ISO 21149:2017
(Main)Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria
Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria
ISO 21149:2017 gives general guidelines for enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria present in cosmetics - by counting the colonies on agar medium after aerobic incubation, or - by checking the absence of bacterial growth after enrichment. Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method may not be appropriate for some products in every detail (e.g. certain water immiscible products). Other methods (e.g. automated) may be substituted for the tests presented here provided that their equivalence has been demonstrated or the method has been otherwise shown to be suitable. If needed, microorganisms enumerated or detected may be identified using suitable identification tests described in the standards given in the Bibliography. In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic products to which this document is applicable. Products considered to present a low microbiological risk (see ISO 29621) include those with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc.
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles
ISO 21149:2017 donne des lignes directrices générales pour le dénombrement et la détection des bactéries aérobies mésophiles présentes dans les cosmétiques - par dénombrement des colonies en milieu gélosé après une incubation aérobie, ou - en vérifiant l'absence de croissance bactérienne après enrichissement. En raison de la grande variété de produits cosmétiques entrant dans ce domaine d'application, la présente méthode peut ne pas être, en tout point, applicable à certains produits (par exemple à certains produits non miscibles dans l'eau). Il est possible de remplacer les essais présentés ici par d'autres méthodes (automatisées, par exemple), sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été validée par ailleurs. Au besoin, les micro-organismes dénombrés ou détectés peuvent être identifiés à l'aide d'essais d'identification appropriés, décrits dans les normes indiquées en Bibliographie. Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d'effectuer une analyse de risque microbiologique appropriée, afin de déterminer les types de produits cosmétiques qui relèvent du présent document. Les produits considérés comme présentant un faible risque microbiologique comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydro-alcooliques, les produits ayant des valeurs de pH extrêmes, etc.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21149
Second edition
2017-06
Cosmetics — Microbiology —
Enumeration and detection of aerobic
mesophilic bacteria
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection des
bactéries aérobies mésophiles
Reference number
ISO 21149:2017(E)
ISO 2017
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ISO 21149:2017(E)
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ii © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 21149:2017(E)
Contents Page
Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v
1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1
2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1
3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1
4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2
4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2
4.2 Plate count .................................................................................................................................................................................................. 2
4.3 Membrane filtration ........................................................................................................................................................................... 2
4.4 Detection of bacteria by enrichment .................................................................................................................................... 3
5 Diluents, neutralizers and culture media ................................................................................................................................... 3
5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 3
5.2 Neutralizing diluents and diluents ........................................................................................................................................ 3
5.3 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution) ....................................... 4
5.4 Culture media ........................................................................................................................................................................................... 4
6 Apparatus and glassware ............................................................................................................................................................................ 7
7 Strains of microorganisms ......................................................................................................................................................................... 7
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples ............................................................................................ 7
9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 7
9.1 General recommendation .............................................................................................................................................................. 7
9.2 Preparation of the initial suspension .................................................................................................................................. 7
9.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 7
9.2.2 Water-miscible products........................................................................................................................................... 8
9.2.3 Water-immiscible products .................................................................................................................................... 8
9.3 Counting methods ................................................................................................................................................................................ 8
9.3.1 Dilutions for counting methods .......................................................................................................................... 8
9.3.2 Plate-count methods .................................................................................................................................................... 8
9.4 Enrichment ................................................................................................................................................................................................. 9
9.4.1 General...................................................................................................................................................................................... 9
9.4.2 Incubation of the sample .......................................................................................................................................... 9
10 Counting of colonies (plate counts and membrane filtration methods) ....................................................9
11 Detection of growth (enrichment method) ............................................................................................................................... 9
12 Expression of results .....................................................................................................................................................................................10
12.1 Method of calculation for plate count ..............................................................................................................................10
12.2 Interpretation .......................................................................................................................................................................................11
12.3 Examples ...................................................................................................................................................................................................11
12.4 Detection after enrichment .......................................................................................................................................................13
13 Neutralization of the antimicrobial properties of the product .........................................................................13
13.1 General ........................................................................................................................................................................................................13
13.2 Preparation of inoculum ..............................................................................................................................................................14
13.3 Suitability of counting methods ............................................................................................................................................14
13.3.1 Principle ...............................................................................................................................................................................14
13.3.2 Suitability test of the pour-plate method ................................................................................................14
13.3.3 Suitability of the surface spread method .................................................................................................14
13.3.4 Suitability of the membrane filtration method ...................................................................................14
13.4 Suitability of the detection method by enrichment .............................................................................................15
13.4.1 Procedure ............................................................................................................................................................................15
13.4.2 Interpretation of results .........................................................................................................................................15
13.5 Interpretation of suitability test results .........................................................................................................................15
14 Test report ................................................................................................................................................................................................................16
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ISO 21149:2017(E)
Annex A (informative) Other neutralizing diluents ...........................................................................................................................17
Annex B (informative) Other diluents ..............................................................................................................................................................19
Annex C (informative) Other culture media ...............................................................................................................................................20
Annex D (informative) Neutralizers of antimicrobial activity of preservatives and
rinsing liquids ......................................................................................................................................................................................................23
Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................24
iv © ISO 2017 – All rights reserved---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 21149:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 21149:2006), of which it constitutes a
minor revision with the following changes:— in the Scope, “validated” has been changed to “shown to be suitable”;
— in the Scope, “see ISO 29621” has been added and the reference has been added to the Bibliography;
— in 4.1, “validated” has been changed to “demonstrated”;— in 4.3, “validated” has been changed to “described”;
— in 5.1, “specifications” has been changed to “instructions”;
— in 9.3.2.1, 9.3.2.2 and 9.3.2.3, “validated” has been changed to “described”;
— in 9.3.2.3, “procedure developed during the validation” has been changed to “suitability test
procedure”;— in 9.4.1, “validation” has been changed to “suitability test”;
— in 12.2.1, “validated according to the chosen method” has been changed to “demonstrated to be
suitable for the chosen method”;— in 13.3 and 13.4, “validation” has been changed to “suitability”;
— in 13.3.2, 13.3.3 and 13.3.4, “validation” has been changed to “suitability”;
— in 13.3.2, 13.3.3 and 13.3.4, “if the validation count is at least 50 % (0,3 log) of the control count” has
been changed to “if the count is at least 50 % of the control”;— in 13.4.1, instances of “validation test” have been changed to “suitability test”;
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ISO 21149:2017(E)
— in 13.4.2, instances of “validation plate” have been changed to “suitability test plate”;
— in 13.5, “validation results” has been changed to “suitability test results” and “validation plates” has
been changed to “suitability test plates”;— in Clause 14 f), “validation of the method” has been changed to “demonstration of the suitability”;
— in A.1, B.1 and C.1, “validated” has been changed to “demonstrated to be suitable”.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21149:2017(E)
Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection
of aerobic mesophilic bacteria
1 Scope
This document gives general guidelines for enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria
present in cosmetics— by counting the colonies on agar medium after aerobic incubation, or
— by checking the absence of bacterial growth after enrichment.
Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method may not be
appropriate for some products in every detail (e.g. certain water immiscible products). Other methods
(e.g. automated) may be substituted for the tests presented here provided that their equivalence has
been demonstrated or the method has been otherwise shown to be suitable.If needed, microorganisms enumerated or detected may be identified using suitable identification tests
described in the standards given in the Bibliography.In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate
microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic products to which this document is
applicable. Products considered to present a low microbiological risk (see ISO 29621) include those
with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc.2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 21148:2017, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination
EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of test organisms used for the
determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal
(including bacteriophages) activity3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
aerobic mesophilic bacterium
mesophilic bacterium growing aerobically under the conditions specified in this document
Note 1 to entry: In the described conditions, other types of microorganisms (e.g. yeast, mould) can be detected.
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ISO 21149:2017(E)
3.2
product
portion of an identified cosmetic product received in the laboratory for testing
3.3
sample
portion of the product (3.2) (at least 1 g or 1 ml) which is used in the test to prepare the initial
suspension (3.4)3.4
initial suspension
suspension (or solution) of a sample (3.3) in a defined volume of an appropriate liquid (diluent,
neutralizer, broth or combination of them)3.5
sample dilution
dilution of the initial suspension (3.4)
4 Principle
4.1 General
This method involves enumeration of colonies on a non-selective agar medium or by the presence or
absence of bacterial growth after enrichment. The possible inhibition of microbial growth by the sample
[7]shall be neutralized to allow the detection of viable microorganisms . In all cases and whatever the
methodology, the neutralization of the antimicrobial properties of the product shall be checked and
[8][9][10]demonstrated (see Clause 13) .
4.2 Plate count
Plate count consists of the following steps.
a) Preparation of poured plates or spread plates, using a specified culture medium, and inoculation of
the plates using a defined quantity of the initial suspension or dilution of the product.
b) Aerobic incubation of the plates at 32,5 °C ± 2,5 °C for 72 h ± 6 h.c) Counting the number of colony forming units (CFU) and calculation of the number of aerobic
mesophilic bacteria per millilitre or per gram of product.4.3 Membrane filtration
Membrane filtration consists of the following steps.
a) Transfer a suitable amount of the sample prepared as described in Clause 13 in the filtration
apparatus wetted with a small volume of an appropriate sterile diluent, filter immediately and
wash according to the described procedure (see 13.3.4). Transfer the membrane filter onto the
surface of the specified agar medium as specified in ISO 21148.b) Aerobic incubation of the membranes at 32,5 °C ± 2,5 °C for 72 h ± 6 h.
c) Counting the number of colony forming units (CFU) and calculation of the number of aerobic
mesophilic bacteria per millilitre or per gram of product.2 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 21149:2017(E)
4.4 Detection of bacteria by enrichment
Detection of bacteria by enrichment consists of the following steps.
a) Incubation at 32,5 °C ± 2,5 °C for at least 20 h of a defined quantity of the initial suspension in a
non-selective liquid medium containing suitable neutralizers and/or dispersing agents.
b) Transfer of a defined quantity of the previous suspension on non-selective solid agar medium.
c) Aerobic incubation at 32,5 °C ± 2,5 °C for 48 h to 72 h.d) Detection of growth and expression of results as “presence/absence” of aerobic mesophilic bacteria
per sample S of product.5 Diluents, neutralizers and culture media
5.1 General
General instructions are given in ISO 21148. When water is mentioned in a document, use distilled
water or purified water as specified in ISO 21148.The following diluents, neutralizers and culture media are suitable for enumeration and detection of
aerobic mesophilic bacteria. Other diluents, neutralizers and culture media may be used if they have
been demonstrated to be suitable for use.5.2 Neutralizing diluents and diluents
5.2.1 General
The diluent is used to disperse the sample. It may contain neutralizers if the specimen to be tested
has antimicrobial properties. The efficacy of the neutralization shall be demonstrated before the
determination of the count (see Clause 13). Information relative to suitable neutralizers is given in
Annex D.5.2.2 Neutralizing diluents
5.2.2.1 Fluid casein digest–soy lecithin–polysorbate 20 medium (SCDLP 20 broth)
5.2.2.1.1 Composition
Pancreatic digest of casein 20,0 g
Soy lecithin 5,0 g
Polysorbate 20 40,0 ml
Water 960,0 ml
5.2.2.1.2 Preparation
Dissolve the polysorbate 20 in 960 ml of water by mixing while heating in a water bath at 49 °C ± 2 °C.
Add pancreatic digest of casein and soy lecithin. Heat for about 30 min to obtain solution. Mix and
dispense the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After
sterilization, the pH shall be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room temperature.
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ISO 21149:2017(E)
5.2.2.2 Other neutralizing diluents
Other neutralizing diluents may be used as appropriate (see Annex A and Annex D).
5.2.3 Diluent5.2.3.1 Fluid A
5.2.3.1.1 Composition
Peptic digest of animal tissue 1,0 g
Water 1 000 ml
5.2.3.1.2 Preparation
Dissolve 1 g of peptone in water to make 1 l. Heat with frequent agitation. Dispense into suitable
containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent
to 7,1 ± 0,2 when measured at room temperature.5.2.3.2 Other diluents
Other diluents may be used as appropriate (see Annex B).
5.3 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution)
5.3.1 Composition
Tryptone, pancreatic digest of casein 1,0 g
Sodium chloride 8,5 g
Water 1 000 ml
5.3.2 Preparation
Dissolve the components in the water by mixing while heating. Dispense into suitable containers.
Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2
when measured at room temperature.5.4 Culture media
5.4.1 General
Culture media may be prepared as follows or from dehydrated culture media according to the
instructions of the manufacturer. Ready-to-use media may be used when their composition and/or
growth yields are comparable to those of the formulas given herein.4 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 21149:2017(E)
5.4.2 Culture media for counting
5.4.2.1 Soybean–casein digest agar medium (SCDA) or tryptic soy agar (TSA)
5.4.2.1.1 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.4.2.1.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating.
Dispense the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After
sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room
temperature.5.4.2.2 Other media for counting
Other media may be used as appropriate (see Annex C).
5.4.3 Culture media for detection
5.4.3.1 General
When chosen, an enrichment broth and an agar medium shall be used for bacterial detection.
The enrichment broth is used to disperse the sample and to increase the initial microbial population. It
may contain neutralizers if the specimen to be tested has antimicrobial properties.
5.4.3.2 Enrichment broth: Eugon LT 100 broth5.4.3.2.1 General
This medium contains ingredients
— which neutralize inhibitory substances present in the sample: lecithin and polysorbate 80, and
— dispersing agent: octoxynol 9.5.4.3.2.2 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
L-cystine 0,7 g
Sodium chloride 4,0 g
Sodium sulfite 0,2 g
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ISO 21149:2017(E)
Glucose 5,5 g
Egg lecithin 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
Water 1 000 ml
5.4.3.2.3 Preparation
Dissolve successively polysorbate 80, octoxynol 9 and egg lecithin into boiling water until their
complete dissolution. Dissolve the other components by mixing while heating. Dispense the medium
into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall
be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at room temperature.5.4.3.3 Agar media for detection
5.4.3.3.1 Eugon LT 100 agar medium
5.4.3.3.1.1 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
L-cystine 0,7 g
Sodium chloride 4,0 g
Sodium sulfite 0,2 g
Glucose 5,5 g
Egg lecithin 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.4.3.3.1.2 Preparation
Dissolve successively polysorbate 80, octoxynol 9 and egg lecithin into boiling water until their complete
dissolution. Dissolve the other components by mixing while heating. Mix gently to avoid foam. Dispense
the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization
and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.4.3.3.2 Other agar media for detectionOther media may be used as appropriate (see Annex C).
5.4.4 Agar medium for cultivation of reference strains
Use soybean-casein digest agar medium (SCDA) or tryptic soy agar (TSA) (5.4.2.1).
6 © ISO 2017 – All rights reserved---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 21149:2017(E)
6 Apparatus and glassware
The laboratory equipment, apparatus and glassware are described in ISO 21148.
7 Strains of microorganisms
For testing the efficacy of neutralizers, two strains representative of both Gram negative and Gram
[8][11]positive microorganisms , respectively, are used:
1) 2) 3) 4)
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (equivalent strain: CIP 82.118 or NCIMB 8626 or NBRC
13275 or KCTC 2513 or other equivalent national collection strain);— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (equivalent strain: CIP 4.83 or NCIMB 9518 or NBRC 13276 or
KCTC 1916 or other equivalent national collection strain).An alternative to the Gram negative strain may be Escherichia coli ATCC 8739 (equivalent strain: CIP
53.126 or NCIMB 8545 or NBRC 3972 or KCTC 2571 or other equivalent national collection strain).
The culture should be reconstituted according to the procedures provided by the supplier of
reference strain.The strains may be kept in the laboratory according to EN 12353.
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples
If necessary, store products to be tested at room temperature. Do not incubate, refrigerate or freeze
products (3.2) and samples (3.3) before or after analysis.Sampling of cosmetic products to be analysed should be carried out, as described in ISO 21148. Analyse
samples as specified in ISO 21148 and according to the procedure described in Clause 9.
9 Procedure9.1 General recommendation
Use sterile material, equipment and aseptic techniques to prepare the sample, initial suspension and
dilutions. In the case of the preparation of an initial suspension, the time which elapses between the
end of the preparation and the moment the inoculum comes into contact with the culture medium shall
not exceed 45 min, unless specifically mentioned in the established protocols or documents.
9.2 Preparation of the initial suspension9.2.1 General
The initial suspension is prepared from a sample of at least 1 g or 1 ml of the well-mixed product
under test.Note S, the exact mass or volume of the sample.
1) ATCC = American Type Culture Collection.
2) CIP = The Collection of Institut Pasteur.
3) NCIMB = National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria.
4) NBRC = Biological Resource Center, NITE.
5) KCTC = Korean Collection for Type Cultures.
© ISO 2017 – All rights reserved 7
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ISO 21149:2017(E)
The initial suspension is usually 1:10 dilution. Larger volumes of diluent or enrichment broth may be
required if high levels of contamination are expected and/or if antimicrobial properties are still present
in 1:10 dilution.9.2.2 Water-miscible products
Transfer the sample S of product to an appropriate volume (e.g. 9 ml) of neutralizing diluent (5.2.2) or
diluent (5.2.3) or enrichment broth (5.4.3.2), depending on the method used (see 9.3 or 9.4).
Note the dilution factor d.9.2.3 Water-immiscible products
Transfer the sample
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21149
Deuxième édition
2017-06
Cosmétiques — Microbiologie —
Dénombrement et détection des
bactéries aérobies mésophiles
Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic
mesophilic bacteria
Numéro de référence
ISO 21149:2017(F)
ISO 2017
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ISO 21149:2017(F)
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© ISO 2017, Publié en Suisse
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ISO 21149:2017(F)
Sommaire Page
Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v
1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1
2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1
3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1
4 Principes ....................................................................................................................................................................................................................... 2
4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2
4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de Petri .............................................................................................................. 2
4.3 Filtration sur membrane ................................................................................................................................................................ 2
4.4 Détection des bactéries par enrichissement ................................................................................................................. 3
5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture ...................................................................................................... 3
5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 3
5.2 Diluants neutralisants et diluants .......................................................................................................................................... 3
5.3 Diluant pour la suspension bactérienne (solution tryptone sel) ................................................................ 4
5.4 Milieux de culture ................................................................................................................................................................................. 4
6 Matériel et verrerie............................................................................................................................................................................................ 7
7 Souches de micro-organismes ................................................................................................................................................................ 7
8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire ........................................7
9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 7
9.1 Recommandations générales...................................................................................................................................................... 7
9.2 Préparation de la suspension initiale .................................................................................................................................. 8
9.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 8
9.2.2 Produits miscibles dans l’eau................................................................................................................................ 8
9.2.3 Produits non miscibles dans l’eau .................................................................................................................... 8
9.3 Méthodes de dénombrement ..................................................................................................................................................... 8
9.3.1 Dilutions pour les méthodes de dénombrement ................................................................................. 8
9.3.2 Méthodes de dénombrement sur gélose en boîtes de Petri ....................................................... 8
9.4 Enrichissement ....................................................................................................................................................................................... 9
9.4.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 9
9.4.2 Incubation de l’échantillon ..................................................................................................................................... 9
10 Dénombrement des colonies (méthodes de dénombrement sur gélose en boîtes dePetri et par filtration sur membrane) .........................................................................................................................................10
11 Détection de croissance (méthode par enrichissement) ........................................................................................10
12 Expression des résultats............................................................................................................................................................................10
12.1 Méthode de calcul pour le dénombrement sur gélose en boîtes de Petri .........................................10
12.2 Interprétation .......................................................................................................................................................................................11
12.3 Exemples ...................................................................................................................................................................................................12
12.4 Détection après enrichissement ...........................................................................................................................................14
13 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit .............................................................................14
13.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................14
13.2 Préparation de l’inoculum ..........................................................................................................................................................14
13.3 Applicabilité des méthodes de dénombrement .......................................................................................................14
13.3.1 Principes ..............................................................................................................................................................................14
13.3.2 Essai d’applicabilité de la méthode par ensemencement en profondeur ....................14
13.3.3 Applicabilité de la méthode par étalement en surface.................................................................15
13.3.4 Applicabilité de la méthode par filtration sur membrane ........................................................15
13.4 Applicabilité de la méthode de détection par enrichissement ...................................................................15
13.4.1 Mode opératoire ............................................................................................................................................................15
13.4.2 Interprétation des résultats ................................................................................................................................16
13.5 Interprétation des résultats d’essai d’applicabilité ..............................................................................................16
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ISO 21149:2017(F)
14 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................16
Annexe A (informative) Autres diluants neutralisants ...................................................................................................................17
Annexe B (informative) Autres diluants ........................................................................................................................................................19
Annexe C (informative) Autres milieux de culture ..............................................................................................................................20
Annexe D (informative) Neutralisants de l’activité antimicrobienne des conservateurs et
des liquides de rinçage ...............................................................................................................................................................................23
Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................24
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 21149:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 21149:2006), qui a fait l’objet d’une
révision mineure comprenant les modifications suivantes:— en le domaine d’application, «validée» a été remplacé par «indiquée comme adéquate»;
— en le domaine d’application, «voir ISO 29621» a été ajouté et le référence a été ajouté au Bibliographie;
— en 4.1, «validée» a été remplacé par «démontrée»;— en 4.3, «validée» a été remplacé par «décrit»;
— en 5.1, «spécifications» a été remplacé par «instructions»;
— en 9.3.2.1, 9.3.2.2 et 9.3.2.3, « validé » a été remplacé par «décrit»;
— en 9.3.2.3, «le mode opératoire mis au point au cours de la validation» a été remplacé par «le mode
opératoire d’essai d’applicabilité»;— en 9.4.1, « validation » a été remplacé par «essai d’applicabilité»;
— en 12.2.1, «validées selon la méthode sélectionnée» a été remplacé par «démontrées comme étant
applicables pour la méthode sélectionnée»;— en 13.3 et 13.4, «validation» a été remplacé par «applicabilité»;
— en 13.3.2, 13.3.3 et 13.3.4, «validation» a été remplacé par «applicabilité»;
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ISO 21149:2017(F)
— en 13.3.2, 13.3.3 et 13.3.4, «si le dénombrement de validation est au moins égal à 50 % (0,3 log) du
dénombrement du témoin» a été remplacé par «si le dénombrement est au moins égal à 50 % du
témoin»;— en 13.4.1, les occurrences de «essai de validation» ont été remplacées par «essai d’applicabilité»;
— en 13.4.2, les occurrences de «gélose de validation» ont été remplacées par «gélose d’essai
d’applicabilité»;— en 13.5, «résultats de validation» a été remplacé par «résultats d’essai d’applicabilité» et «géloses de
validation» a été remplacé par «géloses d’essai d’applicabilité»;— dans l’Article 14 f), «validation de la méthode» a été remplacé par «démonstration de l’applicabilité»;
— en A.1, B.1 et C.1, «validé» a été remplacé par «démontré comme étant applicable».
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NORME INTERNATIONALE ISO 21149:2017(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et
détection des bactéries aérobies mésophiles
1 Domaine d’application
Le présent document donne des lignes directrices générales pour le dénombrement et la détection des
bactéries aérobies mésophiles présentes dans les cosmétiques— par dénombrement des colonies en milieu gélosé après une incubation aérobie, ou
— en vérifiant l’absence de croissance bactérienne après enrichissement.En raison de la grande variété de produits cosmétiques entrant dans ce domaine d’application, la
présente méthode peut ne pas être, en tout point, applicable à certains produits (par exemple à certains
produits non miscibles dans l’eau). Il est possible de remplacer les essais présentés ici par d’autres
méthodes (automatisées, par exemple), sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la
méthode ait été indiquée par ailleurs comme adéquate.Au besoin, les micro-organismes dénombrés ou détectés peuvent être identifiés à l’aide d’essais
d’identification appropriés, décrits dans les normes indiquées en Bibliographie.Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d’effectuer une
analyse de risque microbiologique appropriée, afin de déterminer les types de produits cosmétiques
qui relèvent du présent document. Les produits considérés comme présentant un faible risque
microbiologique (voir ISO 29621) comprennent ceux ayant une faible activité de l’eau, les produits
hydro-alcooliques, les produits ayant des valeurs de pH extrêmes, etc.2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).ISO 21148:2017, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des microorganismes d’essai utilisés
pour la détermination de l’activité bactéricide (Legionella incluses), mycobactéricide, sporicide, fongicide et
virucide (bactériophages inclus)3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp
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ISO 21149:2017(F)
3.1
bactéries aérobies mésophiles
bactéries mésophiles se développant en aérobie dans les conditions spécifiées dans le présent document
Note 1 à l’article: D’autres types de micro-organismes (par exemple des levures et des moisissures) peuvent
également être détectés dans les conditions décrites.3.2
produit
portion d’un produit cosmétique identifié reçue au laboratoire pour essais
3.3
échantillon
portion du produit (3.2) (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée dans l’essai pour préparer la suspension initiale (3.4)
3.4suspension initiale
suspension (ou solution) d’un échantillon (3.3) dans un volume défini d’un liquide approprié (diluant,
agent neutralisant, bouillon ou combinaison de ceux-ci)3.5
dilution de l’échantillon
dilution de la suspension initiale (3.4)
4 Principes
4.1 Généralités
Cette méthode est fondée sur le dénombrement de colonies sur un milieu gélosé non sélectif ou sur
la présence ou l’absence de croissance bactérienne après enrichissement. L’inhibition potentielle de la
croissance microbienne par l’échantillon doit être neutralisée pour permettre la détection de micro-
[7]organismes viables . Dans tous les cas et quelle que soit la méthode utilisée, la neutralisation des
[8][9][10]propriétés antimicrobiennes du produit doit être vérifiée et démontrée (voir Article 13) .
4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de PetriLe dénombrement sur gélose en boîtes de Petri comprend les étapes suivantes:
a) préparation des boîtes de géloses pour ensemencement en profondeur ou pour étalement en
surface, au moyen d’un milieu de culture défini, et ensemencement des boîtes de gélose avec une
quantité définie de la suspension initiale ou d’une dilution du produit;b) incubation aérobie des géloses à 32,5 °C ± 2,5 °C pendant 72 h ± 6 h;
c) dénombrement du nombre d’unités formant colonies (UFC) et calcul du nombre de bactéries
aérobies mésophiles par millilitre ou par gramme de produit.4.3 Filtration sur membrane
La filtration sur membrane comprend les étapes suivantes:
a) transfert d’une quantité adaptée d’échantillon préparé tel que décrit dans l’Article 13 dans l’appareil
de filtration humidifié à l’aide d’un faible volume de diluant approprié stérile, filtration immédiate
et lavage selon un mode opératoire décrit (voir 13.3.4). Transfert de la membrane de filtration à la
surface du milieu gélosé spécifié, comme indiqué dans l’ISO 21148;b) incubation aérobie des membranes à 32,5 °C ± 2,5 °C pendant 72 h ± 6 h;
c) dénombrement du nombre d’unités formant colonies (UFC) et calcul du nombre de bactéries
aérobies mésophiles par millilitre ou par gramme de produit.2 © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 21149:2017(F)
4.4 Détection des bactéries par enrichissement
La détection des bactéries par enrichissement comprend les étapes suivantes:
a) incubation à 32,5 °C ± 2,5 °C, pendant au moins 20 h, d’une quantité définie de la suspension
initiale dans un milieu liquide non sélectif contenant des agents neutralisants et/ou des agents de
dispersion appropriés;b) transfert d’une quantité définie de la suspension précédente sur un milieu gélosé solide non sélectif;
c) incubation aérobie à 32,5 °C ± 2,5 °C pendant 48 h à 72 h;d) détection de la croissance et expression des résultats sous la forme de « présence/absence » de
bactéries aérobies mésophiles par échantillon S du produit.5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture
5.1 Généralités
Les instructions générales sont indiquées dans l’ISO 21148. Lorsque de l’eau est mentionnée dans ce
document, utiliser de l’eau distillée ou purifiée tel qu’indiqué dans l’ISO 21148.
Les diluants, agents neutralisants et milieux de culture suivants conviennent pour le dénombrement
et la détection de bactéries aérobies mésophiles. D’autres diluants, agents neutralisants et milieux de
culture peuvent être utilisés s’il a été démontré qu’ils sont applicables pour cet emploi.
5.2 Diluants neutralisants et diluants5.2.1 Généralités
Le diluant est utilisé pour disperser l’échantillon. Il peut contenir des agents neutralisants si l’échantillon
à soumettre à essai possède des propriétés antimicrobiennes. L’efficacité de la neutralisation doit être
démontrée avant la détermination de la concentration microbienne (voir Article 13). Des informations
relatives à des agents neutralisants appropriés sont fournies dans l’Annexe D.5.2.2 Diluants neutralisants
5.2.2.1 Milieu liquide aux hydrolysats de caséine-lécithine de soja-polysorbate 20 (bouillon
SCDLP 20)5.2.2.1.1 Composition
Hydrolysat pancréatique de caséine 20,0 g
Lécithine de soja 5,0 g
Polysorbate 20 40,0 ml
Eau 960,0 ml
5.2.2.1.2 Préparation
Dissoudre le polysorbate 20 dans 960 ml d’eau en mélangeant pendant le chauffage au bain-marie
à 49 °C ± 2 °C. Ajouter l‘hydrolysat pancréatique de caséine et la lécithine de soja. Chauffer pendant
environ 30 min afin d’obtenir une solution. Mélanger et répartir le milieu dans des récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le
mesurage étant effectué à température ambiante.© ISO 2017 – Tous droits réservés 3
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ISO 21149:2017(F)
5.2.2.2 Autres diluants neutralisants
D’autres diluants neutralisants peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe A et Annexe D).
5.2.3 Diluant5.2.3.1 Liquide A
5.2.3.1.1 Composition
Hydrolysat pepsique de tissus animaux 1,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.1.2 Préparation
Dissoudre 1 g d’hydrolysat dans l’eau pour obtenir 1 l. Chauffer en agitant fréquemment. Répartir dans
des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH
doit être de 7,1 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.5.2.3.2 Autres diluants
D’autres diluants peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe B).
5.3 Diluant pour la suspension bactérienne (solution tryptone sel)
5.3.1 Composition
Tryptone, hydrolysat pancréatique de caséine 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
5.3.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients
appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de
7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.5.4 Milieux de culture
5.4.1 Généralités
Les milieux de culture peuvent être préparés comme suit ou à partir de milieux de culture déshydratés
en respectant les instructions du fabricant. Des milieux prêts à l’emploi peuvent être utilisés si leur
composition et/ou leur rendement de croissance sont comparables à ceux des formulations indiquées
ci-après.4 © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 21149:2017(F)
5.4.2 Milieux de culture pour le dénombrement
5.4.2.1 Milieu gélosé aux hydrolysats de caséine et de soja (SCDA) ou gélose tryptocaséine de
soja (TSA)5.4.2.1.1 Composition
Hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g
Hydrolysat papaïque de soja 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.4.2.1.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau en mélangeant tout en chauffant.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après
stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température
ambiante.5.4.2.2 Autres milieux pour le dénombrement
D’autres milieux peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe C).
5.4.3 Milieux de culture pour la détection
5.4.3.1 Généralités
Un bouillon d’enrichissement et un milieu gélosé doivent être utilisés pour la détection de bactéries,
lorsque cette méthode est sélectionnée.Le bouillon d’enrichissement sert à disperser l’échantillon et à accroître la population microbienne
initiale. Il peut contenir des agents neutralisants si l’échantillon à soumettre à essai possède des
propriétés antimicrobiennes.5.4.3.2 Bouillon d’enrichissement: bouillon Eugon LT 100
5.4.3.2.1 Généralités
Ce milieu contient:
— des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans l’échantillon: lécithine et
polysorbate 80, et— un agent dispersant: l’octoxynol 9.
5.4.3.2.2 Composition
Hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g
Hydrolysat papaïque de soja 5,0 g
L-cystine 0,7 g
© ISO 2017 – Tous droits réservés 5
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ISO 21149:2017(F)
Chlorure de sodium 4,0 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’œuf 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
Eau 1 000 ml
5.4.3.2.3 Préparation
Dissoudre successivement dans l’eau bouillante le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf
jusqu’à dissolution complète. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après
la stérilisation, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
5.4.3.3 Milieux gélosés pour la détection par enrichissement5.4.3.3.1 Milieu gélosé Eugon LT 100
5.4.3.3.1.1 Composition
Hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g
Hydrolysat papaïque de soja 5,0 g
L-cystine 0,7 g
Chlorure de sodium 4,0 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’œuf 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.4.3.3.1.2 Préparation
Dissoudre successivement dans l’eau bouillante le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf
jusqu’à dissolution complète. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant.
Mélanger doucement pour éviter toute formation de mousse. Répartir le milieu dans des récipients
appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation et refroidissement, le pH
doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.6 © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 21149:2017(F)
5.4.3.3.2 Autres milieux gélosés pour la détection par enrichissement
D’autres milieux peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe C).
5.4.4 Milieu gélosé pour la culture de souches de référence
Utiliser le milieu gélosé aux hydrolysats de caséine et de soja (SCDA) ou la gélose tryptocaséine de soja
(TSA) (5.4.2.1).6 Matériel et verrerie
Les équipements, le matériel et la verrerie de laboratoire sont décrits dans l’ISO 21148.
7 Souches de micro-organismesAfin de vérifier l’efficacité des agents neutralisants, deux souches représentatives aussi bien des micro-
[8][11]organismes à Gram négatif qu’à Gram positif , respectivement, sont utilisées:
1) 2) 3)
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (souche équivalente: CIP 82.118 ou NCIMB 8626 ou
4) 5)NBRC 13275 ou KCTC 2513, ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (souche équivalente: CIP 4.83 ou NCIMB 9518 ou NBRC 13276 ou
KCTC 1916, ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale).Une alternative à la souche à Gram négatif peut être Escherichia coli ATCC 8739 (souche équivalente:
CIP 53.126 ou NCIMB 8545 ou NBRC 3972 ou KCTC 2571, ou toute autre souche équivalente issue d’une
collection nationale).Il convient de reconstituer la culture conformément aux méthodes indiquées par le fournisseur de la
souche de référence....
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.