Horizontal methods for molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products

This document describes a procedure for the detection of the DNA transition sequence between the 35S promotor (P35S) from Cauliflower mosaic virus and a modified phoshinothricin-acetyltransferase gene (pat) from Streptomyces viridochromogenes. The P35S-pat construct is frequently found in genetically modified plants with tolerance for phosphinothricin-containing herbicides. The P35S-pat construct specific method is based on a real-time PCR and can be used for qualitative and quantitative screening purposes. For identification and quantification of a specific event, a follow-up analysis can be carried out. This document is applicable to the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It can also be suitable for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of this method requires the extraction of an adequate quantity and quality of amplifiable DNA from the relevant matrix.

Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés

Le présent document décrit un mode opératoire permettant la détection d'une séquence d'ADN de transition entre le promoteur 35S (P35S) du virus de la mosaďque du chou-fleur et un gčne modifié codant pour l'enzyme phosphinothricine-acétyltransférase (pat) et provenant de Streptomyces viridochromogenes. Le construit P35S-pat est fréquemment observé dans les plantes génétiquement modifiées présentant une tolérance aux herbicides contenant de la phosphinothricine. La méthode spécifique du construit P35S-pat est basée sur une méthode par PCR en temps réel et peut ętre utilisée ŕ des fins de criblage qualitatif et quantitatif. Pour l'identification et la quantification d'un événement spécifique, une analyse complémentaire peut ętre effectuée. Le présent document est applicable ŕ l'analyse de l'ADN extrait de produits alimentaires. Il peut ętre également utilisé pour analyser l'ADN extrait d'autres produits tels que des aliments pour animaux et des semences. L'application de cette méthode exige qu'une quantité adéquate d'ADN amplifiable de qualité appropriée soit extraite de la matrice étudiée.

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Publication Date
29-Jun-2020
Current Stage
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Start Date
08-Jun-2020
Completion Date
08-Jun-2020
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Standards Content (sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21569-3
Second edition
2020-06
Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of
genetically modified organisms and
derived products —
Part 3:
Construct-specific real-time PCR
method for detection of P35S-pat-
sequence for screening for genetically
modified organisms
Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 3: Méthode PCR en temps réel construit-spécifique pour la
détection de la séquence P35S-pat pour criblage des organismes
génétiquement modifiés
Reference number
ISO/TS 21569-3:2020(E)
ISO 2020
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2020

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

below or ISO’s member body in the country of the requester.
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CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
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Published in Switzerland
ii © ISO 2020 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 PCR reagents ............................................................................................................................................................................................. 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Test sample procedure ..................................................................................................................................................................... 3

7.2 Preparation of the DNA extracts .............................................................................................................................................. 3

7.3 PCR setup ..................................................................................................................................................................................................... 3

7.4 Temperature-time programme ................................................................................................................................................. 4

8 Accept/reject criteria ...................................................................................................................................................................................... 4

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 4

8.3 Calculation of P35S-pat copy numbers .............................................................................................................................. 5

9 Validation status and performance criteria ............................................................................................................................. 5

9.1 Robustness of the method ............................................................................................................................................................. 5

9.2 Collaborative trial for determination of LOD ................................................................................................................ 5

9.3 Collaborative trial for quantification of the P35S-pat construct in rapeseed ................................... 6

9.4 Sensitivity .................................................................................................................................................................................................... 7

9.5 Specificity .................................................................................................................................................................................................... 7

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 8

Annex A (informative) GenBank BLASTN Search ..................................................................................................................................... 9

Annex B (informative) Joint Research Commission GMO-Matrix ........................................................................................11

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................14

© ISO 2020 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO/TS 21569-3:2015), which has been

technically revised. The main changes compared with the previous edition are as follows:

— the section on in silico search has been updated;
— minor typographical changes have been made throughout.
A list of all parts in the ISO 21569 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2020 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21569-3:2020(E)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products —
Part 3:
Construct-specific real-time PCR method for detection of
P35S-pat-sequence for screening for genetically modified
organisms
1 Scope

This document describes a procedure for the detection of the DNA transition sequence between the 35S

promotor (P35S) from Cauliflower mosaic virus and a modified phoshinothricin-acetyltransferase gene

(pat) from Streptomyces viridochromogenes. The P35S-pat construct is frequently found in genetically

modified plants with tolerance for phosphinothricin-containing herbicides. The P35S-pat construct

specific method is based on a real-time PCR and can be used for qualitative and quantitative screening

purposes. For identification and quantification of a specific event, a follow-up analysis can be carried out.

This document is applicable to the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It can also be suitable

for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of

this method requires the extraction of an adequate quantity and quality of amplifiable DNA from the

relevant matrix.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions

ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Qualitative nucleic acid based methods

ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Nucleic acid extraction

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
© ISO 2020 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(E)
4 Principle

DNA is extracted from the test portion by applying a suitable method. The DNA analysis consists of

two parts:

a) verification of the amount and amplifiability of the extracted DNA, e.g. by means of a target tax on

[1]
specific real-time PCR (see ISO 21570 ):
[2][3]
b) detection of the P35S-pat construct in a real-time PCR .
5 Reagents and materials
5.1 General

Chemicals of recognized analytical grade, appropriate for molecular biology shall be used, as a rule.

The water used shall be double distilled or PCR grade water (i.e. nuclease and nucleic acid free). For all

operations in which gloves, the gloves should be powder free. The use of aerosol-protected pipette tips

as protection against cross contamination is recommended.
5.2 PCR reagents
5.2.1 Thermostable DNA polymerase, for hot-start PCR.

5.2.2 PCR buffer solution, containing magnesium chloride and deoxyribonucleoside triphosphates

(dATP, dCTP, dGTP and dUTP).

Ready-to-use reagent mixtures or mixes of individual components can be used. Reagents and

polymerases that lead to equal or better results may also be used.
5.2.3 Oligonucleotides (see Table 1).
Table 1 — Oligonucleotides
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in PCR
[2][3]
P35S-pat construct as the target sequence
Primer 35SP03.f 5′-AAg TTC ATT TCA TTT ggA gAg gAC A-3′ 200 nmol/l
Primer pat-7.r 5′-Cgg CCA TAT CAg CTg CTg TAg-3′ 200 nmol/l
5′-(FAM)-CCg gAg Agg AgA CCA gTT gAg ATT Agg
Probe GSS01.s 100 nmol/l
C-(TAMRA)-3′
FAM: 6-Carboxyfluorescein, TAMRA: 6-Carboxytetramethylrhodamine.

NOTE Equivalent reporter dyes and/or quencher dyes can be used for the probe if they can be shown to yield

similar or better results.
5.2.4 Standard DNA for calibration

A standard DNA solution of a known concentration (ng/µl) can be used to calculate the copy number of

the P35S-pat target sequence.
2 © ISO 2020 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(E)

When using genomic plant DNA as the standard DNA, the number of haploid genome equivalents should

be calculated on the basis of the molecular mass of the plant haploid genome by applying Formula (1):

c ×1 000
DNA
n = (1)
where
n is number of genome equivalents per microlitre;
m is the haploid genome mass in picograms;
c is the DNA concentration in nanograms per millilitres.
DNA

The respective copy number for the P35S-pat sequence can be calculated based on the genome

equivalents. In doing so, the number of integrations into the plant genome as well as the degree of

zygosity of the plant material used shall be taken into consideration.
6 Apparatus

For apparatus and materials, follow ISO 21569. In addition to the usual laboratory equipment, the

following equipment is required.

6.1 Real-time PCR device, suitable for the excitation of fluorescent molecules and the detection of

fluorescence signals generated during PCR.
7 Procedure
7.1 Test sample procedure

The testing plan for P35S-pat screening assumes that the test samples are a representative sample

drawn from the laboratory sample. Simple representative sampling implies that each test sample has

both an equal and an independent chance of being drawn from the laboratory sample. Measures and

operational steps to be taken into consideration shall be as described in ISO 21571 and ISO 24276.

7.2 Preparation of the DNA extracts

Concerning the preparation of DNA from the test portion, the general instructions and measures

described in ISO 21571 should be followed. It is recommended to choose one of the DNA extraction

methods described in ISO 21571:2005, Annex A.
7.3 PCR setup

The method is described for a total volume of 25 μl per PCR. The reaction set-up is given in Table 2.

Completely thaw reagents at room temperature. Each reagent should be carefully mixed and briefly

centrifuged immediately before pipetting. Prepare a PCR reagent mixture that contains all the

components except for the sample DNA. The required amount of the PCR reagent mixture depends

on the number of reactions to be performed, including at least one additional reaction as a pipetting

reserve. Add 5 µl of sample DNA to each reaction.

Mix the PCR reagent mixture, centrifuge briefly and pipette 20 µl into each reaction vial. For the

amplification reagent control, add 5 µl water into the respective reaction set-up. Pipette either 5 µl of

sample DNA or 5 µl of the respective control solution (extraction blank control, positive DNA target

control). If necessary, prepare a PCR inhibition control as described in ISO 24276.

Transfer the reaction set-ups into the thermal cycler and start the temperature-time programme.

© ISO 2020 – All rights reserved 3
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ISO/TS 21569-3:2020(E)
Table 2 — Reaction set-up for the amplification
Element Set-up
Overall reaction volume 25 µl
Sample DNA (up to 200 ng) or controls 5 µl

PCR buffer solution (including MgCl , dNTPs and hot-start DNA polymerase) 12,5 µl

Primer 35SP03.f and pat-7.r see Table 1
Probe GSS01.s see Table 1
Water to 25 µl

In the collaborative study, depending on the real-time PCR devices, different PCR buffer solutions were used [TaqMan

Universal PCR Mastermix (Life Technologies, Darmstadt), QuantiTect Multiplex PCR NoROX or QuantiTect Probe PCR

Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden)]. This information is given for the convenience of users of this document and does not

constitute an endorsement by ISO of the products named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to

the same results. If necessary, adapt the amounts of the reagents and the temperature-time programme.

7.4 Temperature-time programme

The temperature-time programme as outlined in Table 3 was used in the validation study. The use of

different reaction conditions and real-time PCR cyclers may require specific optimization. The time for

initial denaturation depends on the master mix used.
Table 3 — Temperature-time programme
Step Parameter Temperature Time Fluorescence Cycles
°C measurement
1 UNG activation (optional) 50 2 min no 1
2 Initial denaturation 95 10 min no 1
Denaturation 95 15 s no
3 Amplification 45
Annealing and
60 60 s yes
elongation
8 Accept/reject criteria
8.1 General

A corresponding real-time PCR device-specific data analysis programme is used for the identification

of PCR products. The amplification results may be expressed in a different manner, depending on

the device used. In the absence of detectable PCR products (e.g. negative control), the result can be

expressed as “undetermined”, “no amp” or the maximum number of possible cycles. If the amplification

of the DNA target sequence occurs in a sample (e.g. positive control), a sigmoid-shaped amplification

curve can be observed, and the cycle number is calculated at which a predetermined fluorescence

threshold value is exceeded (C value or C value).
t p

If, due to atypical fluorescence measurement data, the automatic interpretation does not provide

a meaningful result, it might be necessary to set the baseline and the threshold manually prior to

interpreting the data. In this case, the device-specific instructions given in the manual regarding the

use of the interpretation software shall be applied.
8.2 Identification
The target sequence is considered as detected, if:

— by using the P35S-pat specific primers 35SP03.f and pat-7.r and the probe GSS01.s, a sigmoid-shaped

amplification curve can be observed and a predetermined fluorescence threshold value is exceeded;

4 © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO/TS 21569-3:2020(E)

— in the PCR control set-ups with no added DNA (PCR reagent control, negative extraction control), no

sigmoid shaped amplification curve can be observed and a predetermined fluorescence threshold

value is not exceeded;

— in the set-ups for the amplification control (positive DNA target control, PCR inhibition control), the

expected C values (or C values) are achieved.
t p
8.3 Calculation of P35S-pat copy numbers

With DNA standards containing defined amounts of P35S-pat copy numbers (see 5.2.4 and 9.3), a

calibration curve can be generated and used for calculation of P35S-pat copy numbers in unknown

samples.
9 Validation status and performance criteria
9.1 Robustness of the method

The robustness of the method has not been tested with respect to small modifications of factors such as

reagent concentrations (e.g. primers, probe) or reaction conditions (e.g. annealing temperature).

NOTE In the collaborative trial, the robustness of the method has been checked with regard to different

real-time PCR machines and PCR buffer solutions. The real-t
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 21569-3
Deuxième édition
2020-06
Méthodes horizontales d'analyse
moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 3:
Méthode PCR en temps réel construit-
spécifique pour la détection de la
séquence P35S-pat pour criblage des
organismes génétiquement modifiés
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products —
Part 3: Construct-specific real-time PCR method for detection of P35S-
pat-sequence for screening for genetically modified organisms
Numéro de référence
ISO/TS 21569-3:2020(F)
ISO 2020
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2020

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2020 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 2

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

5.2 Réactifs PCR ............................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Mode opératoire applicable à l’échantillon pour essai ......................................................................................... 3

7.2 Préparation des extraits d’ADN ................................................................................................................................................. 3

7.3 Réaction PCR ............................................................................................................................................................................................. 3

7.4 Programme d’amplification ......................................................................................................................................................... 4

8 Critères d’acceptation/de rejet ............................................................................................................................................................. 4

8.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 5

8.3 Calcul du nombre de copies pour la séquence P35S-pat .................................................................................... 5

9 État de validation et critères de performance ....................................................................................................................... 5

9.1 Robustesse de la méthode ............................................................................................................................................................. 5

9.2 Essai interlaboratoires pour la détermination de la limite de détection (LOD) ............................. 5

9.3 Essai interlaboratoires pour la quantification du construit P35S-pat dans le colza .................. 6

9.4 Sensibilité .................................................................................................................................................................................................... 8

9.5 Spécificité ..................................................................................................................................................................................................... 8

10 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 9

Annexe A (informative) Recherche avec BLASTN dans la base de données GenBank ....................................10

Annexe B (informative) Matrice d’OGM du Centre commun de recherche ................................................................12

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................15

© ISO 2020 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,

sous-comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO/TS 21569-3:2015), qui a fait l’objet

d’une révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les

suivantes:
— la section sur la recherche in silico a été mise à jour;

— des modifications typographiques mineures ont été apportées tout au long du document.

Une liste de toutes les parties de la série ISO 21569 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO 2020 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 21569-3:2020(F)
Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés —
Partie 3:
Méthode PCR en temps réel construit-spécifique pour
la détection de la séquence P35S-pat pour criblage des
organismes génétiquement modifiés
1 Domaine d’application

Le présent document décrit un mode opératoire permettant la détection d’une séquence d’ADN de

transition entre le promoteur 35S (P35S) du virus de la mosaïque du chou-fleur et un gène modifié

codant pour l’enzyme phosphinothricine-acétyltransférase (pat) et provenant de Streptomyces

viridochromogenes. Le construit P35S-pat est fréquemment observé dans les plantes génétiquement

modifiées présentant une tolérance aux herbicides contenant de la phosphinothricine. La méthode

spécifique du construit P35S-pat est basée sur une méthode par PCR en temps réel et peut être utilisée

à des fins de criblage qualitatif et quantitatif. Pour l’identification et la quantification d’un événement

spécifique, une analyse complémentaire peut être effectuée.

Le présent document est applicable à l’analyse de l’ADN extrait de produits alimentaires. Il peut être

également utilisé pour analyser l’ADN extrait d’autres produits tels que des aliments pour animaux

et des semences. L’application de cette méthode exige qu’une quantité adéquate d’ADN amplifiable de

qualité appropriée soit extraite de la matrice étudiée.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions

ISO 21569, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques

ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques

ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 16577 s’appliquent.

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ISO/TS 21569-3:2020(F)

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
4 Principe

L’ADN est extrait de la prise d’essai en appliquant une méthode appropriée. L’analyse de l’ADN se divise

en deux parties, à savoir:

a) vérification de la quantité et de l’amplificabilité de l’ADN extrait, par exemple par PCR en temps réel

[1]
spécifique pour le taxon cible (voir l’ISO 21570 );
[2][3]
b) détection du construit P35S-pat par PCR en temps réel .
5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités

En règle générale, des substances chimiques de qualité analytique reconnue, appropriées pour

la biologie moléculaire, doivent être utilisées. L’eau utilisée doit être bidistillée ou de qualité PCR

(c’est-à-dire exempte de nucléases et d’acides nucléiques). Pour toutes les opérations nécessitant le

port de gants, il convient de s’assurer que ceux-ci ne sont pas poudrés. Pour éviter toute contamination

croisée, il est recommandé d’utiliser des embouts de pipette protégés contre les aérosols.

5.2 Réactifs PCR
5.2.1 ADN polymérase thermostable, pour PCR à démarrage à chaud (hot start PCR).

5.2.2 Solution tampon pour PCR, contenant du chlorure de magnésium et des désoxyribonucléosides

triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dUTP).

Il est possible d’utiliser des mélanges de réactifs ou des préparations de composants individuels prêts

à l’emploi. Des réactifs et des polymérases conduisant à des résultats équivalents ou meilleurs peuvent

également être utilisés.
5.2.3 Oligonucléotides (voir Tableau 1).
Tableau 1 — Oligonucléotides
Concentration
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
finale dans la PCR
[2][3]
Construit P35S-pat comme séquence cible :
Amorce 35SP03.f 5′-AAg TTC ATT TCA TTT ggA gAg gAC A-3′ 200 nmol/l
Amorce pat-7.r 5′-Cgg CCA TAT CAg CTg CTg TAg-3′ 200 nmol/l
5′-(FAM)-CCg gAg Agg AgA CCA gTT gAg ATT Agg
Sonde GSS01.s 100 nmol/l
C-(TAMRA)-3′
FAM: carboxy-6-fluorescéine, TAMRA: carboxy-6-tétraméthylrhodamine.

NOTE Des fluorophores rapporteurs et/ou des fluorophores extincteurs équivalents peuvent être utilisés

pour la sonde s’il peut être démontré qu’ils donnent des résultats similaires ou meilleurs.

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ISO/TS 21569-3:2020(F)
5.2.4 ADN étalon pour l’étalonnage

Une solution d’ADN étalon ayant une concentration connue (ng/µl) peut être utilisée pour calculer le

nombre de copies de la séquence cible P35S-pat.

Lorsque l’ADN génomique d’une plante est utilisé comme ADN étalon, il convient de calculer le nombre

d’équivalents génome haploïde sur la base de la masse moléculaire du génome haploïde de la plante, en

appliquant la Formule (1):
c ×1 000
DNA
n = (1)
n est le nombre d’équivalents génome par microlitre;
m est la masse du génome haploïde, en picogrammes;
c est la concentration d’ADN, en nanogrammes par millilitre.
DNA

Sur la base des équivalents génome, il est possible de calculer le nombre de copies correspondant pour

la séquence P35S-pat. Pour ce faire, le nombre d’intégrations dans le génome de la plante ainsi que le

degré de zygosité de la plante utilisée doivent être pris en compte.
6 Appareillage

Pour l’appareillage et les matériaux, voir l’ISO 21569. Outre le matériel courant de laboratoire, les

équipements suivants sont requis.

6.1 Appareil de PCR en temps réel, approprié pour l’excitation des molécules fluorescentes et pour

la détection des signaux de fluorescence générés pendant la PCR.
7 Mode opératoire
7.1 Mode opératoire applicable à l’échantillon pour essai

Le plan d’essai pour le criblage de P35S-pat suppose que l’échantillon pour essai est un échantillon

représentatif prélevé sur l’échantillon pour laboratoire. L’échantillonnage représentatif simple

implique que chaque échantillon pour essai a une probabilité égale et indépendante d’être prélevé sur

l’échantillon pour laboratoire. Les mesures et étapes opératoires à prendre en considération doivent

être telles que décrites dans l’ISO 21571 et l’ISO 24276.
7.2 Préparation des extraits d’ADN

Concernant la préparation d’ADN à partir de la prise d’essai, il convient de suivre les instructions

générales et les mesures spécifiées dans l’ISO 21571. Il est recommandé de choisir l’une des méthodes

d’extraction d’ADN décrites dans l’ISO 21571:2005, Annexe A.
7.3 Réaction PCR

La méthode est décrite pour un volume total de 25 µl par réaction PCR. Le mélange réactionnel est

indiqué dans le Tableau 2.

Décongeler totalement les réactifs à température ambiante. Il convient de s’assurer que chaque réactif

est soigneusement mélangé et brièvement centrifugé juste avant d’être pipeté. Préparer un mélange

de réactifs pour PCR contenant tous les composants, sauf l’ADN échantillon. La quantité nécessaire

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ISO/TS 21569-3:2020(F)

de mélange de réactifs pour PCR dépend du nombre de réactions à réaliser, en incluant au moins une

réaction supplémentaire comme réserve de pipetage. Ajouter 5 µl d’ADN échantillon à chaque réaction.

Agiter le mélange de réactifs pour PCR, le centrifuger brièvement et introduire à l’aide d’une

pipette 20 µl dans chaque tube de réaction. Pour le témoin de réactif pour amplification, ajouter 5 µl

d’eau au mélange réactionnel correspondant. À l’aide d’une pipette, ajouter 5 µl d’ADN échantillon

ou 5 µl de la solution témoin correspondante (témoin de blanc d’extraction, témoin positif d’ADN cible).

Si nécessaire, préparer un témoin d’inhibition de PCR tel que décrit dans l’ISO 24276.

Transférer les mélanges réactionnels dans le thermocycleur et lancer le programme d’amplification.

Tableau 2 — Mélange réactionnel pour l’amplification
Élément Réaction
Volume réactionnel total 25 µl
ADN échantillon (jusqu’à 200 ng) ou témoins 5 µl
Solution tampon pour PCR (contenant du MgCl , des dNTP et de l’ADN polymérase à
12,5 µl
« démarrage à chaud »)
Amorce 35SP03.f et pat-7.r voir Tableau 1
Sonde GSS01.s voir Tableau 1
Eau complément à 25 µl

Lors de l’essai interlaboratoires, en fonction des appareils de PCR en temps réel utilisés, différentes solutions tampons

PCR ont été utilisées [TaqMan Universal PCR Mastermix (Life Technologies, Darmstadt), QuantiTect Multiplex PCR NoROX

ou QuantiTect Probe PCR Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden)]. Cette information est donnée par souci de commodité à

l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ces produits.

Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats. Si nécessaire,

adapter les quantités de réactifs ainsi que le programme d’amplification.
7.4 Programme d’amplification

Le programme d’amplification indiqué dans le Tableau 3 a été utilisé pour l’étude de validation.

L’utilisation de diverses conditions de réaction et de divers cycleurs pour PCR en temps réel peut

nécessiter une optimisation spécifique. Le temps nécessaire pour la dénaturation initiale dépend du

mélange maître utilisé.
Tableau 3 — Programme d’amplification
Étape Paramètre Température Durée Mesurage de la Cycles
°C fluorescence
1 Activation de l’UNG (facultative) 50 2 min non 1
2 Dénaturation initiale 95 10 min non 1
Dénaturation 95 15 s non
3 Amplification 45
Hybridation et
60 60 s oui
élongation
8 Critères d’acceptation/de rejet
8.1 Généralités

Un programme d’analyse des données spécifique à l’appareil de PCR en temps réel correspondant est

utilisé pour l’identification des produits de PCR. Les résultats de l’amplification peuvent être exprimés

d’une manière différente, selon l’appareil utilisé. En l’absence de produits de PCR détectables (résultat

négatif), le résultat peut être exprimé comme suit: « indéterminé », « pas d’amp. » ou nombre maximal

de cycles possibles. Si l’amplification de la séquence cible d’ADN se produit dans un échantillon (par

exemple, témoin positif), on peut observer une courbe d’amplification de forme sigmoïde et calculer

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ISO/TS 21569-3:2020(F)

le nombre de cycles auquel une valeur seuil de fluorescence prédéterminée est dépassée (valeur C ou

valeur C ).

Si, en raison de données de fluorescence mesurée atypiques, l’interprétation automatique ne fournit

pas un résultat probant, il peut être nécessaire de fixer manuellement la ligne de base et le seuil avant

l’interprétation des données. Dans ce cas, il est nécessaire de suivre les instructions spécifiques à

l’appareil données dans le manuel concernant l’utilisation du logiciel d’interprétation.

8.2 Identification
La séquence cible est considérée comme détectée si:

— en utilisant les amorces 35SP03.f et pat-7.r spécifiques au construit P35S-pat et la sonde GSS01.s,

une courbe d’amplification de forme sigmoïde peut être observée et une valeur seuil de fluorescence

prédéterminée est dépassée;

— dans les réactions PCR témoins sans ADN ajouté (témoin de réactif pour PCR, témoin négatif

d’extraction), aucune courbe d’amplification de forme sigmoïde ne peut être observée et une valeur

seuil de fluorescence prédéterminée n’est pas dépassée;

— dans les réactions pour le témoin d’amplification (témoin positif d’ADN cible, témoin d’inhibition de

PCR), les valeurs C (ou les valeurs C ) attendues sont obtenues.
t p
8.3 Calcul du nombre de copies pour la séquence P35S-pat

Avec les ADN étalons contenant des quantités définies de nombres de copies pour la séquence P35S-pat

(voir 5.2.4 et 9.3), une courbe d’étalonnage peut être établie et utilisée pour calculer les nombres de

copies pour la séquence P35S-pat dans des échantillons inconnus.
9 État de validation et critères de performance
9.1 Robustesse de la méthode

La robustesse de la méthode n’a pas été évaluée par rapport à de faibles modifications de facteurs tels

que les concentrations de réactifs (par exemple, amorces, sonde) ou les conditions de réaction (par

exemple, températures d’hybridation).

NOTE Lors de l’essai interlaboratoires, la robustesse de la méthode a été vérifiée par rapport à différents

appareils de PCR en temps réel et à différentes solutions tampons pour PCR. Les appareils de PCR en temps réel

et les solutions tampons pour PCR n’ont eu aucune influence sur les performances de la méthode.

9.2 Essai interlaboratoires pour la détermination de la limite de détection (LOD)

La limite de détection (LOD) de la méthode a été évaluée dans le cadre d’un essai interlaboratoires

coordonné, en 2011, par le Bureau fédéral allemand de la protection des consommateurs et de la sécurité

alimentaire (BVL), avec un total de 10 participants. Les participants ont reçu quatre échantillons d’ADN

provenant de végétaux modifiés génétiquement contenant la séquence cible P35S-pat.

Pour préparer les échantillons, on a utilisé des matériaux de référence certifiés fournis par l’American

Oil Chemists’ Society (AOCS, Urbana, États-Unis), ainsi que par l’Institut de Matériaux de Référence et

de Mesures (IRMM) à Geel, Belgique. Les matériaux utilisés étaient de l’ADN provenant de feuilles de

canola T45 (AOCS, 0208-A2), de soja A2704-12 (AOCS, 0707-B2), de maïs T25 (AOCS, 0306-H), et d’ADN

extrait de poudre de semences de maïs TC1507 (IRMM, ERM-BF418d). Les concentrations en ADN ont

été déterminées par spectrophotométrie. Les nombres d’équivalents génome par microlitre (µl) ont été

calculés en appliquant la Formule (1). Sur la base du nombre d’équivalents génome, le nombre de copies

correspondant pour la séquence P35S-pat a été calculé en tenant compte du nombre d’intégrations de

la séquence P35S-pat dans le génome de la plante ainsi que du degré de zygosité de la plante utilisée

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ISO/TS 21569-3:2020(F)

(voir Tableau 4). Les nombres de copies des ADN échantillons ont été ajustés à environ 100 copies de la

séquence P35S-pat par microlitre (μl).

Tableau 4 — Caractéristiques des matériaux de référence utilisés pour la détermination de la

limite de détection (LOD)
Nombre de Longueur
Masse (pg) copies de la du produit
Source du
Événement Matériau/ du génome séquence de PCR de
matériau de Zygosité
GM % (m/m) GM haploïde P35S-pat la séquence
référence
[4]
par génome P35S-pat
haploïde (bp)
[5]
Canola T45 AOCS ADN / 99,99 % 1,3 homozygote 1 111
[6]
Soja A2704-12 AOCS ADN / 99,99 % 1,13 homozygote 2 102
[7]
Maïs T25 AOCS ADN / 99,99 % 2,7 homozygote 1 111
[8]
Maïs TC1507 IRMM poudre / 10 % 2,7 hétérozygote 1 102

Sur la base de ces quatre solutions d’ADN étalon, une série de dilutions a été préparée par les

participants afin d’obtenir des solutions d’ADN avec des nombres de copies allant respectivement

de 50 à 0,1 par 25 μl de mélange réactionnel pour PCR. Les participants ont analysé chaque solution

d’ADN diluée avec la méthode PCR en temps réel pour la détection de la séquence P35S-pat lors d’une

détermination reproduite six fois dans les conditions décrites dans les Tableaux 1 à 3. Les résultats de

l’essai interlaboratoires sont indiqués dans le Tableau 5.

Tableau 5 — Résultats de l’essai interlaboratoires pour la détermination de la limite de

détection (LOD)
Nombres de copies de la Nombre de résultats positifs (C < 45) sur 60 résultats
séquence P35S-pat par
Canola T45 Maïs TC1507 Maïs T25 Soja A2704-12
PCR
50 60 60 60 60
20 60 60 60 60
10 59 60 60 60
5 46 59 56 55
2 26 52 41 36
1 11 42 21 24
0,1 3 8 3 2

9.3 Essai interlaboratoires pour la quantification du construit P35S-pat dans le colza

La méthode a été validée dans le cadre d’un essai interlaboratoires coordonné, en 2004, par le

sous-comité pour le développement de la méthode du Comité conjoint national et fédéral allemand sur

le génie génétique (LAG) avec un total de 14 participants. Les participants ont reçu cinq échantillons de

semences et cinq échantillons d’ADN.

Pour la préparation des échantillons de semences, du colza non génétiquement modifié a été mélangé

à du colza GS40/90 génétiquement modifié, dans des rapports de 980 g/20 g (2 % GM), 990 g/10 g

(1 % GM), 995 g/5 g (0,5 % GM), 999 g/1 g (0,1 % GM) et 1 000 g/0 g (0 % GM); puis le mélange a été

homogénéisé et subdivisé en échantillons de 30 g à l’aide d’un diviseur d’échantillons. Les participants

devaient broyer les échantillons de semences et extraire l’ADN qu’ils contenaient. Pour la préparation

des échantillons d’ADN fournis aux participants, l’ADN génomique extrait d’un colza oléagineux

GS40/90 a été mélangé à l’ADN génomique extrait d’un colza oléagineux non génétiquement modifié

pour obtenir des solutions contenant 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % et 0 % d’ADN de colza oléagineux GS40/90.

Les concentrations des échantillons d’ADN ont été ajustées à 20 ng/μl.
6 © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO/TS 21569-3:2020(F)

Chaque échantillon a été analysé par les participants au cours d’une détermination reproduite trois

fois avec la méthode PCR en temps réel pour la détection de la séquence P35S-pat dans les conditions

décrites dans les Tableaux 1 à 3. Pour l’étalonnage, six étalons d’ADN (100, 300, 900, 2 700, 8 100,

100 000 copies fournies) ont été mesurés deux fois au cours de la même analyse par PCR. En outre,

le même nombre de mesures a été réalisé en utilisant une méthode de PCR en temps réel spécifique

[2]

pour le taxon ciblant le gène pepC du colza oléagineux . Les courbes d’étalonnage ont été tracées en

reportant les valeurs C en fonction du logarithme des nombres de copies de la séquence cible prévus

pour les solutions d’étalonnage. Les nombres respectifs de copies pour les échantillons ont été calculés

par interpolation par rapport à la courbe d’étalonnage.

Le Tableau 6 présente un résumé des résultats. Le Tableau 7 présente les résultats quantitatifs. Avant le

calcul des teneurs moyennes en éléments génétiquement modifiés et des données de fidélité à l’aide de

[9]

méthodes d’essais statistiques conformément à l’ISO 5725-2 , les valeurs aberrantes ont été identifiées

et éliminées par l’application du test de Grubbs et du test de Cochran, le cas échéant. Dans la mesure où

le nombre d’allèles pepC dans les différentes variétés de colza oléagineux n’est pas connu, il n’est pas

possible d’utiliser les résultats du PCR spécifique pour le taxon pour calculer le nombre de copies du

génome du colza oléagineux. Par conséquent, la justesse de la méthode ne pouvait pas être déterminée.

En outre, il est supposé que la teneur en éléments génétiquement modifiés dans les échantillons de

semences peut s’écarter de la teneur
...

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21569-3
Second edition
Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of
genetically modified organisms and
derived products —
Part 3:
Construct-specific real-time PCR
method for detection of P35S-pat-
sequence for screening for genetically
modified organisms
Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 3: Méthode PCR en temps réel construit-spécifique pour la
détection de la séquence P35S-pat pour criblage des organismes
génétiquement modifiés
PROOF/ÉPREUVE
Reference number
ISO/TS 21569-3:2020(E)
ISO 2020
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ISO/TS 21569-3:2020(E)
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

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ii PROOF/ÉPREUVE © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO/TS 21569-3:2020(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 PCR reagents ............................................................................................................................................................................................. 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Test sample procedure ..................................................................................................................................................................... 3

7.2 Preparation of the DNA extracts .............................................................................................................................................. 3

7.3 PCR setup ..................................................................................................................................................................................................... 3

7.4 Temperature-time programme ................................................................................................................................................. 4

8 Accept/reject criteria ...................................................................................................................................................................................... 4

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 4

8.3 Calculation of P35S-pat copy numbers .............................................................................................................................. 5

9 Validation status and performance criteria ............................................................................................................................. 5

9.1 Robustness of the method ............................................................................................................................................................. 5

9.2 Collaborative trial for determination of LOD ................................................................................................................ 5

9.3 Collaborative trial for quantification of the P35S-pat construct in rapeseed ................................... 6

9.4 Sensitivity .................................................................................................................................................................................................... 7

9.5 Specificity .................................................................................................................................................................................................... 7

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 8

Annex A (informative) Genbank BLASTN Search ..................................................................................................................................... 9

Annex B (informative) Joint Research Commission GMO-Matrix ........................................................................................11

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................14

© ISO 2020 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO/TS 21569-3:2015), which has been

technically revised. The main changes compared with the previous edition are as follows:

— the section on in silico search has been updated;
— minor typographical changes have been made throughout.
A list of all parts in the ISO 21569 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv PROOF/ÉPREUVE © ISO 2020 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21569-3:2020(E)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products —
Part 3:
Construct-specific real-time PCR method for detection of
P35S-pat-sequence for screening for genetically modified
organisms
1 Scope

This document describes a procedure for the detection of the DNA transition sequence between the 35S

promotor (P35S) from Cauliflower mosaic virus and a modified phoshinothricin-acetyltransferase gene

(pat) from Streptomyces viridochromogenes. The P35S-pat construct is frequently found in genetically

modified plants with tolerance for phosphinothricin-containing herbicides. The P35S-pat construct

specific method is based on a real-time PCR and can be used for qualitative and quantitative screening

purposes. For identification and quantification of a specific event, a follow-up analysis can be carried out.

This document is applicable to the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It can also be suitable

for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of

this method requires the extraction of an adequate quantity and quality of amplifiable DNA from the

relevant matrix.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions

ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Qualitative nucleic acid-based methods

ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Nucleic acid extraction

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
© ISO 2020 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2020(E)
4 Principle

DNA is extracted from the test portion by applying a suitable method. The DNA analysis consists of

two parts:

a) verification of the amount and amplifiability of the extracted DNA, e.g. by means of a target tax on

[1]
specific real-time PCR (see ISO 21570 ):
[2][3]
b) detection of the P35S-pat construct in a real-time PCR .
5 Reagents and materials
5.1 General

Chemicals of recognized analytical grade, appropriate for molecular biology shall be used, as a rule.

The water used shall be double distilled or PCR grade water (i.e. nuclease and nucleic acid free). For all

operations in which gloves, the gloves should be powder free. The use of aerosol-protected pipette tips

as protection against cross contamination is recommended.
5.2 PCR reagents
5.2.1 Thermostable DNA polymerase, for hot-start PCR.

5.2.2 PCR buffer solution, containing magnesium chloride and deoxyribonucleoside triphosphates

(dATP, dCTP, dGTP and dUTP).

Ready-to-use reagent mixtures or mixes of individual components can be used. Reagents and

polymerases that lead to equal or better results may also be used.
5.2.3 Oligonucleotides (see Table 1).
Table 1 — Oligonucleotides
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in the PCR
[2][3]
P35S-pat construct as the target sequence :
Primer 35SP03.f 5′-AAg TTC ATT TCA TTT ggA gAg gAC A-3′ 200 nmol/l
Primer pat-7.r 5′-Cgg CCA TAT CAg CTg CTg TAg-3′ 200 nmol/l
5′-(FAM)-CCg gAg Agg AgA CCA gTT gAg ATT Agg
Probe GSS01.s 100 nmol/l
C-(TAMRA)-3′
FAM: 6-Carboxyfluorescein, TAMRA: 6-Carboxytetramethylrhodamine.

NOTE Equivalent reporter dyes and/or quencher dyes can be used for the probe if they can be shown to yield

similar or better results.
5.2.4 Standard DNA for calibration

A standard DNA solution of a known concentration (ng/µl) can be used to calculate the copy number of

the P35S-pat target sequence.
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ISO/TS 21569-3:2020(E)

When using genomic plant DNA as the standard DNA, the number of haploid genome equivalents should

be calculated on the basis of the molecular mass of the plant haploid genome by applying Formula (1):

c ×1 000
DNA
n = (1)
where
n is number of genome equivalents per microlitre;
m is the haploid genome mass in picograms;
c is the DNA concentration in nanograms per millilitres.
DNA

The respective copy number for the P35S-pat sequence can be calculated based on the genome

equivalents. In doing so, the number of integrations into the plant genome as well as the degree of

zygosity of the plant material used shall be taken into consideration.
6 Apparatus

For apparatus and materials, follow ISO 21569. In addition to the usual laboratory equipment, the

following equipment is required.

6.1 Real-time PCR device, suitable for the excitation of fluorescent molecules and the detection of

fluorescence signals generated during PCR.
7 Procedure
7.1 Test sample procedure

The testing plan for P35S-pat screening assumes that the test samples are a representative sample

drawn from the laboratory sample. Simple representative sampling implies that each test sample has

both an equal and an independent chance of being drawn from the laboratory sample. Measures and

operational steps to be taken into consideration shall be as described in ISO 21571 and ISO 24276.

7.2 Preparation of the DNA extracts

Concerning the preparation of DNA from the test portion, the general instructions and measures

described in ISO 21571 should be followed. It is recommended to choose one of the DNA extraction

methods described in ISO 21571:2005, Annex A.
7.3 PCR setup

The method is described for a total volume of 25 μl per PCR. The reaction set-up is given in Table 2.

Completely thaw reagents at room temperature. Each reagent should be carefully mixed and briefly

centrifuged immediately before pipetting. Prepare a PCR reagent mixture that contains all the

components except for the sample DNA. The required amount of the PCR reagent mixture depends

on the number of reactions to be performed, including at least one additional reaction as a pipetting

reserve. Add 5 µl of sample DNA to each reaction.

Mix the PCR reagent mixture, centrifuge briefly and pipette 20 µl into each reaction vial. For the

amplification reagent control, add 5 µl water into the respective reaction set-up. Pipette either 5 µl of

sample DNA or 5 µl of the respective control solution (extraction blank control, positive DNA target

control). If necessary, prepare a PCR inhibition control as described in ISO 24276.

Transfer the reaction set-ups into the thermal cycler and start the temperature-time programme.

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ISO/TS 21569-3:2020(E)
Table 2 — Reaction set-up for the amplification
Element Set-up
Overall reaction volume 25 µl
Sample DNA (up to 200 ng) or controls 5 µl

PCR buffer solution (including MgCl , dNTPs and hot-start DNA polymerase) 12,5 µl

Primer 35SP03.f and pat-7.r see Table 1
Probe GSS01.s see Table 1
Water to 25 µl

In the collaborative study, depending on the real-time PCR devices, different PCR buffer solutions were used [TaqMan

Universal PCR Mastermix (Life Technologies, Darmstadt), QuantiTect Multiplex PCR NoROX or QuantiTect Probe PCR

Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden)]. This information is given for the convenience of users of this document and does not

constitute an endorsement by ISO of the products named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to

the same results. If necessary, adapt the amounts of the reagents and the temperature-time programme.

7.4 Temperature-time programme

The temperature-time programme as outlined in Table 3 was used in the validation study. The use of

different reaction conditions and real-time PCR cyclers may require specific optimization. The time for

initial denaturation depends on the master mix used.
Table 3 — Temperature-time programme
Step Parameter Temperature Time Fluorescence Cycles
°C measurement
1 UNG activation (optional) 50 2 min no 1
2 Initial denaturation 95 10 min no 1
Denaturation 95 15 s no
3 Amplification 45
Annealing and
60 60 s yes
elongation
8 Accept/reject criteria
8.1 General

A corresponding real-time PCR device-specific data analysis programme is used for the identification

of PCR products. The amplification results may be expressed in a different manner, depending on

the device used. In the absence of detectable PCR products (e.g. negative control), the result can be

expressed as “undetermined”, “no amp” or the maximum number of possible cycles. If the amplification

of the DNA target sequence occurs in a sample (e.g. positive control), a sigmoid-shaped amplification

curve can be observed, and the cycle number is calculated at which a predetermined fluorescence

threshold value is exceeded (C value or C value).
t p

If, due to atypical fluorescence measurement data, the automatic interpretation does not provide

a meaningful result, it might be necessary to set the baseline and the threshold manually prior to

interpreting the data. In this case, the device-specific instructions given in the manual regarding the

use of the interpretation software shall be applied.
8.2 Identification
The target sequence is considered as detected, if:

— by using the P35S-pat specific primers 35SP03.f and pat-7.r and the probe GSS01.s, a sigmoid-shaped

amplification curve can be observed and a predetermined fluorescence threshold value is exceeded;

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ISO/TS 21569-3:2020(E)

— in the PCR control set-ups with no added DNA (PCR reagent control, negative extraction control), no

sigmoid shaped amplification curve can be observed and a predetermined fluorescence threshold

value is not exceeded;

— in the set-ups for the amplification control (positive DNA target control, PCR inhibition control), the

expected C values (or C values) are achieved.
t p
8.3 Calculation of P35S-pat copy numbers

With DNA standards containing defined amounts of P35S-pat copy numbers (see 5.2.4 and 9.3), a

calibration curve can be generated and used for calculation of P35S-pat copy numbers in unknown

samples.
9 Validation status and performance criteria
9.1 Robustness of the method

The robustness of the method has not been tested with respect to small modifications of factors such as

reagent concentrations (e.g. primers, probe) or reaction conditions (e.g. annealing temperature).

NOTE In the collaborative trial, the robustness of the method has been checked with regard to different

real-time PCR machines and PCR buffer solutions. The real-time PCR machines and the PCR buffer solutions had

no influence on the performance of the method.
9.2 Collaborative trial for determination of LOD

The limit of detection (LOD) of the method was tested in a collaborative study coordinat

...

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