SIST-TS ISO/TS 23893-2:2010
Water quality - Biochemical and physiological measurements on fish - Part 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD)
Water quality - Biochemical and physiological measurements on fish - Part 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD)
ISO/TS 23893-2:2007 specifies a method for measuring the ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) enzyme activity on a post-mitochondrial fraction of fish liver homogenate (subcellular fraction in which the EROD activity is located) employing a cell or microplate fluorimetric method.
It applies to fish that are sampled in their natural environment (fresh water or salt water) or exposed to substances or effluents in a laboratory.
This method is applicable for EROD values greater than or equal to 1 pmol/(min mg) of proteins. A higher sensitivity may be achieved by using a cell (test tube) procedure.
Qualité de l'eau - Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson - Partie 2: Dosage de l'éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD)
L'ISO/TS 23893-2:2007 spécifie une méthode pour mesurer l'activité enzymatique de l'éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD) sur une fraction post-mitochondriale du broyat du foie de poisson (fraction subcellulaire dans laquelle l'activité EROD est localisée) en employant une méthode d'analyse fluorimétrique avec une cuve ou des microplaques.
Elle s'applique aux poissons prélevés dans leur environnement naturel (eau douce ou eau salée) ou aux poissons exposés à des substances ou effluents dans un laboratoire.
Cette méthode est applicable pour les valeurs de l'EROD supérieures ou égales à 1 pmol/min/mg de protéines. Une sensibilité plus élevée peut être obtenue en utilisant un mode opératoire employant une cuve (tube à essai).
Kakovost vode - Biokemijske in fiziološke meritve v ribah - 2. del: Določevanje etoksiresorufin-O-deetilaze (EROD)
This part of ISO 23893 specifies a method for measuring the ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) enzyme activity on a post-mitochondrial Ta del ISO 23893 določa metodo za merjenje aktivnosti encima etoksiresorufin-O-deetilaze (EROD) na postmitohondrijski frakciji homogenata ribjih jeter (subcelična frakcija z aktivnostjo EROD) z uporabo fluorimetrične metode v celici ali na mikrotitrski ploščici. Velja za ribe, vzorčene v njihovem naravnem okolju (sladka ali slana voda) ali izpostavljene snovem ali odplakam v laboratoriju. Ta metoda velja za vrednosti EROD, večje ali enake 1 pmol/(min•mg) beljakovine. Večja občutljivost se lahko doseže z uporabo postopka v celici (epruveti).
General Information
Standards Content (Sample)
SLOVENSKI STANDARD
01-september-2010
.DNRYRVWYRGH%LRNHPLMVNHLQIL]LRORãNHPHULWYHYULEDKGHO 'RORþHYDQMH
HWRNVLUHVRUXILQ2GHHWLOD]H (52'
Water quality - Biochemical and physiological measurements on fish - Part 2:
Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD)
Qualité de l'eau - Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson - Partie 2:
Dosage de l'éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD)
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO/TS 23893-2:2007
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 23893-2
First edition
2007-11-15
Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish —
Part 2:
Determination of
ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD)
Qualité de l'eau — Mesurages biochimiques et physiologiques sur
poisson —
Partie 2: Dosage de l'éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD)
Reference number
©
ISO 2007
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the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2007
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
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Published in Switzerland
ii © ISO 2007 – All rights reserved
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle. 1
4 Test environment. 1
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 3
7 Sampling and preparation of samples. 4
7.1 Sampling of fish . 4
7.2 Killing of fish and dissection. 4
7.3 Storage. 4
8 Procedure . 4
8.1 Preparation of the fractions. 4
8.2 Determination of protein . 5
8.3 Determination of the EROD activity. 5
8.4 Checking the sensitivity of the biological reagent and compliance with the operating
method . 6
9 Expression of results . 7
9.1 Calculation of the EROD activity. 7
9.2 Statistical processing of the data . 7
10 Test report . 8
Annex A (informative) Examples of results . 9
Bibliography . 14
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of normative document:
⎯ an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
⎯ an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 23893-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
ISO 23893 consists of the following parts, under the general title Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish:
⎯ Part 1: Sampling of fish, handling and preservation of samples
⎯ Part 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) [Technical Specification]
iv © ISO 2007 – All rights reserved
Introduction
The measurement of pollution biomarkers in fish, such as the measurement of biotransformation enzyme
activities, is likely to provide information about exposure levels, bioavailability and the early biological effects
of substances present in aquatic ecosystems. The measurement of the EROD enzyme activity allows the
diagnosis of the exposure of fish to inducers of the P450 1A cytochrome, such as certain polychlorinated
biphenyls (PCBs), polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), and dioxins. A large amount of research work
bears witness to the extent of the studies conducted (see Bibliography).
An induction of EROD activity reflects the presence of inducers such as those mentioned above. On the other
hand, the absence of induction does not necessarily reflect the absence of exposure of the fish to organic
contaminants, account being taken of the inhibition phenomena of the EROD induction of possible
modification of the bioavailability of the inducers or of low exposure concentrations.
The application of a standardised reference method is strongly advised within a monitoring programme. The
intercalibration exercises on the measurement of the EROD enzyme activity undertaken since 1991 have
revealed multiple sources of errors, which are very easy to avoid (dilution of resorufin, determination of
proteins, calculation of the enzyme activity, etc.) once laboratories have become familiar with the analysis of
enzyme activities and the possible error factors.
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 23893-2:2007(E)
Water quality — Biochemical and physiological measurements
on fish —
Part 2:
Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD)
1 Scope
This part of ISO 23893 specifies a method for measuring the ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) enzyme
activity on a post-mitochondrial fraction of fish liver homogenate (subcellular fraction in which the EROD
activity is located) employing a cell or microplate fluorimetric method.
It applies to fish that are sampled in their natural environment (fresh water or salt water) or exposed to
substances or effluents in a laboratory.
This method is applicable for EROD values greater than or equal to 1 pmol/(min·mg) of proteins. A higher
sensitivity may be achieved by using a cell (test tube) procedure.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 23893-1, Water quality — Biochemical and physiological measurements on fish — Part 1: Sampling of
fish, handling and preservation of samples
3 Principle
Samples of fish are collected and dissected as described in ISO 23893-1 to obtain pieces of liver.
Homogenates of fish liver are prepared by crushing (homogenisation) and the supernatant S9 fraction
recovered by centrifugation. The EROD enzyme activity in the S9 fractions is determined by measurement of
the increase in fluorescence due to the transformation of the 7-ethoxyresorufin into resorufin. The
fluorescence is reported in quantities of resorufin by means of a calibration range (external calibration of
resorufin or of rhodamine B). The EROD activity is related to the quantity of proteins in the S9 fraction.
4 Test environment
All of the tests and handling operations with the S9 fraction shall be carried out at a temperature close to 4 °C
(e.g. handling in crushed ice), except the enzyme reaction which shall be performed at 20 °C ± 2 °C.
5 Reagents
Unless otherwise specified, use only reagents of recognised analytical grade.
5.1 Ultra pure water, having a conductivity below 1 µS/cm.
5.2 Potassium chloride, 150 mmol/l solution.
Dissolve 11,2 g of KCl (relative molecular mass 74,6) in 1 l of water (5.1). This solution is stable for 6 months
at a temperature of 4 °C ± 3 °C.
5.3 Phosphate buffer, 100 mmol/l; pH 7,8 ± 0,1.
The ionic composition and pH can affect the EROD activity, and optimal conditions may vary between species.
The following buffer is expected to provide measurable and comparable values of EROD activity for most
species of fish.
Prepare the following two solutions, A and B:
⎯ Solution A: dissolve 17,4 g of K HPO (relative molecular mass 174,2 as the anhydrate) in 1 l of water
2 4
(5.1);
⎯ Solution B: dissolve 13,6 g of KH PO (relative molecular mass 136,1 as the anhydrate) in 1 l of water
2 4
(5.1).
Adjust solution A to pH 7,8 ± 0,1 with solution B.
This solution is stable for 6 months at a temperature of 4 °C ± 3 °C.
5.4 Glycerol (20 %) in phosphate buffer solution.
Add a mass fraction of 20 % of glycerol (C H O ; relative molecular mass 92,1) to the phosphate buffer (5.3).
3 8 3
The final concentrations are then 20 % glycerol and 100 mmol/l phosphate.
5.5 Resorufin (108 mg/l) stock solution.
Dissolve in the d
...
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 23893-2
First edition
2007-11-15
Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish —
Part 2:
Determination of
ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD)
Qualité de l'eau — Mesurages biochimiques et physiologiques sur
poisson —
Partie 2: Dosage de l'éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD)
Reference number
©
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle. 1
4 Test environment. 1
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 3
7 Sampling and preparation of samples. 4
7.1 Sampling of fish . 4
7.2 Killing of fish and dissection. 4
7.3 Storage. 4
8 Procedure . 4
8.1 Preparation of the fractions. 4
8.2 Determination of protein . 5
8.3 Determination of the EROD activity. 5
8.4 Checking the sensitivity of the biological reagent and compliance with the operating
method . 6
9 Expression of results . 7
9.1 Calculation of the EROD activity. 7
9.2 Statistical processing of the data . 7
10 Test report . 8
Annex A (informative) Examples of results . 9
Bibliography . 14
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of normative document:
⎯ an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
⎯ an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 23893-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
ISO 23893 consists of the following parts, under the general title Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish:
⎯ Part 1: Sampling of fish, handling and preservation of samples
⎯ Part 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) [Technical Specification]
iv © ISO 2007 – All rights reserved
Introduction
The measurement of pollution biomarkers in fish, such as the measurement of biotransformation enzyme
activities, is likely to provide information about exposure levels, bioavailability and the early biological effects
of substances present in aquatic ecosystems. The measurement of the EROD enzyme activity allows the
diagnosis of the exposure of fish to inducers of the P450 1A cytochrome, such as certain polychlorinated
biphenyls (PCBs), polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), and dioxins. A large amount of research work
bears witness to the extent of the studies conducted (see Bibliography).
An induction of EROD activity reflects the presence of inducers such as those mentioned above. On the other
hand, the absence of induction does not necessarily reflect the absence of exposure of the fish to organic
contaminants, account being taken of the inhibition phenomena of the EROD induction of possible
modification of the bioavailability of the inducers or of low exposure concentrations.
The application of a standardised reference method is strongly advised within a monitoring programme. The
intercalibration exercises on the measurement of the EROD enzyme activity undertaken since 1991 have
revealed multiple sources of errors, which are very easy to avoid (dilution of resorufin, determination of
proteins, calculation of the enzyme activity, etc.) once laboratories have become familiar with the analysis of
enzyme activities and the possible error factors.
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 23893-2:2007(E)
Water quality — Biochemical and physiological measurements
on fish —
Part 2:
Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD)
1 Scope
This part of ISO 23893 specifies a method for measuring the ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) enzyme
activity on a post-mitochondrial fraction of fish liver homogenate (subcellular fraction in which the EROD
activity is located) employing a cell or microplate fluorimetric method.
It applies to fish that are sampled in their natural environment (fresh water or salt water) or exposed to
substances or effluents in a laboratory.
This method is applicable for EROD values greater than or equal to 1 pmol/(min·mg) of proteins. A higher
sensitivity may be achieved by using a cell (test tube) procedure.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 23893-1, Water quality — Biochemical and physiological measurements on fish — Part 1: Sampling of
fish, handling and preservation of samples
3 Principle
Samples of fish are collected and dissected as described in ISO 23893-1 to obtain pieces of liver.
Homogenates of fish liver are prepared by crushing (homogenisation) and the supernatant S9 fraction
recovered by centrifugation. The EROD enzyme activity in the S9 fractions is determined by measurement of
the increase in fluorescence due to the transformation of the 7-ethoxyresorufin into resorufin. The
fluorescence is reported in quantities of resorufin by means of a calibration range (external calibration of
resorufin or of rhodamine B). The EROD activity is related to the quantity of proteins in the S9 fraction.
4 Test environment
All of the tests and handling operations with the S9 fraction shall be carried out at a temperature close to 4 °C
(e.g. handling in crushed ice), except the enzyme reaction which shall be performed at 20 °C ± 2 °C.
5 Reagents
Unless otherwise specified, use only reagents of recognised analytical grade.
5.1 Ultra pure water, having a conductivity below 1 µS/cm.
5.2 Potassium chloride, 150 mmol/l solution.
Dissolve 11,2 g of KCl (relative molecular mass 74,6) in 1 l of water (5.1). This solution is stable for 6 months
at a temperature of 4 °C ± 3 °C.
5.3 Phosphate buffer, 100 mmol/l; pH 7,8 ± 0,1.
The ionic composition and pH can affect the EROD activity, and optimal conditions may vary between species.
The following buffer is expected to provide measurable and comparable values of EROD activity for most
species of fish.
Prepare the following two solutions, A and B:
⎯ Solution A: dissolve 17,4 g of K HPO (relative molecular mass 174,2 as the anhydrate) in 1 l of water
2 4
(5.1);
⎯ Solution B: dissolve 13,6 g of KH PO (relative molecular mass 136,1 as the anhydrate) in 1 l of water
2 4
(5.1).
Adjust solution A to pH 7,8 ± 0,1 with solution B.
This solution is stable for 6 months at a temperature of 4 °C ± 3 °C.
5.4 Glycerol (20 %) in phosphate buffer solution.
Add a mass fraction of 20 % of glycerol (C H O ; relative molecular mass 92,1) to the phosphate buffer (5.3).
3 8 3
The final concentrations are then 20 % glycerol and 100 mmol/l phosphate.
5.5 Resorufin (108 mg/l) stock solution.
Dissolve in the dark, shaking for 2 h, about 10,8 mg of resorufin (sodium salt C H NNaO ; relative molecular
12 6 3
mass 235,2) in 100 ml of dimethylsulfoxide (DMSO). Read the optical density at 572 nm on the
spectrophotometer. Calculate the exact resorufin concentration, c, in millimoles per litre, using Equation (1):
D
c= (1)
εl
where
−1
D is the optical density (corresponding to the absorbance wavenumber in cm );
−1 −1
ε is the molar extinction coefficient {for resorufin, values of ε = 73,2 (mmol/l) cm at 572 nm
−1 −1
(Reference [17]) and 54,0 ± 1,1 (mmol/l) cm (Reference [36]) have been reported};
l is the optical pathlength, in centimetres.
Prepare this solution at the time of determination and store aliquots of this solution frozen at −20 °C and
sheltered from the light. These aliquots can be stored for 6 months.
NOTE Resorufin is very unstable under daylight conditions.
5.6 Resorufin working solution.
Dilute the stock solution (5.5) with DMSO to obtain approximately 10 ml of 11,5 µmol/l working solution.
Prepare this solution at the time of determination.
2 © ISO 2007 – All rights reserved
ISO/TS 23893-2:20
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 23893-2
Première édition
2007-11-15
Qualité de l'eau — Mesurages
biochimiques et physiologiques
sur poisson —
Partie 2:
Dosage de
l'éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD)
Water quality — Biochemical and physiological measurements on
fish —
Part 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD)
Numéro de référence
©
ISO 2007
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2007 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Principe. 1
4 Environnement d'essai. 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage et préparation des échantillons. 4
7.1 Échantillonnage des poissons . 4
7.2 Mise à mort des poissons et dissection. 4
7.3 Conservation . 4
8 Mode opératoire . 5
8.1 Préparation des fractions . 5
8.2 Dosage des protéines. 5
8.3 Dosage de l'activité EROD. 5
8.4 Vérification de la sensibilité du réactif biologique et de la conformité du mode opératoire. 7
9 Expression des résultats . 7
9.1 Calcul de l'activité EROD . 7
9.2 Traitement statistique des données . 8
10 Rapport d'essai . 8
Annexe A (informative) Exemples de résultats . 9
Bibliographie . 14
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents normatifs:
⎯ une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
⎯ une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 23893 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
L'ISO 23893 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau — Mesurages
biochimiques et physiologiques sur poisson:
⎯ Partie 1: Échantillonnage des poissons, manipulation et conservation des échantillons
⎯ Partie 2: Dosage de l'éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD) [Spécification technique]
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Introduction
Le mesurage des marqueurs biologiques de la pollution dans les poissons, tel que le mesurage des activités
enzymatiques de biotransformation, fournit vraisemblablement des informations sur les niveaux d'exposition,
sur la biodisponibilité et sur les effets biologiques précoces des substances présentes dans les écosystèmes
aquatiques. Le mesurage de l'activité enzymatique de l'EROD permet de réaliser un diagnostic de l'exposition
des poissons aux inducteurs du cytochrome P450 1A, tels que certains biphényles polychlorés (PCB),
hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), dioxines, etc. Une grande quantité de travaux de recherche
témoigne de l'importance des études menées (voir Bibliographie).
L'induction de l'activité EROD traduit la présence d'inducteurs tels que ceux mentionnés ci-dessus. D'un autre
côté, l'absence d'induction ne démontre pas nécessairement que les poissons n'ont pas été exposés à des
contaminants organiques, en considérant les phénomènes d'inhibition de l'induction de l'EROD d'une
modification possible de la biodisponibilité des inducteurs ou l'exposition à de faibles concentrations.
L'application d'une méthode de référence normalisée est fortement conseillée dans un programme de
surveillance. Les exercices d'interétalonnage sur le mesurage de l'activité enzymatique de l'EROD entrepris
depuis 1991 ont révélé de nombreuses sources d'erreurs très faciles à éviter (dilution de la résorufine, dosage
des protéines, calcul de l'activité enzymatique, etc.) une fois que les laboratoires se sont familiarisés avec
l'analyse des activités enzymatiques et les facteurs d'erreur possibles.
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 23893-2:2007(F)
Qualité de l'eau — Mesurages biochimiques et physiologiques
sur poisson —
Partie 2:
Dosage de l'éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD)
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 23893 spécifie une méthode pour mesurer l'activité enzymatique de
l'éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD) sur une fraction post-mitochondriale du broyat du foie de poisson
(fraction subcellulaire dans laquelle l'activité EROD est localisée) en employant une méthode d'analyse
fluorimétrique avec une cuve ou des microplaques.
Elle s'applique aux poissons prélevés dans leur environnement naturel (eau douce ou eau salée) ou aux
poissons exposés à des substances ou effluents dans un laboratoire.
Cette méthode est applicable pour les valeurs de l'EROD supérieures ou égales à 1 pmol/(min·mg) de
protéines. Une sensibilité plus élevée peut être obtenue en utilisant un mode opératoire employant une cuve
(tube à essai).
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 23893-1, Qualité de l'eau — Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson — Partie 1:
Échantillonnage des poissons, manipulation et conservation des échantillons
3 Principe
Les échantillons de poissons sont prélevés et disséqués tel que décrit dans l'ISO 23893-1 pour obtenir des
morceaux de foie. Des broyats de foie de poisson sont préparés (homogénéisation) et le surnageant (fraction
S9) est récupéré par centrifugation. L'activité enzymatique de l'EROD dans les fractions S9 est dosée en
mesurant l'augmentation de la fluorescence due à la transformation de la 7-éthoxyrésorufine en résorufine. La
fluorescence est rapportée en quantités de résorufine à l'aide d'une gamme étalon (étalonnage externe de
résorufine ou de rhodamine B). L'activité EROD est reliée à la quantité de protéines de la fraction S9.
4 Environnement d'essai
Tous les essais et les opérations de manipulation avec la fraction S9 doivent être réalisés à une température
proche de 4 °C (par exemple manipulation dans de la glace pilée), à l'exception de la réaction enzymatique,
qui doit être réalisée à 20 °C ± 2 °C.
5 Réactifs
Sauf indications contraires, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau ultra pure, de conductivité inférieure à 1 µS/cm.
5.2 Chlorure de potassium, solution de 150 mmol/l.
Dissoudre 11,2 g de KCl (masse moléculaire relative de 74,6) dans 1 l d'eau (5.1). Cette solution est stable
durant six mois à une température de 4 °C ± 3 °C.
5.3 Tampon phosphate, 100 mmol/l; pH 7,8 ± 0,1.
La composition ionique et le pH peuvent affecter l'activité EROD et les conditions optimales peuvent varier
selon les espèces. Le tampon suivant doit fournir des valeurs mesurables et comparables de l'activité EROD
pour la plupart des espèces de poissons.
Préparer les deux solutions suivantes, A et B:
⎯ Solution A: dissoudre 17,4 g de K HPO (masse moléculaire relative de 174,2) dans 1 l d'eau (5.1);
2 4
⎯ Solution B: dissoudre 13,6 g de KH PO (masse moléculaire relative de 136,1) dans 1 l d'eau (5.1).
2 4
Ajuster le pH de la solution A à 7,8 ± 0,1 avec la solution B.
Cette solution est stable durant six mois à une température de 4 °C ± 3 °C.
5.4 Glycérol (20 %) dans la solution tampon phosphate.
Ajouter une fraction massique de 20 % de glycérol (C H O ; masse moléculaire relative de 92,1) au tampon
3 8 3
phosphate (5.3). Les concentrations finales sont ensuite de 20 % de glycérol et 100 mmol/l de phosphate.
5.5 Solution mère de résorufine (108 mg/l).
Dissoudre 10,8 mg de résorufine (sel de sodium C H NNaO ; masse moléculaire relative de 235,17) dans
12 6 3
100 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) à l'abri de la lumière et en agitant durant 2 h. Lire la densité optique à
572 nm sur le spectrophotomètre. Calculer la concentration exacte de résorufine, c, en millimoles par litre, en
utilisant l'Équation (1):
D
c = (1)
εl
où
−1
D est la densité optique
...
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