ISO 16578:2022
(Main)Molecular biomarker analysis — Requirements for microarray detection of specific nucleic acid sequences
Molecular biomarker analysis — Requirements for microarray detection of specific nucleic acid sequences
This document specifies verification and validation parameters and processes for microarray detection and identification of specific nucleic acid sequences. This document provides recommendations and protocols for: — microarray design and manufacture; — validation of hybridization specificity; — interlaboratory validation of qualitative methods; — determination of limits of detection for a microarray; — determination of range of reliable signals; — criteria for assessing technical performance of the microarray platform: This document is applicable to all methods that use microarrays for detection of nucleic acids. It does not apply to the following protocols: — quantitative measurement; — requirements for sample preparation prior to DNA microarray experiments.
Analyse moléculaire des biomarqueurs — Exigences relatives à la détection sur microréseaux de séquences d'acides nucléiques spécifiques
Le présent document spécifie les paramètres et procédés de vérification et de validation pour la détection et l’identification de séquences d’acides nucléiques spécifiques à l’aide de microréseaux. Il fournit des recommandations et des protocoles pour: — la conception et la fabrication d’un microréseau; — la validation de la spécificité d’hybridation; — la validation interlaboratoires des méthodes qualitatives; — la détermination des limites de détection pour un microréseau; — la détermination d’une plage de signaux fiables; — les critères d’évaluation des performances techniques du support de microréseau. Il est applicable à toutes les méthodes qui utilisent des microréseaux pour la détection d’acides nucléiques. Il ne s’applique pas aux protocoles suivants: — le mesurage quantitatif; — les exigences relatives à la préparation de l’échantillon avant les expériences sur microréseaux d’ADN.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16578
Second edition
2022-09
Molecular biomarker analysis —
Requirements for microarray
detection of specific nucleic acid
sequences
Analyse moléculaire des biomarqueurs — Exigences relatives à
la détection sur microréseaux de séquences d'acides nucléiques
spécifiques
Reference number
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ISO 16578:2022(E)
Contents Page
Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv
Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v
1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1
2 Normative references ..................................................................................................................................................................................... 1
3 Terms and definitions .................................................................................................................................................................................... 1
4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 3
4.1 DNA microarray platform assay ............................................................................................................................................. 3
4.2 Microarray design and manufacture .................................................................................................................................. 3
4.2.1 General ........................................................................................................................................................................................ 3
4.2.2 Control probe sequences and targeted probes........................................................................................ 3
4.2.3 Analytical power of microarray assay ............................................................................................................ 4
4.3 Validation of hybridization specificity .............................................................................................................................. 4
4.3.1 Theoretical assessment of specificity ............................................................................................................. 4
4.3.2 Experimental assessment of specificity ........................................................................................................ 4
4.3.3 Experimental assessment of cross-hybridization ................................................................................ 4
4.4 Interlaboratory validation of qualitative methods ................................................................................................ 5
4.4.1 General ........................................................................................................................................................................................ 5
4.4.2 Detection limit ...................................................................................................................................................................... 5
4.4.3 Probability of detection ............................................................................................................................................... 6
4.4.4 Limit of detection for microarray platform .............................................................................................. 6
4.4.5 Range of reliable signal ................................................................................................................................................ 6
4.4.6 Test sample .............................................................................................................................................................................. 6
4.4.7 Measuring system ............................................................................................................................................................. 6
4.4.8 Estimation of measurement uncertainty ..................................................................................................... 7
4.4.9 Microarray reagents ....................................................................................................................................................... 7
5 Expression of results ....................................................................................................................................................................................... 7
5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7
5.2 Expression of a negative result ................................................................................................................................................ 7
5.3 Expression of a positive result ................................................................................................................................................. 7
5.4 Expression of inconclusive or ambiguous results ................................................................................................... 8
6 Test report .................................................................................................................................................................................................................. 8
Annex A (informative) Practical determination of limit of detection for microarray
platform (LODP) ...................................................................................................................................................................................................9
Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................13
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ISO 16578:2022(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34 Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis.This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 16578:2013), which has been technically
revised.The main changes are as follows:
— Annex A has been added to provide the practical determination of limit of detection for microarray
platform (LODP).Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.© ISO 2022 – All rights reserved
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ISO 16578:2022(E)
Introduction
Available methods for nucleic acid sequence discovery using nucleic acid containing samples are based
on three technologies: the polymerase chain reaction (PCR), deoxyribonucleic acid (DNA) sequencing
[1]and oligonucleotide microarrays.
DNA microarrays are used in biomarker identification and the measurement of gene expression.
International harmonization efforts of experimental methods for microarray experiments began
with the “Minimum Information about a Microarray Experiment (MIAME)—toward standards for
[2]microarray data” and the US Food and Drug Administration’s critical path project the Microarray
[3][4]Quality Control project (MAQC), which began in 2005 and focused on technical aspects of gene
expression measurements, robust technology platforms and the development of accurate and
reproducible multivariate gene expression-based prediction models.DNA microarrays are made either by chemically synthesizing DNA probes on a solid surface or by
attaching pre-made DNA probes to a solid surface, e.g. a microplate or coated bead. Microarray assays
can be designed to detect multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) simultaneously. High
density oligonucleotide microarrays synthesized in situ using techniques such as photolithography,
ink-jet deposition and robotic arraying of PCR products and pre-synthesized oligonucleotides are
[5]manufactured for detecting specific sequences over a wide range of variability. This technology
continues to develop along with PCR and next generation sequencing (NGS).DNA microarrays are typically used to probe a solution of mixed labelled nucleic acids: hybridization of
the labelled targets to the fixed probes on the array is detected, and their relative concentration to the
remaining nucleic acid species in solution is measured. By generalizing to a very large number of spots
of DNA, an array can be used to quantify an arbitrarily large number of different nucleic acid sequences
[6]in solution.
Microarray technologies are used in food analysis for detection and identification of genetically
[7][8][9][10][11][12]modified organisms (GMO) analysis and other biomarkers. The focus of this document
is DNA microarray-based methodologies for food products and products of agriculture.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16578:2022(E)
Molecular biomarker analysis — Requirements for
microarray detection of specific nucleic acid sequences
1 Scope
This document specifies verification and validation parameters and processes for microarray detection
and identification of specific nucleic acid sequences.This document provides recommendations and protocols for:
— microarray design and manufacture;
— validation of hybridization specificity;
— interlaboratory validation of qualitative methods;
— determination of limits of detection for a microarray;
— determination of range of reliable signals;
— criteria for assessing technical performance of the microarray platform:
This document is applicable to all methods that use microarrays for detection of nucleic acids.
It does not apply to the following protocols:— quantitative measurement;
— requirements for sample preparation prior to DNA microarray experiments.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO/TS 16393, Molecular biomarker analysis — Determination of the performance characteristics of
qualitative measurement methods and validation of methodsISO 16577, Molecular biomarker analysis — Vocabulary for molecular biomarker analytical methods in
agriculture and food production3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
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3.1
limit of detection for microarray platform
LODP
lowest relative quantity of the external measurement standard (3.11) (or reference material) for which a
positive identification can be achieved with reasonable or previously determined confidence or both in
a defined matrix using a specific analytical methodNote 1 to entry: In qualitative testing, an estimate of the LOD is measured at the chosen probability of detection
(POD).3.2
range of reliable signal
concentrations of target sequence for which a method can provide results where the output signal is
proportional to the concentration and/or copy number of the external measurement standard (3.11) (or
reference material)Note 1 to entry: Direct of derived proportionality is acceptable in this range.
3.3
DNA microarray
DNA chip
solid substrate where a collection of probe DNA (3.6) arranged in a specific design is attached in a
high-density fashion, directly or indirectly, that assays large amounts of biological material using high-
throughput screening methods3.4
analytical power
power
probability that an analyte will not go undetected if it is present
3.5
sensitivity
smallest treatment response that will be detectable
3.6
probe DNA
single-strand nucleic acid defined by its property to target specific nucleic acid sequence by base
complementarities, where the stringency of the binding is linked with the length and nucleic acid
composition of the probes, along with reaction parameters3.7
platform
device that supports a DNA microarray (3.3) technology
3.8
fluorescence detection
method of detecting hybridization using immobilized probe DNA (3.6) by measuring a fluorescence
signal3.9
colorimetric detection
method of detecting hybridization using immobilized probe DNA (3.6) by measuring a colorimetric
signal3.10
electrochemical detection
method of detecting hybridization by measuring electric currents of an electrode onto which probe
DNA (3.6) are immobilized© ISO 2022 – All rights reserved
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3.11
external measurement standard
material or substrate prepared for testing the compatibility of the microarray-based methods of
analysis, whose property value is derived as a consensus value based on collaborative experimental
work under the auspices of a scientific or engineering group3.12
cross-hybridization
non-specificity binding of probe DNA (3.6) to non-targeted nucleic acid
4 Principle
4.1 DNA microarray platform assay
A microarray platform assay consists at a minimum of the following steps:
— denaturation of the double- or single-stranded DNA or ribonucleic acid (RNA) analyte (DNA sample);
— hybridization of the target(s) to probe DNAs bound to a solid substrate;— detection of each hybridized target(s) by an electrochemical, colorimetric or fluorescence signal;
— data analysis.The laboratory shall verify the procedure used for each microarray assay step, using known
measurement standards (or reference material) and appropriate controls. Requirements governing
verification of DNA microarray-based methods shall be documented.4.2 Microarray design and manufacture
4.2.1 General
The DNA microarray and device for analysis shall be validated as an integrated measurement system for
specific nucleic acid analysis. The performance of a DNA microarray shall be specified in combination
with its analytical device. The DNA microarray and the device that analyses it should specify the
[13]performance in an integrated state and evaluate its reliability.
4.2.2 Control probe sequences and targeted probes
A DNA microarray analysis shall have the following types of probe DNAs incorporated:
— external measurement standards (or reference material);— a positive control;
— a negative control;
— the nucleic acid sequence of interest.
It shall be designed to be verifiable.
The immobilized DNA probes for signal quality control, including but not limited to the positive and
negative controls, shall be included in the microarray design as replicates located in different positions
[14]on the microarray. Probe DNA design shall consider the Tm value, GC ratio and sequence specificity
of the nucleic acid oligonucleotide. Oligonucleotide probe sequence information shall be provided
according to the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) nomenclature code for
[15]nucleic acids. In order to improve legibility between “G” and “C”, lower-case “g” should be used in the
description (i.e. C, g, A, and T shall be used to indicate bases). The quality of probe DNA shall be ensured
by an appropriate method, e.g. spectroscopic analysis, mass-spectroscopy analysis.
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4.2.3 Analytical power of microarray assay
[16]
Power determines the number of replicates that are needed to validate the performance requirement.
[17]An estimate of expected variance (uncertainty) is required among replicates (see ISO/IEC Guide 98-3 ).
The probability of detection (POD), which is a measure of the variance of the limit of detection (LOD)
for a qualitative (binary) analysis, should be used to ensure that method performance lies within the
chosen confidence interval. ISO/TS 16393 provides guidance for determining the number of replicates
required for validating a qualitative method.Replication should be differentiated from repetition within an assay, i.e. repetition of a hybridization
on the same immobilized DNA sample position. The power and detection limit of a method are not
necessarily improved by doubling the number of hybridizations for each DNA sample and decreasing
the number of samples by one half.NOTE In practice, methods with lower power or detection limit or both can be used to detect the presumptive
presence of a target. Secondary methods with higher power or detection limit or both can be used to confirm the
presence of the target or to resolve presumptive results from the first screen. This is frequently the case when a
screening method is used followed by a method to disclose a specific construct.4.3 Validation of hybridization specificity
4.3.1 Theoretical assessment of specificity
A theoretical assessment of probe DNA specificity shall be performed consisting of in silico screening
of the probe against a nucleic acid sequence database that is fit for purpose for the analysis that will be
performed. Examples of DNA databases are:[18]
— DNA Data Bank of Japan (National Institute of Genetics) ;
[19]
— EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) ;
[20]
— GenBank (National Center for Biotechnology Information) .
Examples of sequence similarity search applications are:
[21]
— BLAST ;
[22]
— FASTA .
Specific sequences should be selected that are not likely to cross-hybridize and be tested experimentally.
4.3.2 Experimental assessment of specificityThe sequence specificity of the probe DNAs should be validated experimentally on the basis of
exclusivity and inclusivity, i.e. on samples having nucleic acid sequences similar to, but not the same as,
the target sequence, as well as on biomarkers identified through the in silico assessment (see 4.3.1) as
[23]presenting sequences homologies likely to cause cross-hybridizations: exclusivity and inclusivity.
The experimental conditions should be the same as those used routinely for the method
4.3.3 Experimental assessment of cross-hybridizationThe validation process shall demonstrate that no cross-hybridizations occurs on a probe DNA that
is capable of experimentally detecting an external measurement standard (or reference material)
in the matrix. An experimental result is accepted only if the probe DNAs for detecting the external
measurement standards (or reference material) are all positive and the probe DNAs for detecting
negative controls are negative.© ISO 2022 – All rights reserved
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4.4 Interlaboratory validation of qualitative methods
4.4.1 General
Qualitative (binary) test results only provide data for detection or non-detection within a pre-
determined performance range. Sensitivity is an indicator of signal strength but cannot serve directly
as a measure of system performance. Detection limits are direct indicators of system performance. The
performance range for the method should be determined in the validation study. The validation study
should begin once the method is established or modified.4.4.2 Detection limit
The detection limit is the true net concentration of target DNA in the sample. It will lead, with probability
(1-β), to the conclusion that the amount of target in the sample is larger than that in the negative control
material. It is defined as shown in Formula (1):P (LL≤ LL==) β (1)
r cD
where
is the estimated value;
L is the critical value;
L is the expectation or true value;
L is the LOD.
NOTE 1 The limit of detection is estimated by:
L ≈ 2t σ
D 1-αν o
where
L is the LOD;
α = β;
t is Student’s t-distribution value, based on ν degrees of freedom for a one-sided confidence interval of
1-αν1-α;
σ is the standard deviation of the true value (expectation).
L = 3,29 σ , when the uncertainty in the mean (expected) value of the blank is negligible, α = β = 0,05
D oand L is normally distributed with known constant variance. However, L is not defined simply as a
fixed coefficient (e.g. 3, 6) times the standard deviation of a pure solution background. To do so can be
extremely misleading. The correct estimation of L can consider degrees of freedom, α and β, and the
distribution of L as influenced by factors such as analyte concentration, matrix effects and interference.
This description of the LOD is suitable for nucleotide analyses such as those used for real-time PCR that
[24]present as non-normal distributions with heteroscedasticity (e.g. “counting” (Poisson) processes).
It is essential to specify the measurement process under consideration since distributions, standard
deviations and blanks can be dramatically different for different measurement processes.
NOTE 2 An empirically derived determination based on the results of a collaborative trial is called the
“practical LOD”. It is defined as the lowest relative quantity of the target DNA that can be detected, given a known
(determined/estimated) number of target taxon copies. The practical LOD is related to the test portion, and the
quality/quantity of the template DNA, and L = 3,29 σ which has also been called the absolute LOD of the method
D owith 95 % confidence.
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4.4.3 Probability of detection
A qualitative (binary) analytical DNA microarray method with the purpose of demonstrating the presence
or absence of a given target sequence in a sample shall provide objective evidence that it is adequate for
its intended use. Method performance should be characterized with respect to the concentration of the
target sequence. The POD permits comparison of probabilities across concentrations. Validation data
can be graphically represented as a POD response curve by concentration with associated error bars
of the mean POD value which characterizes the response probability curve as a function of measurand
mass or concentration.At the LOD, a positive identification of specific probe can be achieved with reasonable or previously
determined confidence or both in a defined matrix using a specific analytical method. In qualitative
testing, an estimate of the LOD is measured at the chosen POD.When LOD for each target probe is evaluated, method validation shall include determining the POD for
the performance range of the method as described in ISO/TS 16393.4.4.4 Limit of detection for microarray platform
4.4.4.1 General
When the number of probes is too large to evaluate the LODs for all target probes, the LODP can be used
as a performance characteristic representing the LOD applicable to the whole microarray platform.
4.4.4.2 Practical LODPAn empirically derived determination based on the results of an experimental trial by use of an external
reference material called the “practical LODP” has been developed for DNA microarrays. Like the
practical LOD, it is defined as the lowest relative quantity of the selected external reference material
that can be detected with 95 % confidence (1 in 20 false negative rate), given a known (determined/
estimated) copy number of a reference material. The practical LODP is related to the test portion, and
the quality/quantity of the template DNA, and L = 3,29 σ which has also been called the “absolute
DP oLODP” of the method with 95 % confidence. The LODP is commonly rounded to one significant figure;
[25]therefore, LODP = 3 σ
NOTE The LODP determination method is described in Annex A.
4.4.5 Range of reliable signal
The range of reliable signal shall be determined for a DNA microarray method. The values should be
confirmed via an interlaboratory trial using appropriate certified reference materials or reference
[26][27]materials. Information may also be derived from single laboratory studies.
4.4.6 Test sample
A solution or an extract containing DNA/RNA molecules appropriate to the field of application
is prepared so that there is no demonstrated hybridization inhibition or interference with the
electrochemical, colorimetric and/or fluorescence detection.4.4.7 Measuring system
The criteria for choosing instrument settings (e.g. background setting, normalization setting) shall
be determined and documented. The measurement accuracy and uncertainty of instruments and
equipment used for microarray detection of specific nucleic acid sequences can affect the validity of
[28]reported results. The following instruments shall be calibrated:
— thermal cyclers;
— hybridization ovens, or other hybridization apparatus;
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ISO 16578:2022(E)
— DNA microarray scanner;
— apparatus or equipment for measuring DNA/RNA integrity and concentration.
Any calculations or models used to derive analytical result shall be validated and documented.
4.4.8 Estimation of measurement uncertaintyThe appropriate measurement uncertainty shall be determined for each component of the DNA
microarray assay. An overall measurement uncertainty shall be determined for the integrated method.
Samples shall be representative. When evaluating the uncertainty of measurement, all components
which are of significance in the given situation shall be taken into account using appropriate methods
of analysis.[29] [17]
NOTE For further information, see the ISO 5725 series and ISO/IEC Guide 98-3 .
4.4.9 Microarray reagents
The characteristics and quality of reagents (e.g. fluorescent dye(s), reverse transcription enzyme,
buffers), and the amount of an external measurement standard (or reference material) that is added to
the reaction mixture should be validated.5 Expression of results
5.1 General
Qualitative determinations will return a binary result: positive or negative. The criteria used to choose
a method for a particular application, i.e. in a specific matrix where the analyte falls within a specific
...NORME ISO
INTERNATIONALE 16578
Deuxième édition
2022-09
Analyse moléculaire des
biomarqueurs — Exigences relatives
à la détection sur microréseaux
de séquences d'acides nucléiques
spécifiques
Molecular biomarker analysis — Requirements for microarray
detection of specific nucleic acid sequences
Numéro de référence
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Sommaire Page
Avant-propos .............................................................................................................................................................................................................................iv
Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v
1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1
2 Références normatives ..................................................................................................................................................................................1
3 Termes et définitions ...................................................................................................................................................................................... 1
4 Principe.......................................................................................................................................................................................................................... 3
4.1 Essai sur support de microréseau d’ADN ........................................................................................................................ 3
4.2 Conception et fabrication d’un microréseau ................................................................................................................ 3
4.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 3
4.2.2 Séquences de sondes témoins et sondes ciblées ..................................................................................... 3
4.2.3 Puissance analytique de l’essai sur microréseau .................................................................................. 4
4.3 Validation de la spécificité d’hybridation ....................................................................................................................... 4
4.3.1 Évaluation théorique de la spécificité ............................................................................................................. 4
4.3.2 Évaluation expérimentale de la spécificité ................................................................................................. 4
4.3.3 Évaluation expérimentale de l’hybridation croisée ............................................................................ 5
4.4 Validation interlaboratoires des méthodes qualitatives ................................................................................... 5
4.4.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 5
4.4.2 Limite de détection .......................................................................................................................................................... 5
4.4.3 Probabilité de détection .............................................................................................................................................. 6
4.4.4 Limite de détection pour le support de microréseau ........................................................................ 6
4.4.5 Plage de signaux fiables ............................................................................................................................................... 6
4.4.6 Échantillon pour essai ................................................................................................................................................... 7
4.4.7 Système de mesure ........................................................................................................................................................... 7
4.4.8 Estimation de l’incertitude de mesure ................................... ......................................................................... 7
4.4.9 Réactifs pour microréseaux ..................................................................................................................................... 7
5 Expression des résultats ............................................................................................................................................................................. 7
5.1 Généralités ................................................................................................................................................................................................. 7
5.2 Expression d’un résultat négatif ............................................................................................................................................. 7
5.3 Expression d’un résultat positif .............................................................................................................................................. 8
5.4 Expression de résultats non concluants ou ambigus ........................................................................................... 8
6 Rapport d’essai ...................................................................................................................................................................................................... 8
Annexe A (informative) Détermination pratique de la limite de détection pour le support
de microréseau (LODP) ...................................................................... ........................................................................................................10
Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................14
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ISO 16578:2022(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34 Produits alimentaires, sous-comité
SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 16578:2013), qui a fait l’objet d’une
révision technique.Les principales modifications sont les suivantes:
— ajout de l’Annexe A relative à la détermination pratique de la limite de détection pour le support de
microréseau (LODP).Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.© ISO 2022 – Tous droits réservés
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ISO 16578:2022(F)
Introduction
Les méthodes disponibles pour la détection des séquences d’acides nucléiques à l’aide d’échantillons
contenant des acides nucléiques reposent sur trois technologies: la réaction de polymérisation en chaîne
[1](PCR), le séquençage de l’acide désoxyribonucléique (ADN) et les microréseaux d’oligonucléotides .
Les microréseaux d’ADN sont utilisés dans le cadre de l’identification des biomarqueurs et du mesurage
de l’expression des gènes. Les travaux d’harmonisation sur le plan international des méthodes
expérimentales pour les expériences sur microréseaux ont débuté avec la norme MIAME «Minimum
Information about a Microarray Experiment (Informations minimales concernant les expériences
[2]sur microréseaux) — vers des normes pour les données obtenues sur microréseaux » et le projet
[3],[4]décisif MAQC «Microarray Quality Control (Contrôle qualité des microréseaux ») de l’US Food and
Drug Administration, qui a commencé en 2005 et abordait les aspects techniques des mesurages de
l’expression des gènes et des supports technologiques solides, ainsi que le développement de modèles
de prédiction multivariés basés sur l’expression précise et reproductible des gènes.
Les microréseaux d’ADN sont fabriqués soit par synthèse chimique de sondes ADN sur une surface
solide, soit en fixant des sondes ADN préfabriquées sur une surface solide, par exemple une microplaque
ou une bille enrobée. Les essais sur microréseaux peuvent être conçus pour détecter simultanément
de multiples polymorphismes mononucléotidiques (SNP). Les microréseaux oligonucléotidiques haute
densité, synthétisés in situ à l’aide de techniques telles que photolithographie, jet d’encre et robot
de dépôt de produits de PCR et d’oligonucléotides présynthétisés, sont fabriqués pour détecter des
[5]séquences spécifiques sur une vaste plage de variabilité. Cette technologie continue de se développer
avec la PCR et le séquençage de nouvelle génération (NGS).Les microréseaux d’ADN sont généralement utilisés pour étudier une solution d’acides nucléiques
mixtes marqués: l’hybridation des cibles marquées aux sondes fixées sur le réseau est détectée, et
leur concentration relative par rapport aux espèces d’acides nucléiques résiduelles dans la solution
est mesurée. En généralisant vers un très grand nombre de points d’ADN, un réseau peut être utilisé
pour quantifier un nombre arbitrairement élevé de séquences différentes d’acides nucléiques dans la
[6]solution .
Les technologies des microréseaux sont utilisées dans le domaine de l’analyse des aliments, pour
[7][8][9]détecter et identifier les organismes génétiquement modifiés (OGM) et d’autres biomarqueurs.
[10][11][12]Le présent document porte sur les méthodologies basées sur les microréseaux d’ADN pour les
produits alimentaires et agricoles.© ISO 2022 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 16578:2022(F)
Analyse moléculaire des biomarqueurs — Exigences
relatives à la détection sur microréseaux de séquences
d'acides nucléiques spécifiques
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les paramètres et procédés de vérification et de validation pour la
détection et l’identification de séquences d’acides nucléiques spécifiques à l’aide de microréseaux.
Il fournit des recommandations et des protocoles pour:— la conception et la fabrication d’un microréseau;
— la validation de la spécificité d’hybridation;
— la validation interlaboratoires des méthodes qualitatives;
— la détermination des limites de détection pour un microréseau;
— la détermination d’une plage de signaux fiables;
— les critères d’évaluation des performances techniques du support de microréseau.
Il est applicable à toutes les méthodes qui utilisent des microréseaux pour la détection d’acides
nucléiques.Il ne s’applique pas aux protocoles suivants:
— le mesurage quantitatif;
— les exigences relatives à la préparation de l’échantillon avant les expériences sur microréseaux
d’ADN.2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).ISO/TS 16393, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Détermination des caractéristiques de
performance des méthodes de mesure qualitatives et validation des méthodesISO 16577, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Vocabulaire pour les méthodes d’analyse de
biomarqueurs moléculaires dans l’agriculture et la production agroalimentaire3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16577 ainsi que les suivants
s’appliquent.L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
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ISO 16578:2022(F)
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
limite de détection pour le support de microréseau
LODP
plus petite quantité relative d’étalon externe (3.11) (ou de matériau de référence) susceptible d’être
identifiée positivement avec un niveau de confiance raisonnable et/ou préalablement déterminé, dans
une matrice définie à l’aide d’une méthode analytique spécifiqueNote 1 à l'article: Lors des essais qualitatifs, une estimation de la LOD est effectuée à la probabilité de détection
(POD) choisie.3.2
plage de signaux fiables
concentrations de la séquence cible pour lesquelles une méthode peut fournir des résultats lorsque le
signal de sortie est proportionnel à la concentration et/ou au nombre de copies de l’étalon externe (3.11)
(ou du matériau de référence)Note 1 à l'article: La proportionnalité directe dérivée est acceptable dans cette plage.
3.3microréseau d’ADN
puce à ADN
support solide sur lequel une collection de sondes ADN (3.6) disposée selon un motif particulier est
fixée en haute densité, directement ou indirectement, pour analyser de grandes quantités de matériau
biologique par des méthodes de criblage à haut débit3.4
puissance analytique
puissance
probabilité pour qu’un analyte ne soit pas non détecté s’il est présent
3.5
sensibilité
plus petite réponse de traitement qui sera détectable
3.6
sonde ADN
acide nucléique simple brin défini par son aptitude à cibler une séquence d’acide nucléique spécifique
par complémentarité des bases, pour lequel la solidité de la liaison est liée à la longueur des sondes et à
la composition de leur acide nucléique, ainsi qu’aux paramètres réactionnels3.7
support
dispositif sur lequel reposent les éléments nécessaires à la technologie des microréseaux d’ADN (3.3)
3.8détection de fluorescence
méthode de détection de l’hybridation au moyen d’une sonde ADN (3.6) immobilisée, par mesurage d’un
signal de fluorescence3.9
détection colorimétrique
méthode de détection de l’hybridation au moyen d’une sonde ADN (3.6) immobilisée, par mesurage d’un
signal colorimétrique3.10
détection électrochimique
méthode de détection de l’hybridation par mesurage des courants électriques sortant d’une électrode
sur laquelle sont immobilisées des sondes ADN (3.6)© ISO 2022 – Tous droits réservés
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ISO 16578:2022(F)
3.11
étalon externe
matériau ou substrat préparé pour tester la compatibilité de méthodes d’analyse basées sur des
microréseaux, dont la valeur caractéristique reconnue a été obtenue à partir d’essais interlaboratoires
menés sous l’égide d’un groupe scientifique ou d’ingénierie3.12
hybridation croisée
liaison non spécifique d’une sonde ADN (3.6) à un acide nucléique non-cible
4 Principe
4.1 Essai sur support de microréseau d’ADN
Un essai sur support de microréseau comprend au moins les étapes suivantes:
— la dénaturation d’un analyte d’ADN ou d’acide ribonucléique (ARN) simple ou double brin (échantillon
d’ADN);— l’hybridation de la ou des cibles aux sondes ADN liées à un support solide;
— la détection de chaque cible hybridée par un signal électrochimique, colorimétrique ou de
fluorescence;— l’analyse des données.
Le laboratoire doit vérifier le mode opératoire utilisé pour chaque étape de mesurage sur microréseau,
à l’aide d’étalons connus (ou d’un matériau de référence) et de témoins appropriés. Les exigences qui
régissent la vérification des méthodes basées sur des microréseaux d’ADN doivent être notées.
4.2 Conception et fabrication d’un microréseau4.2.1 Généralités
Le microréseau d’ADN et le dispositif d’analyse doivent être validés comme système de mesure
intégré pour l’analyse des acides nucléiques spécifiques. La performance d’un microréseau d’ADN doit
être spécifiée, en association avec son dispositif analytique. Il convient que le microréseau d’ADN et
le dispositif qui permet de l’analyser spécifient la performance dans un état intégré et évaluent sa
[13]fiabilité .
4.2.2 Séquences de sondes témoins et sondes ciblées
Une analyse sur microréseau d’ADN doit utiliser les types suivants de sondes ADN:
— les étalons externes (ou le matériau de référence);— un témoin positif;
— un témoin négatif;
— la séquence d’acide nucléique étudiée.
Elle doit être conçue pour être vérifiable.
Les sondes ADN immobilisées pour le contrôle qualité du signal, y compris les témoins positifs et
négatifs, doivent être incluses dans la conception du microréseau sous forme de réplicats situés en
[14]différentes positions sur le microréseau. La conception des sondes ADN doit tenir compte de la
valeur Tm, du ratio G/C et de la spécificité des séquences oligonucléotidiques de l’acide nucléique. Des
informations sur la séquence de la sonde oligonucléotidique doivent être fournies conformément à la
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ISO 16578:2022(F)
nomenclature de l’Union internationale de chimie pure et appliquée (UICPA) pour les acides nucléiques.
[15]Pour différencier «G» et «C», il convient d’utiliser un «g» minuscule dans la description (c’est-à-
dire que C, g, A et T doivent être utilisés pour indiquer les bases). La qualité de la sonde ADN doit être
garantie par une méthode appropriée, comme l’analyse spectroscopique ou l’analyse par spectrométrie
de masse.4.2.3 Puissance analytique de l’essai sur microréseau
[16]
La puissance détermine le nombre de réplicats nécessaires pour valider l’exigence de performance.
[17]Une estimation de la variance prévue (incertitude) des réplicats est requise (voir ISO/IEC Guide 98-3 ).
Il convient d’utiliser la probabilité de détection (POD), qui est une mesure de la variance de la limite
de détection (LOD) pour une analyse qualitative (binaire), pour s’assurer que la performance de la
méthode se situe dans l’intervalle de confiance choisie. L’ISO/TS 16393 fournit des recommandations
pour déterminer le nombre de réplicats nécessaires pour valider une méthode qualitative.
Il convient de faire la distinction entre la réplication et la répétition lors d’un essai, c’est-à-dire la
répétition d’une hybridation sur la même position d’échantillon d’ADN immobilisé. La puissance
et la limite de détection d’une méthode ne sont pas nécessairement améliorées en multipliant par
deux le nombre d’hybridations pour chaque échantillon d’ADN et en réduisant de moitié le nombre
d’échantillons.NOTE En pratique, des méthodes ayant une puissance et/ou une limite de détection moins élevée peuvent
être utilisées pour détecter la présence présumée d’une cible. Des méthodes secondaires ayant une puissance
et/ou une limite de détection plus élevée peuvent être utilisées pour confirmer la présence de la cible ou pour
corriger les résultats présumés du premier criblage. C’est souvent le cas lorsqu’une méthode de criblage est
utilisée avant une méthode de description d’un produit de synthèse spécifique.4.3 Validation de la spécificité d’hybridation
4.3.1 Évaluation théorique de la spécificité
Une évaluation théorique de la spécificité de la sonde ADN doit être effectuée. Elle consiste à réaliser
un criblage in silico de la sonde en fonction d’une base de données de séquences d’acides nucléiques
adaptée à l’analyse à effectuer. Exemples de base de données ADN:[18]
— DNA Data Bank of Japan (National Institute of Genetics) ;
[19]
— EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) ;
[20]
— GenBank (National Center for Biotechnology Information) .
Exemples d’applications de recherche des similarités de séquences:
[21]
— BLAST ;
[22]
— FASTA .
Il convient de choisir des séquences spécifiques qui ne sont pas susceptibles de générer une hybridation
croisée et de les soumettre à essai expérimentalement.4.3.2 Évaluation expérimentale de la spécificité
Il convient de valider expérimentalement la spécificité des séquences des sondes ADN d’après
l’exclusivité et l’inclusivité, c’est-à-dire sur des échantillons ayant des séquences d’acides nucléiques
similaires mais pas identiques à la séquence cible, ainsi que sur des biomarqueurs dont l’évaluation
in silico (voir 4.3.1) a permis d’identifier qu’ils présentent des homologies de séquences susceptibles
[23]d’engendrer des hybridations croisées: exclusivité et inclusivité. Il convient que les conditions
expérimentales soient les mêmes que celles mises en œuvre en routine.© ISO 2022 – Tous droits réservés
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ISO 16578:2022(F)
4.3.3 Évaluation expérimentale de l’hybridation croisée
Le processus de validation doit démontrer qu’il ne peut se produire d’hybridations croisées sur une
sonde ADN permettant de détecter un étalon externe (ou un matériau de référence) dans la matrice.
Un résultat expérimental est accepté uniquement si les sondes ADN permettant de détecter les étalons
externes (ou un matériau de référence) sont toutes positives et si les sondes ADN permettant de détecter
des témoins négatifs sont négatives.4.4 Validation interlaboratoires des méthodes qualitatives
4.4.1 Généralités
Les résultats d’essais qualitatifs (binaires) fournissent uniquement des données sur la détection ou
non-détection dans une plage de performance prédéterminée. La sensibilité est un indicateur de la
puissance du signal, mais ne peut servir directement à mesurer la performance du système. Les limites
de détection sont des indicateurs directs de la performance du système. Il convient de déterminer la
plage de performance de la méthode lors de l’étude de validation. Il convient de commencer l’étude de
validation dès que la méthode est établie ou modifiée.4.4.2 Limite de détection
La limite de détection est la concentration nette vraie de l’ADN cible dans l’échantillon. Elle permet
d’aboutir à la conclusion, avec une probabilité (1-β), que la quantité de cible dans l’échantillon est
supérieure à celle dans le témoin négatif. Elle est définie comme indiqué dans la Formule (1):
P (LL≤ LL==) β (1)r cD
est la valeur estimée;
L est la valeur critique;
L est la prévision ou valeur vraie;
L est la LOD.
NOTE 1 La limite de détection est estimée par:
L ≈ 2t σ
D 1-αν o
L est la LOD;
α = β;
t est la valeur de distribution t de Student, d’après ν degrés de liberté pour un intervalle de confiance
1-ανunilatéral de 1-α;
σ est l’écart-type de la valeur vraie (prévision).
L = 3,29 σ , lorsque l’incertitude de la valeur moyenne (prévue) du blanc est négligeable, α = β = 0,05 et
D oL est normalement distribuée avec une variance constante connue. Toutefois, L n’est pas simplement
définie comme un coefficient fixe (par exemple 3 ou 6) multipliant l’écart-type d’un bruit de fond d’une
solution pure. Cela peut être extrêmement trompeur. L’estimation correcte de L peut tenir compte des
degrés de liberté, α et β, et de la distribution de L influencée par des facteurs tels que la concentration
en analytes, les effets de matrice et les interférences.Cette description de la LOD est appropriée pour les analyses nucléotidiques telles que celles utilisées
pour la PCR en temps réel qui présentent des distributions non normales avec une hétéroscédasticité
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ISO 16578:2022(F)
[24]
[par exemple, processus de «comptage» (Poisson)]. Il est essentiel de spécifier le processus de
mesure étudié, car les distributions, écarts-types et blancs peuvent être nettement différents selon les
processus de mesure.NOTE 2 Une détermination empirique basée sur les résultats d’une étude interlaboratoires est appelée «LOD
pratique». Elle est définie comme la plus petite quantité relative d’ADN cible qui peut être détectée, eu égard à
un nombre connu (déterminé/estimé) de copies de taxons cibles. La LOD pratique est fonction de la prise d’essai,
de la qualité/quantité de matrice d’ADN et de la L = 3,29 σ , aussi appelée «LOD absolue» de la méthode avec un
D oniveau de confiance de 95 %.
4.4.3 Probabilité de détection
Une méthode analytique qualitative (binaire) sur microréseau d’ADN dont l’objectif est de démontrer
la présence ou l’absence d’une séquence cible donnée dans un échantillon doit fournir une preuve
objective de son aptitude à l’usage prévu. Il convient de caractériser la performance de la méthode en
fonction de la concentration de la séquence cible. La POD permet de comparer les probabilités selon les
concentrations. Les données de validation peuvent être représentées graphiquement sous la forme d’une
courbe de réponse POD par concentration avec les barres d’erreur associées de la valeur POD moyenne,
qui caractérise la courbe de probabilité de réponse en fonction de la masse ou de la concentration du
mesurande.À la LOD, une identification positive de la sonde spécifique peut être atteinte avec un niveau de confiance
raisonnable et/ou préalablement déterminé dans une matrice définie à l’aide d’une méthode analytique
spécifique. Lors des essais qualitatifs, une estimation de la LOD est effectuée à la POD choisie.
Lorsque la LOD pour chaque sonde cible est évaluée, la validation de la méthode doit inclure
la détermination de la POD pour la plage de performance de la méthode, comme indiqué dans
l’ISO/TS 16393.4.4.4 Limite de détection pour le support de microréseau
4.4.4.1 Généralités
Lorsque le nombre de sondes est trop élevé pour évaluer les LOD de toutes les sondes cibles, la LODP
peut être utilisée comme caractéristique de performance représentant la LOD applicable à l’ensemble
du support de microréseau.4.4.4.2 LODP pratique
Une détermination empirique basée sur les résultats d’une étude expérimentale utilisant un matériau de
référence externe, appelée «LODP pratique», a été mise au point pour les microréseaux d’ADN. Comme
la LOD pratique, elle est définie comme la plus petite quantité relative du matériau de référence externe
choisi qui peut être détectée avec un niveau de confiance de 95 % (taux de faux négatifs de 5 %), eu
égard à un nombre de copies connu (déterminé/estimé) d’un matériau de référence. La LODP pratique
est fonction de la prise d’essai, de la qualité/quantité de matrice...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.