Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection and identification of animal species in food and feed products (nucleotide sequencing-based methods) — Part 1: General requirements

This document specifies general requirements for DNA sequencing method performance in the detection and identification of animal species in food and feed products. Performance requirements are limited to Sanger and next generation sequencing (NGS), including second and third generation sequencing, for analysis of single species products and multispecies products. This document is applicable to DNA sequences for mammals, birds, fish, molluscs, crustaceans, amphibians, reptiles and insects, and to the validation of the applicable methods. Methods for DNA species quantification are not considered under the scope of this document.

Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments et les aliments pour animaux (méthodes basées sur le séquençage des nucléotides) — Partie 1: Exigences générales

Le présent document spécifie les exigences générales relatives à la performance de la méthode de séquençage de l’ADN pour la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments et les produits alimentaires. Les exigences de performance se limitent au séquençage Sanger et au séquençage de nouvelle génération (NGS), y compris les séquençages de deuxième et troisième générations, pour l’analyse de produits mono-espèces et de produits multi-espèces. Le présent document est applicable aux séquences d’ADN de mammifères, oiseaux, poissons, mollusques, crustacés, amphibiens, reptiles et insectes, ainsi qu’à la validation des méthodes correspondantes. Les méthodes de quantification de l’espèce d’ADN ne font pas partie du domaine d’application du présent document.

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Status
Published
Publication Date
24-Oct-2021
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
25-Oct-2021
Completion Date
25-Oct-2021
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ISO 22949-1:2021 - Molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection and identification of animal species in food and feed products (nucleotide sequencing-based methods)
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ISO 22949-1:2021 - Analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d’analyse pour la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments et les aliments pour animaux (méthodes basées sur le séquençage des nucléotides)
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ISO/FDIS 22949-1:Version 31-jul-2021 - Molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection and identification of animal species in foods and food products (nucleotide sequencing-based methods)
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ISO/FDIS 22949-1:Version 28-avg-2021 - Analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d’analyse pour la détection et l’identification d’especes animales dans les aliments et les produits alimentaires (méthodes basées sur le séquençage des nucléotides)
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22949-1
First edition
2021-10
Molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection
and identification of animal species
in food and feed products (nucleotide
sequencing-based methods) —
Part 1:
General requirements
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la
détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments et
les aliments pour animaux (méthodes basées sur le séquençage des
nucléotides) —
Partie 1: Exigences générales
Reference number
ISO 22949-1:2021(E)
© ISO 2021
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22949-1:2021(E)
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Published in Switzerland
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---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22949-1:2021(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction .............................................................................................................................................................................................................................. vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions .................................................................................................................................................................................... 1

4 Performance characteristics of the methods ........................................................................................................................ 1

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 1

4.2 Fitness for purpose of the method ........................................................................................................................................ 2

4.3 Scientific basis ........................................................................................................................................................................................ 2

4.3.1 General ........................................................................................................................................................................................ 2

4.3.2 Sanger sequencing ............................................................................................................................................................ 2

4.3.3 Next generation sequencing ..................................................................................................................................... 2

4.4 Units of measurement ...................................................................................................................................................................... 3

4.5 Applicability .............................................................................................................................................................................................. 3

4.5.1 Meat or food product considerations ............................................................................................................... 3

4.5.2 Sampling plan ........................................................................................................................................................................ 3

4.5.3 Genomic considerations ............................................................................................................................................... 3

4.5.4 Method testing ..................................................................................................................................................................... 3

4.6 Primer selection and evaluation ............................................................................................................................................. 4

4.7 Database construction and evaluation ............................................................................................................................. 4

4.8 Selectivity and nucleotide sequence specificity ....................................................................................................... 5

4.8.1 General ........................................................................................................................................................................................ 5

4.8.2 Requirements for inclusivity testing ................................................................................................................ 5

4.8.3 Evaluation of non-targeted DNA interference ......................................................................................... 5

4.9 Sensitivity ................................................................................................................................................................................................... 6

4.9.1 General ........................................................................................................................................................................................ 6

4.9.2 Limit of detection ............................................................................................................................................................... 6

4.10 Robustness ................................................................................................................................................................................................. 6

4.10.1 General ........................................................................................................................................................................................ 6

4.10.2 Robustness determination by inter-laboratory study ...................................................................... 6

4.10.3 Robustness determination by a multifactorial orthogonal test design ............................ 7

5 Single-laboratory validation ................................................................................................................................................................... 7

6 Interlaboratory study (collaborative study) .......................................................................................................................... 7

7 General laboratory and procedural requirements ......................................................................................................... 7

7.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7

7.2 Facilities, materials and equipment ..................................................................................................................................... 8

7.3 Sample preparation ............................................................................................................................................................................ 8

7.3.1 General ........................................................................................................................................................................................ 8

7.3.2 Category A: single species sample consisting of a single piece ................................................. 8

7.3.3 Category B: single species product composed by several pieces or units of

the same type of tissue ................................................................................................................................................. 9

7.3.4 Category C: multiple mixed species processed product including those of

non-meat origin or different types of tissues as ingredients ..................................................... 9

7.4 DNA extraction ....................................................................................................................................................................................... 9

7.5 DNA sequencing workflow........................................................................................................................................................ 10

7.5.1 General ..................................................................................................................................................................................... 10

7.5.2 Sanger sequencing method .................................................................................................................................... 10

7.5.3 Next generation sequencing method ............................................................................................................. 11

7.6 DNA sequence data analysis and interpretation ................................................................................................... 14

7.7 Expression of results ........................................................................................................................................... ........................... 14

8 Validation of the NGS bioinformatics pipeline ..................................................................................................................14

iii
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---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22949-1:2021(E)

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................ 14

8.2 Quality metrics .................................................................................................................................................................................... 14

9 Test report ...............................................................................................................................................................................................................15

Annex A (informative) General workflow of the laboratory analytical procedure ........................................16

Annex B (informative) Comparison between Sanger sequencing and next generation

sequencing ...............................................................................................................................................................................................................17

Annex C (informative) In silico workflow for primer set selection .................................................................................18

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................20

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ISO 22949-1:2021(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see

www.iso.org/iso/foreword.html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
A list of all parts in the ISO 22949 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO 22949-1:2021(E)
Introduction

This document provides general guidance for deoxyribonucleic acid (DNA) sequencing for animal

species detection or identification, or both, in food and feed products. DNA sequencing is the process of

determining the order of the four nucleotide bases (adenine, guanine, cytosine and thymine) in a nucleic

acid polymer. Nucleic acid polymers can range in length from a few nucleotides to hundreds of millions

of bases.

Rapid DNA sequencing methods have been successfully validated and verified for detection and

[1]

identification of animal species in food products . Within the food industry, rapid, economical and

high throughput access to whole genome sequences in foods has improved the control of both food

[2]

quality and safety . Two types of DNA sequencing methods are most widely used for food products:

[3][4][5][6][7][8]
chain termination and high throughput sequencing .

Chain termination developed in 1977 by Frederick Sanger still bears his name. Sanger sequencing

reactions can be prepared manually and electropherograms can be read directly by the user. Automated

base calling capillary electrophoresis systems have mostly replaced manually read gels and rapid

Sanger applications are being developed.

High throughput or next generation sequencing (NGS), including next generation short-read and third

generation long-read methods, has reduced the cost of DNA sequencing, improved sequence readability

and automated most of the steps from preparatory to bioinformatics. High throughput automated DNA

sequencing applies base/wavelength specific fluorescence or ionic detection to determine the real-time

enzymatic addition of nucleotides to a DNA template.

Sanger sequencing (dideoxy chain termination) generates high quality data for determining a single

DNA sequence of an individual target. NGS, by contrast, can be used to assess millions of individual DNA

fragments of mixed markers and targets at the same time.

Sanger sequencing and NGS can both be used to verify animal species composition in a food sample or

[9]

compare DNA sequence results to previously defined databases to identify its animal origin, or both .

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 22949-1:2021(E)
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis
for the detection and identification of animal species in
food and feed products (nucleotide sequencing-based
methods) —
Part 1:
General requirements
1 Scope

This document specifies general requirements for DNA sequencing method performance in the

detection and identification of animal species in food and feed products. Performance requirements

are limited to Sanger and next generation sequencing (NGS), including second and third generation

sequencing, for analysis of single species products and multispecies products.

This document is applicable to DNA sequences for mammals, birds, fish, molluscs, crustaceans,

amphibians, reptiles and insects, and to the validation of the applicable methods.

Methods for DNA species quantification are not considered under the scope of this document.

2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions

ISO 20813, Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection and identification

of animal species in foods and food products (nucleic acid-based methods) — General requirements and

definitions

ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Nucleic acid extraction
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Performance characteristics of the methods
4.1 General

The identity of an organism at the species level is established by DNA sequencing through the

comparison of DNA sequences obtained from samples with known reference sequences. Results can

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ISO 22949-1:2021(E)

also be obtained at multiple taxonomic levels (e.g. order, species, genus, family), depending on the type

of database and DNA data analysis performed.

Methods used for animal species identification by DNA sequencing shall meet the performance guidance

provided in this document. The method validation process described in this document, interlaboratory

collaborative or single-laboratory studies or both shall be used to determine and elucidate sequencing

method performance characteristics.

Single species products that have been produced from one piece of meat (e.g. fish fillet, beef tenderloin)

are most appropriately analysed by Sanger sequencing, while NGS is the appropriate method for

simultaneous multispecies identification.
4.2 Fitness for purpose of the method

The method shall be fit for purpose for the identification of organisms and their taxonomic relationship

with other organisms. Identification at the sub-specific levels (e.g. breeds) can be included provided

that the databases and bioinformatic analyses are available. Information regarding the applicability

and limitations of the method shall be documented sufficiently to fulfil the criteria described in this

document. The appropriate commercial DNA sequencing platform(s) suitable for use in all method

procedures should be determined and identified. The target DNA can be located on the nuclear genome,

but also on the mitochondrial genomes. A DNA barcoding or metabarcoding approach can be used

[10][11]
based on one or more allelic regions to be sequenced .
4.3 Scientific basis
4.3.1 General

A general workflow of the laboratory analytical procedure is provided in Annex A.

4.3.2 Sanger sequencing

Sanger sequencing is based on a chain termination method for determining the nucleotide sequence of

DNA. Elongation of the replicated strand of DNA by DNA polymerase is interrupted by the incorporation

of non-elongatable nucleotides that terminate replication successively at each position of the sequenced

fragment. Labelling the four non-elongatable nucleotides (dideoxy-A, G, C and T) permits determination

of the molecular size of the replicated fragment by electrophoresis.

NOTE 1 Sanger sequencing can only be used when a sample contains tissue from a unique single species (e.g.

one fish fillet, one steak, one shrimp), because multiple DNA target sequences in the same sample from more than

one species can produce more than one end labelled chain terminated product of the same chain length. Multiple

chain terminated fragments of the same chain length can present two or more terminated bases at each position

and appear electrophoretically as convoluted or overlapping sequences. The electropherogram for the reaction is

unlikely to be readable and the identification will be compromised.

Automated Sanger sequencing platforms have been available for many years and have appropriately

[12][13][14]

been used for DNA barcoding to identify a single species, e.g. for fish species identification .

[15]
NOTE 2 For an example, see CEN/TS 17303:2019 .
4.3.3 Next generation sequencing

NGS in combination with DNA metabarcoding enables the robust and reliable identification of species

in complex food products (containing multiple species). NGS is a commercial term used to reference

[16]

high throughput DNA sequencing methods (see Annex B) . It is alternatively referred to as "massively

parallel sequencing". Results usually take the form of a text file with millions of individual sequence

reads. Commercially available platforms support second and third generation NGS sequencing methods.

Second generation sequencing is based on the analysis of short DNA fragments generated by a

polymerase chain reaction (PCR) or a fragmentation process to produce fragments of up to 600 bp in

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ISO 22949-1:2021(E)

size. Third generation sequencing is capable of analysing much longer DNA fragments (e.g. bacterial

genomes) and consequently is sometimes referred to as "long-read DNA sequencing".

4.4 Units of measurement

Sequence reads generated by Sanger sequencing or NGS methods are compared bioinformatically

to previously determined and identified reference sequences in DNA databases. Percent similarity

between the sample and reference sequences is calculated. Two sequences are homologous if they share

more similarity than would be expected by chance (p ≤ 0,01).

NOTE A percent similarity greater than 98 % is usually sufficient to identify sequences as the same species.

Identification data shall be provided as a qualitative result, in the form of list of appropriate taxa, their

respective percent similarity and, as appropriate, the expected value.
4.5 Applicability
4.5.1 Meat or food product considerations

The method should contain a definition of the food or food product(s) that will be sequenced and, where

appropriate, the raw materials from which it is derived and any necessary references to manufacturing

processes. In addition, whether the sample(s) will be composed of a single species or mixed species or

both.
4.5.2 Sampling plan

Representative samples taken through an applicable sampling plan should be provided to the

sequencing laboratory. Appropriate methods for subsampling laboratory samples should continue to

ensure the representativeness of the sequencing result. If applicable, statistical criteria for acceptance

or rejection of the analytical result should include the sampling plan and subsampling. Requirements

and limitations for the laboratory sample size and number of individual items forming the sample, and

the handling of the sample and its storage, should be evaluated and described based upon:

— the degree of processing of the sample constituents;
— the different species and animal tissue types involved;
— the nature of the sample matrices;
— the preparation of the sample matrix for analysis.
4.5.3 Genomic considerations

When assessing whether a method is fit for purpose, the following aspects regarding the nature of the

genomic region to be sequenced should be considered:

— the cellular and genomic disposition of the sequence, i.e. cellular: nuclear or mitochondrial, or

genomic: allelic or gene specific;
— the length of the sequence that will be determined;

— the types and design of primer sequences used for sample and library preparation and sequencing.

4.5.4 Method testing

Applicability shall be tested by extracting DNA from matrix-matched test samples representative of the

analytical scope of the method.
© ISO 2021 – All rights reserved
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ISO 22949-1:2021(E)

Highly processed food products can have fragmented DNA or low DNA concentration or both, making

them difficult to sequence. To compensate, some strategies can be employed, e.g. process more samples,

concentrate DNA extracts, work with smaller targeted genomic regions.
4.6 Primer selection and evaluation

Primer selection and evaluation is the first and most important step in the nucleotide sequencing

analytical workflow when a PCR-based DNA sequencing technology is used. The design of new primers

is a bioinformatics task performed using applicable software. There are many commercial and freely

available primer selection tools, e.g. Primer-BLAST and Primer 3. The following primer design factors

affect primer performance: secondary structures, partial sequence matches, hairpins, GC content, etc.

NOTE 1 Primer design and selection is not considered as part of the workflow to select genomic regions to be

sequenced in third generation NGS technology and the DNA fragmentation strategy, e.g. second generation based

NGS, shotgun sequencing.

Universal (consensus) primers can be defined for any taxonomic level (species, genus, family, order,

class, domain, etc). The design of these primers is based on DNA sequence alignments and identification

of consensus regions that are almost identical amongst the taxa to be identified. Degenerate primers

can be designed to increase the universality of the primers. Determining the number of degenerations

included in a single primer to avoid non-specific binding requires evaluation of unspecific annealing.

Primers should be evaluated in silico irrespective of their use in the laboratory workflow. They shall be

assessed using appropriate bioinformatics tools for their match with the species (taxon) to be detected/

identified.

NOTE 2 An example of an in silico workflow for primer set selection is shown in Annex C.

The final evaluation of the performance of each set of primers should be done by applying the laboratory

workflow using reference DNA or tissue material (whenever it is available) representative of the

identifiable group of species (taxa).
4.7 Database construction and evaluation

The DNA database used for species detection or identification or both will determine the number of

different species identifiable by the laboratory workflow. Database construction and evaluation is a

bioinformatics task and many different tools can be used, including in-house developed software.

Publicly available databases can also be used, e.g. GenBank. The databases should have the following

information available:
— the species list;
— the number of different entries for each species;
— the DNA region(s), gene(s) and length of DNA sequences;
— a measure of the validation quality of the sequence entry(ies).

The final performance evaluation of a bioinformatics search of a database shall be done by applying the

laboratory workflow using reference material (whenever possible) that is representative of the species

included in the database (vouchered). The use of higher taxonomic levels is appropriate when the

identification at the species is inconclusive, i.e. when the sample is not differentiable by a more targeted

search. In GenBank, the designation "Bos sp." can be used as the search term for all of the species of the

genus Bos.
© ISO 2021 – All rights reserved
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ISO 22949-1:2021(E)
4.8 Selectivity and nucleotide sequence specificity
4.8.1 General

Excessive amplification of non-targeted species DNA can interfere with the detection of targeted

species DNA, e.g. increased limit of detection (LOD) or critical value or both. Targeted (PCR-based) NGS

and Sanger sequencing methods should provide experimental evidence for nucleotide specificity with

non-targeted species (see ISO 20813). The degree of interference (selectivity) from non-targeted DNA

should be determined. The nucleotide sequence specificity should be assessed in a two-step procedure:

theoretical and e
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 22949-1
Première édition
2021-10
Analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d’analyse
pour la détection et l’identification
d’espèces animales dans les aliments
et les aliments pour animaux
(méthodes basées sur le séquençage
des nucléotides) —
Partie 1:
Exigences générales
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection
and identification of animal species in food and feed products
(nucleotide sequencing-based methods) —
Part 1: General requirements
Numéro de référence
ISO 22949-1:2021(F)
© ISO 2021
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22949-1:2021(F)
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© ISO 2021

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
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ISO 22949-1:2021(F)
Sommaire Page

Avant-propos ...............................................................................................................................................................................................................................v

Introduction .............................................................................................................................................................................................................................. vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ..................................................................................................................................................................................1

3 Termes et définitions ...................................................................................................................................................................................... 1

4 Caractéristiques de performance des méthodes ............................................................................................................... 2

4.1 Généralités ................................................................................................................................................................................................. 2

4.2 Adéquation à un but de la méthode ...................................................................................................................................... 2

4.3 Base scientifique ................................................................................................................................................................................... 2

4.3.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 2

4.3.2 Séquençage Sanger ........................................................................................................................................................... 2

4.3.3 Séquençage de nouvelle génération................................................................................................................... 3

4.4 Unités de mesure .................................................................................................................................................................................. 3

4.5 Applicabilité .............................................................................................................................................................................................. 3

4.5.1 Considérations relatives au produit carné ou au produit alimentaire ............................... 3

4.5.2 Plan d’échantillonnage .................................................................................................................................................. 3

4.5.3 Considérations génomiques ..................................................................................................................................... 4

4.5.4 Évaluation de la méthode ........................................................................................................................................... 4

4.6 Sélection et évaluation des amorces ................................................................................................................................... 4

4.7 Construction et évaluation de la base de données ................................................................................................. 4

4.8 Sélectivité et spécificité de la séquence nucléotidique ....................................................................................... 5

4.8.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 5

4.8.2 Exigences relatives aux essais d’inclusivité ............................................................................................... 5

4.8.3 Évaluation des interférences de l’ADN non-cible ................................................................................... 6

4.9 Sensibilité .................................................................................................................................................................................................... 6

4.9.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 6

4.9.2 Limite de détection .......................................................................................................................................................... 6

4.10 Robustesse ................................................................................................................................................................................................. 7

4.10.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 7

4.10.2 Détermination de la robustesse par une étude interlaboratoires.......................................... 7

4.10.3 Détermination de la robustesse par un essai orthogonal multifactoriel ......................... 7

5 Validation intralaboratoire ......................................................................................................................................................................7

6 Étude comparative interlaboratoires ............................................................................................................................................ 7

7 Exigences générales du laboratoire et du mode opératoire .................................................................................. 8

7.1 Généralités ................................................................................................................................................................................................. 8

7.2 Installations, matériaux et équipement ........................................................................................................................... 8

7.3 Préparation de l’échantillon ....................................................................................................................................................... 9

7.3.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 9

7.3.2 Catégorie A: échantillon mono-espèce constitué d’un seul morceau .................................. 9

7.3.3 Catégorie B: produit mono-espèce constitué de plusieurs morceaux ou

unités du même type de tissu ................................................................................................................................. 9

7.3.4 Catégorie C: produit traité contenant plusieurs espèces mélangées,
notamment produit d’origine non carnée, ou différents types de tissus

comme ingrédients ........................................................................................................................................... ............. 10

7.4 Extraction de l’ADN ......................................................................................................................................................................... 10

7.5 Processus de séquençage de l’ADN .................................................................................................................................... 10

7.5.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 10

7.5.2 Méthode de séquençage Sanger ......................................................................................................................... 11

7.5.3 Méthode de séquence de nouvelle génération .......................................................................................12

7.6 Analyse et interprétation des données de séquences d’ADN ..................................................................... 15

7.7 Expression des résultats ............................................................................................................................................................. 15

iii
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ISO 22949-1:2021(F)

8 Validation du pipeline bio-informatique du NGS ............................................................................................................15

8.1 Généralités .............................................................................................................................................................................................. 15

8.2 Mesures de qualité ........................................................................................................................................................................... 15

9 Rapport d’essai ...................................................................................................................................................................................................16

Annexe A (informative) Logigramme général du mode opératoire analytique du laboratoire ........17

Annexe B (informative) Comparaison entre le séquençage Sanger et le séquençagede

nouvelle génération .......................................................................................................................................................................................18

Annexe C (informative) Processus in silico pour la sélection d’une combinaison d’amorces .............19

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................20

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ISO 22949-1:2021(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir

www.iso.org/directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

Une liste de toutes les parties de la série ISO 22949 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO 22949-1:2021(F)
Introduction

Le présent document fournit des recommandations générales relatives au séquençage de l’acide

désoxyribonucléique (ADN) pour la détection ou l’identification d’espèces animales dans les aliments

et les aliments pour animaux. Le séquençage de l’ADN est le processus consistant à déterminer l’ordre

des quatre bases nucléotidiques (adénine, guanine, cytosine et thymine) dans un polymère d’acides

nucléiques. Les polymères d’acides nucléiques peuvent avoir une longueur variable, allant de quelques

nucléotides à plusieurs centaines de millions de bases.

Les techniques de séquençage rapide de l’ADN ont été validées et vérifiées avec succès pour détecter

[1]

et identifier les espèces animales dans les produits alimentaires. Dans l’industrie agroalimentaire,

l’accès rapide, économique et à haut débit aux séquences du génome entier dans les aliments a permis

[2]

d’améliorer le contrôle de la qualité et de la sécurité des aliments. Deux types de techniques de

séquençage de l’ADN sont couramment utilisées pour les produits alimentaires: le séquençage par

[3][4][5][6][7][8]
terminaison de chaîne et le séquençage à haut débit .

La terminaison de chaîne, mise au point par Frederick Sanger en 1977, porte encore son nom.

Les réactions de séquençage Sanger peuvent être préparées manuellement et les électrophérogrammes

peuvent être directement lus par l’utilisateur. Les systèmes d’électrophorèse capillaire avec détection

automatique de bases ont surtout remplacé les gels à lecture manuelle et des applications Sanger

rapides sont en cours de développement.

Le séquençage à haut débit ou de nouvelle génération (NGS), y compris les méthodes de nouvelle

génération à lecture courte et de troisième génération à lecture longue, ont permis de réduire le coût

de séquençage de l’ADN, d’améliorer la lisibilité des séquences et d’automatiser la plupart des étapes,

de la préparation à la bio-informatique. Le séquençage automatique à haut débit de l’ADN applique la

fluorescence spécifique à la base/longueur d’onde ou la détection ionique pour déterminer l’addition

enzymatique en temps réel de nucléotides à une matrice d’ADN.

Le séquençage Sanger (terminaison de chaîne didésoxy) génère des données de haute qualité pour

déterminer une seule séquence d’ADN d’une cible individuelle. En revanche, le NGS peut être utilisé pour

évaluer simultanément des millions de fragments d’ADN individuels de marqueurs et cibles mélangés.

Le séquençage Sanger et le NGS peuvent tous deux être utilisés pour vérifier la composition de l’espèce

animale dans un échantillon d’aliment et/ou pour comparer les résultats de séquençage de l’ADN avec

[9]

les bases de données précédemment définies afin d’identifier son origine animale .

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NORME INTERNATIONALE ISO 22949-1:2021(F)
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes
d’analyse pour la détection et l’identification d’espèces
animales dans les aliments et les aliments pour animaux
(méthodes basées sur le séquençage des nucléotides) —
Partie 1:
Exigences générales
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie les exigences générales relatives à la performance de la méthode

de séquençage de l’ADN pour la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments

et les aliments pour animaux. Les exigences de performance se limitent au séquençage Sanger et

au séquençage de nouvelle génération (NGS), y compris les séquençages de deuxième et troisième

générations, pour l’analyse de produits mono-espèces et de produits multi-espèces.

Le présent document est applicable aux séquences d’ADN de mammifères, oiseaux, poissons, mollusques,

crustacés, amphibiens, reptiles et insectes, ainsi qu’à la validation des méthodes correspondantes.

Les méthodes de quantification de l’espèce d’ADN ne font pas partie du domaine d’application du présent

document.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions

ISO 20813, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection et l’identification

des espèces animales dans les aliments et les produits alimentaires (méthodes basées sur l’utilisation des

acides nucléiques) — Exigences générales et définitions

ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16577 s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
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ISO 22949-1:2021(F)
4 Caractéristiques de performance des méthodes
4.1 Généralités

L’identité d’un organisme au niveau de l’espèce est établie par séquençage de l’ADN en comparant

les séquences d’ADN obtenues à partir d’échantillons ayant des séquences de référence connues.

Des résultats peuvent également être obtenus à plusieurs niveaux taxonomiques (par exemple l’ordre,

l’espèce, le genre, la famille), en fonction du type de base de données et de l’analyse de données ADN

effectuée.

Les méthodes utilisées pour identifier l’espèce animale par séquençage de l’ADN doivent être conformes

aux recommandations de performance fournies dans le présent document. Le processus de validation

de la méthode décrit dans le présent document, les études interlaboratoires et/ou intralaboratoires

doivent être utilisés pour déterminer et expliciter les caractéristiques de performance de la méthode

de séquençage.

Les produits mono-espèce qui ont été obtenus à partir d’un seul morceau de viande (par exemple le filet

de poisson, le filet de bœuf) sont analysés de façon optimale par séquençage Sanger, tandis que le NGS

est la méthode appropriée pour l’identification multi-espèces simultanée.
4.2 Adéquation à un but de la méthode

La méthode doit être adéquate pour l’identification d’organismes et de leur lien taxonomique avec

d’autres organismes. L’identification à des niveaux subspécifiques (par exemple la race) est possible

à condition que les bases de données et les analyses bio-informatiques soient disponibles. Les

informations concernant l’applicabilité et les limites de la méthode doivent être suffisamment étayées

pour répondre aux critères décrits dans le présent document. Il convient de déterminer et d’identifier

la/les plateforme(s) commerciale(s) de séquençage d’ADN convenant à tous les modes opératoires de

la méthode. L’ADN cible peut être localisé sur le génome nucléaire, mais également sur les génomes

mitochondriaux. Une technique de codage ou de métacodage à barres de l’ADN peut être utilisée en

[10][11]
fonction de la ou des région(s) allélique(s) à séquencer .
4.3 Base scientifique
4.3.1 Généralités

Un logigramme général du mode opératoire analytique de laboratoire est fourni à l’Annexe A.

4.3.2 Séquençage Sanger

Le séquençage Sanger repose sur une méthode par terminaison de chaîne pour déterminer la séquence

nucléotidique de l’ADN. L’allongement du brin répliqué d’ADN par l’ADN polymérase est interrompu par

l’incorporation de nucléotides non étirables qui mettent fin à la réplication successivement à chaque

position du fragment séquencé. Le marquage des quatre nucléotides non étirables (didésoxy-A, G, C et

T) permet de déterminer la taille moléculaire du fragment répliqué par électrophorèse.

NOTE 1 Le séquençage Sanger ne peut être utilisé que lorsqu’un échantillon contient du tissu d’une seule

espèce (par exemple un filet de poisson, un steak, une crevette), car plusieurs séquences cibles d’ADN dans un

même échantillon provenant de plusieurs espèces peuvent produire plusieurs produits de terminaison de chaîne

marqués à une extrémité de même longueur de chaîne. Plusieurs fragments de terminaison de chaîne de même

longueur de chaîne peuvent présenter deux bases terminées ou plus à chaque position et apparaissent par

électrophorèse sous forme de séquences convoluées ou chevauchantes. L’électrophérogramme de la réaction sera

probablement illisible et l’identification sera compromise.

Les plateformes de séquençage automatique Sanger sont disponibles depuis de nombreuses années

et sont utilisées pour le codage à barres de l’ADN afin d’identifier une seule espèce, par exemple pour

[12][13][14]
identifier une espèce de poisson .
[15]
NOTE 2 Par exemple, voir la CEN/TS 17303:2019 .
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ISO 22949-1:2021(F)
4.3.3 Séquençage de nouvelle génération

Le NGS, associé au métacodage à barres de l’ADN, permet une identification robuste et fiable des

espèces présentes dans les produits alimentaires complexes (contenant plusieurs espèces). Le NGS est

un terme commercial utilisé pour faire référence à des méthodes de séquençage de l’ADN à haut débit

[16]

(voir Annexe B). Il est aussi appelé «séquençage massivement parallèle». Les résultats prennent

généralement la forme d’un fichier texte contenant des millions de lectures de séquences individuelles.

Les plateformes disponibles dans le commerce prennent en charge les méthodes de séquençage NGS de

deuxième et troisième générations.

Le séquençage de deuxième génération repose sur l’analyse de fragments d’ADN courts générés par

réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou par un processus de fragmentation pour produire des

fragments pouvant atteindre une taille de 600 pb. Le séquençage de troisième génération est capable

d’analyser des fragments d’ADN bien plus longs, par exemple des génomes bactériens. Il est donc parfois

appelé «séquençage d’ADN à lecture longue».
4.4 Unités de mesure

Les lectures de séquences générées par séquençage Sanger ou par NGS sont comparées de manière

bio-informatique avec des séquences de référence préalablement déterminées et identifiées dans des

bases de données d’ADN. Le pourcentage de similarité entre la séquence de l’échantillon et la séquence

de référence est calculé. Deux séquences sont homologues si elles partagent une similarité supérieure

à celle qui pourrait être attribuée au simple hasard (p ≤ 0,01).

NOTE Un pourcentage de similarité supérieur à 98 % est généralement suffisant pour identifier des

séquences comme appartenant à la même espèce.

Les données d’identification doivent être fournies en tant que résultat qualitatif, sous la forme d’une

liste de taxons appropriés, avec les pourcentages de similarité correspondants et, suivant le cas, la

valeur attendue.
4.5 Applicabilité
4.5.1 Considérations relatives au produit carné ou au produit alimentaire

Il convient que la méthode contienne une définition de l’aliment ou du/des produit(s) alimentaire(s) qui

seront séquencés et, le cas échéant, des matières premières dont ils sont originaires, ainsi que toute

référence nécessaire aux processus de fabrication. Il sera également indiqué si l’échantillon ou les

échantillon(s) sera/seront composé(s) d’une seule espèce et/ou d’espèces mélangées.

4.5.2 Plan d’échantillonnage

Il convient que des échantillons représentatifs prélevés lors d’un plan d’échantillonnage approprié soient

fournis au laboratoire de séquençage. Il convient que des méthodes appropriées de sous-échantillonnage

d’échantillons pour laboratoire assurent la représentativité du résultat de séquençage. Le cas échéant,

il convient que les critères statistiques d’acceptation ou de rejet du résultat analytique incluent le plan

d’échantillonnage et le sous-échantillonnage. Il convient que les exigences et les limitations relatives à

la taille de l’échantillon pour laboratoire et au nombre d’éléments individuels composant l’échantillon,

ainsi qu’à la manipulation et au stockage de l’échantillon, soient évaluées et décrites en fonction:

— du degré de traitement des constituants de l’échantillon;
— des différentes espèces et des différents types de tissus animaux impliqués;
— de la nature des matrices d’échantillon;
— de la préparation de la matrice d’échantillon destinée à l’analyse.
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ISO 22949-1:2021(F)
4.5.3 Considérations génomiques

Lors de l’évaluation de l’adéquation d’une méthode, il convient de tenir compte des aspects suivants

concernant la nature de la région génomique à séquencer:

— la disposition cellulaire et génomique de la séquence, à savoir cellulaire (nucléaire ou mitochondriale)

ou génomique (allélique ou spécifique du gène);
— la longueur de la séquence qui sera déterminée;

— les types et la conception des séquences d’amorces utilisées pour la préparation et le séquençage de

l’échantillon et de la banque.
4.5.4 Évaluation de la méthode

L’applicabilité doit être soumise à essai en extrayant l’ADN des échantillons pour essai de matrices

représentatifs du domaine analytique de la méthode.

Les produits alimentaires hautement transformés peuvent contenir de l’ADN fragmenté et/ou

présenter une faible teneur en ADN, ce qui rend leur séquençage difficile. Pour compenser cela, des

stratégies peuvent être utilisées, par exemple le traitement d’une plus grande quantité d’échantillons,

la concentration d’extraits d’ADN, le travail avec de plus petites régions génomiques ciblées.

4.6 Sélection et évaluation des amorces

La sélection et l’évaluation des amorces sont les premières et principales étapes du processus

analytique de séquençage nucléotidique lorsqu’une technique de séquençage d’ADN par PCR est utilisée.

La conception de nouvelles amorces est une tâche bio-informatique effectuée à l’aide d’un logiciel dédié.

Il existe de nombreux outils de sélection des amorces dans le commerce et disponibles gratuitement,

par exemple Primer-BLAST et Primer 3. Les facteurs de conception d’amorces suivants influencent

la performance des amorces: structures secondaires, appariements partiels de séquences, épingles à

cheveux, pourcentage de GC, etc.

NOTE 1 La conception et la sélection des amorces ne sont pas considérées comme faisant partie du processus

de sélection des régions génomiques à séquencer dans la technique NGS de troisième génération et dans la

stratégie de fragmentation de l’ADN, par exemple le NGS de deuxième génération et le séquençage shotgun.

Des amorces universelles (consensus) peuvent être définies pour n’importe quel niveau taxonomique

(espèce, genre, famille, ordre, classe, domaine, etc.). La conception de ces amorces repose sur les

aligne
...

FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 22949-1
ISO/TC 34/SC 16
Molecular biomarker analysis —
Secretariat: ANSI
Methods of analysis for the detection
Voting begins on:
2021-08-07 and identification of animal species in
foods and food products (nucleotide
Voting terminates on:
2021-10-02
sequencing-based methods) —
Part 1:
General requirements
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour
la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments
et les produits alimentaires (méthodes basées sur le séquençage des
nucléotides) —
Partie 1: Exigences générales
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO-
ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN-
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
NATIONAL REGULATIONS. ISO 2021
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

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Published in Switzerland
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Performance characteristics of the methods .......................................................................................................................... 1

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 1

4.2 Fitness for purpose of the method ......................................................................................................................................... 2

4.3 Scientific basis ......................................................................................................................................................................................... 2

4.3.1 General...................................................................................................................................................................................... 2

4.3.2 Sanger sequencing .................. .................................................... .................................................................................... 2

4.3.3 Next generation sequencing .................................................................................................................................. 2

4.4 Units of measurement ......... .............................................................................................................................................................. 3

4.5 Applicability .............................................................................................................................................................................................. 3

4.5.1 Meat or food product considerations ............................................................................................................. 3

4.5.2 Sampling plan ..................................................................................................................................................................... 3

4.5.3 Genomic considerations ............................................................................................................................................ 3

4.5.4 Method testing ................................................................................................................................................................... 3

4.6 Primer selection and evaluation .............................................................................................................................................. 4

4.7 Database construction and evaluation ............................................................................................................................... 4

4.8 Selectivity and nucleotide sequence specificity ......................................................................................................... 5

4.8.1 General...................................................................................................................................................................................... 5

4.8.2 Requirements for inclusivity testing .............................................................................................................. 5

4.8.3 Evaluation of non-targeted DNA interference ........................................................................................ 5

4.9 Sensitivity .................................................................................................................................................................................................... 6

4.9.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

4.9.2 Limit of detection ............................................................................................................................................................ 6

4.10 Robustness ................................................................................................................................................................................................. 6

4.10.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

4.10.2 Robustness determination by inter-laboratory study ..................................................................... 6

4.10.3 Robustness determination by a multifactorial orthogonal test design ............................ 7

5 Single-laboratory validation .................................................................................................................................................................... 7

6 Interlaboratory study (collaborative study) ............................................................................................................................ 7

7 General laboratory and procedural requirements ........................................................................................................... 7

7.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7

7.2 Facilities, materials and equipment ...................................................................................................................................... 8

7.3 Sample preparation ............................................................................................................................................................................ 8

7.3.1 General...................................................................................................................................................................................... 8

7.3.2 Category A: single species sample consisting of a single piece................................................ 8

7.3.3 Category B: single species product composed by several pieces or units of

the same type of tissue ............................................................................................................................................... 9

7.3.4 Category C: multiple mixed species processed product including those of

non-meat origin or different types of tissues as ingredients .................................................... 9

7.4 DNA extraction ........................................................................................................................................................................................ 9

7.5 DNA sequencing workflow ........................................................................................................................................................10

7.5.1 General...................................................................................................................................................................................10

7.5.2 Sanger sequencing method ..................................................................................................................................10

7.5.3 Next generation sequencing method ..........................................................................................................11

7.6 DNA sequence data analysis and interpretation .....................................................................................................14

7.7 Expression of results .......................................................................................................................................................................14

8 Validation of the NGS bioinformatics pipeline ...................................................................................................................14

© ISO 2021 – All rights reserved iii
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................14

8.2 Quality metrics .....................................................................................................................................................................................14

9 Test report ................................................................................................................................................................................................................15

Annex A (informative) General workflow of the laboratory analytical procedure ...........................................16

Annex B (informative) Comparison between Sanger sequencing and next generation

sequencing ...............................................................................................................................................................................................................17

Annex C (informative) In silico workflow for primer set selection ...................................................................................18

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................20

iv © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
A list of all parts in the ISO 22949 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
© ISO 2021 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
Introduction

This document provides general guidance for deoxyribonucleic acid (DNA) sequencing for animal

species detection or identification, or both, in food and feed products. DNA sequencing is the process of

determining the order of the four nucleotide bases (adenine, guanine, cytosine and thymine) in a nucleic

acid polymer. Nucleic acid polymers can range in length from a few nucleotides to hundreds of millions

of bases.

Rapid DNA sequencing methods have been successfully validated and verified for detection and

[1]

identification of animal species in food products . Within the food industry, rapid, economical and

high throughput access to whole genome sequences in foods has improved the control of both food

[2]

quality and safety . Two types of DNA sequencing methods are most widely used for food products:

[3][4][5][6][7][8]
chain termination and high throughput sequencing .

Chain termination developed in 1977 by Frederick Sanger still bears his name. Sanger sequencing

reactions can be prepared manually and electropherograms can be read directly by the user. Automated

base calling capillary electrophoresis systems have mostly replaced manually read gels and rapid

Sanger applications are being developed.

High throughput or next generation sequencing (NGS), including next generation short-read and third

generation long-read methods, has reduced the cost of DNA sequencing, improved sequence readability

and automated most of the steps from preparatory to bioinformatics. High throughput automated DNA

sequencing applies base/wavelength specific fluorescence or ionic detection to determine the real-time

enzymatic addition of nucleotides to a DNA template.

Sanger sequencing (dideoxy chain termination) generates high quality data for determining a single

DNA sequence of an individual target. NGS, by contrast, can be used to assess millions of individual DNA

fragments of mixed markers and targets at the same time.

Sanger sequencing and NGS can both be used to verify animal species composition in a food sample or

[9]

compare DNA sequence results to previously defined databases to identify its animal origin, or both .

vi © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis
for the detection and identification of animal species in
foods and food products (nucleotide sequencing-based
methods) —
Part 1:
General requirements
1 Scope

This document specifies general requirements for DNA sequencing method performance in the

detection and identification of animal species in food and feed products. Performance requirements

are limited to Sanger and next generation sequencing (NGS), including second and third generation

sequencing, for analysis of single species products and multispecies products.

This document is applicable to DNA sequences for mammals, birds, fish, molluscs, crustaceans,

amphibians, reptiles and insects, and to the validation of the applicable methods.

Methods for DNA species quantification are not considered under the scope of this document.

2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions

ISO 20813, Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection and identification

of animal species in foods and food products (nucleic acid-based methods) — General requirements and

definitions

ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Nucleic acid extraction
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Performance characteristics of the methods
4.1 General

The identity of an organism at the species level is established by DNA sequencing through the

comparison of DNA sequences obtained from samples with known reference sequences. Results can

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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)

also be obtained at multiple taxonomic levels (e.g. order, species, genus, family), depending on the type

of database and DNA data analysis performed.

Methods used for animal species identification by DNA sequencing shall meet the performance guidance

provided in this document. The method validation process described in this document, interlaboratory

collaborative or single-laboratory studies or both shall be used to determine and elucidate sequencing

method performance characteristics.

Single species products that have been produced from one piece of meat (e.g. fish fillet, beef tenderloin)

are most appropriately analysed by Sanger sequencing, while NGS is the appropriate method for

simultaneous multispecies identification.
4.2 Fitness for purpose of the method

The method shall be fit for purpose for the identification of organisms and their taxonomic relationship

with other organisms. Identification at the sub-specific levels (e.g. breeds) can be included provided

that the databases and bioinformatic analyses are available. Information regarding the applicability

and limitations of the method shall be documented sufficiently to fulfil the criteria described in this

document. The appropriate commercial DNA sequencing platform(s) suitable for use in all method

procedures should be determined and identified. The target DNA can be located on the nuclear genome,

but also on the mitochondrial genomes. A DNA barcoding or metabarcoding approach can be used

[10][11]
based on one or more allelic regions to be sequenced .
4.3 Scientific basis
4.3.1 General

A general workflow of the laboratory analytical procedure is provided in Annex A.

4.3.2 Sanger sequencing

Sanger sequencing is based on a chain termination method for determining the nucleotide sequence of

DNA. Elongation of the replicated strand of DNA by DNA polymerase is interrupted by the incorporation

of non-elongatable nucleotides that terminate replication successively at each position of the sequenced

fragment. Labelling the four non-elongatable nucleotides (dideoxy-A, G, C and T) permits determination

of the molecular size of the replicated fragment by electrophoresis.

NOTE 1 Sanger sequencing can only be used when a sample contains tissue from a unique single species (e.g.

one fish fillet, one steak, one shrimp), because multiple DNA target sequences in the same sample from more than

one species can produce more than one end labelled chain terminated product of the same chain length. Multiple

chain terminated fragments of the same chain length can present two or more terminated bases at each position

and appear electrophoretically as convoluted or overlapping sequences. The electropherogram for the reaction is

unlikely to be readable and the identification will be compromised.

Automated Sanger sequencing platforms have been available for many years and have appropriately

[12][13][14]

been used for DNA barcoding to identify a single species, e.g. for fish species identification .

[15]
NOTE 2 For an example, see CEN/TS 17303:2019 .
4.3.3 Next generation sequencing

NGS in combination with DNA metabarcoding enables the robust and reliable identification of species

in complex food products (containing multiple species). NGS is a commercial term used to reference

[16]

high throughput DNA sequencing methods (see Annex B) . It is alternatively referred to as “massively

parallel sequencing”. Results usually take the form of a text file with millions of individual sequence

reads. Commercially available platforms support second and third generation NGS sequencing methods.

Second generation sequencing is based on the analysis of short DNA fragments generated by a

polymerase chain reaction (PCR) or a fragmentation process to produce fragments of up to 600 bp in

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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)

size. Third generation sequencing is capable of analysing much longer DNA fragments (e.g. bacterial

genomes) and consequently is sometimes referred to as “long-read DNA sequencing”.

4.4 Units of measurement

Sequence reads generated by Sanger sequencing or NGS methods are compared bioinformatically

to previously determined and identified reference sequences in DNA databases. Percent similarity

between the sample and reference sequences is calculated. Two sequences are homologous if they share

more similarity than would be expected by chance (p ≤ 0,01).

NOTE A percent similarity greater than 98 % is usually sufficient to identify sequences as the same species.

Identification data shall be provided as a qualitative result, in the form of list of appropriate taxa, their

respective percent similarity and, as appropriate, the expected value.
4.5 Applicability
4.5.1 Meat or food product considerations

The method should contain a definition of the food or food product(s) that will be sequenced and, where

appropriate, the raw materials from which it is derived and any necessary references to manufacturing

processes. In addition, whether the sample(s) will be composed of a single species or mixed species or

both.
4.5.2 Sampling plan

Representative samples taken through an applicable sampling plan should be provided to the

sequencing laboratory. Appropriate methods for subsampling laboratory samples should continue to

ensure the representativeness of the sequencing result. If applicable, statistical criteria for acceptance

or rejection of the analytical result should include the sampling plan and subsampling. Requirements

and limitations for the laboratory sample size and number of individual items forming the sample, and

the handling of the sample and its storage, should be evaluated and described based upon:

— the degree of processing of the sample constituents;
— the different species and animal tissue types involved;
— the nature of the sample matrices;
— the preparation of the sample matrix for analysis.
4.5.3 Genomic considerations

When assessing whether a method is fit for purpose, the following aspects regarding the nature of the

genomic region to be sequenced should be considered:

— the cellular and genomic disposition of the sequence, i.e. cellular: nuclear or mitochondrial, or

genomic: allelic or gene specific;
— the length of the sequence that will be determined;

— the types and design of primer sequences used for sample and library preparation and sequencing.

4.5.4 Method testing

Applicability shall be tested by extracting DNA from matrix-matched test samples representative of the

analytical scope of the method.
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)

Highly processed food products can have fragmented DNA or low DNA concentration or both, making

them difficult to sequence. To compensate, some strategies can be employed, e.g. process more samples,

concentrate DNA extracts, work with smaller targeted genomic regions.
4.6 Primer selection and evaluation

Primer selection and evaluation is the first and most important step in the nucleotide sequencing

analytical workflow when a PCR-based DNA sequencing technology is used. The design of new primers

is a bioinformatics task performed using applicable software. There are many commercial and freely

available primer selection tools, e.g. Primer-BLAST and Primer 3. The following primer design factors

affect primer performance: secondary structures, partial sequence matches, hairpins, GC content, etc.

NOTE 1 Primer design and selection is not considered as part of the workflow to select genomic regions to be

sequenced in third generation NGS technology and the DNA fragmentation strategy, e.g. second generation based

NGS, shotgun sequencing.

Universal (consensus) primers can be defined for any taxonomic level (species, genus, family, order,

class, domain, etc). The design of these primers is based on DNA sequence alignments and identification

of consensus regions that are almost identical amongst the taxa to be identified. Degenerate primers

can be designed to increase the universality of the primers. Determining the number of degenerations

included in a single primer to avoid non-specific binding requires evaluation of unspecific annealing.

Primers should be evaluated in silico irrespective of their use in the laboratory workflow. They shall be

assessed using appropriate bioinformatics tools for their match with the species (taxon) to be detected/

identified.

NOTE 2 An example of an in silico workflow for primer set selection is shown in Annex C.

The final evaluation of the performance of each set of primers should be done by applying the laboratory

workflow using reference DNA or tissue material (whenever it is available) representative of the

identifiable group of species (taxa).
4.7 Database construction and evaluation

The DNA database used for species detection or identification or both will determine the number of

different species identifiable by the laboratory workflow. Database construction and evaluation is a

bioinformatics task and many different tools can be used, including in-house developed software.

Publicly available databases can also be used, e.g. GenBank. The databases should have the following

information available:
— the species list;
— the number of different entries for each species;
— the DNA region(s), gene(s) and length of DNA sequences;
— a measure of the validation quality of the sequence entry(ies).

The final performance evaluation of a bioinformatics search of a database shall be done by applying the

laboratory workflow using reference material (whenever possible) that is representative of the species

included in the database (vouchered). The use of higher taxonomic levels is appropriate when the

identification at the species is inconclusive, i.e. when the sample is not differentiable by a more targeted

search. In GenBank, the designation “Bos sp.” can be used as the search term for all of the species of the

genus Bos.
4 © ISO 2021 – All rights reserved
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...

PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 22949-1
ISO/TC 34/SC 16
Analyse moléculaire de
Secrétariat: ANSI
biomarqueurs — Méthodes d’analyse
Début de vote:
2021-08-07 pour la détection et l’identification
d’espèces animales dans les
Vote clos le:
2021-10-02
aliments et les produits alimentaires
(méthodes basées sur le séquençage
des nucléotides) —
Partie 1:
Exigences générales
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection
and identification of animal species in foods and food products
(nucleotide sequencing-based methods) —
Part 1: General requirements
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
TION NATIONALE. ISO 2021
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
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Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Caractéristiques de performance des méthodes ................................................................................................................ 2

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

4.2 Adéquation à un but de la méthode ...................................................................................................................................... 2

4.3 Base scientifique .................................................................................................................................................................................... 2

4.3.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 2

4.3.2 Séquençage Sanger ........................................................................................................................................................ 2

4.3.3 Séquençage de nouvelle génération ................................................................................................................ 3

4.4 Unités de mesure ................................................................................................................................................................................... 3

4.5 Applicabilité .............................................................................................................................................................................................. 3

4.5.1 Considérations relatives au produit carné ou au produit alimentaire .............................. 3

4.5.2 Plan d’échantillonnage ............................................................................................................................................... 3

4.5.3 Considérations génomiques ................................................................................................................................... 4

4.5.4 Évaluation de la méthode ......................................................................................................................................... 4

4.6 Sélection et évaluation des amorces .................................................................................................................................... 4

4.7 Construction et évaluation de la base de données ................................................................................................... 4

4.8 Sélectivité et spécificité de la séquence nucléotidique ......... ................................................................................ 5

4.8.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 5

4.8.2 Exigences relatives aux essais d’inclusivité .............................................................................................. 5

4.8.3 Évaluation des interférences de l’ADN non-cible ................................................................................. 6

4.9 Sensibilité .................................................................................................................................................................................................... 6

4.9.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 6

4.9.2 Limite de détection ........................................................................................................................................................ 6

4.10 Robustesse .................................................................................................................................................................................................. 7

4.10.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 7

4.10.2 Détermination de la robustesse par une étude interlaboratoires ......................................... 7

4.10.3 Détermination de la robustesse par un essai orthogonal multifactoriel ......................... 7

5 Validation intralaboratoire ....................................................................................................................................................................... 7

6 Étude comparative interlaboratoires ............................................................................................................................................. 7

7 Exigences générales du laboratoire et du mode opératoire ................................................................................... 8

7.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 8

7.2 Installations, matériaux et équipement............................................................................................................................. 8

7.3 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 9

7.3.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 9

7.3.2 Catégorie A: échantillon mono-espèce constitué d’un seul morceau ................................. 9

7.3.3 Catégorie B: produit mono-espèce constitué de plusieurs morceaux ou

unités du même type de tissu ............................................................................................................................... 9

7.3.4 Catégorie C: produit traité contenant plusieurs espèces mélangées,
notamment produit d’origine non carnée, ou différents types de tissus

comme ingrédients .....................................................................................................................................................10

7.4 Extraction de l’ADN ...........................................................................................................................................................................10

7.5 Processus de séquençage de l’ADN .....................................................................................................................................10

7.5.1 Généralités .........................................................................................................................................................................10

7.5.2 Méthode de séquençage Sanger ......................................................................................................................11

7.5.3 Méthode de séquence de nouvelle génération ....................................................................................12

7.6 Analyse et interprétation des données de séquences d’ADN .......................................................................15

7.7 Expression des résultats ..............................................................................................................................................................15

© ISO 2021 – Tous droits réservés iii
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)

8 Validation du pipeline bio-informatique du NGS.............................................................................................................15

8.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................15

8.2 Mesures de qualité ............................................................................................................................................................................15

9 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................16

Annexe A (informative) Logigramme général du mode opératoire analytique du laboratoire ...........17

Annexe B (informative) Comparaison entre le séquençage Sanger et le séquençagede

nouvelle génération........................................................................................................................................................................................18

Annexe C (informative) Processus in silico pour la sélection d’une combinaison d’amorces ...............19

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................20

iv © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

Une liste de toutes les parties de la série ISO 22949 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
© ISO 2021 – Tous droits réservés v
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
Introduction

Le présent document fournit des recommandations générales relatives au séquençage de l’acide

désoxyribonucléique (ADN) pour la détection ou l’identification d’espèces animales dans les aliments

et les produits alimentaires. Le séquençage de l’ADN est le processus consistant à déterminer l’ordre

des quatre bases nucléotidiques (adénine, guanine, cytosine et thymine) dans un polymère d’acides

nucléiques. Les polymères d’acides nucléiques peuvent avoir une longueur variable, allant de quelques

nucléotides à plusieurs centaines de millions de bases.

Les techniques de séquençage rapide de l’ADN ont été validées et vérifiées avec succès pour détecter

[1]

et identifier les espèces animales dans les produits alimentaires. Dans l’industrie agroalimentaire,

l’accès rapide, économique et à haut débit aux séquences du génome entier dans les aliments a permis

[2]

d’améliorer le contrôle de la qualité et de la sécurité des aliments. Deux types de techniques de

séquençage de l’ADN sont couramment utilisées pour les produits alimentaires: le séquençage par

[3][4][5][6][7][8]
terminaison de chaîne et le séquençage à haut débit .

La terminaison de chaîne, mise au point par Frederick Sanger en 1977, porte encore son nom.

Les réactions de séquençage Sanger peuvent être préparées manuellement et les électrophérogrammes

peuvent être directement lus par l’utilisateur. Les systèmes d’électrophorèse capillaire avec détection

automatique de bases ont surtout remplacé les gels à lecture manuelle et des applications Sanger

rapides sont en cours de développement.

Le séquençage à haut débit ou de nouvelle génération (NGS), y compris les méthodes de nouvelle

génération à lecture courte et de troisième génération à lecture longue, ont permis de réduire le coût

de séquençage de l’ADN, d’améliorer la lisibilité des séquences et d’automatiser la plupart des étapes,

de la préparation à la bio-informatique. Le séquençage automatique à haut débit de l’ADN applique la

fluorescence spécifique à la base/longueur d’onde ou la détection ionique pour déterminer l’addition

enzymatique en temps réel de nucléotides à une matrice d’ADN.

Le séquençage Sanger (terminaison de chaîne didésoxy) génère des données de haute qualité pour

déterminer une seule séquence d’ADN d’une cible individuelle. En revanche, le NGS peut être utilisé pour

évaluer simultanément des millions de fragments d’ADN individuels de marqueurs et cibles mélangés.

Le séquençage Sanger et le NGS peuvent tous deux être utilisés pour vérifier la composition de l’espèce

animale dans un échantillon d’aliment et/ou pour comparer les résultats de séquençage de l’ADN avec

[9]

les bases de données précédemment définies afin d’identifier son origine animale .

vi © ISO 2021 – Tous droits réservés
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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes
d’analyse pour la détection et l’identification d’espèces
animales dans les aliments et les produits alimentaires
(méthodes basées sur le séquençage des nucléotides) —
Partie 1:
Exigences générales
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie les exigences générales relatives à la performance de la méthode de

séquençage de l’ADN pour la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments et les

produits alimentaires. Les exigences de performance se limitent au séquençage Sanger et au séquençage

de nouvelle génération (NGS), y compris les séquençages de deuxième et troisième générations, pour

l’analyse de produits mono-espèces et de produits multi-espèces.

Le présent document est applicable aux séquences d’ADN de mammifères, oiseaux, poissons, mollusques,

crustacés, amphibiens, reptiles et insectes, ainsi qu’à la validation des méthodes correspondantes.

Les méthodes de quantification de l’espèce d’ADN ne font pas partie du domaine d’application du présent

document.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions

ISO 20813, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d'analyse pour la détection et l'identification

des espèces animales dans les aliments et les produits alimentaires (méthodes basées sur l'utilisation des

acides nucléiques) — Exigences générales et définitions

ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 16577 s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
4 Caractéristiques de performance des méthodes
4.1 Généralités

L’identité d’un organisme au niveau de l’espèce est établie par séquençage de l’ADN en comparant

les séquences d’ADN obtenues à partir d’échantillons ayant des séquences de référence connues.

Des résultats peuvent également être obtenus à plusieurs niveaux taxonomiques (par exemple l’ordre,

l’espèce, le genre, la famille), en fonction du type de base de données et de l’analyse de données ADN

effectuée.

Les méthodes utilisées pour identifier l’espèce animale par séquençage de l’ADN doivent être conformes

aux recommandations de performance fournies dans le présent document. Le processus de validation

de la méthode décrit dans le présent document, les études interlaboratoires et/ou intralaboratoires

doivent être utilisés pour déterminer et expliciter les caractéristiques de performance de la méthode

de séquençage.

Les produits mono-espèce qui ont été obtenus à partir d’un seul morceau de viande (par exemple le filet

de poisson, le filet de bœuf) sont analysés de façon optimale par séquençage Sanger, tandis que le NGS

est la méthode appropriée pour l’identification multi-espèces simultanée.
4.2 Adéquation à un but de la méthode

La méthode doit être adéquate pour l’identification d’organismes et de leur lien taxonomique avec

d’autres organismes. L’identification à des niveaux subspécifiques (par exemple la race) est possible

à condition que les bases de données et les analyses bio-informatiques soient disponibles. Les

informations concernant l’applicabilité et les limites de la méthode doivent être suffisamment étayées

pour répondre aux critères décrits dans le présent document. Il convient de déterminer et d’identifier

la/les plateforme(s) commerciale(s) de séquençage d’ADN convenant à tous les modes opératoires de

la méthode. L’ADN cible peut être localisé sur le génome nucléaire, mais également sur les génomes

mitochondriaux. Une technique de codage ou de métacodage à barres de l’ADN peut être utilisée en

[10][11]
fonction de la ou des région(s) allélique(s) à séquencer .
4.3 Base scientifique
4.3.1 Généralités

Un logigramme général du mode opératoire analytique de laboratoire est fourni à l’Annexe A.

4.3.2 Séquençage Sanger

Le séquençage Sanger repose sur une méthode par terminaison de chaîne pour déterminer la séquence

nucléotidique de l’ADN. L’allongement du brin répliqué d’ADN par l’ADN polymérase est interrompu par

l’incorporation de nucléotides non étirables qui mettent fin à la réplication successivement à chaque

position du fragment séquencé. Le marquage des quatre nucléotides non étirables (didésoxy-A, G, C et

T) permet de déterminer la taille moléculaire du fragment répliqué par électrophorèse.

NOTE 1 Le séquençage Sanger ne peut être utilisé que lorsqu’un échantillon contient du tissu d’une seule

espèce (par exemple un filet de poisson, un steak, une crevette), car plusieurs séquences cibles d’ADN dans un

même échantillon provenant de plusieurs espèces peuvent produire plusieurs produits de terminaison de chaîne

marqués à une extrémité de même longueur de chaîne. Plusieurs fragments de terminaison de chaîne de même

longueur de chaîne peuvent présenter deux bases terminées ou plus à chaque position et apparaissent par

électrophorèse sous forme de séquences convoluées ou chevauchantes. L’électrophérogramme de la réaction sera

probablement illisible et l’identification sera compromise.

Les plateformes de séquençage automatique Sanger sont disponibles depuis de nombreuses années

et sont utilisées pour le codage à barres de l’ADN afin d’identifier une seule espèce, par exemple pour

[12][13][14]
identifier une espèce de poisson .
[15]
NOTE 2 Par exemple, voir la CEN/TS 17303:2019 .
2 © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
4.3.3 Séquençage de nouvelle génération

Le NGS, associé au métacodage à barres de l’ADN, permet une identification robuste et fiable des

espèces présentes dans les produits alimentaires complexes (contenant plusieurs espèces). Le NGS est

un terme commercial utilisé pour faire référence à des méthodes de séquençage de l’ADN à haut débit

[16]

(voir Annexe B). Il est aussi appelé «séquençage massivement parallèle». Les résultats prennent

généralement la forme d’un fichier texte contenant des millions de lectures de séquences individuelles.

Les plateformes disponibles dans le commerce prennent en charge les méthodes de séquençage NGS de

deuxième et troisième générations.

Le séquençage de deuxième génération repose sur l’analyse de fragments d’ADN courts générés par

réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou par un processus de fragmentation pour produire des

fragments pouvant atteindre une taille de 600 pb. Le séquençage de troisième génération est capable

d’analyser des fragments d’ADN bien plus longs, par exemple des génomes bactériens. Il est donc parfois

appelé «séquençage d’ADN à lecture longue».
4.4 Unités de mesure

Les lectures de séquences générées par séquençage Sanger ou par NGS sont comparées de manière

bio-informatique avec des séquences de référence préalablement déterminées et identifiées dans des

bases de données d’ADN. Le pourcentage de similarité entre la séquence de l’échantillon et la séquence

de référence est calculé. Deux séquences sont homologues si elles partagent une similarité supérieure

à celle qui pourrait être attribuée au simple hasard (p ≤ 0,01).

NOTE Un pourcentage de similarité supérieur à 98 % est généralement suffisant pour identifier des

séquences comme appartenant à la même espèce.

Les données d’identification doivent être fournies en tant que résultat qualitatif, sous la forme d’une

liste de taxons appropriés, avec les pourcentages de similarité correspondants et, suivant le cas, la

valeur attendue.
4.5 Applicabilité
4.5.1 Considérations relatives au produit carné ou au produit alimentaire

Il convient que la méthode contienne une définition de l’aliment ou du/des produit(s) alimentaire(s) qui

seront séquencés et, le cas échéant, des matières premières dont ils sont originaires, ainsi que toute

référence nécessaire aux processus de fabrication. Il sera également indiqué si l’échantillon ou les

échantillon(s) sera/seront composé(s) d’une seule espèce et/ou d’espèces mélangées.

4.5.2 Plan d’échantillonnage

Il convient que des échantillons représentatifs prélevés lors d’un plan d’échantillonnage approprié soient

fournis au laboratoire de séquençage. Il convient que des méthodes appropriées de sous-échantillonnage

d’échantillons pour laboratoire assurent la représentativité du résultat de séquençage. Le cas échéant,

il convient que les critères statistiques d’acceptation ou de rejet du résultat analytique incluent le plan

d’échantillonnage et le sous-échantillonnage. Il convient que les exigences et les limitations relatives à

la taille de l’échantillon pour laboratoire et au nombre d’éléments individuels composant l’échantillon,

ainsi qu’à la manipulation et au stockage de l’échantillon, soient évaluées et décrites en fonction:

— du degré de traitement des constituants de l’échantillon;
— des différentes espèces et des différents types de tissus animaux impliqués;
— de la nature des matrices d’échantillon;
— de la préparation de la matrice d’échantillon destinée à l’analyse.
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
4.5.3 Considérations génomiques

Lors de l’évaluation de l’adéquation d’une méthode, il convient de tenir compte des aspects suivants

concernant la nature de la région génomique à séquencer:

— la disposition cellulaire et génomique de la séquence, à savoir cellulaire (nucléaire ou mitochondriale)

ou génomique (allélique ou spécifique du gène);
— la longueur de la séquence qui sera déterminée;

— les types et la conception des séquences d’amorces utilisées pour la préparation et le séquençage de

l’échantillon et de la banque.
4.5.4 Évaluation de la méthode

L’applicabilité doit être soumise à essai en extrayant l’ADN des échantillons pour essai de matrices

représentatifs du domaine analytique de la méthode.

Les produits alimentaires hautement transformés peuvent contenir de l’ADN fragmenté et/ou

présenter une faible teneur en ADN, ce qui rend leur séquençage difficile. Pour compenser cela, des

stratégies peuvent être utilisées, par exemple le traitement d’une plus grande quantité d’échantillons,

la concentration d’extraits d’ADN, le travail avec de plus petites régions génomiques ciblées.

4.6 Sélection et évaluation des amorces

La sélection et l’évaluation des amorces sont les premières et principales étapes du processus

analytique de séquençage nucléotidique lorsqu’une technique de séquençage d’ADN par PCR est utilisée.

La conception de nouvelles amorces est une tâche bio-informatique effectuée à l’aide d’un logiciel dédié.

Il existe de nombreux outils de sélection des amorces dans le commerce et disponibles gra

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