored refrigerated in the dark for no more than 8 hours before analysis.

• Extraction Process
  The ethanol extraction involves heating to 75 °C to deactivate enzymes and enhance pigment release. Two extraction variants enable flexibility: direct heating of filter pieces in ethanol with homogenization, or submersion followed by heating in a water bath. Ethanol is preferred over acetone or methanol due to higher extraction efficiency and fewer analytical interferences.

• Analytical Equipment
  A visible-range spectrometer with high sensitivity and 1-5 cm optical pathlength cuvettes is required to measure absorbances precisely. Vacuum filtration devices and glass-fiber filters (retaining particles >1 μm) are essential for sample preparation.

• Calculation of Concentrations
  Chlorophyll-a concentration is calculated using spectrometric absorbance values, known extract volumes, and specific absorption coefficients. Phaeopigment concentrations are estimated similarly but are inherently less precise due to analytical variability.

Applications

• Water Quality Monitoring
  Accurate determination of chlorophyll-a serves as a proxy for phytoplankton biomass and photosynthetic activity, helping to assess eutrophication, nutrient loading, and overall aquatic ecosystem health.

• Algal Growth Testing in Bio-Assays
  The method supports laboratory and field bio-assays by quantifying algal pigment concentrations, which reflect algal population dynamics and responses to environmental stressors.

• Phytobenthic Community Analysis
  With adjusted sampling protocols, this standard is applicable to benthic algae on substrates, aiding in comprehensive ecological assessments of freshwater and marine habitats.

• Environmental Research and Management
  SIST ISO 10260:2001 facilitates standardized data collection across studies and monitoring programs, supporting regulatory compliance, environmental impact assessments, and water resource management.

Related Standards

• ISO 5667-1 and ISO 5667-2
  Provide guidance on water sampling design and techniques, essential for proper sample collection before chlorophyll-a determination.

• ISO/TC 147 / SC 2
  Refers to the technical committee responsible for physical, chemical, and biochemical water quality methods, ensuring harmonization with related measurement standards.

• Other Methods for Chlorophyll Analysis
  While ISO 10260 focuses on spectrometric ethanol extraction methods, international organizations such as UNESCO and SCOR have recommended alternative solvents and protocols referenced within the annexes.

---

Keywords: ISO 10260, chlorophyll-a concentration, water quality, biochemical parameters, spectrometric determination, phytoplankton, phytobenthos, algae pigment extraction, bio-assay, environmental monitoring, aquatic ecosystems.

Standards Content (Sample)

SLOVENSKI STANDARD
01-december-2001
.DNRYRVWYRGH0HUMHQMHELRNHPLMVNLKSDUDPHWURY6SHNWURPHWULþQRGRORþHYDQMH
NRQFHQWUDFLMHNORURILOD
Water quality -- Measurement of biochemical parameters -- Spectrometric determination
of the chlorophyll-a concentration
Qualité de l'eau -- Mesurage des paramètres biochimiques -- Dosage spectrométrique
de la chlorophylle a
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 10260:1992
ICS:
13.060.50 3UHLVNDYDYRGHQDNHPLþQH Examination of water for
VQRYL chemical substances
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

INTERNATIONAL
STANDARD
First edi tion
1992-07-15
Water quality - Measurement of biochemical
Parameters - Spectrometric determination of
the chlorophyll-a concentration
Qualite de I ’eau - Mesurage des paramefres biochimiques - Dosage
spectrometrique de la chlorophylle a
---
------
Reference number
--
---. -.- ------
ISO 10260: 1992(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Inter-
national Standard requires approval by at least 75 % of the member
bodies casting a vote.
International Standard ISO 10260 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Wafer quality, Sub-Committee SC 2, Physical, Chemical,
biochemical methods.
Annexes A and B of this International Standard are for information only.
0 ISO 1992
All righfs reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any ferm
or by any means, electronie or mechanical, including photocopying and microfilm, without
permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Seitzerland
Printed in Switzerland
ii
Introduction
Chlorophyll-a is the essential photosynthetic Pigment present in all
green plants. The chlorophyll content of a surface water is an indicator
of its trophic state. The determination of the chlorophyll-a concentration
provides information concerning the quantity and potential
photosynthetic activity of algae. The most important metabolites of
chlorophylls are phaeophytines and phaeophorbide. The ratio of
chlorophyll to phaeopigments is indicative of the physiological state of
the algae.
. . .
Ill
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INTERNATIONAL STANDARD
Measurement of biochemical Parameters -
Water quality -
Spectrometric determination of the chlorophyll-a
concentration
1.6 The Pigment of certain rarely occurring
1 Scope
phototrophic bacteria (e.g. Chlorobium) interferes
with the determination of chlorophyll-a concen-
1.1 This International Standard specifies a method tration [l]. The contribution of chlorophyll-b and
for the determination of the chlorophyll-a concen- chlorophyll-c to the absorbance at 665 nm is negli-
tration. The procedure tan be applied for gible [2].
phytoplankton in natura1 surface waters and for
testing algal growth in bio-assays. Using appropriate
2 Normative references
sampling it tan also be applied to phytobenthic
communities (see annex A).
The following Standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions
of this International Standard. At the time of publi-
1.2 Other algal Pigments such as chlorophyll-b and
cation, the editions indicated were valid. All stan-
chlorophyll-c and some chlorophyll metabolites do
dards are subject to revision, and Parties to
not contribute to the determination. Phaeopigments
agreements based on this International Standard
may be determined semiquantitatively, to correct for
are encouraged to investigate the possibility of ap-
interference with chlorophyll-a determination and to
plying the most recent editions of the Standards in-
indicate the Portion of inactive algal biomass.
dicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
1.3 Chlorophyll is sensitive to Iight and Oxygen,
especially when it is extracted. To avoid oxidative
ISO 5667-1:1980, Water quality - Sampling -
and photochemical destruction, the samples shall
Part 1: Guidance on the design of sampling pro-
not be exposed to bright light or air. Homogenization
grammes.
of the Sample may in some cases increase the ex-
traction efficiency.
ISO 5667-2:1991, Water quality - Sampling -
Part 2: Guidance oi7 sampling techniques.
1.4 The extraction procedure with ethanol involves
heating to inactivate
75 OC for 5 min to 3 Principle
chlorophyllase and accelerate the lysis of Pigments.
Storage of extracts (except filters containing sus- Collection of algae and other suspended matter from
pended matter) Prior to photometric measurement a water Sample by filtration. Extraction of algal pig-
should be kept to a minimum, but is possible up to ments from the filter residue into hot ethanol. Spec-
3 d under refrigeration at 4 OC. Storage of extracts determination of the chlorophyll-a
trometric
at less than - 25 OC is possible for at least 30 d.
concentration in the extract. Evaluation of the
chlorophyll-a and phaeopigment concentration from
the differente in absorbance at 665 nm Prior to and
1.5 Even though the procedure involves filtration
after acidification of the extract [3] [4].
or centrifugation to clarify the final extract, a slight
turbidity may remain. The acidification step may
also Cause turbidity. Therefore, the absorbance 4 Reagents
measured at 665 nm has to be corrected for turbidity
Use only reagents of recognized analytical grade
by substracting the absorbance measured at
and only deionized water of equivalent purity.
750 nm.
4.1 Hydrochlorit acid, c(HCI) = 3 mol/i. range 0,l litre to 2 litres, depending on the concen-
tration of algae) through a glass-fibre filter (5.3)
clamped in a suitable holder. Dry the filter in a vac-
4.2 Ethanol.
uum, as soon as it is dry remove it from the holder
(CJ-l~OH), aiueous Solution 90 % (V/V ’).
and place it in the extraction vessel. If it does not fit
into the extraction vessel, tear it into pieces.
NOTE 1 Generally, a denaturant in ethanol does not in-
terfere. Nevertheless, a comparative determination with
Avoid contact with fingers.
pure ethanol (90 Oh) is recommended with each unknown
batch [4].
7.2 Extraction variant A
5 Apparatus
Ordinary Iaboratory apparatus and the following: Heat the required volume of ethanol (4.2) to 75 “C.
Pour a small volume (usually 30 ml to 40 ml) of the
5.1 Spectrometer, for use in the visible range up to
hot ethanol into the vessel containing the filter or
750 nm, with a resolution of 1 nm, a bandwidth of
filter pieces. After cooling for a few minutes, grind
2 nm or less, sensitivity less than or equal to 0,001
the filter to facilitate extraction, preferably with a
absorbance units and with Optical cells of path
rod-shaped homogenizer. Wash the homogenizer
length between 1 cm and 5 cm.
rod with a small volume of ethanol (4.2) to remove
particles of Sample adhering to it. Extract the sus-
5.2 Vacuum filtration device, filter holder with
Pension for at least 3 min.
clamp.
NOTE 2 Usually the extraction is carried out at room
5.3 Glas+fibre filters free of organic binder, for fil-
temperature for several hours or overnight. lf the ex-
tration of water samples, retaining more than 99 % traction is prolonged, or the extract is stored for several
days (e.g. over the weekend), the extraction vessels
of particles greater than 1 Pm. Suitable diameters
should be stored in a refrigerator.
range from 25 mm to 50 mm.
Filter the slurry through a dense filter (5.4) into a
5.4 Filters for filtration of extracts, as described in
calibrated flask (of capacity 50 ml or 100 ml) with a
5.3 but of small diameter e.g. 25 mm.
stopper. Wash the extraction vessel with ethanol
(4.2) to remove residual extract and transfer
Alternative: Centrifuge, with an acceleration of
quantitatively while rinsing the filter into the cali-
6 000 g and a rotor suitable for appropriate ex-
brated flask. Fill to the mark, stopper and mix thor-
traction tubes.
oughly. This is the extract volume l/e.
5.5 Water bath, adjustable to 75 OC + 1 “C with a
-
Proceed with step 7.4.
rack for extraction vessels.
5.6 Extraction vessels, e.g. wide-necked amber
7.3 Extraction variant B
glass vials with polytetrafluoroethylene (PTFE)-lined
screw taps, of typical capacity 30 ml to 50 ml, suit-
Dispense an exact volume VE (usually 20 ml or
able for centrifugation at 6 000 g.
25 ml) of
...

INTERNATIONAL
STANDARD
First edi tion
1992-07-15
Water quality - Measurement of biochemical
Parameters - Spectrometric determination of
the chlorophyll-a concentration
Qualite de I ’eau - Mesurage des paramefres biochimiques - Dosage
spectrometrique de la chlorophylle a
---
------
Reference number
--
---. -.- ------
ISO 10260: 1992(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Inter-
national Standard requires approval by at least 75 % of the member
bodies casting a vote.
International Standard ISO 10260 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Wafer quality, Sub-Committee SC 2, Physical, Chemical,
biochemical methods.
Annexes A and B of this International Standard are for information only.
0 ISO 1992
All righfs reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any ferm
or by any means, electronie or mechanical, including photocopying and microfilm, without
permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Seitzerland
Printed in Switzerland
ii
Introduction
Chlorophyll-a is the essential photosynthetic Pigment present in all
green plants. The chlorophyll content of a surface water is an indicator
of its trophic state. The determination of the chlorophyll-a concentration
provides information concerning the quantity and potential
photosynthetic activity of algae. The most important metabolites of
chlorophylls are phaeophytines and phaeophorbide. The ratio of
chlorophyll to phaeopigments is indicative of the physiological state of
the algae.
. . .
Ill
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INTERNATIONAL STANDARD
Measurement of biochemical Parameters -
Water quality -
Spectrometric determination of the chlorophyll-a
concentration
1.6 The Pigment of certain rarely occurring
1 Scope
phototrophic bacteria (e.g. Chlorobium) interferes
with the determination of chlorophyll-a concen-
1.1 This International Standard specifies a method tration [l]. The contribution of chlorophyll-b and
for the determination of the chlorophyll-a concen- chlorophyll-c to the absorbance at 665 nm is negli-
tration. The procedure tan be applied for gible [2].
phytoplankton in natura1 surface waters and for
testing algal growth in bio-assays. Using appropriate
2 Normative references
sampling it tan also be applied to phytobenthic
communities (see annex A).
The following Standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions
of this International Standard. At the time of publi-
1.2 Other algal Pigments such as chlorophyll-b and
cation, the editions indicated were valid. All stan-
chlorophyll-c and some chlorophyll metabolites do
dards are subject to revision, and Parties to
not contribute to the determination. Phaeopigments
agreements based on this International Standard
may be determined semiquantitatively, to correct for
are encouraged to investigate the possibility of ap-
interference with chlorophyll-a determination and to
plying the most recent editions of the Standards in-
indicate the Portion of inactive algal biomass.
dicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
1.3 Chlorophyll is sensitive to Iight and Oxygen,
especially when it is extracted. To avoid oxidative
ISO 5667-1:1980, Water quality - Sampling -
and photochemical destruction, the samples shall
Part 1: Guidance on the design of sampling pro-
not be exposed to bright light or air. Homogenization
grammes.
of the Sample may in some cases increase the ex-
traction efficiency.
ISO 5667-2:1991, Water quality - Sampling -
Part 2: Guidance oi7 sampling techniques.
1.4 The extraction procedure with ethanol involves
heating to inactivate
75 OC for 5 min to 3 Principle
chlorophyllase and accelerate the lysis of Pigments.
Storage of extracts (except filters containing sus- Collection of algae and other suspended matter from
pended matter) Prior to photometric measurement a water Sample by filtration. Extraction of algal pig-
should be kept to a minimum, but is possible up to ments from the filter residue into hot ethanol. Spec-
3 d under refrigeration at 4 OC. Storage of extracts determination of the chlorophyll-a
trometric
at less than - 25 OC is possible for at least 30 d.
concentration in the extract. Evaluation of the
chlorophyll-a and phaeopigment concentration from
the differente in absorbance at 665 nm Prior to and
1.5 Even though the procedure involves filtration
after acidification of the extract [3] [4].
or centrifugation to clarify the final extract, a slight
turbidity may remain. The acidification step may
also Cause turbidity. Therefore, the absorbance 4 Reagents
measured at 665 nm has to be corrected for turbidity
Use only reagents of recognized analytical grade
by substracting the absorbance measured at
and only deionized water of equivalent purity.
750 nm.
4.1 Hydrochlorit acid, c(HCI) = 3 mol/i. range 0,l litre to 2 litres, depending on the concen-
tration of algae) through a glass-fibre filter (5.3)
clamped in a suitable holder. Dry the filter in a vac-
4.2 Ethanol.
uum, as soon as it is dry remove it from the holder
(CJ-l~OH), aiueous Solution 90 % (V/V ’).
and place it in the extraction vessel. If it does not fit
into the extraction vessel, tear it into pieces.
NOTE 1 Generally, a denaturant in ethanol does not in-
terfere. Nevertheless, a comparative determination with
Avoid contact with fingers.
pure ethanol (90 Oh) is recommended with each unknown
batch [4].
7.2 Extraction variant A
5 Apparatus
Ordinary Iaboratory apparatus and the following: Heat the required volume of ethanol (4.2) to 75 “C.
Pour a small volume (usually 30 ml to 40 ml) of the
5.1 Spectrometer, for use in the visible range up to
hot ethanol into the vessel containing the filter or
750 nm, with a resolution of 1 nm, a bandwidth of
filter pieces. After cooling for a few minutes, grind
2 nm or less, sensitivity less than or equal to 0,001
the filter to facilitate extraction, preferably with a
absorbance units and with Optical cells of path
rod-shaped homogenizer. Wash the homogenizer
length between 1 cm and 5 cm.
rod with a small volume of ethanol (4.2) to remove
particles of Sample adhering to it. Extract the sus-
5.2 Vacuum filtration device, filter holder with
Pension for at least 3 min.
clamp.
NOTE 2 Usually the extraction is carried out at room
5.3 Glas+fibre filters free of organic binder, for fil-
temperature for several hours or overnight. lf the ex-
tration of water samples, retaining more than 99 % traction is prolonged, or the extract is stored for several
days (e.g. over the weekend), the extraction vessels
of particles greater than 1 Pm. Suitable diameters
should be stored in a refrigerator.
range from 25 mm to 50 mm.
Filter the slurry through a dense filter (5.4) into a
5.4 Filters for filtration of extracts, as described in
calibrated flask (of capacity 50 ml or 100 ml) with a
5.3 but of small diameter e.g. 25 mm.
stopper. Wash the extraction vessel with ethanol
(4.2) to remove residual extract and transfer
Alternative: Centrifuge, with an acceleration of
quantitatively while rinsing the filter into the cali-
6 000 g and a rotor suitable for appropriate ex-
brated flask. Fill to the mark, stopper and mix thor-
traction tubes.
oughly. This is the extract volume l/e.
5.5 Water bath, adjustable to 75 OC + 1 “C with a
-
Proceed with step 7.4.
rack for extraction vessels.
5.6 Extraction vessels, e.g. wide-necked amber
7.3 Extraction variant B
glass vials with polytetrafluoroethylene (PTFE)-lined
screw taps, of typical capacity 30 ml to 50 ml, suit-
Dispense an exact volume VE (usually 20 ml or
able for centrifugation at 6 000 g.
25 ml) of the ethanol (4.2) into the extraction vessel
(5.6) and allow the filter pieces to submerge. Close
6 Sampling and storage
the screw cap tightly to avoid losses from evap-
oration of extractant. Shake slightly to resuspend the
Sample according to ISO 5667-1 and ISO 5667-2.
filter residue. Place the tube in the water bath (5.5)
Refrigerated storage of water samples in the dark
so that the extractant level aligns with the level of
for less than 8 h is acceptable but should be
the bath. Heat for 5 min, shaking slightly if necess-
avoided. If possible, perform Steps 7.1 to 7.3 im-
ary.
...

ISO
NORME
INTERNATIONALE
Première édition
1992-07-l 5
Qualité de l’eau - Mesurage des paramètres
- Dosage spectrométrique de la
biochimiques
chlorophylle a
Wa ter quality - Measurement of biochemical parameters -
Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration
Numéro de référence
ISO 10260: 1992(F)
Avant-propos
LIS0 (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 10260 a été élaborée par le comité techni-
que ISO/TC 147, Qualité de /‘eau, sous-comité SC 2, Méthodes physi-
ques, chimiques et biochimiques.
Les annexes A et l3 de I a prése nte N orme internationale sont données
uniq uement à
titre d’info rmation
0 ISO 1992
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
Introduction
La chlorophylle a est le principal pigment photosynthétique des algues
vertes. La teneur en chlorophylle a des eaux de surface constitue un
indicateur de leur état trophique. Sa détermination permet d’évaluer la
biomasse et l’activité photosynthétique potentielle des algues. Les
principaux produits de dégradation de la chlorophylle sont la
phéophytine et la phéophorbide, et le rapport chlorophylle
alphéopigments est un indicateur de l’état physiologique des algues.
. . .
III
Page blanche
NORME INTERNATIONALE ISO 10260:1992(F)
- Mesurage des paramètres
Qualité de l’eau
biochimiques - Dosage spectrométrique de la chlorophylle a
traîner une certaine turbidité. II faut donc soustraire
1 Domaine d’application
de la valeur de I’absorbance à 665 nm une correc-
tion de turbidité égale à I’absorbance à 750 nm.
1.1 La présente Norme internationale prescrit une
méthode de dosage de la chlorophylle a. Elle est
1.6 Le pigment de certaines
bactéries
applicable à l’évaluation du phytoplancton dans les
phototrophes peu courantes (Chîorobium par exem-
eaux de surface naturelles et aux essais biologiques
ple) interfère dans le dosage de la chlorophylle a
portant sur la croissance algale.
[l]. Par contre, la contribution des chlorophylles b
et c à l’absorbante à 665 nm est négligeable [2].
A condition d’utiliser des méthodes d’échantillon-
nage appropriées, elle peut également être appli-
quée aux communautés phytobenthiques (voir
annexe A).
2 Références normatives
1.2 Les autres pigments tels que les chlorophylles
b et c et certains des produits de dégradation de la
Les normes suivantes contiennent des dispositions
chlorophylle n’interviennent pas dans le dosage. II
qui, par suite de la référence qui en est faite,
est possible d’effectuer une analyse semi-
constituent des dispositions valables pour la pré-
quantitative des phéopigments afin de tenir compte
sente Norme internationale. Au moment de la pu-
de leur interférence dans le dosage de la
blication, les éditions indiquées étaient en vigueur.
chlorophylle a et d’évaluer la proportion de
Toute norme est sujette à révision et les parties
biomasse algale inactive.
prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la
possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes
1.3 La chlorophylle est sensible à l’action de la
des normes indiquées ci-après. Les membres de la
lumière et de l’oxygène, notamment au moment de
CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes
l’extraction. Pour empêcher sa dégradation par
internationales en vigueur à un moment donné.
oxydation ou photoréaction, il faut éviter toute ex-
position à la lumière des échantillons et tout contact
ISO 5667-l :1980, Qualité de l’eau - Échantillonnage
avec l’air. L’homogénéisation de l’échantillon per-
- Partie 1: Guide général pour l’établissement des
met dans certains cas d’accroître le rendement
programmes d’échantillonnage.
d’extraction.
ISO 5667,2:1991, Qualité de l’eau - Échantillonnage
1.4 Si l’extraction est effectuée à I’éthanol, il faut
- Partie 2: Guide général sur les techniques
chauffer à 75 OC pendant 5 min afin d’inactiver la
d’échan fillonnage.
chlorophyllase et d’accélérer la lyse des pigments.
Le temps entre l’extraction et le mesurage doit être
bref, mais il est possible de conserver les extraits
3 Principe
(mais non les filtres) au réfrigérateur (4 OC), pendant
3 jours au maximum, ou à température inférieure à
Filtration d’un échantillon d’eau pour isoler les al-
- 25 OC pendant au moins 30 jours.
gues et autres matières en suspension. À partir du
résidu de filtration, extraction des pigments à
1.5 Bien que le mode opératoire comprenne une I’éthanol chaud. Dosage spectrométrique de la
chlorophylle a contenue dans l’extrait. l%aluation de
étape de filtration ou centrifugation destinée à la
clarification de l’extrait final, il peut subsister une la concentration de la chlorophylle a et des
légère turbidité. L’acidifkation, également, peut en- phéopigments d’après la différence d’absorbance à
665 nm avant et après acidifïcation de l’extrait [3],
6 Échantillonnage et conservation des
.
I?l
échantillons
4 Réactifs
L’échantillonnage doit être conduit comme spécifié
dans I’ISO 5667-l et I’ISO 5667-2. La conservation
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analyti-
des échantillons d’eau au réfrigérateur (à l’obscurité
que reconnue et de l’eau désionisée ou de pureté
et pendant moins de 8 h) est admise, mais il est
équivalente.
préférable, si possible, de procéder aux opérations
7.1 à 7.3 immédiatement après l’échantillonnage.
Les extraits bruts peuvent être conservés à tempé-
4.1 Acide chlorydrique, c(HCI) = 3 mol/l.
rature inférieure à - 25 OC, pendant au moins 30
jours, dans des tubes à extraction en verre brun
4.2 Ëthanol, C,H,OH, en solution aqueuse à
(5.5) hermétiquement fermés. Les échantillons et les
90 % (V/I/).
filtres, par contre, ne doivent pas être congelés.
NOTE 1 En règle générale, la présence d’un dénaturant
dans I’éthanol n’interfère pas dans le dosage. II est tou-
tefois recommandé de procéder à un dosage comparatif
7 Mode opératoire
avec de l’éthanol pur (90 Oh) lors de la réception de tout
lot inconnu [4].
7.1 Filtration
Agiter les échantillons pour bien les homogénéiser.
Filtrer un volume d’échantillon I/, (généralement
5 Appareillage
compris entre 0,l litre et 2 litres, suivant la teneur
en algues) à travers un filtre en fibre de verre (5.3)
Matériel courant de laboratoire, et
fixé sur un support adéquat avec une pince.
5.1 Spectromètre, permettant de mesurer I’absor-
Sécher le filtre sous vide. le séparer de son support
bance dans le domaine visible, jusqu’à 750 nm, avec
et le placer dans le tube à extraction. S’il entre dif-
une résolution de 1 nm, une largeur de bande infé-
ficilement dans le tube, le découper en morceaux.
rieure ou égale à 2 nm, et une sensibilité inférieure
ou égale à 0,001 unité d’absorbance, muni de cuves
Éviter tout contact avec les doigts.
de parcours optique compris entre 1 cm et 5 cm.
5.2 Dispositif de filtration sous vide, support et 7.2 Variante d’extraction A
pince de fixation.
Chauffer à 75 OC le volume requis d’éthanol (4.2).
5.3 Filtres en fibre de verre sans liant organique,
Verser un petit volume d’éthanol chaud (géné-
destinés à la filtration des échantillons d’eau, rete-
ralement 30 ml à 40 ml) dans le tube contenant les
nant plus de 99 % des particules de diamètre supé-
morceaux de filtre. Laisser refroidir quelques minu-
rieur à 1 pm, et de diamètre compris entre 25 mm
tes, puis déchiqueter le filtre, de préférence avec
et 50 mm.
une baguette de broyage de tissus, pour faciliter
l’extraction. Laver la baguette avec un peu d’éthanol
5.4 Filtres destinés à la filtration des extraits, pré-
(4.2) pour entraîner les particules adhérentes. Pro-
sentant les mêmes caractéristiques que les filtres
céder à l’extraction pendant au moins 3 min.
décrits en 5.3, mais de diamètre inférieur, par
exemple 25 mm,
NOTE 2 En règle générale, l’extraction est conduite à
température ambiante pendant plusieurs heures ou toute
une nuit. Si elle est prolongée, ou si l’extrait doit être
conservé pendant plusieurs jours (par exemple un week-
lec a ccélération de 6 000 g et rotor
Centrifugeuse, av
end), il convient de placer les tubes à extraction au réfri-
ion spécifiés.
pouvant recevoir les t ubes à extract
gérateur.
5.5 Bain d’eau, pouvant être maintenu à
Transférer ia suspension, au travers d’un filtre
75 OC + 1 OC, avec support destiné à recevoir les
(5.4), dans une fiole jaugée avec bouchon (capacité
tubes a extraction.
50 ml ou 100 ml). Laver le tube à extraction avec de
I’éthanol (4.2) pour entraîner l’extrait résiduel et
5.6 Tubes à extraction, par exemple en verre transférer quantitativement le produit de lavage
ambré à col large et capuchon à vis revêtu de dans la fiole jaugée, en rincant le filtre. Compléter
au trait, boucher et bien homogénéiser. Le volume
polytétrafluoréthylène (PTFE), capacité 30 ml à
obtenu est le volume d’extrait VE.
50 ml, utilisables pour la centrifugation à 6 0
...

IS0
NORME
I NTE R NAT1 O NALE
Première édition
1992-07-1 5
Qualité de l’eau - Mesurage des paramètres
biochimiques - Dosage spectrometrique de la
chlorophylle a
Wafer quality - Measurement of biochemical parameters -
Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration
Numéro de référence
IS0 10260: 1992( F)
IS0 10260:1992(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
tnon d i a I e d ’org a n i s m es n at ion aux de norm a I i sa t ion (corn it és m e m b res
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
.
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale IS0 10260 a été élaborée par le comité techni-
que ISO/TC 147, Qualité de l‘eau, sous-comité SC 2, Méthodes physi-
ques, chimiques et biochimiques.
Les annexes A et B de la présente Norme internationale sont données
II n iq ueme nt a tit re d’in format ion.
O IS0 1992
Droits de reproduction reserves. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de I’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 CH-I211 Geneve 20 Suisse
Imprimé en Suisse
ii
IS0 10260:1992(F)
Introduction
La chlorophylle a est le principal pigment photosynthétique des algues
vertes. La teneur en chlorophylle a des eaux de surface constitue un
indicateur de leur état trophique. Sa détermination permet d’évaluer la
biomasse et l’activité photosynthétique potentielle des algues. Les
principaux produits de dégradation de la chlorophylle sont la
phéophytine et la phéophorbid.e, et le rapport chlorophylle
alphéopigments est un indicateur de I’état physiologique des algues.
iii
NORME INTERNATIONALE IS0 10260:1992(F)
Qualité de l’eau - Mesurage des paramètres
biochimiques - Dosage spectrométrique de la chlorophylle a
traîner une certaine turbidité. II faut donc soustraire
1 Domaine d’application
de la valeur de I’absorbance à 665 nm une correc-
tion de turbidit6égale a I’absorbance à 750 nm.
1.1 La présente Norme internationale prescrit une
méthode de dosage de la chlorophylle a. Elle est
1.6 Le pigment - de certaines bactéries
applicable à I’évaluation du phytoplancton dans les
phototrophes peu courantes (Chlorobium par exem-
eaux de surface naturelles et aux essais biologiques
ple) interfère dans le dosage de la chlorophylle a
portant sur la croissance algale.
[I]. Par contre, la contribution des chlorophylles b
et c à I’absorbance a 665 nm est négligeable [2].
À condition d’utiliser des méthodes d’échantillon-
nage appropriées, elle peut également être appli-
quée aux communautés phytobenthiques (voir
annexe A).
2 Références normatives
1.2 Les autres pigments tels que les chlorophylles
b et c et certains des produits de dégradation de la
Les normes suivantes contiennent des dispositions
chlorophylle n’interviennent pas dans le dosage. II
qui, par suite de la réference qui en est faite,
est possible d’effectuer une analyse semi-
constituent des dispositions valables pour la pré-
quantitative des phéopigments afin de tenir compte
sente Norme internationale. Au moment de la pu-
de leur interférence dans le dosage de la
blication, les éditions indiquées étaient en vigueur.
chlorophylle a et d‘évaluer la proportion de
Toute norme est sujette à révision et les parties
biomasse algale inactive.
prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la
possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes
1.3 La chlorophylle est sensible à l’action de la
des normes indiquées ci-après. Les membres de la
lumière et de l’oxygène, notamment au moment de
CE1 et de I’ISO possèdent le registre des Normes
l‘extraction. Pour empêcher sa dégradation par
internationales en vigueur à un moment donné.
oxydation ou photoréaction, il faut éviter toute ex-
position à la lumière des échantillons et tout contact
IS0 5667-1:1980, Qualité de l’eau - Échantillonnage
avec l’air. L’homogénéisation de I’échantillon per-
- Partie 1: Guide général pour I‘établissement des
met dans certains cas d’accroître le rendement
programmes d‘échantillonnage.
d’extraction.
IS0 5667-2:1991, Qualité de l’eau - khantillonnage
1.4 Si l’extraction est effectuée à I’éthanol, il faut
- Partie 2: Guide général sur les techniques
à 75 OC pendant 5 min afin d’inactiver la
chauffer
d‘échantillonnage.
chlorophyllase et d’accélérer la lyse des pigments.
Le temps entre l’extraction et le mesurage doit etre
bref, mais il est possible de conserver les extraits
3 Principe
(mais non les filtres) au réfrigkrateur (4 OC), pendant
3 jours au maximum, ou à température inférieure à
Filtration d’un échantillon d’eau pour isoler les al-
- 25 OC pendant au moins 30 jours.
gues et autres matières en suspension. À partir du
résidu de filtration, extraction des pigments à
1.5 Bien que le mode opératoire comprenne une I’éthanol chaud. Dosage spectrométrique de la
étape de filtration ou centrifugation destinée à la chlorophylle a contenue dans l’extrait. Evaluation de
la concentration de la chlorophylle a et des
clarification de l’extrait final, il peut subsister une
phkopigments d’aprks la différence d‘absorbance a
légère turbidité. L’acidification, Bgalement, peut en-
IS0 10260:1992(F)
665 nm avant et après acidification de l’extrait [a],
6 Échantillonnage et conservation des
~41.
échantillons
4 Réactifs
L’échantillonnage doit être conduit comme spécifié
dans I’ISO 5667-1 et I’ISO 5667-2. La conservation
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analyti-
des échantillons d’eau au réfrigérateur (à l’obscurité
que reconnue et de l’eau désionisée ou de pureté
et pendant moins de 8 h) est admise, mais il est
éq u iva le nte.
préférable. si possible, de procéder aux opérations
7.1 à 7.3 immédiatement après I‘échantillonnage.
Les extraits bruts peuvent être conservés à tempé-
4.1 Acide chlorydrique, c(HCI) = 3 mol/l.
rature inférieure à - 25 OC, pendant au moins 30
jours, dans des tubes a extraction en verre brun
4.2 Ethanol, C,H,OH, en solution aqueuse à
(5.5) hermétiquement fermés. Les échantillons et les
90 Y0 (Vjv).
filtres, par contre, ne doivent pas être congelés.
NOTE 1 En règle générale, la présence d’un dénaturant
dans I’éthanol n’interfère pas dans le dosage. II est tou-
tefois recommandé de procéder à un dosage comparatif
7 Mode opératoire
avec de I’éthanol pur (90 %) lors de la réception de tout
lot inconnu [4].
7.1 Filtration
Agiter les échantillons pour bien les homogénéiser.
V, (généralement
Filtrer un volume d’échantillon
5 Appareillage
compris entre 0,l litre et 2 litres, suivant la teneur
en algues) à travers un filtre en fibre de verre (5.3)
Matériel courant de laboratoire, et
fixé sur un support adéquat avec une pince.
5.1 Spectromètre, permettant de mesurer I’absor-
Sécher le filtre sous vide. le séparer de son support
bance dans le domaine visible, jusqu’à 750 nm, avec
et le placer dans le tube à extraction. S’il entre dif-
une résolution de 1 nm, une largeur de bande infé-
ficilement dans le tube, le découper en morceaux.
rieure ou égale à 2 nm, et une sensibilité inférieure
ou égale à 0,001 unité d’absorbance, muni de cuves
hiter tout contact avec les doigts.
de parcours optique compris entre 1 cm et 5 cm.
5.2 Dispositif de filtration sous vide, support et 7.2 Variante d’extraction A
pince de fixation.
Chauffer à 75 OC le volume requis d’éthanol (4.2)
5.3 Filtres en fibre de verre sans liant organique,
Verser un petit volume d’éthanol chaud (géné-
destinés à la filtration des échantillons d’eau, rete-
ralement 30 ml à 40 ml) dans le tube contenant les
nant plus de 99 Y. des particules de diamètre supé-
morceaux de filtre. Laisser refroidir quelques minu-
rieur à 1 pm, et de diamètre compris entre 25 mm
tes, puis déchiqueter le filtre, de préférence avec
et 50 mm.
une baguette de broyage de tissus, pour faciliter
l’extraction. Laver la baguette avec un peu d’éthanol
5.4 Filtres destinés a la filtration des extraits, pré-
(4.2) pour entraîner les particules adhérentes. Pro-
sentant les mêmes caractéristiques que les filtres
céder à l’extraction pendant au moins 3 min.
décrits en 5.3, mais de diamètre inférieur, par
exemple 25 mm,
NOTE 2 En règle générale, l’extraction est conduite à
température ambiante pendant plusieurs heures ou toute
ou
une nuit. Si elle est prolongée, ou si l’extrait doit être
conservé pendant plusieurs jours (par exemple un week-
Centrifugeuse, avec accélération de 6 O00 g et rotor
end), il convient de placer les tubes à extraction au réfri-
pouvant recevoir les tubes à extraction spécifiés.
gérateur.
5.5 Bain d’eau, pouvant être maintenu à
Transférer la suspension, au travers d’un filtre
75 OC f 1 OC, avec support destiné à recevoir les
(5.4), dans une fiole jaugée avec bouchon (capacité
tubes à extraction.
50 ml ou 100 ml). Laver le tube à extraction avec de
I’éthanol (4.2) pour entraîner l’extrait résiduel et
5.6 Tubes A extraction, par exemple en verre transférer quantitativement le produit de lavage
ambré à col large et capuchon à vis revêtu de dans la fiole jaugée, en rincant le filtre. Compléter
au trait, boucher et bien homogénéiser. Le volume
polytétrafluoréthylène (PTFE), capacité 30 ml à
obtenu est le volu
...