ISO 22718:2015

Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus

ISO 22718:2015 gives general guidelines for the detection and identification of the specified microorganism Staphylococcus aureus in cosmetic products. Microorganisms considered as specified in this International Standard might differ from country to country according to national practices or regulations. In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic product to which this International Standard is applicable. Products considered to present a low microbiological (see ISO 29621) risk include those with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc. The method described in this International Standard is based on the detection of Staphylococcus aureus in a non-selective liquid medium (enrichment broth), followed by isolation on a selective agar medium. Other methods may be appropriate dependent on the level of detection required. NOTE For the detection of Staphylococcus aureus, subcultures can be performed on non-selective culture media followed by suitable identification steps (e.g. using identification kits). Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method may not be appropriate for some products in every detail (e.g. certain water immiscible products). Other International Standards (ISO 18415) may be appropriate. Other methods (e.g. automated) may be substituted for the tests presented here provided that their equivalence has been demonstrated or the method has been otherwise shown to be suitable.

Cosmétiques — Microbiologie — Détection de Staphylococcus aureus

ISO 22718:2015 donne des lignes directrices générales pour la détection et l'identification du microorganisme spécifié Staphylococcus aureus dans les produits cosmétiques. Les microorganismes considérés comme spécifiés dans la présente Norme internationale peuvent différer d'un pays à l'autre suivant les pratiques ou les réglementations nationales. Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est préférable d'effectuer une analyse appropriée du risque microbiologique afin de déterminer les types de produits cosmétiques qui relèvent de la présente Norme internationale. Les produits considérés comme présentant un faible risque microbiologique (voir ISO 29621) comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydroalcooliques, ceux ayant des valeurs de pH extrêmes, etc. La méthode décrite dans la présente Norme internationale repose d'abord sur la détection de Staphylococcus aureus dans un milieu liquide non sélectif (bouillon d'enrichissement), suivie d'un isolement sur un milieu gélosé sélectif. D'autres méthodes peuvent être appropriées en fonction du niveau de détection exigé. NOTE Pour la détection de Staphylococcus aureus, il est possible de réaliser des subcultures sur des milieux de culture non sélectifs, puis de procéder aux étapes appropriées d'identification (par exemple en utilisant des kits d'identification). En raison de la grande variété de produits cosmétiques relevant de ce domaine d'application, il se peut que cette méthode ne soit pas adaptée en tous points à certains produits (par exemple aux produits non miscibles à l'eau). D'autres Normes internationales (ISO 18415) peuvent être appropriées. Il est possible de remplacer les essais présentés ici par d'autres méthodes (par exemple des méthodes automatisées) sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été par ailleurs indiquée comme adéquate.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 24-Nov-2015
• ICS: 07.100.40 - Cosmetics microbiology
• ICS: 07.100.99 - Other standards related to microbiology
• ICS: 71.100.70 - Cosmetics. Toiletries
• Technical Committee: ISO/TC 217 - Cosmetics
• Drafting Committee: ISO/TC 217/WG 1 - Microbiological standards and limits
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 22-May-2021

Relations

• Amended By: ISO 22718:2015/Amd 1:2022 - Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus — Amendment 1
• Effective Date: 26-Nov-2021
• Revises: ISO 22718:2006 - Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus
• Effective Date: 04-Nov-2015

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22718
Second edition
2015-12-01
Cosmetics — Microbiology —
Detection of Staphylococcus aureus
Cosmétiques — Microbiologie — Détection de Staphylococcus aureus
Reference number
ISO 22718:2015(E)
ISO 2015
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ISO 22718:2015(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2015, Published in Switzerland

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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

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ii © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 22718:2015(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Diluents and culture media ....................................................................................................................................................................... 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution) ....................................... 3

5.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 3

5.2.2 Composition ......................................................................................................................................................................... 3

5.2.3 Preparation ........................................................................................................................................................................... 3

5.3 Culture media ........................................................................................................................................................................................... 3

5.3.1 General .................................................................................................................................................................................... 3

5.3.2 Agar medium for the suitability test (see Clause 11) [soybean-casein

digest agar medium (SCDA) or tryptic soy agar (TSA)] ................................................................. 3

5.3.3 Enrichment broth ............................................................................................................................................................ 4

5.3.4 Selective agar medium for isolation of Staphylococcus aureus ............................................ 5

6 Apparatus and glassware ............................................................................................................................................................................ 6

7 Strains of microorganisms ......................................................................................................................................................................... 6

8 Handling of cosmetic products and laboratory samples ............................................................................................ 6

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 7

9.1 General recommendation .............................................................................................................................................................. 7

9.2 Preparation of the initial suspension in the enrichment broth .................................................................... 7

9.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 7

9.2.2 Water-miscible products........................................................................................................................................... 7

9.2.3 Water-immiscible products .................................................................................................................................... 7

9.2.4 Filterable products ......................................................................................................................................................... 7

9.3 Incubation of the inoculated enrichment broth ......................................................................................................... 7

9.4 Detection and identification of Staphylococcus aureus .................................................................................... 7

9.4.1 Isolation ................................................................................................................................................................................... 7

9.4.2 Identification of Staphylococcus aureus ................................................................................................... 8

10 Expression of the results (detection of Staphylococcus aureus) ......................................................................... 8

11 Neutralization of the antimicrobial properties of the product ............................................................................ 9

11.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 9

11.2 Preparation of inoculum ................................................................................................................................................................. 9

11.3 Suitability of the detection method ....................................................................................................................................... 9

11.3.1 Procedure ............................................................................................................................................................................... 9

11.3.2 Interpretation of suitability test results ...................................................................................................... 9

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................10

Annex A (informative) Other media ...................................................................................................................................................................11

Annex B (informative) Neutralizers of antimicrobial activity of preservatives and

rinsing liquids ......................................................................................................................................................................................................14

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................15

© ISO 2015 – All rights reserved iii
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ISO 22718:2015(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 217, Cosmetics.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 22718:2006), of which it constitutes a

minor revision.
iv © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 22718:2015(E)
Introduction

Microbiological examinations of cosmetic products are carried out according to an appropriate

microbiological risk analysis in order to ensure their quality and safety for consumers.

Microbiological risk analysis depends on several parameters such as the following:

— potential alteration of cosmetic products;
— pathogenicity of microorganisms;

— site of application of the cosmetic product (hair, skin, eyes, mucous membranes);

— type of users (adults, children under 3 years).

For cosmetics and other topical products, the detection of skin pathogens such as Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans may be relevant because they can cause skin

or eye infections. The detection of other kinds of microorganism might be of interest since these

microorganisms (including indicators of faecal contamination e.g. Escherichia coli) suggest hygienic

failure during the manufacturing process.
© ISO 2015 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 22718:2015(E)
Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus
aureus
1 Scope

This International Standard gives general guidelines for the detection and identification of the

specified microorganism Staphylococcus aureus in cosmetic products. Microorganisms considered as

specified in this International Standard might differ from country to country according to national

practices or regulations.

In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate

microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic product to which this International

Standard is applicable. Products considered to present a low microbiological (see ISO 29621) risk

include those with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc.

The method described in this International Standard is based on the detection of Staphylococcus aureus

in a non-selective liquid medium (enrichment broth), followed by isolation on a selective agar medium.

Other methods may be appropriate dependent on the level of detection required.

NOTE For the detection of Staphylococcus aureus, subcultures can be performed on non-selective culture

media followed by suitable identification steps (e.g. using identification kits).

Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method may

not be appropriate for some products in every detail (e.g. certain water immiscible products). Other

International Standards (ISO 18415) may be appropriate. Other methods (e.g. automated) may be

substituted for the tests presented here provided that their equivalence has been demonstrated or the

method has been otherwise shown to be suitable.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 21148:2005, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination

EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of test organisms used for the

determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal

(including bacteriophages) activity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
product
portion of an identified cosmetic product received in the laboratory for testing
3.2
sample

portion of the product (at least 1 g or 1 ml) that is used in the test to prepare the initial suspension

© ISO 2015 – All rights reserved 1
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ISO 22718:2015(E)
3.3
initial suspension

suspension (or solution) of the sample in a defined volume of an appropriate enrichment broth

3.4
sample dilution
dilution of the initial suspension
3.5
specified microorganism

aerobic mesophilic bacterium or yeast that is undesirable in a cosmetic product and is recognized as a

skin pathogen species that may be harmful for human health or as an indication of hygienic failure in

the manufacturing process
3.6
Staphylococcus aureus

gram-positive cocci, mainly aggregated in grape-like clusters, smooth colonies generally pigmented in

yellow

Note 1 to entry: The main characteristics for identification are: growth on specific selective medium, catalase

positive, coagulase positive.

Note 2 to entry: Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen for humans that can also be present on

the skin of healthy people without causing disorder for them. It is undesirable in cosmetic products due to its

potential pathogenicity.
3.7
enrichment broth

non-selective liquid medium containing suitable neutralizers and/or dispersing agents and

demonstrated to be suitable for the product under test
4 Principle

The first step of the procedure is to perform an enrichment by using a non-selective broth medium to

increase the number of microorganisms without the risk of inhibition by the selective ingredients that

are present in selective/differential growth media.

The second step of the test (isolation) is performed on a selective medium followed by identification tests.

The possible inhibition of microbial growth by the sample shall be neutralized to allow the detection

[1]

of viable microorganisms . In all cases and whatever the methodology, the neutralization of the

antimicrobial properties of the product shall be checked and demonstrated (see Clause 11).

5 Diluents and culture media
5.1 General

General instructions are given in ISO 21148. When water is mentioned in this International Standard,

use distilled water or purified water as specified in ISO 21148.

The enrichment broth is used to disperse the sample and to increase the initial microbial population. It

may contain neutralizers if the specimen to be tested has antimicrobial properties. The efficacy of the

neutralization shall be demonstrated (see Clause 11). Information relative to suitable neutralizers is

given in Annex B.

The enrichment broth (5.3.3.1), or any of the ones listed in Annex A, is suitable for checking the

presence of Staphylococcus aureus in accordance with this International Standard provided that it has

been demonstrated to be suitable in accordance with Clause 11.
2 © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 22718:2015(E)

Other diluents and culture media may be used if it has been demonstrated that they are suitable for use.

5.2 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution)
5.2.1 General

The diluent is used for the preparation of bacterial suspension used for the suitability test procedure

(see Clause 11).
5.2.2 Composition
— tryptone, pancreatic digest of casein 1,0 g
— sodium chloride 8,5 g
— water 1 000 ml
5.2.3 Preparation

Dissolve the components in water by mixing while heating. Dispense into suitable containers. Sterilize

in the autoclave at 121 °C for 15 min.

After sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at room

temperature.
5.3 Culture media
5.3.1 General

Culture media may be prepared using the descriptions provided below or from dehydrated culture

media according to the instructions from the manufacturer. The instructions provided by the supplier

of the media should be followed.

NOTE Ready-to-use media can be used when their composition and/or growth yields are comparable to

those of the formulae given herein.

5.3.2 Agar medium for the suitability test (see Clause 11) [soybean-casein digest agar medium

(SCDA) or tryptic soy agar (TSA)]
5.3.2.1 Composition
— pancreatic digest of casein 15,0 g
— papaic digest of soybean meal 5,0 g
— sodium chloride 5,0 g
— agar 15,0 g
— water 1 000 ml
5.3.2.2 Preparation

Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating.

Dispense the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min.

After sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room

temperature.
© ISO 2015 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22718:2015(E)
5.3.3 Enrichment broth
5.3.3.1 Eugon LT 100 broth
5.3.3.1.1 General

This medium contains ingredients which neutralize inhibitory substances present in the sample:

lecithin and polysorbate 80, and dispersing agent: octoxynol 9.
5.3.3.1.2 Composition
— pancreatic digest of casein 15,0 g
— papaic digest of soybean meal 5,0 g
— L-cystine 0,7 g
— sodium chloride 4,0 g
— sodium sulfite 0,2 g
— glucose 5,5 g
— egg lecithin 1,0 g
— polysorbate 80 5,0 g
— octoxynol 9 1,0 g
— water 1 000 ml
5.3.3.1.3 Preparation

Dissolve the components, polysorbate 80, octoxynol 9 and egg lecithin successively into boiling water

until their complete dissolution. Dissolve the other components by mixing while heating. Dispense the

medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min.

After sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at room

temperature.
5.3.3.2 Other enrichment broths
Other enrichment broths may be used as appropriate (see Ann
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 22718
Deuxième édition
2015-12-01
Cosmétiques — Microbiologie —
Détection de Staphylococcus aureus
Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus
Numéro de référence
ISO 22718:2015(F)
ISO 2015
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ISO 22718:2015(F)
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© ISO 2015, Publié en Suisse

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO 22718:2015(F)
Sommaire Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Diluants et milieux de culture ................................................................................................................................................................ 2

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

5.2 Diluant pour la suspension bactérienne (solution de tryptone et de chlorure de sodium) . 3

5.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 3

5.2.2 Composition ......................................................................................................................................................................... 3

5.2.3 Préparation ........................................................................................................................................................................... 3

5.3 Milieux de culture ................................................................................................................................................................................. 3

5.3.1 Généralités ........................................................................................................................................................................... 3

5.3.2 Milieu gélosé pour l’essai d’applicabilité (voir Article 11) [milieu gélosé à

l’hydrolysat de caséine et de soja (SCDA) ou gélose tryptone-soja (TSA)] .................... 4

5.3.3 Bouillon d’enrichissement ....................................................................................................................................... 4

5.3.4 Milieu gélosé sélectif pour l’isolement de Staphylococcus aureus .................................... 5

6 Appareillage et verrerie ................................................................................................................................................................................ 6

7 Souches de microorganismes .................................................................................................................................................................. 6

8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire ........................................7

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 7

9.1 Recommandations générales...................................................................................................................................................... 7

9.2 Préparation de la suspension initiale dans le milieu liquide d’enrichissement ............................. 7

9.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 7

9.2.2 Produits miscibles à l’eau ......................................................................................................................................... 7

9.2.3 Produits non miscibles à l’eau .............................................................................................................................. 7

9.2.4 Produits filtrables ........................................................................................................................................................... 7

9.3 Incubation du bouillon d’enrichissement ensemencé .......................................................................................... 8

9.4 Détection et identification de Staphylococcus aureus ....................................................................................... 8

9.4.1 Isolement ................................................................................................................................................................................ 8

9.4.2 Identification de Staphylococcus aureus .................................................................................................. 8

10 Expression des résultats (détection de Staphylococcus aureus) ......................................................................... 9

11 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit ................................................................................ 9

11.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 9

11.2 Préparation de l’inoculum ............................................................................................................................................................. 9

11.3 Applicabilité de la méthode de détection......................................................................................................................... 9

11.3.1 Mode opératoire ............................................................................................................................................................... 9

11.3.2 Interprétation des résultats de l’essai d’applicabilité...................................................................10

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................10

Annexe A (informative) Autres milieux ..........................................................................................................................................................11

Annexe B (informative) Neutralisants de l’activité antimicrobienne des conservateurs et

liquides de rinçage ..........................................................................................................................................................................................14

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................15

© ISO 2015 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22718:2015(F)
Foreword

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer

un engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 217, Cosmétiques.

Cette seconde édition annule et remplace la première édition (ISO 22718:2006), qui a fait l’objet d’une

révision mineure.
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO 22718:2015(F)
Introduction

Les examens microbiologiques des produits cosmétiques sont réalisés selon une analyse de risque

microbiologique appropriée afin de garantir leur qualité et la sécurité des consommateurs.

L’analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramètres tels que les suivants:

— l’altération potentielle des produits cosmétiques;
— le caractère pathogène des microorganismes;
— le site d’application du produit cosmétique (cheveux, peau, yeux, muqueuses);
— la catégorie d’utilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans).

Pour les cosmétiques et les autres produits topiques, la détection d’agents pathogènes pour la peau, tels

que Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans peut être justifiée parce qu’ils

peuvent causer des infections cutanées ou oculaires. La recherche d’autres sortes de microorganismes

peut aussi présenter un intérêt car ceux-ci (y compris des indicateurs de contamination fécale, par exemple

Escherichia coli) peuvent indiquer une défaillance de l’hygiène au cours du processus de fabrication.

© ISO 2015 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 22718:2015(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Détection de
Staphylococcus aureus
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale donne des lignes directrices générales pour la détection et

l’identification du microorganisme spécifié Staphylococcus aureus dans les produits cosmétiques. Les

microorganismes considérés comme spécifiés dans la présente Norme internationale peuvent différer

d’un pays à l’autre suivant les pratiques ou les réglementations nationales.

Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est préférable d’effectuer une

analyse appropriée du risque microbiologique afin de déterminer les types de produits cosmétiques

qui relèvent de la présente Norme internationale. Les produits considérés comme présentant un

faible risque microbiologique (voir ISO 29621) comprennent ceux ayant une faible activité de l’eau, les

produits hydroalcooliques, ceux ayant des valeurs de pH extrêmes, etc.

La méthode décrite dans la présente Norme internationale repose d’abord sur la détection de

Staphylococcus aureus dans un milieu liquide non sélectif (bouillon d’enrichissement), suivie d’un

isolement sur un milieu gélosé sélectif. D’autres méthodes peuvent être appropriées en fonction du

niveau de détection exigé.

NOTE Pour la détection de Staphylococcus aureus, il est possible de réaliser des subcultures sur des milieux

de culture non sélectifs, puis de procéder aux étapes appropriées d’identification (par exemple en utilisant des

kits d’identification).

En raison de la grande variété de produits cosmétiques relevant de ce domaine d’application, il se peut

que cette méthode ne soit pas adaptée en tous points à certains produits (par exemple aux produits non

miscibles à l’eau). D’autres Normes internationales (ISO 18415) peuvent être appropriées. Il est possible

de remplacer les essais présentés ici par d’autres méthodes (par exemple des méthodes automatisées)

sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été par ailleurs indiquée

comme adéquate.
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 21148:2005, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques

EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des microorganismes d’essai utilisés

pour la détermination de l’activité bactéricide (Legionella incluses), mycobactéricide, sporicide, fongicide et

virucide (bactériophages inclus)
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

3.1
produit
portion d’un produit cosmétique identifié reçue au laboratoire pour essais
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ISO 22718:2015(F)
3.2
échantillon

portion du produit (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée lors de l’essai pour préparer la suspension initiale

(solution mère)
3.3
suspension initiale

suspension (ou solution) de l’échantillon dans un volume défini d’un bouillon d’enrichissement approprié

3.4
Dilution de l’échantillon
dilution de la suspension initiale
3.5
microorganisme spécifié

bactérie aérobie mésophile ou levure qui est indésirable dans un produit cosmétique et qui est reconnue

comme étant une espèce pathogène pour la peau, susceptible d’être néfaste pour la santé humaine ou

considérée comme indication de défaillance de l’hygiène dans le processus de fabrication

3.6
Staphylococcus aureus

cocci Gram positif, principalement regroupés en grappes, formant des colonies lisses généralement

pigmentées en jaune

Note 1 à l’article: Les principales caractéristiques pour l’identification sont les suivantes: croissance sur milieu

sélectif spécifique, catalase positive, coagulase positive.

Note 2 à l’article: Staphylococcus aureus est un agent pathogène opportuniste chez l’homme, qui peut également

être présente sur la peau d’individus sains chez lesquels elle n’engendre apparemment aucune maladie. Sa

présence est indésirable dans les produits cosmétiques en raison de son caractère potentiellement pathogène.

3.7
bouillon d’enrichissement

milieu liquide non sélectif contenant des neutralisants et/ou des agents dispersants appropriés, dont il

a été démontré qu’il convient pour le produit soumis à essai
4 Principe

La première étape du mode opératoire est une phase d’enrichissement utilisant un bouillon non sélectif

afin d’augmenter le nombre de microorganismes sans risque d’inhibition par les ingrédients sélectifs

qui sont présents dans les milieux de culture sélectifs/différentiels.

La seconde étape de l’essai (isolement) est réalisée sur un milieu sélectif et elle est suivie d’essais

d’identification.

L’inhibition potentielle de la croissance microbienne par l’échantillon doit être neutralisée pour

[1]

permettre la détection des microorganismes viables . Dans tous les cas et quelle que soit la méthode

employée, la neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit doit être vérifiée et démontrée

(voir Article 11).
5 Diluants et milieux de culture
5.1 Généralités

Des instructions générales sont données dans l’ISO 21148. Lorsque la présente Norme internationale

mentionne l’emploi d’eau, il faut utiliser de l’eau distillée ou de l’eau purifiée comme spécifié dans

l’ISO 21148.
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Le bouillon d’enrichissement est utilisé pour disperser l’échantillon et pour augmenter la population

microbienne initiale. Il peut contenir des neutralisants si l’échantillon à soumettre à essai possède

des propriétés antimicrobiennes. L’efficacité de la neutralisation doit être démontrée (voir Article 11).

L’Annexe B fournit des informations relatives aux neutralisants appropriés.

Le bouillon d’enrichissement (5.3.3.1), ou l’un de ceux donnés dans l’Annexe A, peut être utilisé pour

vérifier la présence de Staphylococcus aureus conformément à la présente Norme internationale à

condition qu’il ait été démontré qu’il est approprié conformément à l’Article 11.

D’autres diluants et milieux de culture sont utilisables s’il a été démontré que leur emploi convient.

5.2 Diluant pour la suspension bactérienne (solution de tryptone et de chlorure de

sodium)
5.2.1 Généralités

Le diluant est utilisé pour préparer la suspension bactérienne utilisée pour le mode opératoire de l’essai

d’applicabilité (voir Article 11).
5.2.2 Composition
— tryptone, hydrolysat pancréatique de caséine 1,0 g
— chlorure de sodium 8,5 g
— eau 1 000 ml
5.2.3 Préparation

Dissoudre les composants dans l’eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients

appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à

température ambiante.
5.3 Milieux de culture
5.3.1 Généralités

Les milieux de culture peuvent être préparés suivant les modes opératoires ci-dessous ou à partir de

milieux de culture déshydratés conformément aux instructions du fabricant. Il convient de se conformer

aux instructions données par le fournisseur des milieux.

NOTE Il est possible d’utiliser des milieux prêts à l’emploi quand leur composition et/ou leurs performances

de croissance sont comparables à celles des formules indiquées ci-après.
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5.3.2 Milieu gélosé pour l’essai d’applicabilité (voir Article 11) [milieu gélosé à l’hydrolysat de

caséine et de soja (SCDA) ou gélose tryptone-soja (TSA)]
5.3.2.1 Composition
— hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g
— hydrolysat papaïque de soja 5,0 g
— chlorure de sodium 5,0 g
— agar 15,0 g
— eau 1 000 ml
5.3.2.2 Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau en mélangeant tout en chauffant.

Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le mesurage étant effectué à

température ambiante.
5.3.3 Bouillon d’enrichissement
5.3.3.1 Bouillon Eugon LT 100
5.3.3.1.1 Généralités

Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans

l’échantillon, tels que la lécithine et le polysorbate 80 ainsi qu’un agent dispersant comme l’octoxynol 9.

5.3.3.1.2 Composition
— hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g
— hydrolysat papaïque de soja 5,0 g
— L-cystine 0,7 g
— chlorure de sodium 4,0 g
— sulfite de sodium 0,2 g
— glucose 5,5 g
— lécithine d’œuf 1,0 g
— polysorbate 80 5,0 g
— octoxynol 9 1,0 g
— eau 1 000 ml
5.3.3.1.3 Préparation

Dissoudre successivement dans l’eau bouillante le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf

jusqu’à dissolution complète. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant.

Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.

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Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à

température ambiante.
5.3.3.2 Autres bouillons d’enrichissement

D’autres bouillons d’enrichissement peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe A).

5.3.4 Milieu gélosé sélectif pour l’isolement de Staphylococcus aureus
5.3.4.1 Gélose Baird Parker
5.3.4.1.1 Milieu de base
5.3.4.1.1.1 Composition
— hydrolysat pancréatique de caséine 10,0 g
— extrait de levure 1,0 g
— extrait de viande 5,0 g
— pyruvate de sodium 10,0 g
— L-glycine 12,0 g
— chlorure de lithium 5,0 g
— agar 12 g à 22 g
— eau compléter au volume final de 950 ml
5.3.4.1.1.2 Préparation

Dissoudre tous ces composants ou la base complète déshydratée dans l’eau à ébullition. Transférer le

milieu par portions de 100 ml dans des fioles ou flacons de capacité appropriée. Stériliser à l’autoclave

à 121 °C pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,2 ± 0,2, le mesurage étant effectué à

température ambiante.
5.3.4.1.2 Solution de tellurite de potassium
5.3.4.1.2.1 Composition
— tellurite de potassium (K TeO ) 1,0 g
2 3
— eau 100 ml
5.3.4.1.2.2 Préparation

Dissoudre le tellurite de potassium complètement dans l’eau en chauffant au minimum.

Stériliser par filtration sur des membranes ayant une porosité de 0,22 µm. La solution peut être

conservée à 3 °C ± 2 °C pendant une période maximale d’un mois. Rejeter la solution en cas de formation

d’un précipité blanc.

En principe, la poudre se dissout facilement. S’il persiste dans l’eau une substance blanche insoluble, il

convient de rejeter la poudre.
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5.3.4.1.3 Émulsion de jaune d’œuf (concentration de 20 % approximativement ou selon les

instructions du fabricant)

Si l’on ne dispose pas d’une préparation commerciale, préparer le milieu de la façon suivante.

Utiliser des œufs de poule frais aux coquilles intactes. Les laver à la brosse avec un détergent liquide.

Les rincer à l’eau courante, désinfecter les coquilles soit en les plongeant dans de l’éthanol à 70 %

(fraction volumique) pendant 30 s et en les laissant sécher à l’air, soit en les vaporisant d’alcool et en les

stérilisant à la flamme. Dans des conditions aseptiques, casser chaque œuf et séparer le jaune du blanc

en faisant passer le jaune d’une moitié de coquille dans l’autre, et ce plusieurs fois de suite. Mettre les

jaunes dans une fiole stérile et ajouter quatre fois leur volume d’eau stérile. Bien mélanger. Chauffer ce

mélange à 47 °C pendant 2 h et le laisser reposer pendant 18 h à 24 h à 3 °C ± 2 °C pour qu’un précipité

se forme. Recueillir aseptiquement le surnageant et le transférer dans une fiole stérile fraiche en vue de

son utilisation.
L’émulsion peut être conservée à 3 °C ± 2 °C pendant 72 h au plus.
5.3.4.1.4 Milieu complet
5.3.4.1.4.1 Composition
— milieu de base (5.3.4.1.1) 100 ml
— solution de tellurite de potassium (5.3.4.1.2) 1,0 ml
— émulsion de jaune d’œuf (5.3.4.1.3) 5,0 ml
5.3.4.1.4.2 Préparation

Faire fondre le milieu de base ((5.3.4.1.1), puis le laisser refroidir jusqu’à environ 47 °C. Dans des

conditions aseptiques, ajouter les deux autres solutions (5.3.4.1.2 et 5.3.4.1.3) préalablement chauffées

à 47 °C, en mélangeant bien après chaque ajout.
5.3.4.2 Autres milieux gélosés sélectifs
D’autres milieux gélosés sélectifs peuvent être utilisés (voir Annexe A).
6 Appareillage et verrerie

Utiliser l’équipement de laboratoire, l’appareillage et la verrerie décrits dans l’ISO 21148.

7 Souches de microorganismes

Pour vérifier que les conditions d’essai sont applicables, utiliser la souche représentative suivante:

1) 2) 3)
Staphylococcus aureus ATCC 6538 (souche équivalente: CIP 4.83 ou NCIMB 9518).

Il convient de reconstituer la culture conformément aux méthodes indiquées par le fournisseur de la

souche de référence.
La souche peut être conservée au laboratoire conformément à l’EN 12353.

1) ATCC = American Type Culture Collection (Collection américaine de cultures types).

2) CIP = Collection de l’Institut Pasteur.

3) NCIMB = National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Collection nationale de bactéries industrielles

et marines).
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8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire
Si nécessaire, stocker les produits à soumettre à essai à température ambiante.

Ne pas incuber, réfrigérer ou congeler les produits et les échantillons avant ou après l’analyse.

Il convient d’effectuer l’échantillonnage des produits cosmétiques à analyser conformément à la

description donnée dans l’ISO 21148. Analyser les échantillons selon la description donnée dans

l’ISO 21148 et conformément au mode opératoire indiqué à l’Article 9.
9 Mode opératoire
9.1 Recommandations générales

Utiliser du matériel et un équipement stériles ainsi que des techniques aseptiques pour préparer

l’échantillon, la suspension initiale et les dilutions. En cas de préparation de la suspension initiale dans

un agent solubilisant approprié, le temps écoulé entre la fin de la préparation et le moment où l’inoculum

entre en contact avec le bouillon d’enrichissement ne doit pas dépasser 45 min, sauf indications

particulières mentionnées dans la documentation ou les protocoles établis.

9.2 Préparation de la suspension initiale dans le milieu liquide d’enrichissement

9.2.1 Généralités

L’enrichissement est préparé à partir d’un échantillon (3.2) d’au moins 1 g ou 1 ml du produit

soumis à essai, préalablement mélangé avec soin, qui est dispersé dans au moins 9 ml de bouillon

d’enrichissement.
Noter S, la masse ou le volume exact de l’échantillon.

Il faut vérifier la méthode en s’assurant que la composition (avec ajout éventuel de neutralisant) et le

volume du bouillon donnent des résultats satisfaisants (voir 11.3).

NOTE Dans certains cas, et lorsque cela est réalisable, la filtration du produit cosmétique sur une

membrane, qui est ensuite transférée dans le bouillon d’enrichissement, facilite la neutralisation des propriétés

antimicrobiennes du produit (voir 11.3).
9.2.2 Produits miscibles à l’eau

Transférer l’échantillon de produit, S, dans un récipient approprié contenant un volume adéquat de

bouillon.
9.2.3 Produits non miscibles à l’eau

Transférer l’échantillon de produit, S, dans un récipient approprié contenant une quantité adéquate

d’agent solubilisant (par exemple Polysorbate 80).

Disperser l’échantillon dans l’agent solubilisant et ajouter un volume adéquat de bouillon.

9.2.4 Produits filtrables

Utiliser une membrane filtrante ayant une porosité nominale inférieure ou égale à 0,45 µm.

Transférer l’échantillon, S, sur la membrane d’un appareil de filtration (voir l’ISO 21148). Filtrer

immédiatement et laver la membrane en utilisant des volumes définis d’eau et/ou de diluant.

Transférer et immerger la membrane dans un tube ou une fiole de dimension appropriée contenant un

volume adéquat de bouillon.
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9.3 Incubation du bouillon d’enrichissement ensemencé

Incuber la suspension initiale préparée dans le bouillon (voir 9.2) à 32,5 °C ± 2,5 °C, pendant au moins

20 h (72 h au maximum).
9.4 Détection et identification de Staphylococcus aureus
9.4.1 Isolement

À l’aide d’une anse stérile, étaler par stries une aliquote du bouillon d’enrichissement incubé à la surface

de la gélose Baird Parker en vue d’obtenir des colonies isolées.

Retourner la boîte de Petri et incuber à 32,5 °C ± 2,5 °C, pendant au moins 24 h (48 h au maximum).

Vérifier la présence de colonies caractéristiques (voir Tableau 1).
Tableau 1 — Caractéristiques morphologiques de Staphylococ
...