ISO 16578:2022

Molecular biomarker analysis — Requirements for microarray detection of specific nucleic acid sequences

This document specifies verification and validation parameters and processes for microarray detection and identification of specific nucleic acid sequences. This document provides recommendations and protocols for: — microarray design and manufacture; — validation of hybridization specificity; — interlaboratory validation of qualitative methods; — determination of limits of detection for a microarray; — determination of range of reliable signals; — criteria for assessing technical performance of the microarray platform: This document is applicable to all methods that use microarrays for detection of nucleic acids. It does not apply to the following protocols: — quantitative measurement; — requirements for sample preparation prior to DNA microarray experiments.

Analyse moléculaire des biomarqueurs — Exigences relatives à la détection sur microréseaux de séquences d'acides nucléiques spécifiques

Le présent document spécifie les paramètres et procédés de vérification et de validation pour la détection et l’identification de séquences d’acides nucléiques spécifiques à l’aide de microréseaux. Il fournit des recommandations et des protocoles pour: — la conception et la fabrication d’un microréseau; — la validation de la spécificité d’hybridation; — la validation interlaboratoires des méthodes qualitatives; — la détermination des limites de détection pour un microréseau; — la détermination d’une plage de signaux fiables; — les critères d’évaluation des performances techniques du support de microréseau. Il est applicable à toutes les méthodes qui utilisent des microréseaux pour la détection d’acides nucléiques. Il ne s’applique pas aux protocoles suivants: — le mesurage quantitatif; — les exigences relatives à la préparation de l’échantillon avant les expériences sur microréseaux d’ADN.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 27-Sep-2022
• ICS: 67.050 - General methods of tests and analysis for food products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 16 - Horizontal methods for molecular biomarker analysis
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 16 - Horizontal methods for molecular biomarker analysis
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 28-Sep-2022
• Due Date: 16-Sep-2023
• Completion Date: 28-Sep-2022

Relations

• Revises: ISO 16578:2013 - Molecular biomarker analysis — General definitions and requirements for microarray detection of specific nucleic acid sequences
• Effective Date: 23-Apr-2020

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16578
Second edition
2022-09
Molecular biomarker analysis —
Requirements for microarray
detection of specific nucleic acid
sequences
Analyse moléculaire des biomarqueurs — Exigences relatives à
la détection sur microréseaux de séquences d'acides nucléiques
spécifiques
Reference number
ISO 16578:2022(E)
© ISO 2022
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ISO 16578:2022(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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Published in Switzerland
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Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions .................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 3

4.1 DNA microarray platform assay ............................................................................................................................................. 3

4.2 Microarray design and manufacture .................................................................................................................................. 3

4.2.1 General ........................................................................................................................................................................................ 3

4.2.2 Control probe sequences and targeted probes........................................................................................ 3

4.2.3 Analytical power of microarray assay ............................................................................................................ 4

4.3 Validation of hybridization specificity .............................................................................................................................. 4

4.3.1 Theoretical assessment of specificity ............................................................................................................. 4

4.3.2 Experimental assessment of specificity ........................................................................................................ 4

4.3.3 Experimental assessment of cross-hybridization ................................................................................ 4

4.4 Interlaboratory validation of qualitative methods ................................................................................................ 5

4.4.1 General ........................................................................................................................................................................................ 5

4.4.2 Detection limit ...................................................................................................................................................................... 5

4.4.3 Probability of detection ............................................................................................................................................... 6

4.4.4 Limit of detection for microarray platform .............................................................................................. 6

4.4.5 Range of reliable signal ................................................................................................................................................ 6

4.4.6 Test sample .............................................................................................................................................................................. 6

4.4.7 Measuring system ............................................................................................................................................................. 6

4.4.8 Estimation of measurement uncertainty ..................................................................................................... 7

4.4.9 Microarray reagents ....................................................................................................................................................... 7

5 Expression of results ....................................................................................................................................................................................... 7

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7

5.2 Expression of a negative result ................................................................................................................................................ 7

5.3 Expression of a positive result ................................................................................................................................................. 7

5.4 Expression of inconclusive or ambiguous results ................................................................................................... 8

6 Test report .................................................................................................................................................................................................................. 8

Annex A (informative) Practical determination of limit of detection for microarray

platform (LODP) ...................................................................................................................................................................................................9

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................13

iii
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ISO 16578:2022(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

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constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see

www.iso.org/iso/foreword.html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34 Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 16578:2013), which has been technically

revised.
The main changes are as follows:

— Annex A has been added to provide the practical determination of limit of detection for microarray

platform (LODP).

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO 16578:2022(E)
Introduction

Available methods for nucleic acid sequence discovery using nucleic acid containing samples are based

on three technologies: the polymerase chain reaction (PCR), deoxyribonucleic acid (DNA) sequencing

[1]
and oligonucleotide microarrays.

DNA microarrays are used in biomarker identification and the measurement of gene expression.

International harmonization efforts of experimental methods for microarray experiments began

with the “Minimum Information about a Microarray Experiment (MIAME)—toward standards for

[2]

microarray data” and the US Food and Drug Administration’s critical path project the Microarray

[3][4]

Quality Control project (MAQC), which began in 2005 and focused on technical aspects of gene

expression measurements, robust technology platforms and the development of accurate and

reproducible multivariate gene expression-based prediction models.

DNA microarrays are made either by chemically synthesizing DNA probes on a solid surface or by

attaching pre-made DNA probes to a solid surface, e.g. a microplate or coated bead. Microarray assays

can be designed to detect multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) simultaneously. High

density oligonucleotide microarrays synthesized in situ using techniques such as photolithography,

ink-jet deposition and robotic arraying of PCR products and pre-synthesized oligonucleotides are

[5]

manufactured for detecting specific sequences over a wide range of variability. This technology

continues to develop along with PCR and next generation sequencing (NGS).

DNA microarrays are typically used to probe a solution of mixed labelled nucleic acids: hybridization of

the labelled targets to the fixed probes on the array is detected, and their relative concentration to the

remaining nucleic acid species in solution is measured. By generalizing to a very large number of spots

of DNA, an array can be used to quantify an arbitrarily large number of different nucleic acid sequences

[6]
in solution.

Microarray technologies are used in food analysis for detection and identification of genetically

[7][8][9][10][11][12]

modified organisms (GMO) analysis and other biomarkers. The focus of this document

is DNA microarray-based methodologies for food products and products of agriculture.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16578:2022(E)
Molecular biomarker analysis — Requirements for
microarray detection of specific nucleic acid sequences
1 Scope

This document specifies verification and validation parameters and processes for microarray detection

and identification of specific nucleic acid sequences.
This document provides recommendations and protocols for:
— microarray design and manufacture;
— validation of hybridization specificity;
— interlaboratory validation of qualitative methods;
— determination of limits of detection for a microarray;
— determination of range of reliable signals;
— criteria for assessing technical performance of the microarray platform:

This document is applicable to all methods that use microarrays for detection of nucleic acids.

It does not apply to the following protocols:
— quantitative measurement;
— requirements for sample preparation prior to DNA microarray experiments.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO/TS 16393, Molecular biomarker analysis — Determination of the performance characteristics of

qualitative measurement methods and validation of methods

ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Vocabulary for molecular biomarker analytical methods in

agriculture and food production
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 and the following apply.

ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
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ISO 16578:2022(E)
3.1
limit of detection for microarray platform
LODP

lowest relative quantity of the external measurement standard (3.11) (or reference material) for which a

positive identification can be achieved with reasonable or previously determined confidence or both in

a defined matrix using a specific analytical method

Note 1 to entry: In qualitative testing, an estimate of the LOD is measured at the chosen probability of detection

(POD).
3.2
range of reliable signal

concentrations of target sequence for which a method can provide results where the output signal is

proportional to the concentration and/or copy number of the external measurement standard (3.11) (or

reference material)
Note 1 to entry: Direct of derived proportionality is acceptable in this range.
3.3
DNA microarray
DNA chip

solid substrate where a collection of probe DNA (3.6) arranged in a specific design is attached in a

high-density fashion, directly or indirectly, that assays large amounts of biological material using high-

throughput screening methods
3.4
analytical power
power
probability that an analyte will not go undetected if it is present
3.5
sensitivity
smallest treatment response that will be detectable
3.6
probe DNA

single-strand nucleic acid defined by its property to target specific nucleic acid sequence by base

complementarities, where the stringency of the binding is linked with the length and nucleic acid

composition of the probes, along with reaction parameters
3.7
platform
device that supports a DNA microarray (3.3) technology
3.8
fluorescence detection

method of detecting hybridization using immobilized probe DNA (3.6) by measuring a fluorescence

signal
3.9
colorimetric detection

method of detecting hybridization using immobilized probe DNA (3.6) by measuring a colorimetric

signal
3.10
electrochemical detection

method of detecting hybridization by measuring electric currents of an electrode onto which probe

DNA (3.6) are immobilized
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ISO 16578:2022(E)
3.11
external measurement standard

material or substrate prepared for testing the compatibility of the microarray-based methods of

analysis, whose property value is derived as a consensus value based on collaborative experimental

work under the auspices of a scientific or engineering group
3.12
cross-hybridization
non-specificity binding of probe DNA (3.6) to non-targeted nucleic acid
4 Principle
4.1 DNA microarray platform assay
A microarray platform assay consists at a minimum of the following steps:

— denaturation of the double- or single-stranded DNA or ribonucleic acid (RNA) analyte (DNA sample);

— hybridization of the target(s) to probe DNAs bound to a solid substrate;

— detection of each hybridized target(s) by an electrochemical, colorimetric or fluorescence signal;

— data analysis.

The laboratory shall verify the procedure used for each microarray assay step, using known

measurement standards (or reference material) and appropriate controls. Requirements governing

verification of DNA microarray-based methods shall be documented.
4.2 Microarray design and manufacture
4.2.1 General

The DNA microarray and device for analysis shall be validated as an integrated measurement system for

specific nucleic acid analysis. The performance of a DNA microarray shall be specified in combination

with its analytical device. The DNA microarray and the device that analyses it should specify the

[13]
performance in an integrated state and evaluate its reliability.
4.2.2 Control probe sequences and targeted probes

A DNA microarray analysis shall have the following types of probe DNAs incorporated:

— external measurement standards (or reference material);
— a positive control;
— a negative control;
— the nucleic acid sequence of interest.
It shall be designed to be verifiable.

The immobilized DNA probes for signal quality control, including but not limited to the positive and

negative controls, shall be included in the microarray design as replicates located in different positions

[14]

on the microarray. Probe DNA design shall consider the Tm value, GC ratio and sequence specificity

of the nucleic acid oligonucleotide. Oligonucleotide probe sequence information shall be provided

according to the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) nomenclature code for

[15]

nucleic acids. In order to improve legibility between “G” and “C”, lower-case “g” should be used in the

description (i.e. C, g, A, and T shall be used to indicate bases). The quality of probe DNA shall be ensured

by an appropriate method, e.g. spectroscopic analysis, mass-spectroscopy analysis.

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ISO 16578:2022(E)
4.2.3 Analytical power of microarray assay
[16]

Power determines the number of replicates that are needed to validate the performance requirement.

[17]

An estimate of expected variance (uncertainty) is required among replicates (see ISO/IEC Guide 98-3 ).

The probability of detection (POD), which is a measure of the variance of the limit of detection (LOD)

for a qualitative (binary) analysis, should be used to ensure that method performance lies within the

chosen confidence interval. ISO/TS 16393 provides guidance for determining the number of replicates

required for validating a qualitative method.

Replication should be differentiated from repetition within an assay, i.e. repetition of a hybridization

on the same immobilized DNA sample position. The power and detection limit of a method are not

necessarily improved by doubling the number of hybridizations for each DNA sample and decreasing

the number of samples by one half.

NOTE In practice, methods with lower power or detection limit or both can be used to detect the presumptive

presence of a target. Secondary methods with higher power or detection limit or both can be used to confirm the

presence of the target or to resolve presumptive results from the first screen. This is frequently the case when a

screening method is used followed by a method to disclose a specific construct.
4.3 Validation of hybridization specificity
4.3.1 Theoretical assessment of specificity

A theoretical assessment of probe DNA specificity shall be performed consisting of in silico screening

of the probe against a nucleic acid sequence database that is fit for purpose for the analysis that will be

performed. Examples of DNA databases are:
[18]
— DNA Data Bank of Japan (National Institute of Genetics) ;
[19]
— EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) ;
[20]
— GenBank (National Center for Biotechnology Information) .
Examples of sequence similarity search applications are:
[21]
— BLAST ;
[22]
— FASTA .

Specific sequences should be selected that are not likely to cross-hybridize and be tested experimentally.

4.3.2 Experimental assessment of specificity

The sequence specificity of the probe DNAs should be validated experimentally on the basis of

exclusivity and inclusivity, i.e. on samples having nucleic acid sequences similar to, but not the same as,

the target sequence, as well as on biomarkers identified through the in silico assessment (see 4.3.1) as

[23]

presenting sequences homologies likely to cause cross-hybridizations: exclusivity and inclusivity.

The experimental conditions should be the same as those used routinely for the method

4.3.3 Experimental assessment of cross-hybridization

The validation process shall demonstrate that no cross-hybridizations occurs on a probe DNA that

is capable of experimentally detecting an external measurement standard (or reference material)

in the matrix. An experimental result is accepted only if the probe DNAs for detecting the external

measurement standards (or reference material) are all positive and the probe DNAs for detecting

negative controls are negative.
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ISO 16578:2022(E)
4.4 Interlaboratory validation of qualitative methods
4.4.1 General

Qualitative (binary) test results only provide data for detection or non-detection within a pre-

determined performance range. Sensitivity is an indicator of signal strength but cannot serve directly

as a measure of system performance. Detection limits are direct indicators of system performance. The

performance range for the method should be determined in the validation study. The validation study

should begin once the method is established or modified.
4.4.2 Detection limit

The detection limit is the true net concentration of target DNA in the sample. It will lead, with probability

(1-β), to the conclusion that the amount of target in the sample is larger than that in the negative control

material. It is defined as shown in Formula (1):
P (LL≤ LL==) β (1)
r cD
where
is the estimated value;
L is the critical value;
L is the expectation or true value;
L is the LOD.
NOTE 1 The limit of detection is estimated by:
L ≈ 2t σ
D 1-αν o
where
L is the LOD;
α = β;

t is Student’s t-distribution value, based on ν degrees of freedom for a one-sided confidence interval of

1-αν
1-α;
σ is the standard deviation of the true value (expectation).

L = 3,29 σ , when the uncertainty in the mean (expected) value of the blank is negligible, α = β = 0,05

D o

and L is normally distributed with known constant variance. However, L is not defined simply as a

fixed coefficient (e.g. 3, 6) times the standard deviation of a pure solution background. To do so can be

extremely misleading. The correct estimation of L can consider degrees of freedom, α and β, and the

distribution of L as influenced by factors such as analyte concentration, matrix effects and interference.

This description of the LOD is suitable for nucleotide analyses such as those used for real-time PCR that

[24]

present as non-normal distributions with heteroscedasticity (e.g. “counting” (Poisson) processes).

It is essential to specify the measurement process under consideration since distributions, standard

deviations and blanks can be dramatically different for different measurement processes.

NOTE 2 An empirically derived determination based on the results of a collaborative trial is called the

“practical LOD”. It is defined as the lowest relative quantity of the target DNA that can be detected, given a known

(determined/estimated) number of target taxon copies. The practical LOD is related to the test portion, and the

quality/quantity of the template DNA, and L = 3,29 σ which has also been called the absolute LOD of the method

D o
with 95 % confidence.
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4.4.3 Probability of detection

A qualitative (binary) analytical DNA microarray method with the purpose of demonstrating the presence

or absence of a given target sequence in a sample shall provide objective evidence that it is adequate for

its intended use. Method performance should be characterized with respect to the concentration of the

target sequence. The POD permits comparison of probabilities across concentrations. Validation data

can be graphically represented as a POD response curve by concentration with associated error bars

of the mean POD value which characterizes the response probability curve as a function of measurand

mass or concentration.

At the LOD, a positive identification of specific probe can be achieved with reasonable or previously

determined confidence or both in a defined matrix using a specific analytical method. In qualitative

testing, an estimate of the LOD is measured at the chosen POD.

When LOD for each target probe is evaluated, method validation shall include determining the POD for

the performance range of the method as described in ISO/TS 16393.
4.4.4 Limit of detection for microarray platform
4.4.4.1 General

When the number of probes is too large to evaluate the LODs for all target probes, the LODP can be used

as a performance characteristic representing the LOD applicable to the whole microarray platform.

4.4.4.2 Practical LODP

An empirically derived determination based on the results of an experimental trial by use of an external

reference material called the “practical LODP” has been developed for DNA microarrays. Like the

practical LOD, it is defined as the lowest relative quantity of the selected external reference material

that can be detected with 95 % confidence (1 in 20 false negative rate), given a known (determined/

estimated) copy number of a reference material. The practical LODP is related to the test portion, and

the quality/quantity of the template DNA, and L = 3,29 σ which has also been called the “absolute

DP o

LODP” of the method with 95 % confidence. The LODP is commonly rounded to one significant figure;

[25]
therefore, LODP = 3 σ
NOTE The LODP determination method is described in Annex A.
4.4.5 Range of reliable signal

The range of reliable signal shall be determined for a DNA microarray method. The values should be

confirmed via an interlaboratory trial using appropriate certified reference materials or reference

[26][27]
materials. Information may also be derived from single laboratory studies.
4.4.6 Test sample

A solution or an extract containing DNA/RNA molecules appropriate to the field of application

is prepared so that there is no demonstrated hybridization inhibition or interference with the

electrochemical, colorimetric and/or fluorescence detection.
4.4.7 Measuring system

The criteria for choosing instrument settings (e.g. background setting, normalization setting) shall

be determined and documented. The measurement accuracy and uncertainty of instruments and

equipment used for microarray detection of specific nucleic acid sequences can affect the validity of

[28]
reported results. The following instruments shall be calibrated:
— thermal cyclers;
— hybridization ovens, or other hybridization apparatus;
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— DNA microarray scanner;
— apparatus or equipment for measuring DNA/RNA integrity and concentration.

Any calculations or models used to derive analytical result shall be validated and documented.

4.4.8 Estimation of measurement uncertainty

The appropriate measurement uncertainty shall be determined for each component of the DNA

microarray assay. An overall measurement uncertainty shall be determined for the integrated method.

Samples shall be representative. When evaluating the uncertainty of measurement, all components

which are of significance in the given situation shall be taken into account using appropriate methods

of analysis.
[29] [17]
NOTE For further information, see the ISO 5725 series and ISO/IEC Guide 98-3 .
4.4.9 Microarray reagents

The characteristics and quality of reagents (e.g. fluorescent dye(s), reverse transcription enzyme,

buffers), and the amount of an external measurement standard (or reference material) that is added to

the reaction mixture should be validated.
5 Expression of results
5.1 General

Qualitative determinations will return a binary result: positive or negative. The criteria used to choose

a method for a particular application, i.e. in a specific matrix where the analyte falls within a specific

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16578
Deuxième édition
2022-09
Analyse moléculaire des
biomarqueurs — Exigences relatives
à la détection sur microréseaux
de séquences d'acides nucléiques
spécifiques
Molecular biomarker analysis — Requirements for microarray
detection of specific nucleic acid sequences
Numéro de référence
ISO 16578:2022(F)
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ISO 16578:2022(F)
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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ISO 16578:2022(F)
Sommaire Page

Avant-propos .............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ..................................................................................................................................................................................1

3 Termes et définitions ...................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe.......................................................................................................................................................................................................................... 3

4.1 Essai sur support de microréseau d’ADN ........................................................................................................................ 3

4.2 Conception et fabrication d’un microréseau ................................................................................................................ 3

4.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 3

4.2.2 Séquences de sondes témoins et sondes ciblées ..................................................................................... 3

4.2.3 Puissance analytique de l’essai sur microréseau .................................................................................. 4

4.3 Validation de la spécificité d’hybridation ....................................................................................................................... 4

4.3.1 Évaluation théorique de la spécificité ............................................................................................................. 4

4.3.2 Évaluation expérimentale de la spécificité ................................................................................................. 4

4.3.3 Évaluation expérimentale de l’hybridation croisée ............................................................................ 5

4.4 Validation interlaboratoires des méthodes qualitatives ................................................................................... 5

4.4.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 5

4.4.2 Limite de détection .......................................................................................................................................................... 5

4.4.3 Probabilité de détection .............................................................................................................................................. 6

4.4.4 Limite de détection pour le support de microréseau ........................................................................ 6

4.4.5 Plage de signaux fiables ............................................................................................................................................... 6

4.4.6 Échantillon pour essai ................................................................................................................................................... 7

4.4.7 Système de mesure ........................................................................................................................................................... 7

4.4.8 Estimation de l’incertitude de mesure ................................... ......................................................................... 7

4.4.9 Réactifs pour microréseaux ..................................................................................................................................... 7

5 Expression des résultats ............................................................................................................................................................................. 7

5.1 Généralités ................................................................................................................................................................................................. 7

5.2 Expression d’un résultat négatif ............................................................................................................................................. 7

5.3 Expression d’un résultat positif .............................................................................................................................................. 8

5.4 Expression de résultats non concluants ou ambigus ........................................................................................... 8

6 Rapport d’essai ...................................................................................................................................................................................................... 8

Annexe A (informative) Détermination pratique de la limite de détection pour le support

de microréseau (LODP) ...................................................................... ........................................................................................................10

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................14

iii
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ISO 16578:2022(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir

www.iso.org/directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34 Produits alimentaires, sous-comité

SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 16578:2013), qui a fait l’objet d’une

révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:

— ajout de l’Annexe A relative à la détermination pratique de la limite de détection pour le support de

microréseau (LODP).

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO 16578:2022(F)
Introduction

Les méthodes disponibles pour la détection des séquences d’acides nucléiques à l’aide d’échantillons

contenant des acides nucléiques reposent sur trois technologies: la réaction de polymérisation en chaîne

[1]

(PCR), le séquençage de l’acide désoxyribonucléique (ADN) et les microréseaux d’oligonucléotides .

Les microréseaux d’ADN sont utilisés dans le cadre de l’identification des biomarqueurs et du mesurage

de l’expression des gènes. Les travaux d’harmonisation sur le plan international des méthodes

expérimentales pour les expériences sur microréseaux ont débuté avec la norme MIAME «Minimum

Information about a Microarray Experiment (Informations minimales concernant les expériences

[2]

sur microréseaux) — vers des normes pour les données obtenues sur microréseaux » et le projet

[3],[4]

décisif MAQC «Microarray Quality Control (Contrôle qualité des microréseaux ») de l’US Food and

Drug Administration, qui a commencé en 2005 et abordait les aspects techniques des mesurages de

l’expression des gènes et des supports technologiques solides, ainsi que le développement de modèles

de prédiction multivariés basés sur l’expression précise et reproductible des gènes.

Les microréseaux d’ADN sont fabriqués soit par synthèse chimique de sondes ADN sur une surface

solide, soit en fixant des sondes ADN préfabriquées sur une surface solide, par exemple une microplaque

ou une bille enrobée. Les essais sur microréseaux peuvent être conçus pour détecter simultanément

de multiples polymorphismes mononucléotidiques (SNP). Les microréseaux oligonucléotidiques haute

densité, synthétisés in situ à l’aide de techniques telles que photolithographie, jet d’encre et robot

de dépôt de produits de PCR et d’oligonucléotides présynthétisés, sont fabriqués pour détecter des

[5]

séquences spécifiques sur une vaste plage de variabilité. Cette technologie continue de se développer

avec la PCR et le séquençage de nouvelle génération (NGS).

Les microréseaux d’ADN sont généralement utilisés pour étudier une solution d’acides nucléiques

mixtes marqués: l’hybridation des cibles marquées aux sondes fixées sur le réseau est détectée, et

leur concentration relative par rapport aux espèces d’acides nucléiques résiduelles dans la solution

est mesurée. En généralisant vers un très grand nombre de points d’ADN, un réseau peut être utilisé

pour quantifier un nombre arbitrairement élevé de séquences différentes d’acides nucléiques dans la

[6]
solution .

Les technologies des microréseaux sont utilisées dans le domaine de l’analyse des aliments, pour

[7][8][9]

détecter et identifier les organismes génétiquement modifiés (OGM) et d’autres biomarqueurs.

[10][11][12]

Le présent document porte sur les méthodologies basées sur les microréseaux d’ADN pour les

produits alimentaires et agricoles.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16578:2022(F)
Analyse moléculaire des biomarqueurs — Exigences
relatives à la détection sur microréseaux de séquences
d'acides nucléiques spécifiques
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie les paramètres et procédés de vérification et de validation pour la

détection et l’identification de séquences d’acides nucléiques spécifiques à l’aide de microréseaux.

Il fournit des recommandations et des protocoles pour:
— la conception et la fabrication d’un microréseau;
— la validation de la spécificité d’hybridation;
— la validation interlaboratoires des méthodes qualitatives;
— la détermination des limites de détection pour un microréseau;
— la détermination d’une plage de signaux fiables;

— les critères d’évaluation des performances techniques du support de microréseau.

Il est applicable à toutes les méthodes qui utilisent des microréseaux pour la détection d’acides

nucléiques.
Il ne s’applique pas aux protocoles suivants:
— le mesurage quantitatif;

— les exigences relatives à la préparation de l’échantillon avant les expériences sur microréseaux

d’ADN.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).

ISO/TS 16393, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Détermination des caractéristiques de

performance des méthodes de mesure qualitatives et validation des méthodes

ISO 16577, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Vocabulaire pour les méthodes d’analyse de

biomarqueurs moléculaires dans l’agriculture et la production agroalimentaire
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16577 ainsi que les suivants

s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

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ISO 16578:2022(F)
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
limite de détection pour le support de microréseau
LODP

plus petite quantité relative d’étalon externe (3.11) (ou de matériau de référence) susceptible d’être

identifiée positivement avec un niveau de confiance raisonnable et/ou préalablement déterminé, dans

une matrice définie à l’aide d’une méthode analytique spécifique

Note 1 à l'article: Lors des essais qualitatifs, une estimation de la LOD est effectuée à la probabilité de détection

(POD) choisie.
3.2
plage de signaux fiables

concentrations de la séquence cible pour lesquelles une méthode peut fournir des résultats lorsque le

signal de sortie est proportionnel à la concentration et/ou au nombre de copies de l’étalon externe (3.11)

(ou du matériau de référence)

Note 1 à l'article: La proportionnalité directe dérivée est acceptable dans cette plage.

3.3
microréseau d’ADN
puce à ADN

support solide sur lequel une collection de sondes ADN (3.6) disposée selon un motif particulier est

fixée en haute densité, directement ou indirectement, pour analyser de grandes quantités de matériau

biologique par des méthodes de criblage à haut débit
3.4
puissance analytique
puissance
probabilité pour qu’un analyte ne soit pas non détecté s’il est présent
3.5
sensibilité
plus petite réponse de traitement qui sera détectable
3.6
sonde ADN

acide nucléique simple brin défini par son aptitude à cibler une séquence d’acide nucléique spécifique

par complémentarité des bases, pour lequel la solidité de la liaison est liée à la longueur des sondes et à

la composition de leur acide nucléique, ainsi qu’aux paramètres réactionnels
3.7
support

dispositif sur lequel reposent les éléments nécessaires à la technologie des microréseaux d’ADN (3.3)

3.8
détection de fluorescence

méthode de détection de l’hybridation au moyen d’une sonde ADN (3.6) immobilisée, par mesurage d’un

signal de fluorescence
3.9
détection colorimétrique

méthode de détection de l’hybridation au moyen d’une sonde ADN (3.6) immobilisée, par mesurage d’un

signal colorimétrique
3.10
détection électrochimique

méthode de détection de l’hybridation par mesurage des courants électriques sortant d’une électrode

sur laquelle sont immobilisées des sondes ADN (3.6)
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3.11
étalon externe

matériau ou substrat préparé pour tester la compatibilité de méthodes d’analyse basées sur des

microréseaux, dont la valeur caractéristique reconnue a été obtenue à partir d’essais interlaboratoires

menés sous l’égide d’un groupe scientifique ou d’ingénierie
3.12
hybridation croisée
liaison non spécifique d’une sonde ADN (3.6) à un acide nucléique non-cible
4 Principe
4.1 Essai sur support de microréseau d’ADN
Un essai sur support de microréseau comprend au moins les étapes suivantes:

— la dénaturation d’un analyte d’ADN ou d’acide ribonucléique (ARN) simple ou double brin (échantillon

d’ADN);
— l’hybridation de la ou des cibles aux sondes ADN liées à un support solide;

— la détection de chaque cible hybridée par un signal électrochimique, colorimétrique ou de

fluorescence;
— l’analyse des données.

Le laboratoire doit vérifier le mode opératoire utilisé pour chaque étape de mesurage sur microréseau,

à l’aide d’étalons connus (ou d’un matériau de référence) et de témoins appropriés. Les exigences qui

régissent la vérification des méthodes basées sur des microréseaux d’ADN doivent être notées.

4.2 Conception et fabrication d’un microréseau
4.2.1 Généralités

Le microréseau d’ADN et le dispositif d’analyse doivent être validés comme système de mesure

intégré pour l’analyse des acides nucléiques spécifiques. La performance d’un microréseau d’ADN doit

être spécifiée, en association avec son dispositif analytique. Il convient que le microréseau d’ADN et

le dispositif qui permet de l’analyser spécifient la performance dans un état intégré et évaluent sa

[13]
fiabilité .
4.2.2 Séquences de sondes témoins et sondes ciblées

Une analyse sur microréseau d’ADN doit utiliser les types suivants de sondes ADN:

— les étalons externes (ou le matériau de référence);
— un témoin positif;
— un témoin négatif;
— la séquence d’acide nucléique étudiée.
Elle doit être conçue pour être vérifiable.

Les sondes ADN immobilisées pour le contrôle qualité du signal, y compris les témoins positifs et

négatifs, doivent être incluses dans la conception du microréseau sous forme de réplicats situés en

[14]

différentes positions sur le microréseau. La conception des sondes ADN doit tenir compte de la

valeur Tm, du ratio G/C et de la spécificité des séquences oligonucléotidiques de l’acide nucléique. Des

informations sur la séquence de la sonde oligonucléotidique doivent être fournies conformément à la

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nomenclature de l’Union internationale de chimie pure et appliquée (UICPA) pour les acides nucléiques.

[15]

Pour différencier «G» et «C», il convient d’utiliser un «g» minuscule dans la description (c’est-à-

dire que C, g, A et T doivent être utilisés pour indiquer les bases). La qualité de la sonde ADN doit être

garantie par une méthode appropriée, comme l’analyse spectroscopique ou l’analyse par spectrométrie

de masse.
4.2.3 Puissance analytique de l’essai sur microréseau
[16]

La puissance détermine le nombre de réplicats nécessaires pour valider l’exigence de performance.

[17]

Une estimation de la variance prévue (incertitude) des réplicats est requise (voir ISO/IEC Guide 98-3 ).

Il convient d’utiliser la probabilité de détection (POD), qui est une mesure de la variance de la limite

de détection (LOD) pour une analyse qualitative (binaire), pour s’assurer que la performance de la

méthode se situe dans l’intervalle de confiance choisie. L’ISO/TS 16393 fournit des recommandations

pour déterminer le nombre de réplicats nécessaires pour valider une méthode qualitative.

Il convient de faire la distinction entre la réplication et la répétition lors d’un essai, c’est-à-dire la

répétition d’une hybridation sur la même position d’échantillon d’ADN immobilisé. La puissance

et la limite de détection d’une méthode ne sont pas nécessairement améliorées en multipliant par

deux le nombre d’hybridations pour chaque échantillon d’ADN et en réduisant de moitié le nombre

d’échantillons.

NOTE En pratique, des méthodes ayant une puissance et/ou une limite de détection moins élevée peuvent

être utilisées pour détecter la présence présumée d’une cible. Des méthodes secondaires ayant une puissance

et/ou une limite de détection plus élevée peuvent être utilisées pour confirmer la présence de la cible ou pour

corriger les résultats présumés du premier criblage. C’est souvent le cas lorsqu’une méthode de criblage est

utilisée avant une méthode de description d’un produit de synthèse spécifique.
4.3 Validation de la spécificité d’hybridation
4.3.1 Évaluation théorique de la spécificité

Une évaluation théorique de la spécificité de la sonde ADN doit être effectuée. Elle consiste à réaliser

un criblage in silico de la sonde en fonction d’une base de données de séquences d’acides nucléiques

adaptée à l’analyse à effectuer. Exemples de base de données ADN:
[18]
— DNA Data Bank of Japan (National Institute of Genetics) ;
[19]
— EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) ;
[20]
— GenBank (National Center for Biotechnology Information) .
Exemples d’applications de recherche des similarités de séquences:
[21]
— BLAST ;
[22]
— FASTA .

Il convient de choisir des séquences spécifiques qui ne sont pas susceptibles de générer une hybridation

croisée et de les soumettre à essai expérimentalement.
4.3.2 Évaluation expérimentale de la spécificité

Il convient de valider expérimentalement la spécificité des séquences des sondes ADN d’après

l’exclusivité et l’inclusivité, c’est-à-dire sur des échantillons ayant des séquences d’acides nucléiques

similaires mais pas identiques à la séquence cible, ainsi que sur des biomarqueurs dont l’évaluation

in silico (voir 4.3.1) a permis d’identifier qu’ils présentent des homologies de séquences susceptibles

[23]

d’engendrer des hybridations croisées: exclusivité et inclusivité. Il convient que les conditions

expérimentales soient les mêmes que celles mises en œuvre en routine.
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4.3.3 Évaluation expérimentale de l’hybridation croisée

Le processus de validation doit démontrer qu’il ne peut se produire d’hybridations croisées sur une

sonde ADN permettant de détecter un étalon externe (ou un matériau de référence) dans la matrice.

Un résultat expérimental est accepté uniquement si les sondes ADN permettant de détecter les étalons

externes (ou un matériau de référence) sont toutes positives et si les sondes ADN permettant de détecter

des témoins négatifs sont négatives.
4.4 Validation interlaboratoires des méthodes qualitatives
4.4.1 Généralités

Les résultats d’essais qualitatifs (binaires) fournissent uniquement des données sur la détection ou

non-détection dans une plage de performance prédéterminée. La sensibilité est un indicateur de la

puissance du signal, mais ne peut servir directement à mesurer la performance du système. Les limites

de détection sont des indicateurs directs de la performance du système. Il convient de déterminer la

plage de performance de la méthode lors de l’étude de validation. Il convient de commencer l’étude de

validation dès que la méthode est établie ou modifiée.
4.4.2 Limite de détection

La limite de détection est la concentration nette vraie de l’ADN cible dans l’échantillon. Elle permet

d’aboutir à la conclusion, avec une probabilité (1-β), que la quantité de cible dans l’échantillon est

supérieure à celle dans le témoin négatif. Elle est définie comme indiqué dans la Formule (1):

P (LL≤ LL==) β (1)
r cD
est la valeur estimée;
L est la valeur critique;
L est la prévision ou valeur vraie;
L est la LOD.
NOTE 1 La limite de détection est estimée par:
L ≈ 2t σ
D 1-αν o
L est la LOD;
α = β;

t est la valeur de distribution t de Student, d’après ν degrés de liberté pour un intervalle de confiance

1-αν
unilatéral de 1-α;
σ est l’écart-type de la valeur vraie (prévision).

L = 3,29 σ , lorsque l’incertitude de la valeur moyenne (prévue) du blanc est négligeable, α = β = 0,05 et

D o

L est normalement distribuée avec une variance constante connue. Toutefois, L n’est pas simplement

définie comme un coefficient fixe (par exemple 3 ou 6) multipliant l’écart-type d’un bruit de fond d’une

solution pure. Cela peut être extrêmement trompeur. L’estimation correcte de L peut tenir compte des

degrés de liberté, α et β, et de la distribution de L influencée par des facteurs tels que la concentration

en analytes, les effets de matrice et les interférences.

Cette description de la LOD est appropriée pour les analyses nucléotidiques telles que celles utilisées

pour la PCR en temps réel qui présentent des distributions non normales avec une hétéroscédasticité

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[24]

[par exemple, processus de «comptage» (Poisson)]. Il est essentiel de spécifier le processus de

mesure étudié, car les distributions, écarts-types et blancs peuvent être nettement différents selon les

processus de mesure.

NOTE 2 Une détermination empirique basée sur les résultats d’une étude interlaboratoires est appelée «LOD

pratique». Elle est définie comme la plus petite quantité relative d’ADN cible qui peut être détectée, eu égard à

un nombre connu (déterminé/estimé) de copies de taxons cibles. La LOD pratique est fonction de la prise d’essai,

de la qualité/quantité de matrice d’ADN et de la L = 3,29 σ , aussi appelée «LOD absolue» de la méthode avec un

D o
niveau de confiance de 95 %.
4.4.3 Probabilité de détection

Une méthode analytique qualitative (binaire) sur microréseau d’ADN dont l’objectif est de démontrer

la présence ou l’absence d’une séquence cible donnée dans un échantillon doit fournir une preuve

objective de son aptitude à l’usage prévu. Il convient de caractériser la performance de la méthode en

fonction de la concentration de la séquence cible. La POD permet de comparer les probabilités selon les

concentrations. Les données de validation peuvent être représentées graphiquement sous la forme d’une

courbe de réponse POD par concentration avec les barres d’erreur associées de la valeur POD moyenne,

qui caractérise la courbe de probabilité de réponse en fonction de la masse ou de la concentration du

mesurande.

À la LOD, une identification positive de la sonde spécifique peut être atteinte avec un niveau de confiance

raisonnable et/ou préalablement déterminé dans une matrice définie à l’aide d’une méthode analytique

spécifique. Lors des essais qualitatifs, une estimation de la LOD est effectuée à la POD choisie.

Lorsque la LOD pour chaque sonde cible est évaluée, la validation de la méthode doit inclure

la détermination de la POD pour la plage de performance de la méthode, comme indiqué dans

l’ISO/TS 16393.
4.4.4 Limite de détection pour le support de microréseau
4.4.4.1 Généralités

Lorsque le nombre de sondes est trop élevé pour évaluer les LOD de toutes les sondes cibles, la LODP

peut être utilisée comme caractéristique de performance représentant la LOD applicable à l’ensemble

du support de microréseau.
4.4.4.2 LODP pratique

Une détermination empirique basée sur les résultats d’une étude expérimentale utilisant un matériau de

référence externe, appelée «LODP pratique», a été mise au point pour les microréseaux d’ADN. Comme

la LOD pratique, elle est définie comme la plus petite quantité relative du matériau de référence externe

choisi qui peut être détectée avec un niveau de confiance de 95 % (taux de faux négatifs de 5 %), eu

égard à un nombre de copies connu (déterminé/estimé) d’un matériau de référence. La LODP pratique

est fonction de la prise d’essai, de la qualité/quantité de matrice
...