ISO 22949-1:2021
(Main)Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection and identification of animal species in food and feed products (nucleotide sequencing-based methods) — Part 1: General requirements
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection and identification of animal species in food and feed products (nucleotide sequencing-based methods) — Part 1: General requirements
This document specifies general requirements for DNA sequencing method performance in the detection and identification of animal species in food and feed products. Performance requirements are limited to Sanger and next generation sequencing (NGS), including second and third generation sequencing, for analysis of single species products and multispecies products. This document is applicable to DNA sequences for mammals, birds, fish, molluscs, crustaceans, amphibians, reptiles and insects, and to the validation of the applicable methods. Methods for DNA species quantification are not considered under the scope of this document.
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments et les aliments pour animaux (méthodes basées sur le séquençage des nucléotides) — Partie 1: Exigences générales
Le présent document spécifie les exigences générales relatives à la performance de la méthode de séquençage de l’ADN pour la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments et les produits alimentaires. Les exigences de performance se limitent au séquençage Sanger et au séquençage de nouvelle génération (NGS), y compris les séquençages de deuxième et troisième générations, pour l’analyse de produits mono-espèces et de produits multi-espèces. Le présent document est applicable aux séquences d’ADN de mammifères, oiseaux, poissons, mollusques, crustacés, amphibiens, reptiles et insectes, ainsi qu’à la validation des méthodes correspondantes. Les méthodes de quantification de l’espèce d’ADN ne font pas partie du domaine d’application du présent document.
General Information
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22949-1
First edition
2021-10
Molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection
and identification of animal species
in food and feed products (nucleotide
sequencing-based methods) —
Part 1:
General requirements
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la
détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments et
les aliments pour animaux (méthodes basées sur le séquençage des
nucléotides) —
Partie 1: Exigences générales
Reference number
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ISO 22949-1:2021(E)
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .v
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Performance characteristics of the methods . 1
4.1 General . 1
4.2 Fitness for purpose of the method . 2
4.3 Scientific basis . 2
4.3.1 General . 2
4.3.2 Sanger sequencing . 2
4.3.3 Next generation sequencing . 2
4.4 Units of measurement . 3
4.5 Applicability . 3
4.5.1 Meat or food product considerations . 3
4.5.2 Sampling plan . 3
4.5.3 Genomic considerations . 3
4.5.4 Method testing . 3
4.6 Primer selection and evaluation . 4
4.7 Database construction and evaluation . 4
4.8 Selectivity and nucleotide sequence specificity . 5
4.8.1 General . 5
4.8.2 Requirements for inclusivity testing . 5
4.8.3 Evaluation of non-targeted DNA interference . 5
4.9 Sensitivity . 6
4.9.1 General . 6
4.9.2 Limit of detection . 6
4.10 Robustness . 6
4.10.1 General . 6
4.10.2 Robustness determination by inter-laboratory study . 6
4.10.3 Robustness determination by a multifactorial orthogonal test design . 7
5 Single-laboratory validation . 7
6 Interlaboratory study (collaborative study) . 7
7 General laboratory and procedural requirements . 7
7.1 General . 7
7.2 Facilities, materials and equipment . 8
7.3 Sample preparation . 8
7.3.1 General . 8
7.3.2 Category A: single species sample consisting of a single piece . 8
7.3.3 Category B: single species product composed by several pieces or units of
the same type of tissue . 9
7.3.4 Category C: multiple mixed species processed product including those of
non-meat origin or different types of tissues as ingredients . 9
7.4 DNA extraction . 9
7.5 DNA sequencing workflow. 10
7.5.1 General . 10
7.5.2 Sanger sequencing method . 10
7.5.3 Next generation sequencing method . 11
7.6 DNA sequence data analysis and interpretation . 14
7.7 Expression of results . . 14
8 Validation of the NGS bioinformatics pipeline .14
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ISO 22949-1:2021(E)
8.1 General . 14
8.2 Quality metrics . 14
9 Test report .15
Annex A (informative) General workflow of the laboratory analytical procedure .16
Annex B (informative) Comparison between Sanger sequencing and next generation
sequencing .17
Annex C (informative) In silico workflow for primer set selection .18
Bibliography .20
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ISO 22949-1:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
A list of all parts in the ISO 22949 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO 22949-1:2021(E)
Introduction
This document provides general guidance for deoxyribonucleic acid (DNA) sequencing for animal
species detection or identification, or both, in food and feed products. DNA sequencing is the process of
determining the order of the four nucleotide bases (adenine, guanine, cytosine and thymine) in a nucleic
acid polymer. Nucleic acid polymers can range in length from a few nucleotides to hundreds of millions
of bases.
Rapid DNA sequencing methods have been successfully validated and verified for detection and
[1]
identification of animal species in food products . Within the food industry, rapid, economical and
high throughput access to whole genome sequences in foods has improved the control of both food
[2]
quality and safety . Two types of DNA sequencing methods are most widely used for food products:
[3][4][5][6][7][8]
chain termination and high throughput sequencing .
Chain termination developed in 1977 by Frederick Sanger still bears his name. Sanger sequencing
reactions can be prepared manually and electropherograms can be read directly by the user. Automated
base calling capillary electrophoresis systems have mostly replaced manually read gels and rapid
Sanger applications are being developed.
High throughput or next generation sequencing (NGS), including next generation short-read and third
generation long-read methods, has reduced the cost of DNA sequencing, improved sequence readability
and automated most of the steps from preparatory to bioinformatics. High throughput automated DNA
sequencing applies base/wavelength specific fluorescence or ionic detection to determine the real-time
enzymatic addition of nucleotides to a DNA template.
Sanger sequencing (dideoxy chain termination) generates high quality data for determining a single
DNA sequence of an individual target. NGS, by contrast, can be used to assess millions of individual DNA
fragments of mixed markers and targets at the same time.
Sanger sequencing and NGS can both be used to verify animal species composition in a food sample or
[9]
compare DNA sequence results to previously defined databases to identify its animal origin, or both .
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 22949-1:2021(E)
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis
for the detection and identification of animal species in
food and feed products (nucleotide sequencing-based
methods) —
Part 1:
General requirements
1 Scope
This document specifies general requirements for DNA sequencing method performance in the
detection and identification of animal species in food and feed products. Performance requirements
are limited to Sanger and next generation sequencing (NGS), including second and third generation
sequencing, for analysis of single species products and multispecies products.
This document is applicable to DNA sequences for mammals, birds, fish, molluscs, crustaceans,
amphibians, reptiles and insects, and to the validation of the applicable methods.
Methods for DNA species quantification are not considered under the scope of this document.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions
ISO 20813, Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection and identification
of animal species in foods and food products (nucleic acid-based methods) — General requirements and
definitions
ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Nucleic acid extraction
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Performance characteristics of the methods
4.1 General
The identity of an organism at the species level is established by DNA sequencing through the
comparison of DNA sequences obtained from samples with known reference sequences. Results can
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ISO 22949-1:2021(E)
also be obtained at multiple taxonomic levels (e.g. order, species, genus, family), depending on the type
of database and DNA data analysis performed.
Methods used for animal species identification by DNA sequencing shall meet the performance guidance
provided in this document. The method validation process described in this document, interlaboratory
collaborative or single-laboratory studies or both shall be used to determine and elucidate sequencing
method performance characteristics.
Single species products that have been produced from one piece of meat (e.g. fish fillet, beef tenderloin)
are most appropriately analysed by Sanger sequencing, while NGS is the appropriate method for
simultaneous multispecies identification.
4.2 Fitness for purpose of the method
The method shall be fit for purpose for the identification of organisms and their taxonomic relationship
with other organisms. Identification at the sub-specific levels (e.g. breeds) can be included provided
that the databases and bioinformatic analyses are available. Information regarding the applicability
and limitations of the method shall be documented sufficiently to fulfil the criteria described in this
document. The appropriate commercial DNA sequencing platform(s) suitable for use in all method
procedures should be determined and identified. The target DNA can be located on the nuclear genome,
but also on the mitochondrial genomes. A DNA barcoding or metabarcoding approach can be used
[10][11]
based on one or more allelic regions to be sequenced .
4.3 Scientific basis
4.3.1 General
A general workflow of the laboratory analytical procedure is provided in Annex A.
4.3.2 Sanger sequencing
Sanger sequencing is based on a chain termination method for determining the nucleotide sequence of
DNA. Elongation of the replicated strand of DNA by DNA polymerase is interrupted by the incorporation
of non-elongatable nucleotides that terminate replication successively at each position of the sequenced
fragment. Labelling the four non-elongatable nucleotides (dideoxy-A, G, C and T) permits determination
of the molecular size of the replicated fragment by electrophoresis.
NOTE 1 Sanger sequencing can only be used when a sample contains tissue from a unique single species (e.g.
one fish fillet, one steak, one shrimp), because multiple DNA target sequences in the same sample from more than
one species can produce more than one end labelled chain terminated product of the same chain length. Multiple
chain terminated fragments of the same chain length can present two or more terminated bases at each position
and appear electrophoretically as convoluted or overlapping sequences. The electropherogram for the reaction is
unlikely to be readable and the identification will be compromised.
Automated Sanger sequencing platforms have been available for many years and have appropriately
[12][13][14]
been used for DNA barcoding to identify a single species, e.g. for fish species identification .
[15]
NOTE 2 For an example, see CEN/TS 17303:2019 .
4.3.3 Next generation sequencing
NGS in combination with DNA metabarcoding enables the robust and reliable identification of species
in complex food products (containing multiple species). NGS is a commercial term used to reference
[16]
high throughput DNA sequencing methods (see Annex B) . It is alternatively referred to as "massively
parallel sequencing". Results usually take the form of a text file with millions of individual sequence
reads. Commercially available platforms support second and third generation NGS sequencing methods.
Second generation sequencing is based on the analysis of short DNA fragments generated by a
polymerase chain reaction (PCR) or a fragmentation process to produce fragments of up to 600 bp in
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size. Third generation sequencing is capable of analysing much longer DNA fragments (e.g. bacterial
genomes) and consequently is sometimes referred to as "long-read DNA sequencing".
4.4 Units of measurement
Sequence reads generated by Sanger sequencing or NGS methods are compared bioinformatically
to previously determined and identified reference sequences in DNA databases. Percent similarity
between the sample and reference sequences is calculated. Two sequences are homologous if they share
more similarity than would be expected by chance (p ≤ 0,01).
NOTE A percent similarity greater than 98 % is usually sufficient to identify sequences as the same species.
Identification data shall be provided as a qualitative result, in the form of list of appropriate taxa, their
respective percent similarity and, as appropriate, the expected value.
4.5 Applicability
4.5.1 Meat or food product considerations
The method should contain a definition of the food or food product(s) that will be sequenced and, where
appropriate, the raw materials from which it is derived and any necessary references to manufacturing
processes. In addition, whether the sample(s) will be composed of a single species or mixed species or
both.
4.5.2 Sampling plan
Representative samples taken through an applicable sampling plan should be provided to the
sequencing laboratory. Appropriate methods for subsampling laboratory samples should continue to
ensure the representativeness of the sequencing result. If applicable, statistical criteria for acceptance
or rejection of the analytical result should include the sampling plan and subsampling. Requirements
and limitations for the laboratory sample size and number of individual items forming the sample, and
the handling of the sample and its storage, should be evaluated and described based upon:
— the degree of processing of the sample constituents;
— the different species and animal tissue types involved;
— the nature of the sample matrices;
— the preparation of the sample matrix for analysis.
4.5.3 Genomic considerations
When assessing whether a method is fit for purpose, the following aspects regarding the nature of the
genomic region to be sequenced should be considered:
— the cellular and genomic disposition of the sequence, i.e. cellular: nuclear or mitochondrial, or
genomic: allelic or gene specific;
— the length of the sequence that will be determined;
— the types and design of primer sequences used for sample and library preparation and sequencing.
4.5.4 Method testing
Applicability shall be tested by extracting DNA from matrix-matched test samples representative of the
analytical scope of the method.
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Highly processed food products can have fragmented DNA or low DNA concentration or both, making
them difficult to sequence. To compensate, some strategies can be employed, e.g. process more samples,
concentrate DNA extracts, work with smaller targeted genomic regions.
4.6 Primer selection and evaluation
Primer selection and evaluation is the first and most important step in the nucleotide sequencing
analytical workflow when a PCR-based DNA sequencing technology is used. The design of new primers
is a bioinformatics task performed using applicable software. There are many commercial and freely
available primer selection tools, e.g. Primer-BLAST and Primer 3. The following primer design factors
affect primer performance: secondary structures, partial sequence matches, hairpins, GC content, etc.
NOTE 1 Primer design and selection is not considered as part of the workflow to select genomic regions to be
sequenced in third generation NGS technology and the DNA fragmentation strategy, e.g. second generation based
NGS, shotgun sequencing.
Universal (consensus) primers can be defined for any taxonomic level (species, genus, family, order,
class, domain, etc). The design of these primers is based on DNA sequence alignments and identification
of consensus regions that are almost identical amongst the taxa to be identified. Degenerate primers
can be designed to increase the universality of the primers. Determining the number of degenerations
included in a single primer to avoid non-specific binding requires evaluation of unspecific annealing.
Primers should be evaluated in silico irrespective of their use in the laboratory workflow. They shall be
assessed using appropriate bioinformatics tools for their match with the species (taxon) to be detected/
identified.
NOTE 2 An example of an in silico workflow for primer set selection is shown in Annex C.
The final evaluation of the performance of each set of primers should be done by applying the laboratory
workflow using reference DNA or tissue material (whenever it is available) representative of the
identifiable group of species (taxa).
4.7 Database construction and evaluation
The DNA database used for species detection or identification or both will determine the number of
different species identifiable by the laboratory workflow. Database construction and evaluation is a
bioinformatics task and many different tools can be used, including in-house developed software.
Publicly available databases can also be used, e.g. GenBank. The databases should have the following
information available:
— the species list;
— the number of different entries for each species;
— the DNA region(s), gene(s) and length of DNA sequences;
— a measure of the validation quality of the sequence entry(ies).
The final performance evaluation of a bioinformatics search of a database shall be done by applying the
laboratory workflow using reference material (whenever possible) that is representative of the species
included in the database (vouchered). The use of higher taxonomic levels is appropriate when the
identification at the species is inconclusive, i.e. when the sample is not differentiable by a more targeted
search. In GenBank, the designation "Bos sp." can be used as the search term for all of the species of the
genus Bos.
4
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ISO 22949-1:2021(E)
4.8 Selectivity and nucleotide sequence specificity
4.8.1 General
Excessive amplification of non-targeted species DNA can interfere with the detection of targeted
species DNA, e.g. increased limit of detection (LOD) or critical value or both. Targeted (PCR-based) NGS
and Sanger sequencing methods should provide experimental evidence for nucleotide specificity with
non-targeted species (see ISO 20813). The degree of interference (selectivity) from non-targeted DNA
should be determined. The nucleotide sequence specificity should be assessed in a two-step procedure:
theoretical and e
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 22949-1
Première édition
2021-10
Analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d’analyse
pour la détection et l’identification
d’espèces animales dans les aliments
et les aliments pour animaux
(méthodes basées sur le séquençage
des nucléotides) —
Partie 1:
Exigences générales
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection
and identification of animal species in food and feed products
(nucleotide sequencing-based methods) —
Part 1: General requirements
Numéro de référence
ISO 22949-1:2021(F)
© ISO 2021
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ISO 22949-1:2021(F)
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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ISO 22949-1:2021(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction . vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Caractéristiques de performance des méthodes . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Adéquation à un but de la méthode . 2
4.3 Base scientifique . 2
4.3.1 Généralités . 2
4.3.2 Séquençage Sanger . 2
4.3.3 Séquençage de nouvelle génération. 3
4.4 Unités de mesure . 3
4.5 Applicabilité . 3
4.5.1 Considérations relatives au produit carné ou au produit alimentaire . 3
4.5.2 Plan d’échantillonnage . 3
4.5.3 Considérations génomiques . 4
4.5.4 Évaluation de la méthode . 4
4.6 Sélection et évaluation des amorces . 4
4.7 Construction et évaluation de la base de données . 4
4.8 Sélectivité et spécificité de la séquence nucléotidique . 5
4.8.1 Généralités . 5
4.8.2 Exigences relatives aux essais d’inclusivité . 5
4.8.3 Évaluation des interférences de l’ADN non-cible . 6
4.9 Sensibilité . 6
4.9.1 Généralités . 6
4.9.2 Limite de détection . 6
4.10 Robustesse . 7
4.10.1 Généralités . 7
4.10.2 Détermination de la robustesse par une étude interlaboratoires. 7
4.10.3 Détermination de la robustesse par un essai orthogonal multifactoriel . 7
5 Validation intralaboratoire .7
6 Étude comparative interlaboratoires . 7
7 Exigences générales du laboratoire et du mode opératoire . 8
7.1 Généralités . 8
7.2 Installations, matériaux et équipement . 8
7.3 Préparation de l’échantillon . 9
7.3.1 Généralités . 9
7.3.2 Catégorie A: échantillon mono-espèce constitué d’un seul morceau . 9
7.3.3 Catégorie B: produit mono-espèce constitué de plusieurs morceaux ou
unités du même type de tissu . 9
7.3.4 Catégorie C: produit traité contenant plusieurs espèces mélangées,
notamment produit d’origine non carnée, ou différents types de tissus
comme ingrédients . . 10
7.4 Extraction de l’ADN . 10
7.5 Processus de séquençage de l’ADN . 10
7.5.1 Généralités . 10
7.5.2 Méthode de séquençage Sanger . 11
7.5.3 Méthode de séquence de nouvelle génération .12
7.6 Analyse et interprétation des données de séquences d’ADN . 15
7.7 Expression des résultats . 15
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ISO 22949-1:2021(F)
8 Validation du pipeline bio-informatique du NGS .15
8.1 Généralités . 15
8.2 Mesures de qualité . 15
9 Rapport d’essai .16
Annexe A (informative) Logigramme général du mode opératoire analytique du laboratoire .17
Annexe B (informative) Comparaison entre le séquençage Sanger et le séquençagede
nouvelle génération .18
Annexe C (informative) Processus in silico pour la sélection d’une combinaison d’amorces .19
Bibliographie .20
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ISO 22949-1:2021(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 22949 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO 22949-1:2021(F)
Introduction
Le présent document fournit des recommandations générales relatives au séquençage de l’acide
désoxyribonucléique (ADN) pour la détection ou l’identification d’espèces animales dans les aliments
et les aliments pour animaux. Le séquençage de l’ADN est le processus consistant à déterminer l’ordre
des quatre bases nucléotidiques (adénine, guanine, cytosine et thymine) dans un polymère d’acides
nucléiques. Les polymères d’acides nucléiques peuvent avoir une longueur variable, allant de quelques
nucléotides à plusieurs centaines de millions de bases.
Les techniques de séquençage rapide de l’ADN ont été validées et vérifiées avec succès pour détecter
[1]
et identifier les espèces animales dans les produits alimentaires. Dans l’industrie agroalimentaire,
l’accès rapide, économique et à haut débit aux séquences du génome entier dans les aliments a permis
[2]
d’améliorer le contrôle de la qualité et de la sécurité des aliments. Deux types de techniques de
séquençage de l’ADN sont couramment utilisées pour les produits alimentaires: le séquençage par
[3][4][5][6][7][8]
terminaison de chaîne et le séquençage à haut débit .
La terminaison de chaîne, mise au point par Frederick Sanger en 1977, porte encore son nom.
Les réactions de séquençage Sanger peuvent être préparées manuellement et les électrophérogrammes
peuvent être directement lus par l’utilisateur. Les systèmes d’électrophorèse capillaire avec détection
automatique de bases ont surtout remplacé les gels à lecture manuelle et des applications Sanger
rapides sont en cours de développement.
Le séquençage à haut débit ou de nouvelle génération (NGS), y compris les méthodes de nouvelle
génération à lecture courte et de troisième génération à lecture longue, ont permis de réduire le coût
de séquençage de l’ADN, d’améliorer la lisibilité des séquences et d’automatiser la plupart des étapes,
de la préparation à la bio-informatique. Le séquençage automatique à haut débit de l’ADN applique la
fluorescence spécifique à la base/longueur d’onde ou la détection ionique pour déterminer l’addition
enzymatique en temps réel de nucléotides à une matrice d’ADN.
Le séquençage Sanger (terminaison de chaîne didésoxy) génère des données de haute qualité pour
déterminer une seule séquence d’ADN d’une cible individuelle. En revanche, le NGS peut être utilisé pour
évaluer simultanément des millions de fragments d’ADN individuels de marqueurs et cibles mélangés.
Le séquençage Sanger et le NGS peuvent tous deux être utilisés pour vérifier la composition de l’espèce
animale dans un échantillon d’aliment et/ou pour comparer les résultats de séquençage de l’ADN avec
[9]
les bases de données précédemment définies afin d’identifier son origine animale .
vi
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NORME INTERNATIONALE ISO 22949-1:2021(F)
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes
d’analyse pour la détection et l’identification d’espèces
animales dans les aliments et les aliments pour animaux
(méthodes basées sur le séquençage des nucléotides) —
Partie 1:
Exigences générales
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les exigences générales relatives à la performance de la méthode
de séquençage de l’ADN pour la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments
et les aliments pour animaux. Les exigences de performance se limitent au séquençage Sanger et
au séquençage de nouvelle génération (NGS), y compris les séquençages de deuxième et troisième
générations, pour l’analyse de produits mono-espèces et de produits multi-espèces.
Le présent document est applicable aux séquences d’ADN de mammifères, oiseaux, poissons, mollusques,
crustacés, amphibiens, reptiles et insectes, ainsi qu’à la validation des méthodes correspondantes.
Les méthodes de quantification de l’espèce d’ADN ne font pas partie du domaine d’application du présent
document.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions
ISO 20813, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection et l’identification
des espèces animales dans les aliments et les produits alimentaires (méthodes basées sur l’utilisation des
acides nucléiques) — Exigences générales et définitions
ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16577 s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
1
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ISO 22949-1:2021(F)
4 Caractéristiques de performance des méthodes
4.1 Généralités
L’identité d’un organisme au niveau de l’espèce est établie par séquençage de l’ADN en comparant
les séquences d’ADN obtenues à partir d’échantillons ayant des séquences de référence connues.
Des résultats peuvent également être obtenus à plusieurs niveaux taxonomiques (par exemple l’ordre,
l’espèce, le genre, la famille), en fonction du type de base de données et de l’analyse de données ADN
effectuée.
Les méthodes utilisées pour identifier l’espèce animale par séquençage de l’ADN doivent être conformes
aux recommandations de performance fournies dans le présent document. Le processus de validation
de la méthode décrit dans le présent document, les études interlaboratoires et/ou intralaboratoires
doivent être utilisés pour déterminer et expliciter les caractéristiques de performance de la méthode
de séquençage.
Les produits mono-espèce qui ont été obtenus à partir d’un seul morceau de viande (par exemple le filet
de poisson, le filet de bœuf) sont analysés de façon optimale par séquençage Sanger, tandis que le NGS
est la méthode appropriée pour l’identification multi-espèces simultanée.
4.2 Adéquation à un but de la méthode
La méthode doit être adéquate pour l’identification d’organismes et de leur lien taxonomique avec
d’autres organismes. L’identification à des niveaux subspécifiques (par exemple la race) est possible
à condition que les bases de données et les analyses bio-informatiques soient disponibles. Les
informations concernant l’applicabilité et les limites de la méthode doivent être suffisamment étayées
pour répondre aux critères décrits dans le présent document. Il convient de déterminer et d’identifier
la/les plateforme(s) commerciale(s) de séquençage d’ADN convenant à tous les modes opératoires de
la méthode. L’ADN cible peut être localisé sur le génome nucléaire, mais également sur les génomes
mitochondriaux. Une technique de codage ou de métacodage à barres de l’ADN peut être utilisée en
[10][11]
fonction de la ou des région(s) allélique(s) à séquencer .
4.3 Base scientifique
4.3.1 Généralités
Un logigramme général du mode opératoire analytique de laboratoire est fourni à l’Annexe A.
4.3.2 Séquençage Sanger
Le séquençage Sanger repose sur une méthode par terminaison de chaîne pour déterminer la séquence
nucléotidique de l’ADN. L’allongement du brin répliqué d’ADN par l’ADN polymérase est interrompu par
l’incorporation de nucléotides non étirables qui mettent fin à la réplication successivement à chaque
position du fragment séquencé. Le marquage des quatre nucléotides non étirables (didésoxy-A, G, C et
T) permet de déterminer la taille moléculaire du fragment répliqué par électrophorèse.
NOTE 1 Le séquençage Sanger ne peut être utilisé que lorsqu’un échantillon contient du tissu d’une seule
espèce (par exemple un filet de poisson, un steak, une crevette), car plusieurs séquences cibles d’ADN dans un
même échantillon provenant de plusieurs espèces peuvent produire plusieurs produits de terminaison de chaîne
marqués à une extrémité de même longueur de chaîne. Plusieurs fragments de terminaison de chaîne de même
longueur de chaîne peuvent présenter deux bases terminées ou plus à chaque position et apparaissent par
électrophorèse sous forme de séquences convoluées ou chevauchantes. L’électrophérogramme de la réaction sera
probablement illisible et l’identification sera compromise.
Les plateformes de séquençage automatique Sanger sont disponibles depuis de nombreuses années
et sont utilisées pour le codage à barres de l’ADN afin d’identifier une seule espèce, par exemple pour
[12][13][14]
identifier une espèce de poisson .
[15]
NOTE 2 Par exemple, voir la CEN/TS 17303:2019 .
2
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4.3.3 Séquençage de nouvelle génération
Le NGS, associé au métacodage à barres de l’ADN, permet une identification robuste et fiable des
espèces présentes dans les produits alimentaires complexes (contenant plusieurs espèces). Le NGS est
un terme commercial utilisé pour faire référence à des méthodes de séquençage de l’ADN à haut débit
[16]
(voir Annexe B). Il est aussi appelé «séquençage massivement parallèle». Les résultats prennent
généralement la forme d’un fichier texte contenant des millions de lectures de séquences individuelles.
Les plateformes disponibles dans le commerce prennent en charge les méthodes de séquençage NGS de
deuxième et troisième générations.
Le séquençage de deuxième génération repose sur l’analyse de fragments d’ADN courts générés par
réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou par un processus de fragmentation pour produire des
fragments pouvant atteindre une taille de 600 pb. Le séquençage de troisième génération est capable
d’analyser des fragments d’ADN bien plus longs, par exemple des génomes bactériens. Il est donc parfois
appelé «séquençage d’ADN à lecture longue».
4.4 Unités de mesure
Les lectures de séquences générées par séquençage Sanger ou par NGS sont comparées de manière
bio-informatique avec des séquences de référence préalablement déterminées et identifiées dans des
bases de données d’ADN. Le pourcentage de similarité entre la séquence de l’échantillon et la séquence
de référence est calculé. Deux séquences sont homologues si elles partagent une similarité supérieure
à celle qui pourrait être attribuée au simple hasard (p ≤ 0,01).
NOTE Un pourcentage de similarité supérieur à 98 % est généralement suffisant pour identifier des
séquences comme appartenant à la même espèce.
Les données d’identification doivent être fournies en tant que résultat qualitatif, sous la forme d’une
liste de taxons appropriés, avec les pourcentages de similarité correspondants et, suivant le cas, la
valeur attendue.
4.5 Applicabilité
4.5.1 Considérations relatives au produit carné ou au produit alimentaire
Il convient que la méthode contienne une définition de l’aliment ou du/des produit(s) alimentaire(s) qui
seront séquencés et, le cas échéant, des matières premières dont ils sont originaires, ainsi que toute
référence nécessaire aux processus de fabrication. Il sera également indiqué si l’échantillon ou les
échantillon(s) sera/seront composé(s) d’une seule espèce et/ou d’espèces mélangées.
4.5.2 Plan d’échantillonnage
Il convient que des échantillons représentatifs prélevés lors d’un plan d’échantillonnage approprié soient
fournis au laboratoire de séquençage. Il convient que des méthodes appropriées de sous-échantillonnage
d’échantillons pour laboratoire assurent la représentativité du résultat de séquençage. Le cas échéant,
il convient que les critères statistiques d’acceptation ou de rejet du résultat analytique incluent le plan
d’échantillonnage et le sous-échantillonnage. Il convient que les exigences et les limitations relatives à
la taille de l’échantillon pour laboratoire et au nombre d’éléments individuels composant l’échantillon,
ainsi qu’à la manipulation et au stockage de l’échantillon, soient évaluées et décrites en fonction:
— du degré de traitement des constituants de l’échantillon;
— des différentes espèces et des différents types de tissus animaux impliqués;
— de la nature des matrices d’échantillon;
— de la préparation de la matrice d’échantillon destinée à l’analyse.
3
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ISO 22949-1:2021(F)
4.5.3 Considérations génomiques
Lors de l’évaluation de l’adéquation d’une méthode, il convient de tenir compte des aspects suivants
concernant la nature de la région génomique à séquencer:
— la disposition cellulaire et génomique de la séquence, à savoir cellulaire (nucléaire ou mitochondriale)
ou génomique (allélique ou spécifique du gène);
— la longueur de la séquence qui sera déterminée;
— les types et la conception des séquences d’amorces utilisées pour la préparation et le séquençage de
l’échantillon et de la banque.
4.5.4 Évaluation de la méthode
L’applicabilité doit être soumise à essai en extrayant l’ADN des échantillons pour essai de matrices
représentatifs du domaine analytique de la méthode.
Les produits alimentaires hautement transformés peuvent contenir de l’ADN fragmenté et/ou
présenter une faible teneur en ADN, ce qui rend leur séquençage difficile. Pour compenser cela, des
stratégies peuvent être utilisées, par exemple le traitement d’une plus grande quantité d’échantillons,
la concentration d’extraits d’ADN, le travail avec de plus petites régions génomiques ciblées.
4.6 Sélection et évaluation des amorces
La sélection et l’évaluation des amorces sont les premières et principales étapes du processus
analytique de séquençage nucléotidique lorsqu’une technique de séquençage d’ADN par PCR est utilisée.
La conception de nouvelles amorces est une tâche bio-informatique effectuée à l’aide d’un logiciel dédié.
Il existe de nombreux outils de sélection des amorces dans le commerce et disponibles gratuitement,
par exemple Primer-BLAST et Primer 3. Les facteurs de conception d’amorces suivants influencent
la performance des amorces: structures secondaires, appariements partiels de séquences, épingles à
cheveux, pourcentage de GC, etc.
NOTE 1 La conception et la sélection des amorces ne sont pas considérées comme faisant partie du processus
de sélection des régions génomiques à séquencer dans la technique NGS de troisième génération et dans la
stratégie de fragmentation de l’ADN, par exemple le NGS de deuxième génération et le séquençage shotgun.
Des amorces universelles (consensus) peuvent être définies pour n’importe quel niveau taxonomique
(espèce, genre, famille, ordre, classe, domaine, etc.). La conception de ces amorces repose sur les
aligne
...
FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 22949-1
ISO/TC 34/SC 16
Molecular biomarker analysis —
Secretariat: ANSI
Methods of analysis for the detection
Voting begins on:
2021-08-07 and identification of animal species in
foods and food products (nucleotide
Voting terminates on:
2021-10-02
sequencing-based methods) —
Part 1:
General requirements
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour
la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments
et les produits alimentaires (méthodes basées sur le séquençage des
nucléotides) —
Partie 1: Exigences générales
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO-
ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN-
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
©
NATIONAL REGULATIONS. ISO 2021
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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Phone: +41 22 749 01 11
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Published in Switzerland
ii © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Performance characteristics of the methods . 1
4.1 General . 1
4.2 Fitness for purpose of the method . 2
4.3 Scientific basis . 2
4.3.1 General. 2
4.3.2 Sanger sequencing . . . 2
4.3.3 Next generation sequencing . 2
4.4 Units of measurement . . 3
4.5 Applicability . 3
4.5.1 Meat or food product considerations . 3
4.5.2 Sampling plan . 3
4.5.3 Genomic considerations . 3
4.5.4 Method testing . 3
4.6 Primer selection and evaluation . 4
4.7 Database construction and evaluation . 4
4.8 Selectivity and nucleotide sequence specificity . 5
4.8.1 General. 5
4.8.2 Requirements for inclusivity testing . 5
4.8.3 Evaluation of non-targeted DNA interference . 5
4.9 Sensitivity . 6
4.9.1 General. 6
4.9.2 Limit of detection . 6
4.10 Robustness . 6
4.10.1 General. 6
4.10.2 Robustness determination by inter-laboratory study . 6
4.10.3 Robustness determination by a multifactorial orthogonal test design . 7
5 Single-laboratory validation . 7
6 Interlaboratory study (collaborative study) . 7
7 General laboratory and procedural requirements . 7
7.1 General . 7
7.2 Facilities, materials and equipment . 8
7.3 Sample preparation . 8
7.3.1 General. 8
7.3.2 Category A: single species sample consisting of a single piece. 8
7.3.3 Category B: single species product composed by several pieces or units of
the same type of tissue . 9
7.3.4 Category C: multiple mixed species processed product including those of
non-meat origin or different types of tissues as ingredients . 9
7.4 DNA extraction . 9
7.5 DNA sequencing workflow .10
7.5.1 General.10
7.5.2 Sanger sequencing method .10
7.5.3 Next generation sequencing method .11
7.6 DNA sequence data analysis and interpretation .14
7.7 Expression of results .14
8 Validation of the NGS bioinformatics pipeline .14
© ISO 2021 – All rights reserved iii
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
8.1 General .14
8.2 Quality metrics .14
9 Test report .15
Annex A (informative) General workflow of the laboratory analytical procedure .16
Annex B (informative) Comparison between Sanger sequencing and next generation
sequencing .17
Annex C (informative) In silico workflow for primer set selection .18
Bibliography .20
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
A list of all parts in the ISO 22949 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
© ISO 2021 – All rights reserved v
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
Introduction
This document provides general guidance for deoxyribonucleic acid (DNA) sequencing for animal
species detection or identification, or both, in food and feed products. DNA sequencing is the process of
determining the order of the four nucleotide bases (adenine, guanine, cytosine and thymine) in a nucleic
acid polymer. Nucleic acid polymers can range in length from a few nucleotides to hundreds of millions
of bases.
Rapid DNA sequencing methods have been successfully validated and verified for detection and
[1]
identification of animal species in food products . Within the food industry, rapid, economical and
high throughput access to whole genome sequences in foods has improved the control of both food
[2]
quality and safety . Two types of DNA sequencing methods are most widely used for food products:
[3][4][5][6][7][8]
chain termination and high throughput sequencing .
Chain termination developed in 1977 by Frederick Sanger still bears his name. Sanger sequencing
reactions can be prepared manually and electropherograms can be read directly by the user. Automated
base calling capillary electrophoresis systems have mostly replaced manually read gels and rapid
Sanger applications are being developed.
High throughput or next generation sequencing (NGS), including next generation short-read and third
generation long-read methods, has reduced the cost of DNA sequencing, improved sequence readability
and automated most of the steps from preparatory to bioinformatics. High throughput automated DNA
sequencing applies base/wavelength specific fluorescence or ionic detection to determine the real-time
enzymatic addition of nucleotides to a DNA template.
Sanger sequencing (dideoxy chain termination) generates high quality data for determining a single
DNA sequence of an individual target. NGS, by contrast, can be used to assess millions of individual DNA
fragments of mixed markers and targets at the same time.
Sanger sequencing and NGS can both be used to verify animal species composition in a food sample or
[9]
compare DNA sequence results to previously defined databases to identify its animal origin, or both .
vi © ISO 2021 – All rights reserved
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FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis
for the detection and identification of animal species in
foods and food products (nucleotide sequencing-based
methods) —
Part 1:
General requirements
1 Scope
This document specifies general requirements for DNA sequencing method performance in the
detection and identification of animal species in food and feed products. Performance requirements
are limited to Sanger and next generation sequencing (NGS), including second and third generation
sequencing, for analysis of single species products and multispecies products.
This document is applicable to DNA sequences for mammals, birds, fish, molluscs, crustaceans,
amphibians, reptiles and insects, and to the validation of the applicable methods.
Methods for DNA species quantification are not considered under the scope of this document.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions
ISO 20813, Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection and identification
of animal species in foods and food products (nucleic acid-based methods) — General requirements and
definitions
ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Nucleic acid extraction
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Performance characteristics of the methods
4.1 General
The identity of an organism at the species level is established by DNA sequencing through the
comparison of DNA sequences obtained from samples with known reference sequences. Results can
© ISO 2021 – All rights reserved 1
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
also be obtained at multiple taxonomic levels (e.g. order, species, genus, family), depending on the type
of database and DNA data analysis performed.
Methods used for animal species identification by DNA sequencing shall meet the performance guidance
provided in this document. The method validation process described in this document, interlaboratory
collaborative or single-laboratory studies or both shall be used to determine and elucidate sequencing
method performance characteristics.
Single species products that have been produced from one piece of meat (e.g. fish fillet, beef tenderloin)
are most appropriately analysed by Sanger sequencing, while NGS is the appropriate method for
simultaneous multispecies identification.
4.2 Fitness for purpose of the method
The method shall be fit for purpose for the identification of organisms and their taxonomic relationship
with other organisms. Identification at the sub-specific levels (e.g. breeds) can be included provided
that the databases and bioinformatic analyses are available. Information regarding the applicability
and limitations of the method shall be documented sufficiently to fulfil the criteria described in this
document. The appropriate commercial DNA sequencing platform(s) suitable for use in all method
procedures should be determined and identified. The target DNA can be located on the nuclear genome,
but also on the mitochondrial genomes. A DNA barcoding or metabarcoding approach can be used
[10][11]
based on one or more allelic regions to be sequenced .
4.3 Scientific basis
4.3.1 General
A general workflow of the laboratory analytical procedure is provided in Annex A.
4.3.2 Sanger sequencing
Sanger sequencing is based on a chain termination method for determining the nucleotide sequence of
DNA. Elongation of the replicated strand of DNA by DNA polymerase is interrupted by the incorporation
of non-elongatable nucleotides that terminate replication successively at each position of the sequenced
fragment. Labelling the four non-elongatable nucleotides (dideoxy-A, G, C and T) permits determination
of the molecular size of the replicated fragment by electrophoresis.
NOTE 1 Sanger sequencing can only be used when a sample contains tissue from a unique single species (e.g.
one fish fillet, one steak, one shrimp), because multiple DNA target sequences in the same sample from more than
one species can produce more than one end labelled chain terminated product of the same chain length. Multiple
chain terminated fragments of the same chain length can present two or more terminated bases at each position
and appear electrophoretically as convoluted or overlapping sequences. The electropherogram for the reaction is
unlikely to be readable and the identification will be compromised.
Automated Sanger sequencing platforms have been available for many years and have appropriately
[12][13][14]
been used for DNA barcoding to identify a single species, e.g. for fish species identification .
[15]
NOTE 2 For an example, see CEN/TS 17303:2019 .
4.3.3 Next generation sequencing
NGS in combination with DNA metabarcoding enables the robust and reliable identification of species
in complex food products (containing multiple species). NGS is a commercial term used to reference
[16]
high throughput DNA sequencing methods (see Annex B) . It is alternatively referred to as “massively
parallel sequencing”. Results usually take the form of a text file with millions of individual sequence
reads. Commercially available platforms support second and third generation NGS sequencing methods.
Second generation sequencing is based on the analysis of short DNA fragments generated by a
polymerase chain reaction (PCR) or a fragmentation process to produce fragments of up to 600 bp in
2 © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
size. Third generation sequencing is capable of analysing much longer DNA fragments (e.g. bacterial
genomes) and consequently is sometimes referred to as “long-read DNA sequencing”.
4.4 Units of measurement
Sequence reads generated by Sanger sequencing or NGS methods are compared bioinformatically
to previously determined and identified reference sequences in DNA databases. Percent similarity
between the sample and reference sequences is calculated. Two sequences are homologous if they share
more similarity than would be expected by chance (p ≤ 0,01).
NOTE A percent similarity greater than 98 % is usually sufficient to identify sequences as the same species.
Identification data shall be provided as a qualitative result, in the form of list of appropriate taxa, their
respective percent similarity and, as appropriate, the expected value.
4.5 Applicability
4.5.1 Meat or food product considerations
The method should contain a definition of the food or food product(s) that will be sequenced and, where
appropriate, the raw materials from which it is derived and any necessary references to manufacturing
processes. In addition, whether the sample(s) will be composed of a single species or mixed species or
both.
4.5.2 Sampling plan
Representative samples taken through an applicable sampling plan should be provided to the
sequencing laboratory. Appropriate methods for subsampling laboratory samples should continue to
ensure the representativeness of the sequencing result. If applicable, statistical criteria for acceptance
or rejection of the analytical result should include the sampling plan and subsampling. Requirements
and limitations for the laboratory sample size and number of individual items forming the sample, and
the handling of the sample and its storage, should be evaluated and described based upon:
— the degree of processing of the sample constituents;
— the different species and animal tissue types involved;
— the nature of the sample matrices;
— the preparation of the sample matrix for analysis.
4.5.3 Genomic considerations
When assessing whether a method is fit for purpose, the following aspects regarding the nature of the
genomic region to be sequenced should be considered:
— the cellular and genomic disposition of the sequence, i.e. cellular: nuclear or mitochondrial, or
genomic: allelic or gene specific;
— the length of the sequence that will be determined;
— the types and design of primer sequences used for sample and library preparation and sequencing.
4.5.4 Method testing
Applicability shall be tested by extracting DNA from matrix-matched test samples representative of the
analytical scope of the method.
© ISO 2021 – All rights reserved 3
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ISO/FDIS 22949-1:2021(E)
Highly processed food products can have fragmented DNA or low DNA concentration or both, making
them difficult to sequence. To compensate, some strategies can be employed, e.g. process more samples,
concentrate DNA extracts, work with smaller targeted genomic regions.
4.6 Primer selection and evaluation
Primer selection and evaluation is the first and most important step in the nucleotide sequencing
analytical workflow when a PCR-based DNA sequencing technology is used. The design of new primers
is a bioinformatics task performed using applicable software. There are many commercial and freely
available primer selection tools, e.g. Primer-BLAST and Primer 3. The following primer design factors
affect primer performance: secondary structures, partial sequence matches, hairpins, GC content, etc.
NOTE 1 Primer design and selection is not considered as part of the workflow to select genomic regions to be
sequenced in third generation NGS technology and the DNA fragmentation strategy, e.g. second generation based
NGS, shotgun sequencing.
Universal (consensus) primers can be defined for any taxonomic level (species, genus, family, order,
class, domain, etc). The design of these primers is based on DNA sequence alignments and identification
of consensus regions that are almost identical amongst the taxa to be identified. Degenerate primers
can be designed to increase the universality of the primers. Determining the number of degenerations
included in a single primer to avoid non-specific binding requires evaluation of unspecific annealing.
Primers should be evaluated in silico irrespective of their use in the laboratory workflow. They shall be
assessed using appropriate bioinformatics tools for their match with the species (taxon) to be detected/
identified.
NOTE 2 An example of an in silico workflow for primer set selection is shown in Annex C.
The final evaluation of the performance of each set of primers should be done by applying the laboratory
workflow using reference DNA or tissue material (whenever it is available) representative of the
identifiable group of species (taxa).
4.7 Database construction and evaluation
The DNA database used for species detection or identification or both will determine the number of
different species identifiable by the laboratory workflow. Database construction and evaluation is a
bioinformatics task and many different tools can be used, including in-house developed software.
Publicly available databases can also be used, e.g. GenBank. The databases should have the following
information available:
— the species list;
— the number of different entries for each species;
— the DNA region(s), gene(s) and length of DNA sequences;
— a measure of the validation quality of the sequence entry(ies).
The final performance evaluation of a bioinformatics search of a database shall be done by applying the
laboratory workflow using reference material (whenever possible) that is representative of the species
included in the database (vouchered). The use of higher taxonomic levels is appropriate when the
identification at the species is inconclusive, i.e. when the sample is not differentiable by a more targeted
search. In GenBank, the designation “Bos sp.” can be used as the search term for all of the species of the
genus Bos.
4 © ISO 2021 – All rights reserved
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...
PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 22949-1
ISO/TC 34/SC 16
Analyse moléculaire de
Secrétariat: ANSI
biomarqueurs — Méthodes d’analyse
Début de vote:
2021-08-07 pour la détection et l’identification
d’espèces animales dans les
Vote clos le:
2021-10-02
aliments et les produits alimentaires
(méthodes basées sur le séquençage
des nucléotides) —
Partie 1:
Exigences générales
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection
and identification of animal species in foods and food products
(nucleotide sequencing-based methods) —
Part 1: General requirements
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
©
TION NATIONALE. ISO 2021
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Caractéristiques de performance des méthodes . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Adéquation à un but de la méthode . 2
4.3 Base scientifique . 2
4.3.1 Généralités . 2
4.3.2 Séquençage Sanger . 2
4.3.3 Séquençage de nouvelle génération . 3
4.4 Unités de mesure . 3
4.5 Applicabilité . 3
4.5.1 Considérations relatives au produit carné ou au produit alimentaire . 3
4.5.2 Plan d’échantillonnage . 3
4.5.3 Considérations génomiques . 4
4.5.4 Évaluation de la méthode . 4
4.6 Sélection et évaluation des amorces . 4
4.7 Construction et évaluation de la base de données . 4
4.8 Sélectivité et spécificité de la séquence nucléotidique . . 5
4.8.1 Généralités . 5
4.8.2 Exigences relatives aux essais d’inclusivité . 5
4.8.3 Évaluation des interférences de l’ADN non-cible . 6
4.9 Sensibilité . 6
4.9.1 Généralités . 6
4.9.2 Limite de détection . 6
4.10 Robustesse . 7
4.10.1 Généralités . 7
4.10.2 Détermination de la robustesse par une étude interlaboratoires . 7
4.10.3 Détermination de la robustesse par un essai orthogonal multifactoriel . 7
5 Validation intralaboratoire . 7
6 Étude comparative interlaboratoires . 7
7 Exigences générales du laboratoire et du mode opératoire . 8
7.1 Généralités . 8
7.2 Installations, matériaux et équipement. 8
7.3 Préparation de l’échantillon . 9
7.3.1 Généralités . 9
7.3.2 Catégorie A: échantillon mono-espèce constitué d’un seul morceau . 9
7.3.3 Catégorie B: produit mono-espèce constitué de plusieurs morceaux ou
unités du même type de tissu . 9
7.3.4 Catégorie C: produit traité contenant plusieurs espèces mélangées,
notamment produit d’origine non carnée, ou différents types de tissus
comme ingrédients .10
7.4 Extraction de l’ADN .10
7.5 Processus de séquençage de l’ADN .10
7.5.1 Généralités .10
7.5.2 Méthode de séquençage Sanger .11
7.5.3 Méthode de séquence de nouvelle génération .12
7.6 Analyse et interprétation des données de séquences d’ADN .15
7.7 Expression des résultats .15
© ISO 2021 – Tous droits réservés iii
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
8 Validation du pipeline bio-informatique du NGS.15
8.1 Généralités .15
8.2 Mesures de qualité .15
9 Rapport d’essai .16
Annexe A (informative) Logigramme général du mode opératoire analytique du laboratoire .17
Annexe B (informative) Comparaison entre le séquençage Sanger et le séquençagede
nouvelle génération.18
Annexe C (informative) Processus in silico pour la sélection d’une combinaison d’amorces .19
Bibliographie .20
iv © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 22949 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
© ISO 2021 – Tous droits réservés v
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
Introduction
Le présent document fournit des recommandations générales relatives au séquençage de l’acide
désoxyribonucléique (ADN) pour la détection ou l’identification d’espèces animales dans les aliments
et les produits alimentaires. Le séquençage de l’ADN est le processus consistant à déterminer l’ordre
des quatre bases nucléotidiques (adénine, guanine, cytosine et thymine) dans un polymère d’acides
nucléiques. Les polymères d’acides nucléiques peuvent avoir une longueur variable, allant de quelques
nucléotides à plusieurs centaines de millions de bases.
Les techniques de séquençage rapide de l’ADN ont été validées et vérifiées avec succès pour détecter
[1]
et identifier les espèces animales dans les produits alimentaires. Dans l’industrie agroalimentaire,
l’accès rapide, économique et à haut débit aux séquences du génome entier dans les aliments a permis
[2]
d’améliorer le contrôle de la qualité et de la sécurité des aliments. Deux types de techniques de
séquençage de l’ADN sont couramment utilisées pour les produits alimentaires: le séquençage par
[3][4][5][6][7][8]
terminaison de chaîne et le séquençage à haut débit .
La terminaison de chaîne, mise au point par Frederick Sanger en 1977, porte encore son nom.
Les réactions de séquençage Sanger peuvent être préparées manuellement et les électrophérogrammes
peuvent être directement lus par l’utilisateur. Les systèmes d’électrophorèse capillaire avec détection
automatique de bases ont surtout remplacé les gels à lecture manuelle et des applications Sanger
rapides sont en cours de développement.
Le séquençage à haut débit ou de nouvelle génération (NGS), y compris les méthodes de nouvelle
génération à lecture courte et de troisième génération à lecture longue, ont permis de réduire le coût
de séquençage de l’ADN, d’améliorer la lisibilité des séquences et d’automatiser la plupart des étapes,
de la préparation à la bio-informatique. Le séquençage automatique à haut débit de l’ADN applique la
fluorescence spécifique à la base/longueur d’onde ou la détection ionique pour déterminer l’addition
enzymatique en temps réel de nucléotides à une matrice d’ADN.
Le séquençage Sanger (terminaison de chaîne didésoxy) génère des données de haute qualité pour
déterminer une seule séquence d’ADN d’une cible individuelle. En revanche, le NGS peut être utilisé pour
évaluer simultanément des millions de fragments d’ADN individuels de marqueurs et cibles mélangés.
Le séquençage Sanger et le NGS peuvent tous deux être utilisés pour vérifier la composition de l’espèce
animale dans un échantillon d’aliment et/ou pour comparer les résultats de séquençage de l’ADN avec
[9]
les bases de données précédemment définies afin d’identifier son origine animale .
vi © ISO 2021 – Tous droits réservés
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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes
d’analyse pour la détection et l’identification d’espèces
animales dans les aliments et les produits alimentaires
(méthodes basées sur le séquençage des nucléotides) —
Partie 1:
Exigences générales
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les exigences générales relatives à la performance de la méthode de
séquençage de l’ADN pour la détection et l’identification d’espèces animales dans les aliments et les
produits alimentaires. Les exigences de performance se limitent au séquençage Sanger et au séquençage
de nouvelle génération (NGS), y compris les séquençages de deuxième et troisième générations, pour
l’analyse de produits mono-espèces et de produits multi-espèces.
Le présent document est applicable aux séquences d’ADN de mammifères, oiseaux, poissons, mollusques,
crustacés, amphibiens, reptiles et insectes, ainsi qu’à la validation des méthodes correspondantes.
Les méthodes de quantification de l’espèce d’ADN ne font pas partie du domaine d’application du présent
document.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions
ISO 20813, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d'analyse pour la détection et l'identification
des espèces animales dans les aliments et les produits alimentaires (méthodes basées sur l'utilisation des
acides nucléiques) — Exigences générales et définitions
ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 16577 s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
4 Caractéristiques de performance des méthodes
4.1 Généralités
L’identité d’un organisme au niveau de l’espèce est établie par séquençage de l’ADN en comparant
les séquences d’ADN obtenues à partir d’échantillons ayant des séquences de référence connues.
Des résultats peuvent également être obtenus à plusieurs niveaux taxonomiques (par exemple l’ordre,
l’espèce, le genre, la famille), en fonction du type de base de données et de l’analyse de données ADN
effectuée.
Les méthodes utilisées pour identifier l’espèce animale par séquençage de l’ADN doivent être conformes
aux recommandations de performance fournies dans le présent document. Le processus de validation
de la méthode décrit dans le présent document, les études interlaboratoires et/ou intralaboratoires
doivent être utilisés pour déterminer et expliciter les caractéristiques de performance de la méthode
de séquençage.
Les produits mono-espèce qui ont été obtenus à partir d’un seul morceau de viande (par exemple le filet
de poisson, le filet de bœuf) sont analysés de façon optimale par séquençage Sanger, tandis que le NGS
est la méthode appropriée pour l’identification multi-espèces simultanée.
4.2 Adéquation à un but de la méthode
La méthode doit être adéquate pour l’identification d’organismes et de leur lien taxonomique avec
d’autres organismes. L’identification à des niveaux subspécifiques (par exemple la race) est possible
à condition que les bases de données et les analyses bio-informatiques soient disponibles. Les
informations concernant l’applicabilité et les limites de la méthode doivent être suffisamment étayées
pour répondre aux critères décrits dans le présent document. Il convient de déterminer et d’identifier
la/les plateforme(s) commerciale(s) de séquençage d’ADN convenant à tous les modes opératoires de
la méthode. L’ADN cible peut être localisé sur le génome nucléaire, mais également sur les génomes
mitochondriaux. Une technique de codage ou de métacodage à barres de l’ADN peut être utilisée en
[10][11]
fonction de la ou des région(s) allélique(s) à séquencer .
4.3 Base scientifique
4.3.1 Généralités
Un logigramme général du mode opératoire analytique de laboratoire est fourni à l’Annexe A.
4.3.2 Séquençage Sanger
Le séquençage Sanger repose sur une méthode par terminaison de chaîne pour déterminer la séquence
nucléotidique de l’ADN. L’allongement du brin répliqué d’ADN par l’ADN polymérase est interrompu par
l’incorporation de nucléotides non étirables qui mettent fin à la réplication successivement à chaque
position du fragment séquencé. Le marquage des quatre nucléotides non étirables (didésoxy-A, G, C et
T) permet de déterminer la taille moléculaire du fragment répliqué par électrophorèse.
NOTE 1 Le séquençage Sanger ne peut être utilisé que lorsqu’un échantillon contient du tissu d’une seule
espèce (par exemple un filet de poisson, un steak, une crevette), car plusieurs séquences cibles d’ADN dans un
même échantillon provenant de plusieurs espèces peuvent produire plusieurs produits de terminaison de chaîne
marqués à une extrémité de même longueur de chaîne. Plusieurs fragments de terminaison de chaîne de même
longueur de chaîne peuvent présenter deux bases terminées ou plus à chaque position et apparaissent par
électrophorèse sous forme de séquences convoluées ou chevauchantes. L’électrophérogramme de la réaction sera
probablement illisible et l’identification sera compromise.
Les plateformes de séquençage automatique Sanger sont disponibles depuis de nombreuses années
et sont utilisées pour le codage à barres de l’ADN afin d’identifier une seule espèce, par exemple pour
[12][13][14]
identifier une espèce de poisson .
[15]
NOTE 2 Par exemple, voir la CEN/TS 17303:2019 .
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4.3.3 Séquençage de nouvelle génération
Le NGS, associé au métacodage à barres de l’ADN, permet une identification robuste et fiable des
espèces présentes dans les produits alimentaires complexes (contenant plusieurs espèces). Le NGS est
un terme commercial utilisé pour faire référence à des méthodes de séquençage de l’ADN à haut débit
[16]
(voir Annexe B). Il est aussi appelé «séquençage massivement parallèle». Les résultats prennent
généralement la forme d’un fichier texte contenant des millions de lectures de séquences individuelles.
Les plateformes disponibles dans le commerce prennent en charge les méthodes de séquençage NGS de
deuxième et troisième générations.
Le séquençage de deuxième génération repose sur l’analyse de fragments d’ADN courts générés par
réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou par un processus de fragmentation pour produire des
fragments pouvant atteindre une taille de 600 pb. Le séquençage de troisième génération est capable
d’analyser des fragments d’ADN bien plus longs, par exemple des génomes bactériens. Il est donc parfois
appelé «séquençage d’ADN à lecture longue».
4.4 Unités de mesure
Les lectures de séquences générées par séquençage Sanger ou par NGS sont comparées de manière
bio-informatique avec des séquences de référence préalablement déterminées et identifiées dans des
bases de données d’ADN. Le pourcentage de similarité entre la séquence de l’échantillon et la séquence
de référence est calculé. Deux séquences sont homologues si elles partagent une similarité supérieure
à celle qui pourrait être attribuée au simple hasard (p ≤ 0,01).
NOTE Un pourcentage de similarité supérieur à 98 % est généralement suffisant pour identifier des
séquences comme appartenant à la même espèce.
Les données d’identification doivent être fournies en tant que résultat qualitatif, sous la forme d’une
liste de taxons appropriés, avec les pourcentages de similarité correspondants et, suivant le cas, la
valeur attendue.
4.5 Applicabilité
4.5.1 Considérations relatives au produit carné ou au produit alimentaire
Il convient que la méthode contienne une définition de l’aliment ou du/des produit(s) alimentaire(s) qui
seront séquencés et, le cas échéant, des matières premières dont ils sont originaires, ainsi que toute
référence nécessaire aux processus de fabrication. Il sera également indiqué si l’échantillon ou les
échantillon(s) sera/seront composé(s) d’une seule espèce et/ou d’espèces mélangées.
4.5.2 Plan d’échantillonnage
Il convient que des échantillons représentatifs prélevés lors d’un plan d’échantillonnage approprié soient
fournis au laboratoire de séquençage. Il convient que des méthodes appropriées de sous-échantillonnage
d’échantillons pour laboratoire assurent la représentativité du résultat de séquençage. Le cas échéant,
il convient que les critères statistiques d’acceptation ou de rejet du résultat analytique incluent le plan
d’échantillonnage et le sous-échantillonnage. Il convient que les exigences et les limitations relatives à
la taille de l’échantillon pour laboratoire et au nombre d’éléments individuels composant l’échantillon,
ainsi qu’à la manipulation et au stockage de l’échantillon, soient évaluées et décrites en fonction:
— du degré de traitement des constituants de l’échantillon;
— des différentes espèces et des différents types de tissus animaux impliqués;
— de la nature des matrices d’échantillon;
— de la préparation de la matrice d’échantillon destinée à l’analyse.
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ISO/FDIS 22949-1:2021(F)
4.5.3 Considérations génomiques
Lors de l’évaluation de l’adéquation d’une méthode, il convient de tenir compte des aspects suivants
concernant la nature de la région génomique à séquencer:
— la disposition cellulaire et génomique de la séquence, à savoir cellulaire (nucléaire ou mitochondriale)
ou génomique (allélique ou spécifique du gène);
— la longueur de la séquence qui sera déterminée;
— les types et la conception des séquences d’amorces utilisées pour la préparation et le séquençage de
l’échantillon et de la banque.
4.5.4 Évaluation de la méthode
L’applicabilité doit être soumise à essai en extrayant l’ADN des échantillons pour essai de matrices
représentatifs du domaine analytique de la méthode.
Les produits alimentaires hautement transformés peuvent contenir de l’ADN fragmenté et/ou
présenter une faible teneur en ADN, ce qui rend leur séquençage difficile. Pour compenser cela, des
stratégies peuvent être utilisées, par exemple le traitement d’une plus grande quantité d’échantillons,
la concentration d’extraits d’ADN, le travail avec de plus petites régions génomiques ciblées.
4.6 Sélection et évaluation des amorces
La sélection et l’évaluation des amorces sont les premières et principales étapes du processus
analytique de séquençage nucléotidique lorsqu’une technique de séquençage d’ADN par PCR est utilisée.
La conception de nouvelles amorces est une tâche bio-informatique effectuée à l’aide d’un logiciel dédié.
Il existe de nombreux outils de sélection des amorces dans le commerce et disponibles gra
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.