Microbiology - Microbiological testing of impregnated or coated products - Wipes and masks

This document gives guidance for the enumeration and/or detection of microorganisms present in a cosmetic product that is impregnated or coated onto a substrate (i.e. wipes and masks) where sampling and microbiological influence of the manufactured product presents particular challenges in terms of microbiological sampling and testing.
The principle of this document can also be applied to test similar products (e.g. cushion, impregnated sponge, etc.) or applicators (e.g. brush, puff, sponge, etc.) with modification of the procedure as appropriate.

Microbiologie - Cosmétiques - Essais microbiologiques de produits imprégnés ou enduits - Lingettes et masques

Le présent document fournit des recommandations pour le dénombrement et/ou la détection des micro-organismes présents dans les produits cosmétiques imprégnés ou enduits sur un substrat (lingettes et masques), pour lesquels l'échantillonnage et le contexte microbiologique du produit fabriqué posent des problčmes particuliers lorsqu'il s'agit de réaliser un échantillonnage et des essais microbiologiques.
Le principe du présent document peut également ętre appliqué ŕ des produits similaires (par exemple, cushion, éponges imprégnées, etc.) ou des applicateurs (par exemple, pinceau, houpette, éponge, etc.), en modifiant le mode opératoire comme approprié.

Kozmetika - Mikrobiologija - Preskušanje impregniranih izdelkov ali izdelkov, obdelanih s premazi - Robčki in maske

General Information

Status
Published
Public Enquiry End Date
04-Dec-2019
Publication Date
14-Sep-2020
Current Stage
6060 - National Implementation/Publication (Adopted Project)
Start Date
11-Aug-2020
Due Date
16-Oct-2020
Completion Date
15-Sep-2020

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SIST ISO 21322:2020
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ISO 21322:2020 - Cosmetics -- Microbiology -- Testing of impregnated or coated wipes and masks
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ISO 21322:2020 - Cosmétiques -- Microbiologie -- Essais sur lingettes et masques imprégnés ou enduits
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Standards Content (sample)

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 21322:2020
01-oktober-2020
Kozmetika - Mikrobiologija - Preskušanje impregniranih izdelkov ali izdelkov,
obdelanih s premazi - Robčki in maske

Microbiology - Microbiological testing of impregnated or coated products - Wipes and

masks

Microbiologie - Cosmétiques - Essais microbiologiques de produits imprégnés ou enduits

- Lingettes et masques
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 21322:2020
ICS:
07.100.40 Kozmetika - mikrobiologija Cosmetics microbiology
71.100.70 Kozmetika. Toaletni Cosmetics. Toiletries
pripomočki
SIST ISO 21322:2020 en

2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 21322:2020
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SIST ISO 21322:2020
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21322
First edition
2020-06
Cosmetics — Microbiology — Testing
of impregnated or coated wipes and
masks
Cosmétiques — Microbiologie — Essais sur lingettes et masques
imprégnés ou enduits
Reference number
ISO 21322:2020(E)
ISO 2020
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2020

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on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

below or ISO’s member body in the country of the requester.
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Published in Switzerland
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

4.1 General information ........................................................................................................................................................................... 2

4.2 Selection of the test sample ......................................................................................................................................................... 2

4.3 Selection of the method ................................................................................................................................................................... 3

4.4 Recovery of microorganisms from the test sample ................................................................................................. 3

4.5 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms ........................................................................................... 3

4.5.1 General...................................................................................................................................................................................... 3

4.5.2 Plate count method overview ............................................................................................................................... 3

4.5.3 Membrane filtration method overview ........................................................................................................ 3

4.6 Detection of specified microorganisms by enrichment method .................................................................. 4

5 Diluents, neutralizers and culture media ................................................................................................................................... 4

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

5.2 Diluents and neutralizers .............................................................................................................................................................. 4

5.3 Culture media ........................................................................................................................................................................................... 4

5.3.1 Media for enumeration and detection ........................................................................................................... 4

5.3.2 Media for preparation of spores of Bacillus subtilis ...................................................................... 4

6 Apparatus and glassware ............................................................................................................................................................................ 4

7 Strains of microorganisms ......................................................................................................................................................................... 4

8 Handling of cosmetic products and laboratory samples ............................................................................................ 5

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 5

9.1 General recommendation .............................................................................................................................................................. 5

9.2 Selection and preparation of the test sample ............................................................................................................... 5

9.2.1 Selection of the test sample .................................................................................................................................... 5

9.2.2 Preparation of the initial suspension ............................................................................................................. 5

9.3 Recovery of microorganisms ...................................................................................................................................................... 6

9.3.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

9.3.2 Stomaching ........................................................................................................................................................................... 6

9.3.3 Shaking/Stirring ...................................................................... ......................................................................................... 6

9.4 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms ........................................................................................... 6

9.4.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

9.4.2 Pour plate method .......................................................................................................................................................... 6

9.4.3 Surface spread method ............................................................................................................................................... 7

9.4.4 Membrane filtration method ................................................................................................................................. 7

9.4.5 Incubation .............................................................................................................................................................................. 7

9.4.6 Counting of colonies...................................................................................................................................................... 7

9.5 Detection of specified microorganisms by enrichment method .................................................................. 8

9.5.1 General...................................................................................................................................................................................... 8

9.5.2 Test for specified microorganisms ................................................................................................................... 8

10 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 9

10.1 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms ........................................................................................... 9

10.2 Detection of specified microorganisms ............................................................................................................................. 9

11 Suitability test ......................................................................................................................................................................................................... 9

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9

© ISO 2020 – All rights reserved iii
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)

Annex A (normative) Guidance on methods for microbiological testing of impregnated or

coated products — Wipes and masks ..........................................................................................................................................10

Annex B (informative) Expression and interpretation of results ........................................................................................14

Annex C (normative) Suitability test method ...........................................................................................................................................21

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................26

iv © ISO 2020 – All rights reserved
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance

are described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval

criteria needed for the different types of ISO documents should be noted. This document

was drafted in accordance with the editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see

www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be

the subject of patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such

patent rights. Details of any patent rights identified during the development of the document

will be in the Introduction and/or on the ISO list of patent declarations received (see

www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see

www .iso .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
© ISO 2020 – All rights reserved v
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)
Introduction

For technical reasons, current standards in cosmetics microbiology may not be applicable to

impregnated or coated cosmetic products, such as wipes and masks, in which there is no direct access

to the formulation.

Based on their product form or delivery there is a need to adapt these standards to assess the

microbiological quality of these products.
vi © ISO 2020 – All rights reserved
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SIST ISO 21322:2020
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21322:2020(E)
Cosmetics — Microbiology — Testing of impregnated or
coated wipes and masks
1 Scope

This document gives guidance for the enumeration and/or detection of microorganisms present in a

cosmetic product that is impregnated or coated onto a substrate (i.e. wipes and masks) where sampling

and microbiological influence of the manufactured product presents particular challenges in terms of

microbiological sampling and testing.

The principle of this document can also be applied to test similar products (e.g. cushion, impregnated

sponge, etc.) or applicators (e.g. brush, puff, sponge, etc.) with modification of the procedure as

appropriate.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 11930, Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product

ISO 16212, Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
ISO 18416, Cosmetics — Microbiology — Detection of Candida albicans

ISO 21148, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination

ISO 21149, Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria

ISO 21150, Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli
ISO 22717, Cosmetics — Microbiology — Detection of Pseudomonas aeruginosa
ISO 22718, Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
cosmetic formulation

preparation of raw materials with a qualitatively and quantitatively defined composition

3.2
cosmetic product

cosmetic formulation (3.1) that has undergone all stages of production, including packaging in its final

container, for shipment
© ISO 2020 – All rights reserved 1
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)
3.3
impregnated product
product absorbed on the support
3.4
coated product
product adsorbed on the support
3.5
test sample
representative unit of the entire cosmetic product (3.2) for testing
4 Principle
4.1 General information

The method determines the population of viable microorganisms by enumeration of colonies on a

non-selective agar medium and by the presence or absence of specified microorganisms growth after

enrichment.
The method involves the following steps:
— selection of the test sample;
— selection of an appropriate method;
— recovery of microorganisms;

— enumeration of the population of viable microorganisms by filtration or plate count method;

— tests for specified microorganisms by enrichment method.

The experimental conditions shall be evaluated to ensure that the method should not affect the viability

of microorganisms and the recovery of bioburden from the sample and should include the verification

of the efficacy of the neutralization (see Clause 11).

In order to ensure product quality and safety for the consumer, an appropriate microbiological risk

assessment should be performed to determine the types of cosmetic products to which this document

is applicable (see ISO 29621:2017, Table 2).

Other methods may be substituted provided that their equivalence has been demonstrated.

4.2 Selection of the test sample

— Whenever practical, the entire unit should be used for testing with a minimum weight of 1 g. If for

technical reasons the entire unit cannot be tested, a defined Unit Item Portion (UIP) is used for

testing. A “UIP” is a microbiologically-representative subunit of the test sample and is referenced

throughout the document.

— If the unit is < 1 g per unit then the appropriate number of units should be sampled to achieve the

appropriate weight or volume.

— The weight of the test sample shall be recorded even if the results are expressed by unit.

Selection of the test sample shall be according to A.1.
2 © ISO 2020 – All rights reserved
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)
4.3 Selection of the method

The method should be conducted according to an appropriate procedure based on the specifics of the

product (size, volume, single unit/multi–unit package, level of bioburden. etc.) and should ensure that a

representative sample is evaluated.
Selection of the method shall be according to A.1 and A.2.
4.4 Recovery of microorganisms from the test sample

The degree to which microorganisms adhere to the test sample surface is dependent on the wipe or

mask in which the liquid portion of the formulation has been either impregnated or coated. Preliminary

treatments may be necessary to separate microorganisms from the test sample.

Regardless of the treatment, the verification of recovery method should be performed in order to

demonstrate that the method can release microorganisms from the test sample without having an

adverse effect on their viability (see Clause 11).
4.5 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms
4.5.1 General

The enumeration of aerobic mesophilic microorganisms includes bacteria, yeasts and moulds.

Based on the nature of the test sample, the volume of diluent used to immerse the test sample and the

expected level of bioburden, two types of counting methods may be used:
— plate count method;
— membrane filtration method.
4.5.2 Plate count method overview
Plate count method consists of either using a pour plate or spread plate method.
Each method consists of the following steps.

— Prepare the agar plates and diluent using a non-selective agar medium for plating the diluent in

which the sample was immersed.
— Incubate the plates for enumeration and/or detection.

— Count the number of colonies forming units (CFU) based on the number of aerobic mesophilic

microorganisms recovered per unit or g.
4.5.3 Membrane filtration method overview
Membrane filtration consists of the following steps.

— Transfer the diluent or a defined quantity of diluent in which the test sample was immersed to a

filtration apparatus wetted with a small volume of an appropriate sterile diluent.

— After filtration and rinsing, transfer the membrane filter onto the surface of plates with non-

selective agar medium.
— Aerobic incubation of the plates.

— Count the number of colony forming units (CFU) and calculate of the number of aerobic mesophilic

microorganisms per g or unit.
© ISO 2020 – All rights reserved 3
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)
4.6 Detection of specified microorganisms by enrichment method

The objective of the enrichment method is to incubate a test sample in a non-selective broth medium to

increase the number of microorganisms that are present in a test sample.

— The first step of an enrichment method is to incubate the test sample in a non-selective broth

medium to increase the number of microorganisms present in the test sample.

— The second step of an enrichment method is to isolate specified microorganisms that may be present

on a test sample through the use of selective agar media followed by confirmatory identification

tests for characteristic colonies. See ISO 18416, ISO 21150, ISO 22717 and ISO 22718.

5 Diluents, neutralizers and culture media
5.1 General

The diluents, neutralizers and culture media suitable for enumeration and detection of aerobic

mesophilic microorganisms are described in ISO 11930, ISO 16212 and ISO 21149. Other diluents,

neutralizers and culture media may be used if they have been demonstrated to be suitable for use.

Use the general instructions given in ISO 21148. When water is mentioned in this document, use

distilled water or purified water as specified in ISO 21148.
5.2 Diluents and neutralizers

The diluent is used to disperse the sample. It is required that it contain neutralizers if the sample to be

tested has antimicrobial properties or contains a preservative. The efficacy of the neutralization shall

be demonstrated before the determination of the count (see Clause 11). Diluents and neutralizers shall

be in accordance with ISO 11930, ISO 16212, ISO 18416, ISO 21149, ISO 21150, ISO 22717 and ISO 22718.

5.3 Culture media
5.3.1 Media for enumeration and detection

Culture media for enumeration and/or detection shall be in accordance with ISO 11930, ISO 16212,

ISO 18416, ISO 21149, ISO 21150, ISO 22717 and ISO 22718.
5.3.2 Media for preparation of spores of Bacillus subtilis
See C.1.3.1.
6 Apparatus and glassware
The laboratory equipment, apparatus and glassware are described in ISO 21148.
7 Strains of microorganisms

The culture should be reconstituted according to the procedures provided by the supplier of the

reference strain. The strains may be stored in the laboratory conforming to EN 12353 or according to

another suitable method.

For testing the recovery of microorganisms on the test samples, spores of Bacillus subtilis ATCC 6633

(equivalent strain CIP 52.62 or NCIMB 8054 or NBRC 3134 or other equivalent national collection

strain) are used.
4 © ISO 2020 – All rights reserved
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)

For testing the efficacy of neutralizers, two strains representative of both Gram negative and Gram

positive bacteria and a yeast are used:

— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (equivalent strain: CIP 4.83 or NCIMB 9518 or NBRC 13276 or

KCTC 1916 or other equivalent national collection strain);

— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (equivalent strain: CIP 82.118 or NCIMB 8626 or NBRC 13275

or KCTC 2513 or other equivalent national collection strain).

An alternative Gram negative strain may be Escherichia coli ATCC 8739 (equivalent strain: CIP 53.126 or

NCIMB 8545 or NBRC 3972 or KCTC 2571 or other equivalent national collection strain).

— Candida albicans ATCC 10231 (equivalent strain: IP 48.72 or NCPF 3179 or NBRC 1594 or KCTC 17205,

or other equivalent national collection strain).
The strains may be kept in the laboratory according to the EN 12353.
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples

If storage is necessary, keep the products to be tested at room temperature. Do not incubate, refrigerate

or freeze products and samples before or after analysis. Sampling and test procedures should follow

the guidelines specified in ISO 21148 and in accordance with the procedure outlined in Clause 9.

9 Procedure
9.1 General recommendation

Use sterile equipment and aseptic technique whenever preparing the test sample and diluent.

For the preparation of an initial suspension, the time which elapses between the end of the preparation

of the test sample and the moment the diluent of the initial suspension comes into contact with the

culture medium shall not exceed (30 ± 15) min, unless specifically mentioned in the established

protocols or documents.

The method should follow the procedure developed during the suitability test, to ensure neutralization

of potential inhibitory effects (see Clause 11) and to guarantee the recovery of microorganisms.

9.2 Selection and preparation of the test sample
9.2.1 Selection of the test sample
The test sample shall weigh at least 1 g.

The test sample can be either the entire unit, or multiple units if the weight of one unit is less than 1 g,

or the UIP (see A.1).
Record the exact weight of the test sample, S, and, the number of units, n.
If a UIP is used for testing, record the UIP value of the test sample (see 4.2).
9.2.2 Preparation of the initial suspension

Place the test sample (see 9.2.1) into an appropriate container, with a known volume of diluent, defined

in the suitability test (see Clause 11). The test sample should be completely immersed in the diluent.

Record the value for “V”, the volume of diluent used.
© ISO 2020 – All rights reserved 5
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)
9.3 Recovery of microorganisms
9.3.1 General

After immersion, the following treatments may be used to remove microorganisms from the test sample:

— stomaching;
— shaking/stirring;
— vortexing (see A.3).

NOTE If necessary, record the volume of the diluent after stomaching or shaking of test sample.

9.3.2 Stomaching

Prepare the initial suspension utilizing a sterile stomacher bag and then place it into the stomacher.

Proceed according to the parameters (time and speed) outlined in the suitability test (see Clause 11).

Record the time and the speed at which the stomaching took place.
9.3.3 Shaking/Stirring

Prepare the initial suspension in the appropriate closed container and mix according to the parameters

(duration and frequency) applied in the suitability test (see Clause 11).

Sterile glass beads may be added to enhance product mixing and organism recovery.

Record the time, frequency and the speed of shaking/stirring (if applicable) and whether glass beads

are added or not.
9.4 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms
9.4.1 General

The enumeration of aerobic mesophilic microorganisms includes bacteria, yeasts and moulds.

The choice of the method depends on the volume of diluent used for the preparation of the initial

suspension (see A.2).

Based on the test sample size, the level of bioburden and the sensitivity of the method, all of the diluent

in which the test sample is immersed (V) or a fraction of V (Vd) is used for enumeration.

Usually, the volume V or Vd of the initial suspension diluent is the dilution used for enumeration. No

further diluting of the initial preparation is required.

The minimal volume of diluent shall be equivalent to at least 1 g of the test sample.

9.4.2 Pour plate method

Use the appropriate number of Petri dishes to properly evaluate the volume of diluent needed to

properly immerse and transfer the product to be plated (V or Vd).

The diluent (V) is divided into two work streams: one half (V/2) is for the enumeration of bacteria and

the other half (V/2) for enumeration of yeasts and moulds.

If the enumeration is conducted on a fraction of the total diluent (Vd), two equal fractions (Vd/2) shall

be plated: one for bacteria and the other for yeasts and moulds.
6 © ISO 2020 – All rights reserved
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SIST ISO 21322:2020
ISO 21322:2020(E)

If Petri dishes, 85 mm to 100 mm in diameter are used, add 1 ml of the diluent and pour 15 ml to

20 ml of the melted agar medium (as specified in ISO 21149 and ISO 16212) kept in a water bath not to

exceed 48 °C.

If larger Petri dishes (140 mm in diameter) are used, add no more than 10 ml of diluent in each plate and

the appropriate amount of agar medium based on the volume of diluent dispensed.
Slowly mix the transferred diluent with the medium, carefully rotating or t
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21322
First edition
2020-06
Cosmetics — Microbiology — Testing
of impregnated or coated wipes and
masks
Cosmétiques — Microbiologie — Essais sur lingettes et masques
imprégnés ou enduits
Reference number
ISO 21322:2020(E)
ISO 2020
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ISO 21322:2020(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2020

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Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

4.1 General information ........................................................................................................................................................................... 2

4.2 Selection of the test sample ......................................................................................................................................................... 2

4.3 Selection of the method ................................................................................................................................................................... 3

4.4 Recovery of microorganisms from the test sample ................................................................................................. 3

4.5 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms ........................................................................................... 3

4.5.1 General...................................................................................................................................................................................... 3

4.5.2 Plate count method overview ............................................................................................................................... 3

4.5.3 Membrane filtration method overview ........................................................................................................ 3

4.6 Detection of specified microorganisms by enrichment method .................................................................. 4

5 Diluents, neutralizers and culture media ................................................................................................................................... 4

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

5.2 Diluents and neutralizers .............................................................................................................................................................. 4

5.3 Culture media ........................................................................................................................................................................................... 4

5.3.1 Media for enumeration and detection ........................................................................................................... 4

5.3.2 Media for preparation of spores of Bacillus subtilis ...................................................................... 4

6 Apparatus and glassware ............................................................................................................................................................................ 4

7 Strains of microorganisms ......................................................................................................................................................................... 4

8 Handling of cosmetic products and laboratory samples ............................................................................................ 5

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 5

9.1 General recommendation .............................................................................................................................................................. 5

9.2 Selection and preparation of the test sample ............................................................................................................... 5

9.2.1 Selection of the test sample .................................................................................................................................... 5

9.2.2 Preparation of the initial suspension ............................................................................................................. 5

9.3 Recovery of microorganisms ...................................................................................................................................................... 6

9.3.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

9.3.2 Stomaching ........................................................................................................................................................................... 6

9.3.3 Shaking/Stirring ...................................................................... ......................................................................................... 6

9.4 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms ........................................................................................... 6

9.4.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

9.4.2 Pour plate method .......................................................................................................................................................... 6

9.4.3 Surface spread method ............................................................................................................................................... 7

9.4.4 Membrane filtration method ................................................................................................................................. 7

9.4.5 Incubation .............................................................................................................................................................................. 7

9.4.6 Counting of colonies...................................................................................................................................................... 7

9.5 Detection of specified microorganisms by enrichment method .................................................................. 8

9.5.1 General...................................................................................................................................................................................... 8

9.5.2 Test for specified microorganisms ................................................................................................................... 8

10 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 9

10.1 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms ........................................................................................... 9

10.2 Detection of specified microorganisms ............................................................................................................................. 9

11 Suitability test ......................................................................................................................................................................................................... 9

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9

© ISO 2020 – All rights reserved iii
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ISO 21322:2020(E)

Annex A (normative) Guidance on methods for microbiological testing of impregnated or

coated products — Wipes and masks ..........................................................................................................................................10

Annex B (informative) Expression and interpretation of results ........................................................................................14

Annex C (normative) Suitability test method ...........................................................................................................................................21

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................26

iv © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 21322:2020(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance

are described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval

criteria needed for the different types of ISO documents should be noted. This document

was drafted in accordance with the editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see

www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be

the subject of patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such

patent rights. Details of any patent rights identified during the development of the document

will be in the Introduction and/or on the ISO list of patent declarations received (see

www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see

www .iso .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
© ISO 2020 – All rights reserved v
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ISO 21322:2020(E)
Introduction

For technical reasons, current standards in cosmetics microbiology may not be applicable to

impregnated or coated cosmetic products, such as wipes and masks, in which there is no direct access

to the formulation.

Based on their product form or delivery there is a need to adapt these standards to assess the

microbiological quality of these products.
vi © ISO 2020 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21322:2020(E)
Cosmetics — Microbiology — Testing of impregnated or
coated wipes and masks
1 Scope

This document gives guidance for the enumeration and/or detection of microorganisms present in a

cosmetic product that is impregnated or coated onto a substrate (i.e. wipes and masks) where sampling

and microbiological influence of the manufactured product presents particular challenges in terms of

microbiological sampling and testing.

The principle of this document can also be applied to test similar products (e.g. cushion, impregnated

sponge, etc.) or applicators (e.g. brush, puff, sponge, etc.) with modification of the procedure as

appropriate.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 11930, Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product

ISO 16212, Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
ISO 18416, Cosmetics — Microbiology — Detection of Candida albicans

ISO 21148, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination

ISO 21149, Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria

ISO 21150, Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli
ISO 22717, Cosmetics — Microbiology — Detection of Pseudomonas aeruginosa
ISO 22718, Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
cosmetic formulation

preparation of raw materials with a qualitatively and quantitatively defined composition

3.2
cosmetic product

cosmetic formulation (3.1) that has undergone all stages of production, including packaging in its final

container, for shipment
© ISO 2020 – All rights reserved 1
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ISO 21322:2020(E)
3.3
impregnated product
product absorbed on the support
3.4
coated product
product adsorbed on the support
3.5
test sample
representative unit of the entire cosmetic product (3.2) for testing
4 Principle
4.1 General information

The method determines the population of viable microorganisms by enumeration of colonies on a

non-selective agar medium and by the presence or absence of specified microorganisms growth after

enrichment.
The method involves the following steps:
— selection of the test sample;
— selection of an appropriate method;
— recovery of microorganisms;

— enumeration of the population of viable microorganisms by filtration or plate count method;

— tests for specified microorganisms by enrichment method.

The experimental conditions shall be evaluated to ensure that the method should not affect the viability

of microorganisms and the recovery of bioburden from the sample and should include the verification

of the efficacy of the neutralization (see Clause 11).

In order to ensure product quality and safety for the consumer, an appropriate microbiological risk

assessment should be performed to determine the types of cosmetic products to which this document

is applicable (see ISO 29621:2017, Table 2).

Other methods may be substituted provided that their equivalence has been demonstrated.

4.2 Selection of the test sample

— Whenever practical, the entire unit should be used for testing with a minimum weight of 1 g. If for

technical reasons the entire unit cannot be tested, a defined Unit Item Portion (UIP) is used for

testing. A “UIP” is a microbiologically-representative subunit of the test sample and is referenced

throughout the document.

— If the unit is < 1 g per unit then the appropriate number of units should be sampled to achieve the

appropriate weight or volume.

— The weight of the test sample shall be recorded even if the results are expressed by unit.

Selection of the test sample shall be according to A.1.
2 © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 21322:2020(E)
4.3 Selection of the method

The method should be conducted according to an appropriate procedure based on the specifics of the

product (size, volume, single unit/multi–unit package, level of bioburden. etc.) and should ensure that a

representative sample is evaluated.
Selection of the method shall be according to A.1 and A.2.
4.4 Recovery of microorganisms from the test sample

The degree to which microorganisms adhere to the test sample surface is dependent on the wipe or

mask in which the liquid portion of the formulation has been either impregnated or coated. Preliminary

treatments may be necessary to separate microorganisms from the test sample.

Regardless of the treatment, the verification of recovery method should be performed in order to

demonstrate that the method can release microorganisms from the test sample without having an

adverse effect on their viability (see Clause 11).
4.5 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms
4.5.1 General

The enumeration of aerobic mesophilic microorganisms includes bacteria, yeasts and moulds.

Based on the nature of the test sample, the volume of diluent used to immerse the test sample and the

expected level of bioburden, two types of counting methods may be used:
— plate count method;
— membrane filtration method.
4.5.2 Plate count method overview
Plate count method consists of either using a pour plate or spread plate method.
Each method consists of the following steps.

— Prepare the agar plates and diluent using a non-selective agar medium for plating the diluent in

which the sample was immersed.
— Incubate the plates for enumeration and/or detection.

— Count the number of colonies forming units (CFU) based on the number of aerobic mesophilic

microorganisms recovered per unit or g.
4.5.3 Membrane filtration method overview
Membrane filtration consists of the following steps.

— Transfer the diluent or a defined quantity of diluent in which the test sample was immersed to a

filtration apparatus wetted with a small volume of an appropriate sterile diluent.

— After filtration and rinsing, transfer the membrane filter onto the surface of plates with non-

selective agar medium.
— Aerobic incubation of the plates.

— Count the number of colony forming units (CFU) and calculate of the number of aerobic mesophilic

microorganisms per g or unit.
© ISO 2020 – All rights reserved 3
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ISO 21322:2020(E)
4.6 Detection of specified microorganisms by enrichment method

The objective of the enrichment method is to incubate a test sample in a non-selective broth medium to

increase the number of microorganisms that are present in a test sample.

— The first step of an enrichment method is to incubate the test sample in a non-selective broth

medium to increase the number of microorganisms present in the test sample.

— The second step of an enrichment method is to isolate specified microorganisms that may be present

on a test sample through the use of selective agar media followed by confirmatory identification

tests for characteristic colonies. See ISO 18416, ISO 21150, ISO 22717 and ISO 22718.

5 Diluents, neutralizers and culture media
5.1 General

The diluents, neutralizers and culture media suitable for enumeration and detection of aerobic

mesophilic microorganisms are described in ISO 11930, ISO 16212 and ISO 21149. Other diluents,

neutralizers and culture media may be used if they have been demonstrated to be suitable for use.

Use the general instructions given in ISO 21148. When water is mentioned in this document, use

distilled water or purified water as specified in ISO 21148.
5.2 Diluents and neutralizers

The diluent is used to disperse the sample. It is required that it contain neutralizers if the sample to be

tested has antimicrobial properties or contains a preservative. The efficacy of the neutralization shall

be demonstrated before the determination of the count (see Clause 11). Diluents and neutralizers shall

be in accordance with ISO 11930, ISO 16212, ISO 18416, ISO 21149, ISO 21150, ISO 22717 and ISO 22718.

5.3 Culture media
5.3.1 Media for enumeration and detection

Culture media for enumeration and/or detection shall be in accordance with ISO 11930, ISO 16212,

ISO 18416, ISO 21149, ISO 21150, ISO 22717 and ISO 22718.
5.3.2 Media for preparation of spores of Bacillus subtilis
See C.1.3.1.
6 Apparatus and glassware
The laboratory equipment, apparatus and glassware are described in ISO 21148.
7 Strains of microorganisms

The culture should be reconstituted according to the procedures provided by the supplier of the

reference strain. The strains may be stored in the laboratory conforming to EN 12353 or according to

another suitable method.

For testing the recovery of microorganisms on the test samples, spores of Bacillus subtilis ATCC 6633

(equivalent strain CIP 52.62 or NCIMB 8054 or NBRC 3134 or other equivalent national collection

strain) are used.
4 © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 21322:2020(E)

For testing the efficacy of neutralizers, two strains representative of both Gram negative and Gram

positive bacteria and a yeast are used:

— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (equivalent strain: CIP 4.83 or NCIMB 9518 or NBRC 13276 or

KCTC 1916 or other equivalent national collection strain);

— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (equivalent strain: CIP 82.118 or NCIMB 8626 or NBRC 13275

or KCTC 2513 or other equivalent national collection strain).

An alternative Gram negative strain may be Escherichia coli ATCC 8739 (equivalent strain: CIP 53.126 or

NCIMB 8545 or NBRC 3972 or KCTC 2571 or other equivalent national collection strain).

— Candida albicans ATCC 10231 (equivalent strain: IP 48.72 or NCPF 3179 or NBRC 1594 or KCTC 17205,

or other equivalent national collection strain).
The strains may be kept in the laboratory according to the EN 12353.
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples

If storage is necessary, keep the products to be tested at room temperature. Do not incubate, refrigerate

or freeze products and samples before or after analysis. Sampling and test procedures should follow

the guidelines specified in ISO 21148 and in accordance with the procedure outlined in Clause 9.

9 Procedure
9.1 General recommendation

Use sterile equipment and aseptic technique whenever preparing the test sample and diluent.

For the preparation of an initial suspension, the time which elapses between the end of the preparation

of the test sample and the moment the diluent of the initial suspension comes into contact with the

culture medium shall not exceed (30 ± 15) min, unless specifically mentioned in the established

protocols or documents.

The method should follow the procedure developed during the suitability test, to ensure neutralization

of potential inhibitory effects (see Clause 11) and to guarantee the recovery of microorganisms.

9.2 Selection and preparation of the test sample
9.2.1 Selection of the test sample
The test sample shall weigh at least 1 g.

The test sample can be either the entire unit, or multiple units if the weight of one unit is less than 1 g,

or the UIP (see A.1).
Record the exact weight of the test sample, S, and, the number of units, n.
If a UIP is used for testing, record the UIP value of the test sample (see 4.2).
9.2.2 Preparation of the initial suspension

Place the test sample (see 9.2.1) into an appropriate container, with a known volume of diluent, defined

in the suitability test (see Clause 11). The test sample should be completely immersed in the diluent.

Record the value for “V”, the volume of diluent used.
© ISO 2020 – All rights reserved 5
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ISO 21322:2020(E)
9.3 Recovery of microorganisms
9.3.1 General

After immersion, the following treatments may be used to remove microorganisms from the test sample:

— stomaching;
— shaking/stirring;
— vortexing (see A.3).

NOTE If necessary, record the volume of the diluent after stomaching or shaking of test sample.

9.3.2 Stomaching

Prepare the initial suspension utilizing a sterile stomacher bag and then place it into the stomacher.

Proceed according to the parameters (time and speed) outlined in the suitability test (see Clause 11).

Record the time and the speed at which the stomaching took place.
9.3.3 Shaking/Stirring

Prepare the initial suspension in the appropriate closed container and mix according to the parameters

(duration and frequency) applied in the suitability test (see Clause 11).

Sterile glass beads may be added to enhance product mixing and organism recovery.

Record the time, frequency and the speed of shaking/stirring (if applicable) and whether glass beads

are added or not.
9.4 Enumeration of aerobic mesophilic microorganisms
9.4.1 General

The enumeration of aerobic mesophilic microorganisms includes bacteria, yeasts and moulds.

The choice of the method depends on the volume of diluent used for the preparation of the initial

suspension (see A.2).

Based on the test sample size, the level of bioburden and the sensitivity of the method, all of the diluent

in which the test sample is immersed (V) or a fraction of V (Vd) is used for enumeration.

Usually, the volume V or Vd of the initial suspension diluent is the dilution used for enumeration. No

further diluting of the initial preparation is required.

The minimal volume of diluent shall be equivalent to at least 1 g of the test sample.

9.4.2 Pour plate method

Use the appropriate number of Petri dishes to properly evaluate the volume of diluent needed to

properly immerse and transfer the product to be plated (V or Vd).

The diluent (V) is divided into two work streams: one half (V/2) is for the enumeration of bacteria and

the other half (V/2) for enumeration of yeasts and moulds.

If the enumeration is conducted on a fraction of the total diluent (Vd), two equal fractions (Vd/2) shall

be plated: one for bacteria and the other for yeasts and moulds.
6 © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 21322:2020(E)

If Petri dishes, 85 mm to 100 mm in diameter are used, add 1 ml of the diluent and pour 15 ml to

20 ml of the melted agar medium (as specified in ISO 21149 and ISO 16212) kept in a water bath not to

exceed 48 °C.

If larger Petri dishes (140 mm in diameter) are used, add no more than 10 ml of diluent in each plate and

the appropriate amount of agar medium based on the volume of diluent dispensed.

Slowly mix the transferred diluent with the medium, carefully rotating or tilting the plates to

sufficiently disperse the agar. Allow the mixture in the Petri dishes to solidify on a horizontal surface at

room temperature. Record the volume of diluent plated for each medium V/2 or Vd/2.

9.4.3 Surface spread method

Use the appropriate number of Petri dishes to properly evaluate the volume of diluent needed to

properly immerse and transfer the product to be plated (V or Vd).

In Petri dishes 85 mm to 100 mm in diameter, put 15 ml to 20 ml of the melted agar medium kept in

a water bath at no more than 48 °C. If larger Petri dishes are used, the volume of the agar is increased

accordingly. Allow plates to cool and solidify on a horizontal surface at room temperature.

The diluent (V) is divided into two work streams: one half (V/2) is for the enumeration of bacteria and

the other half (V/2) for enumeration of yeasts and moulds.

If the enumeration is conducted on a fraction of the total diluent (Vd), two equal fractions (Vd/2) shall

be plated: one for bacteria and the other for yeasts and moulds.
Spread over the surface of the medium a measure
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21322
Première édition
2020-06
Cosmétiques — Microbiologie —
Essais sur lingettes et masques
imprégnés ou enduits
Cosmetics — Microbiology — Testing of impregnated or coated wipes
and masks
Numéro de référence
ISO 21322:2020(F)
ISO 2020
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ISO 21322:2020(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Fax: +41 22 749 09 47
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Publié en Suisse
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ISO 21322:2020(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d'application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

4.1 Informations générales .................................................................................................................................................................... 2

4.2 Sélection de l'échantillon pour essai .................................................................................................................................... 2

4.3 Sélection de la méthode .................................................................................................................................................................. 3

4.4 Extraction des micro-organismes de l'échantillon pour essai ....................................................................... 3

4.5 Dénombrement des micro-organismes aérobies mésophiles ........................................................................ 3

4.5.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 3

4.5.2 Aperçu de la méthode par dénombrement sur plaques ................................................................ 3

4.5.3 Aperçu de la méthode par filtration sur membrane ......................................................................... 3

4.6 Détection de micro-organismes spécifiés selon une méthode par enrichissement .................... 4

5 Diluants, neutralisants et milieux de culture ......................................................................................................................... 4

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

5.2 Diluants et neutralisants ................................................................................................................................................................ 4

5.3 Milieux de culture ................................................................................................................................................................................. 4

5.3.1 Milieux utilisés pour le dénombrement et la détection ................................................................. 4

5.3.2 Milieux utilisés pour la préparation de spores de Bacillus subtilis ................................... 4

6 Appareillage et verrerie ................................................................................................................................................................................ 4

7 Souches de micro-organismes ................................................................................................................................................................ 5

8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire ........................................5

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 5

9.1 Recommandations générales...................................................................................................................................................... 5

9.2 Sélection et préparation de l'échantillon pour essai .............................................................................................. 5

9.2.1 Sélection de l'échantillon pour essai .............................................................................................................. 5

9.2.2 Préparation de la suspension initiale ............................................................................................................ 6

9.3 Extraction des micro-organismes ........................................................................................................................................... 6

9.3.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 6

9.3.2 Passage au stomacher ................................................................................................................................................. 6

9.3.3 Agitation .................................................................................................................................................................................. 6

9.4 Dénombrement des micro-organismes aérobies mésophiles ........................................................................ 6

9.4.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 6

9.4.2 Méthode par ensemencement en profondeur ........................................................................................ 7

9.4.3 Méthode par étalement en surface................................................................................................................... 7

9.4.4 Méthode par filtration sur membrane .......................................................................................................... 7

9.4.5 Incubation .............................................................................................................................................................................. 8

9.4.6 Dénombrement des colonies ................................................................................................................................. 8

9.5 Détection de micro-organismes spécifiés selon une méthode par enrichissement .................... 8

9.5.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 8

9.5.2 Recherche des micro-organismes spécifiés .............................................................................................. 8

10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 9

10.1 Dénombrement des micro-organismes aérobies mésophiles ........................................................................ 9

10.2 Détection de micro-organismes spécifiés ........................................................................................................................ 9

11 Essai d'applicabilité .......................................................................................................................................................................................... 9

12 Rapport d'essai ...................................................................................................................................................................................................10

© ISO 2020 – Tous droits réservés iii
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ISO 21322:2020(F)
Annexe A (normative) Recommandations relatives aux méthodes d’essais

microbiologiques de produits imprégnés ou enduits — Lingettes et masques ...............................11

Annexe B (informative) Expression et interprétation des résultats.................................................................................14

Annexe C (normative) Méthode de l'essai d'applicabilité ...........................................................................................................21

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................26

iv © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO 21322:2020(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.

Le présent document été élaboré par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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ISO 21322:2020(F)
Introduction

Pour des raisons techniques, les normes actuelles relatives à la microbiologie des cosmétiques peuvent

ne pas être applicables aux produits cosmétiques imprégnés ou enduits, tels que les masques et les

lingettes, dont la formulation n'est pas directement accessible.

Compte tenu de leur forme ou de l'état dans lequel ils sont mis sur le marché, il est nécessaire d'adapter

lesdites normes pour évaluer la qualité microbiologique de ces produits.
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NORME INTERNATIONALE ISO 21322:2020(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Essais sur lingettes et
masques imprégnés ou enduits
1 Domaine d'application

Le présent document fournit des recommandations pour le dénombrement et/ou la détection des micro-

organismes présents dans les produits cosmétiques imprégnés ou enduits sur un substrat (lingettes et

masques), pour lesquels l'échantillonnage et le contexte microbiologique du produit fabriqué posent des

problèmes particuliers lorsqu'il s'agit de réaliser un échantillonnage et des essais microbiologiques.

Le principe du présent document peut également être appliqué à des produits similaires (par exemple,

cushion, éponges imprégnées, etc.) ou des applicateurs (par exemple, pinceau, houpette, éponge, etc.),

en modifiant le mode opératoire comme approprié.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 11930, Cosmétiques — Microbiologie — Évaluation de la protection antimicrobienne d'un produit

cosmétique

ISO 16212, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et des moisissures

ISO 18416, Cosmétiques — Microbiologie — Détection de Candida albicans

ISO 21148, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques

ISO 21149, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles

ISO 21150, Cosmétiques — Microbiologie — Détection d'Escherichia coli
ISO 22717, Cosmétiques — Microbiologie — Détection de Pseudomonas aeruginosa
ISO 22718, Cosmétiques — Microbiologie — Détection de Staphylococcus aureus
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l'adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
formulation cosmétique

préparation constituée de matières premières dont la composition est qualitativement et

quantitativement définie
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ISO 21322:2020(F)
3.2
produit cosmétique

formulation cosmétique (3.1) ayant subi toutes les étapes de la production, y compris le conditionnement

dans son emballage final, en vue de son expédition
3.3
produit imprégné
produit absorbé sur le support
3.4
produit enduit
produit adsorbé sur le support
3.5
échantillon pour essai

unité représentative de la totalité du produit cosmétique (3.2) destiné à être soumis à essai

4 Principe
4.1 Informations générales

Cette méthode permet de déterminer la population de micro-organismes viables par dénombrement des

colonies sur un milieu gélosé non sélectif et par détection de la présence ou de l'absence de croissance

des micro-organismes spécifiés après enrichissement.
La méthode comprend les étapes suivantes:
— sélection de l'échantillon pour essai;
— sélection d'une méthode appropriée;
— extraction des micro-organismes;

— dénombrement de la population de micro-organismes viables selon une méthode par filtration ou

par dénombrement sur plaques;
— recherche des micro-organismes spécifiés selon une méthode par enrichissement.

Les conditions expérimentales doivent être évaluées afin de garantir que la méthode utilisée n'affecte

pas la viabilité des micro-organismes et la récupération de la biocharge de l'échantillon; il convient

également d’intégrer la vérification de l'efficacité de la neutralisation (voir Article 11).

Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il convient de procéder à

une appréciation du risque microbiologique appropriée afin de déterminer les types de produits

cosmétiques auxquels le présent document est applicable (voir ISO 29621:2017, Tableau 2).

D'autres méthodes peuvent être utilisées sous réserve que leur équivalence ait été démontrée.

4.2 Sélection de l'échantillon pour essai

— Chaque fois que possible, il convient d'utiliser pour l'essai l'unité dans sa totalité, d'une masse

minimale d'un gramme (1 g). Si, pour des raisons techniques, l'unité dans sa totalité ne peut pas

être soumise à essai, une portion de l'unité de produit (PUP) définie est utilisée pour les essais.

Une portion de l'unité de produit est une sous-unité, représentative sur le plan microbiologique, de

l'échantillon pour essai, à laquelle il est fait référence dans tout le document.

— Si l’unité pèse moins d'un gramme (< 1 g), il convient d'échantillonner le nombre approprié d'unités

pour obtenir la masse ou le volume nécessaire.

— La masse de l'échantillon pour essai doit être consignée, même si les résultats sont exprimés par unité.

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L'échantillon pour essai doit être sélectionné conformément à A.1.
4.3 Sélection de la méthode

Il convient que la méthode soit mise en œuvre conformément à un mode opératoire approprié fondé

sur les caractéristiques spécifiques du produit (taille, volume, emballage individuel/multiple, niveau de

biocharge, etc.) et qu'elle garantisse la représentativité de l’échantillon à évaluer.

La méthode doit être sélectionnée conformément à A.1 et A.2.
4.4 Extraction des micro-organismes de l'échantillon pour essai

Le degré d'adhérence des micro-organismes à la surface de l'échantillon pour essai dépend de la

lingette ou du masque dans lequel la portion de liquide de la formulation a été imprégnée ou enduite.

Des traitements préliminaires peuvent s'avérer nécessaires pour séparer les micro-organismes de

l'échantillon pour essai.

Indépendamment du traitement, il convient de vérifier la méthode de récupération afin de démontrer

qu'elle permet d’extraire les micro-organismes de l'échantillon pour essai sans nuire à leur viabilité

(voir Article 11).
4.5 Dénombrement des micro-organismes aérobies mésophiles
4.5.1 Généralités

Le dénombrement des micro-organismes aérobies mésophiles inclut les bactéries, les levures et les

moisissures.

En fonction de la nature de l'échantillon pour essai, du volume de diluant utilisé pour immerger

l'échantillon pour essai et du niveau de biocharge attendu, deux types de méthode de dénombrement

peuvent être utilisés:
— la méthode par dénombrement sur plaques;
— la méthode par filtration sur membrane.
4.5.2 Aperçu de la méthode par dénombrement sur plaques

Deux méthodes peuvent être utilisées pour le dénombrement sur plaques: la méthode par

ensemencement en profondeur ou la méthode par étalement en surface.
Chaque méthode comprend les étapes suivantes:

— préparation des boîtes de gélose et du diluant en utilisant un milieu gélosé non sélectif pour

ensemencer le diluant dans lequel l'échantillon a été immergé;
— incubation des plaques en vue du dénombrement et/ou de la détection;

— dénombrement du nombre d'unités formant colonies (UFC), sur la base du nombre de micro-

organismes aérobies mésophiles récupérés par unité ou par gramme (g).
4.5.3 Aperçu de la méthode par filtration sur membrane
La filtration sur membrane comprend les étapes suivantes:

— transfert du diluant ou d'une quantité définie du diluant dans lequel l'échantillon pour essai a été

immergé dans un appareil de filtration humidifié avec un faible volume de diluant approprié stérile;

— après filtration et rinçage, transfert de la membrane de filtration à la surface des boîtes contenant

le milieu gélosé non sélectif;
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— incubation en aérobiose des boîtes;

— dénombrement du nombre d'unités formant colonies (UFC) et calcul du nombre de micro-organismes

aérobies mésophiles par gramme (g) ou par unité.

4.6 Détection de micro-organismes spécifiés selon une méthode par enrichissement

L’objectif de la méthode par enrichissement est d’incuber un échantillon pour essai dans un bouillon

nutritif non sélectif pour augmenter le nombre de micro-organismes présents sur l’échantillon pour essai.

— La première étape d’une méthode par enrichissement consiste à incuber l'échantillon pour essai

dans un bouillon nutritif non sélectif pour augmenter le nombre de micro-organismes présents sur

l’échantillon pour essai.

— La seconde étape d’une méthode par enrichissement consiste à isoler les micro-organismes spécifiés

susceptibles d’être présents sur un échantillon pour essai à l'aide de milieux sélectifs de gélose et à

confirmer ensuite la présence de colonies caractéristiques par des essais d'identification. Voir les

normes ISO 18416, ISO 21150, ISO 22717 et ISO 22718.
5 Diluants, neutralisants et milieux de culture
5.1 Généralités

Les diluants, neutralisants et milieux de culture appropriés pour le dénombrement et la détection de

micro-organismes aérobies mésophiles sont décrits dans les normes ISO 11930, ISO 16212 et ISO 21149.

D'autres diluants, neutralisants et milieux de culture peuvent être utilisés s'il a été démontré qu'ils sont

applicables.

Se référer aux instructions générales figurant dans l’ISO 21148. Lorsqu’il est fait mention d’eau dans le

présent document, utiliser de l'eau distillée ou de l'eau purifiée comme spécifié dans l'ISO 21148.

5.2 Diluants et neutralisants

Le diluant sert à disperser l'échantillon. Il est nécessaire qu’il contienne des neutralisants si l'échantillon

devant être soumis à essai possède des propriétés antimicrobiennes ou contient un conservateur.

L'efficacité de la neutralisation doit être démontrée avant le dénombrement (voir Article 11). Les

diluants et les neutralisants doivent être conformes aux normes ISO 11930, ISO 16212, ISO 18416,

ISO 21149, ISO 21150, ISO 22717 et ISO 22718.
5.3 Milieux de culture
5.3.1 Milieux utilisés pour le dénombrement et la détection

Les milieux de culture utilisés pour le dénombrement et/ou la détection doivent être conformes aux

normes ISO 11930, ISO 16212, ISO 18416, ISO 21149, ISO 21150, ISO 22717 et ISO 22718.

5.3.2 Milieux utilisés pour la préparation de spores de Bacillus subtilis
Voir C.1.3.1.
6 Appareillage et verrerie

Les équipements, l'appareillage et la verrerie de laboratoire sont décrits dans l'ISO 21148.

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7 Souches de micro-organismes

Il convient de reconstituer la culture conformément aux modes opératoires indiqués par le fournisseur

de la souche de référence. Il est possible de conserver les souches au laboratoire conformément à

l’EN 12353 ou à une autre méthode appropriée.

Pour effectuer les essais de récupération des micro-organismes de l’échantillon pour essai, des spores

de Bacillus subtilis ATCC 6633 (souche équivalente CIP 52.62 ou NCIMB 8054 ou NBRC 3134, ou toute

autre souche équivalente issue d'une collection nationale) sont utilisées.

Afin de vérifier l'efficacité des neutralisants, deux souches représentatives de bactéries à Gram négatif

et de bactéries à Gram positif et une levure sont utilisées:

— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (souche équivalente: CIP 4.83 ou NCIMB 9518 ou NBRC 13276 ou

KCTC 1916, ou toute autre souche équivalente issue d'une collection nationale);

— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (souche équivalente: CIP 82.118 ou NCIMB 8626 ou NBRC 13275

ou KCTC 2513, ou toute autre souche équivalente issue d'une collection nationale).

Escherichia coli ATCC 8739 (souche équivalente: CIP 53.126 ou NCIMB 8545 ou NBRC 3972 ou KCTC 2571,

ou toute autre souche équivalente issue d'une collection nationale) peut être utilisée comme souche à

Gram négatif alternative.

— Candida albicans ATCC 10231 (souche équivalente: IP 48.72 ou NCPF 3179 ou NBRC 1594 ou

KCTC 17205, ou toute autre souche équivalente issue d'une collection nationale).

Il est possible de conserver les souches au laboratoire conformément à l'EN 12353.

8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire

Si nécessaire, conserver les produits devant être soumis à essai à température ambiante. Ne pas

incuber, réfrigérer ou congeler les produits et les échantillons avant ou après l'analyse. Il convient que

les modes opératoires d’échantillonnage et d’essai soient conformes aux lignes directrices spécifiées

dans l’ISO 21148 ainsi qu’au mode opératoire décrit à l’Article 9.
9 Mode opératoire
9.1 Recommandations générales

Utiliser un équipement stérile, ainsi que des règles d’asepsie, pour la préparation de l’échantillon pour

essai et du diluant.

Pour la préparation de la suspension initiale, le temps écoulé entre la fin de la préparation de

l’échantillon pour essai et le moment où le diluant de la suspension initiale entre en contact avec le

milieu de culture ne doit pas dépasser (30 ± 15) min, sauf mention particulière dans la documentation

ou les protocoles établis.

Il convient que la méthode se conforme au mode opératoire mis au point au cours de l'essai d'applicabilité

afin de s’assurer de la neutralisation des effets inhibiteurs potentiels (voir Article 11) et de garantir la

récupération des micro-organismes.
9.2 Sélection et préparation de l'échantillon pour essai
9.2.1 Sélection de l'échantillon pour essai
L'échantillon pour essai doit peser au moins un gramme (1 g).
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L'échantillon pour essai peut être constitué soit de l'unité dans sa totalité, soit de plusieurs unités si la

masse d'une unité est inférieure à 1 g, soit d’une portion de l’unité de produit (PUP) (voir A.1).

Consigner la masse exacte, S, de l'échantillon pour essai et le nombre d'unités, n.

Si une portion de l'unité de produit (PUP) est utilisée pour les essais, consigner la valeur de la portion

correspondant à l'échantillon pour essai (voir 4.2).
9.2.2 Préparation de la suspension initiale

Placer l'échantillon pour essai (voir 9.2.1) dans un récipient approprié contenant un volume de diluant

connu, défini dans l'essai d'applicabilité (voir Article 11). Il convient que l’échantillon pour essai soit

totalement immergé dans le diluant.
Consigner la valeur du volume, V, de diluant utilisé.
9.3 Extraction des micro-organismes
9.3.1 Généralités

Après immersion, les traitements suivants peuvent être utilisés pour extraire les micro-organismes de

l'échantillon pour essai:
— passage au stomacher;
— agitation;
— passage à l’agitateur type Vortex (voir A.3).

NOTE Si nécessaire, consigner le volume de diluant après passage au stomacher ou agitation de l’échantillon

pour essai.
9.3.2 Passage au stomacher

Préparer la suspension initiale en utilisant un sac stérile pour stomacher qui est ensuite placé dans

l'appareil.

Procéder conformément aux paramètres (durée et vitesse) appliqués dans l'essai d'applicabilité (voir

Article 11).
Consigner la durée et la vitesse appliquées lors du passage au stomacher.
9.3.3 Agitation

Préparer la suspension initiale dans un récipient approprié fermé et mélanger conformément aux

paramètres (durée et fréquence) appliqués dans l'essai d'applicabilité (voir Article 11).

Des billes en verre stériles peuvent être ajoutées pour optimiser le mélange du produit et améliorer la

récupération des organismes.

Consigner la durée, la fréquence et la vitesse appliquées lors de l’agitation (le cas échéant); mentionner

l’ajout éventuel de billes en verre.
9.4 Dénombrement des micro-organismes aérobies mésophiles
9.4.1 Généralités

Le dénombrement des micro-organismes aérobies mésophiles inclut les bactéries, les levures et les

moisissures.
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ISO 21322:2020(F)

Le choix de la méthode dépend du volume de diluant utilisé pour préparer la suspension initiale

(voir A.2).
En fonction de la taille de l'échantillon pou
...

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