ISO 22942-1:2022

Molecular biomarker analysis - Isothermal polymerase chain reaction (isoPCR) methods - Part 1: General requirements

This document specifies general criteria for development, validation and use of nucleic acid analytical methods based on the isothermal polymerase chain reaction (isoPCR). It provides additional information and guidance for specific isoPCR technologies. This document is applicable to food, feed, plant matrices and their propagules, plant pathogens, and animals in which amplification of a specific biomolecular target sequence is required.

Analyse de biomarqueurs moléculaires — Méthodes de réaction de polymérisation en chaîne isotherme (isoPCR) — Partie 1: Exigences générales

Le présent document spécifie des critères généraux pour la mise au point, la validation et l’utilisation de méthodes d’analyse d’acide nucléique fondées sur la réaction de polymérisation en chaîne isotherme (isoPCR). Il délivre des informations supplémentaires et des recommandations pour des technologies isoPCR particulières. Le présent document est applicable aux aliments, aux aliments pour animaux, aux matrices végétales et à leurs propagules, aux agents phytopathogènes, et aux animaux pour lesquels une amplification d’une séquence biomoléculaire cible spécifique est requise.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 23-Mar-2022
• ICS: 67.050 - General methods of tests and analysis for food products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 16 - Horizontal methods for molecular biomarker analysis
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 16/WG 10 - Rapid nucleic acid amplification methods
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 24-Mar-2022
• Due Date: 06-Oct-2021
• Completion Date: 24-Mar-2022

Overview

ISO 22942-1:2022 specifies general requirements for development, validation and routine use of nucleic acid analytical methods based on isothermal polymerase chain reaction (isoPCR). Applicable to food, feed, plant matrices and propagules, plant pathogens and animals, the standard defines principles, laboratory practices, performance criteria and reporting expectations for isoPCR workflows. It also provides technology-specific guidance (LAMP, RCA, RPA, HDA, SDA, NASBA, Cas9nAR) in informative annexes.

Key topics and technical requirements

• Principle and scope: Defines isoPCR as constant-temperature enzymatic amplification methods that can operate without precision thermal cycling.
• Method development: Requirements for intended purpose, scientific rationale, units of measurement and documentation (including Minimum Information for an isoPCR Experiment - MIIPCRE).
• Validation and performance criteria: Structured validation covering sensitivity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), linearity, range, precision, accuracy, selectivity/specificity, robustness and applicability to target matrices.
• Nucleic acid quality: Guidance on extraction, sample preparation and assessment of extract quality for reliable amplification.
• Controls and contamination management: Use of environmental, positive, negative and extraction controls; workspace design and procedural segregation to reduce false positives/negatives.
• Interpretation and reporting: Criteria for interpreting assay controls, expression of negative/positive/quantitative/ambiguous results, and required content for test reports.
• Annexed methods: Informative examples and protocol-level guidance for LAMP, RCA, HDA, RPA, SDA, NASBA and Cas9nAR to support practical implementation.

Applications and who should use it

ISO 22942-1:2022 is designed for:

• Diagnostic and regulatory laboratories performing molecular biomarker analysis in food safety, plant health and veterinary contexts.
• Test developers and kit manufacturers creating isoPCR-based assays (LAMP, RPA, etc.).
• Accreditation bodies, quality managers and scientists implementing method validation, establishing LOD/LOQ, and producing compliant test reports.
• Field-deployable testing programs where rapid, low-instrumentation nucleic acid detection is required (e.g., on-site plant pathogen screening, food authenticity checks).

Practical value: enables consistent, validated isoPCR workflows that reduce false results, streamline reporting and facilitate regulatory acceptance for food/feed and plant/animal testing.

Related standards

• Other parts of the ISO 22942 series (technology- or application-specific parts).
• Relevant laboratory and accreditation guidance such as ISO/IEC 17025 for testing laboratory competence and quality systems.

Keywords: ISO 22942-1:2022, isoPCR, isothermal PCR, LAMP, RPA, method validation, limit of detection, molecular biomarker analysis, food testing, plant pathogen detection.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22942-1
First edition
2022-03
Molecular biomarker analysis —
Isothermal polymerase chain reaction
(isoPCR) methods —
Part 1:
General requirements
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Méthodes de réaction de
polymérisation en chaîne isotherme (isoPCR) —
Partie 1: Exigences générales
Reference number
© ISO 2022
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
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Email: [e-mail]
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .v
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Development of an isoPCR method . 3
5.1 General . 3
5.2 Intended purpose . 3
5.3 Scientific basis . 3
5.4 Units of measurement . 6
5.5 Method validation . 6
5.6 Performance criteria . 6
5.6.1 General . 6
5.6.2 Sensitivity . 6
5.6.3 Nucleic acid extract quality . 7
5.6.4 Applicability . 7
5.6.5 Nucleic acid sequence specificity . 7
5.6.6 Precision . 7
5.6.7 Accuracy . 8
5.6.8 Selectivity . 8
5.6.9 Linearity . 8
5.6.10 Limit of detection (LOD) . 8
5.6.11 Limit of quantification (LOQ) . 9
5.6.12 Range . 10
5.6.13 Robustness . . . 10
6 General laboratory and procedural requirements .11
6.1 Competence . 11
6.2 Sample preparation . 11
6.2.1 General . 11
6.2.2 Obtaining a representative sample . 11
6.2.3 Preparation of the test portion . 11
6.2.4 Nucleic acid extraction .12
6.3 Use of controls .12
6.3.1 General .12
6.3.2 Environmental controls .12
6.3.3 Positive controls .12
6.3.4 Negative controls .12
6.3.5 Extraction controls .12
6.4 Workspace organization .13
6.4.1 General .13
6.4.2 Design of the workspace — Laboratory design .13
6.4.3 Design of non-laboratory workspaces . 13
6.4.4 Personnel . 13
6.4.5 Apparatus and equipment . 14
7 Materials and reagents .14
8 Interpretation of results .14
8.1 General . 14
8.2 Interpretation of controls . 14
8.3 Expression of results . 15
8.3.1 General .15
iii
8.3.2 Expression of a negative result . 15
8.3.3 Expression of a positive result . 16
8.3.4 Expression of quantitative results . 16
8.3.5 Expression of ambiguous results . . 16
9 Test report .16
Annex A (informative) Minimum information for an isoPCR experiment (MIIPCRE) .18
Annex B (normative) Use of controls .21
Annex C (informative) Examples of isothermal nucleic acid isoPCR amplification results .22
Annex D (informative) Loop mediated isothermal amplification (LAMP) .23
Annex E (informative) Rolling circle amplification (RCA).26
Annex F (informative) Helicase dependent amplification (HDA) .27
Annex G (informative) Recombinase polymerase amplification (RPA) .29
Annex H (informative) Strand displacement amplification (SDA) .31
Annex I (informative) Nucleic acid sequence based amplification (NASBA) .33
Annex J (informative) Cas9nAR amplification .36
Bibliography .38
iv
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
A list of all parts in the ISO 22942 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
v
Introduction
Isothermal nucleic acid amplification describes methods that use constant temperature polymerase-
[1][2][3][4][5][6]
catalysed reactions to amplify a nucleic acid target sequence . In contrast to thermal-
cycler based polymerase chain reactions, isothermal nucleic acid amplification does not require
variable temperature cycling for denaturation, annealing, and polymerization although, in some cases,
primer binding requires a single high temperature denaturation and an annealing step. Isothermal
amplification methods can be described by the term “isothermal PCR (isoPCR)”.
Naturally, living organisms isothermally replicate DNA during cell division and transcribe RNA
to produce structural, and regulatory components. IsoPCR leverages both natural and synthetic
isothermal enzymatic processes. The enzymes include DNA and RNA polymerase, helicase,
recombinase, exonuclease and nickase. Because isoPCR does not require variable temperature
cycling for denaturation, polymerization and annealing there is no need for precision thermal cycling
instruments. Reactions are run at a single temperature, except in cases where a nickase or displacing
enzyme is not present in the reaction and an initial denaturation is required. In addition, various non-
enzymatic nucleic acid binding proteins can be necessary. IsoPCR amplification in many applications
can be performed on cell lysates without nucleic acid extraction. Some examples of amplification
[7]
strategies are loop-mediated isothermal amplification (LAMP) , rolling circle amplification (RCA)
[8] [9] [10]
, helicase dependent amplification (HDA) , recombinase polymerase amplification (RPA) , strand
[11] [12]
displacement amplification (SDA) , nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) and
[13]
Cas9 nickase-based amplification reaction (Cas9nAR) . The LAMP, RCA, HDA, RPA, SDA and NASBA
strategies can incorporate both deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) into amplified
nucleic acids. Cas9nAR can only use DNA as the starting template for amplification.
IsoPCR methods can be used for amplification, detection, identification, quantification, and analysis of
specific low concentration nucleic acids in food and food products. These methods can, in most cases,
amplify nucleic acids from un-purified nucleotide extracts. Detection of the target sequence is achieved
through real-time or end-point techniques using one of several different amplification strategies and
detection chemistries. Detection chemistries include turbidimetry, chromatography, gel electrophoresis
and fluorescence, and can, in some applications, be achieved in a closed lateral flow device system.
Key features of isoPCR methods are constant temperature nucleic acid amplification, use of crude
extracts, simple detection methods, and short reaction times without the need for precision thermal
cycling instruments.
Because isoPCR methods are gaining in popularity and applicability, standardization of the acceptance
criteria for these methods in food products is important.
vi
INTERNATIONAL STANDARD ISO 22942-1:2022(E)
Molecular biomarker analysis — Isothermal polymerase
chain reaction (isoPCR) methods —
Part 1:
General requirements
1 Scope
This document specifies general criteria for development, validation and use of nucleic acid analytical
methods based on the isothermal polymerase chain reaction (isoPCR). It provides additional
information and guidance for specific isoPCR technologies.
This document is applicable to food, feed, plant matrices and their propagules, plant pathogens, and
animals in which amplification of a specific biomolecular target sequence is required.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO/TS 16393, Molecular biomarker analysis — Determination of the performance characteristics of
qualitative measurement methods and validation of methods
ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Vocabulary for molecular biomarker analytical methods in
agriculture and food production
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
extraction blank control
negative control reaction generated by performing all required steps in an extraction procedure except
for the addition of the test portion
EXAMPLE By substitution of water for the test portion.
Note 1 to entry: This control is used to demonstrate the absence of contamination during extraction.
3.2
extraction control
positive control reaction generated by performing all required steps in an extraction procedure except
with a known test portion containing a known amount of target nucleic acid or tissue
Note 1 to entry: This control is used to demonstrate the performance of the extraction process.
3.3
isothermal polymerase chain reaction
isoPCR
isothermal nucleic acid amplification
isothermal nucleic acid amplification technology
isothermal amplification
polymerase chain reaction that polymerizes nucleic acids without thermal cycling (3.10), e.g., at constant
temperature
Note 1 to entry: In some isoPCR applications, nucleic acids are denatured at a higher temperature prior to the
start of the amplification reaction.
Note 2 to entry: Seven isoPCR strategies are described in this document. These strategies can be applied to a
number of different methods consisting of DNA extraction, amplification and detection chemistries.
3.4
isoPCR method
analytical method that applies an isoPCR (3.3) strategy
3.5
non-laboratory field setting
workspace lacking conditions controlled for environmental aerosol contamination and sophisticated
nucleic acid purification apparatus
3.6
nucleotide sequence specificity
capacity to exclusively recognize a specific nucleic acid sequence target to be amplified, distinguishing
it from other nucleic acids and contaminants
3.7
percentage dynamic range
percentage applicability range
percentage range of quantification
ratio as a percentage of upper and lower limits of quantification as expressed by a set of reference
materials (or dilutions) with a suitable level of precision and accuracy
3.8
representative sample
sampling units (samples or groups) that have been extracted from the lot with a process ensuring all
sampling units of the lots have an equal probability of being selected and not altered in any way that
would change the analytical result
Note 1 to entry: The extraction process can be a multi-stage process.
[SOURCE: ISO 22753:2021, 3.15]
3.9
selectivity
extent to which a method can determine particular analyte(s) in a mixture(s) or matrix(matrices)
without interferences from other components of similar behaviour
Note 1 to entry: The selectivity of an isoPCR method (3.4) for RNA or DNA or both can be determined with respect
to inhibitors such as polyamines, polysaccharides and polyphenols, since these interfere with the ability of the
reaction to amplify and disclose a specific target sequence.
Note 2 to entry: Selectivity is differentiated from nucleotide sequence specificity (3.6) which measures the
recognition of the target sequence by the assay at the molecular or taxonomic levels.
3.10
thermal cycling
thermocycling
process including numerous heating and cooling steps of a pre-determined temperature regime used to
denature, anneal, and elongate nucleic acids in a polymerase chain reaction
4 Principle
Detection of the target sequence is achieved through real-time or end-point techniques that apply
a specific amplification strategy and leverage several different detection chemistries. Detection
chemistries include turbidimetry, chromatography, gel electrophoresis and fluorescence. In some
isoPCR applications, a product can be detected in a closed lateral flow device system or fluorescence
detection instrument.
A general overview for seven examples of isoPCR amplification strategies is provided in Table 1.
Descriptions of each isoPCR strategy, their applications, advantages and disadvantages can be found in
Annexes D to J.
5 Development of an isoPCR method
5.1 General
A DNA or RNA isoPCR method can be used to detect, identify and, as required, quantify an intended
specific nucleic acid target(s). A method consists of:
— a matrix-specific extraction (where required);
— any further purification step(s);
— the enzymatic components and reagents;
— a description of the oligonucleotide primers and probes (labelled and non-labelled) that will be used
(including how the target and oligonucleotide sequences were chosen);
— a description of how the amplified products will be detected;
— a protocol describing the conditions under which the isoPCR method is used including the use of
controls and example calculations.
Guidelines for the minimum information for publication of isoPCR experiments (MIIPCRE) are provided
in Annex A. MIIPCRE are guidelines for the minimum information necessary for evaluating isoPCR
experiments. Annex A is a checklist for laboratories.
5.2 Intended purpose
Information regarding the intended purpose and the limitations of a method shall be provided.
Specifically, the method shall be evaluated for fitness for purpose based on the criteria and requirements
described in this document.
5.3 Scientific basis
An overview of the principles and application of the method shall be provided. Appropriate references
to relevant scientific publications should be included.
Table 1 — General overview for seven isoPCR amplification strategies
IsoPCR Target Enzymes Initial Time Amplification Meas- LOD Analyte Detection Equipment needed
strategy nucleic involved heating (h) urement (copies) method(s)
Power Tempera-
acid method(s)
o
ture ( C)
LAMP DNA, RNA Polymerase Yes < 1 Exponen- 60 to 65 Qualitative, ~5 DNA, RNA, Turbidimetry of Visual detection, tur-
tial quantitative Small pyrophosphate, bidimeter (real-time);
molecules fluorescent dye, elec- isothermal fluorom-
trochemistry, eter; electrochemical
single-stranded LAMP microfluidic
nucleotide tag chip, lateral flow
hybridization detection strips or
printed array strip
RCA DNA, RNA Polymerase Yes 1 to 4 Linear 30 to 65 Qualitative, 10 DNA, RNA, Fluorescent tags, Spectrophotometer,
quantitative Protein, fluorometry isothermal
Methylated fluorometer
DNA, Small
molecules,
Cells
HDA DNA, RNA Helicase, No 0,5 to 2 Exponen- 64 Qualitative, 1 DNA, Gel electrophoresis; Electrophoresis cham-
polymerase tial quantitative Protein immunohistochemis- ber, UV transillumina-
try, fluorescent dyes tor; closed lateral flow
device system, isother-
mal fluorometer
RPA DNA, RNA Recombi- No < 1 Exponen- 37 to 42 Qualitative, 1 DNA, RNA, Gel electrophoresis; Electrophoresis cham-
nase, tial quantitative Protein immunohistochemis- ber, UV Transillumina-
polymerase try, fluorometry tor; closed lateral flow
device system, isother-
mal fluorometer
SDA DNA, RNA Polymerase, Yes 1 to 2 Exponen- 30 to 55 Qualitative 10 DNA, RNA, Gel electrophoresis; Electrophoresis cham-
restriction tial small pH indicator dyes; ber, UV transillumina-
enzyme molecules fluorescence tor; visual detection;
spectrophotometer or
isothermal fluorom-
eter
NOTE  Adapted from Reference [19].

Table 1 (continued)
IsoPCR Target Enzymes Initial Time Amplification Meas- LOD Analyte Detection Equipment needed
strategy nucleic involved heating (h) urement (copies) method(s)
Power Tempera-
acid method(s)
o
ture ( C)
NASBA RNA, DNA Reverse No 1 to 3 Exponen- 41 Qualitative, 1 DNA, RNA, Gel electrophoresis; Electrophoresis
tran- tial quantitative miRNA, fluorescent probes; chamber, UV transil-
scriptase, Protein ELISA, fluorometry luminator; microplate
RNA pol- reader, isothermal
ymerase, fluorometer
RNase H
Cas9nAR DNA Cas9 No Exponen- 37 Qualitative DNA Gel electrophoresis; Electrophoresis
polymerase tial fluorescent dyes chamber, UV transil-
luminator; isothermal
fluorometer or visual
NOTE  Adapted from Reference [19].

5.4 Units of measurement
Qualitative (binary) measurement with isoPCR methods provides a binary result based on a
predetermined probability of detection (POD). Qualitative measurements are used to determine the
presence or absence of molecular biomarkers in food or food products (including seeds and propagules
of food crops). The performance characterization of a qualitative method shall be carried out as
described in ISO/TS 16393.
Quantitative methods determine the amount of the target analyte present in a sample. Quantitative
units of measurement (e.g. target copy number), performance and data reporting criteria shall be
specified. Quantitative results can be reported as:
— nucleic acid copy number (c);
— copy number ratio (c/c , where c is a known reference copy number);
r r
— percentage of the analyte;
— other criteria as described in the method.
The principles of calculation of any ratio used shall be reported. For quantification methods, the
quantification strategy will depend on the application. Application of a calibration curve or copy
[15]
number determination method evaluation can be carried out as described in ISO 20395 .
5.5 Method validation
The isoPCR method shall be developed considering its fitness for purpose. Validation and verification
shall include sufficient testing to provide adequate confidence that the procedure is selective, repeatable
and can detect the target in a known applicability range. Although collaborative studies are preferable,
[16]
single laboratory validations can be acceptable. Thompson et al. provides criteria for the single
laboratory validation of a method and ISO/TS 16393 gives further guidance for collaborative validation
of qualitative methods.
ISO 20395 provides generic requirements for evaluating the performance and ensuring the quality
of methods used for the quantification of specific nucleic acid sequences (targets) including method
validation (precision, linearity, limit of quantification, limit of detection, trueness and robustness).
Collaborative trials for isoPCR methods should be undertaken during the validation step. For
[17]
quantitative methods, the ISO/AOAC/IUPAC Harmonized Protocol describes a process for validating
a method via collaborative trials. The results of all interlaboratory or single-laboratory collaborative
trials, or both, and the resulting performance characteristics should be analysed, described and
[ ]
included with the published method 16 .
The JRC technical report “Verification of analytical methods for GMO testing when implementing
interlaboratory validated methods” provides guidance on how to carry out the method verification of
[18]
interlaboratory validated methods for the qualitative and quantitative detection of GMOs .
5.6 Performance criteria
5.6.1 General
Performance criteria shall be determined and set for method validation. Performance criteria includes
sensitivity, nucleic acid extract quality, applicability, nucleic acid sequence specificity, precision
(repeatability, intermediate precision, reproducibility), accuracy, selectivity, linearity, limit of detection,
limit of quantification, range, measurement uncertainty and robustness.
5.6.2 Sensitivity
The sensitivity of an isoPCR amplification method for biomarker analysis shall be established by
determining the slope of a calibration curve. The calibration curve can be constructed by assaying
sequential samples descending in target DNA concentration by a 10-fold serial dilution. A minimum of
five sample concentrations run in triplicate is required.
5.6.3 Nucleic acid extract quality
Nucleic acids should be extracted from the most relevant types of matrices, including those types
reflecting the method scope, containing a known mass/mass content of the target(s) to genomic nucleic
acid of the species (evenly distributed over the percentage dynamic range of the method) and tissues
relevant for the application.
The nucleic acid extraction procedure used for validation and verification of the isoPCR method of a
specific target in a specific matrix shall be identified. The extraction method shall produce nucleic acids
that are of sufficient length, chemical purity and structural integrity for subsequent amplification and
analysis. For amplification directly from cell extracts, determination of the nucleic acid extract quality
is dependent upon the particular matrix. Performance should be determined based on the results from
each cell matrix tested. Nucleic acid extract quality is affected by nucleic acid concentration, structural
integrity, purity, presence of inhibitors, etc.
5.6.4 Applicability
The applicability or fitness for purpose of the isoPCR methods shall include the intended purpose, a
protocol, the target, the cellular location of the target (nuclear or mitochondrial), and the range of
copy numbers or concentration range for which the target is detectable. The nature of the matrix (e.g.
organism, tissues, processed food) should also be considered.
5.6.5 Nucleic acid sequence specificity
The theoretical nucleic acid sequence specificities of the primers and probes shall be assessed through
a search of the relevant databases.
Primers for amplification shall be designed to recognize and anneal to their complementary sequences
and allow specific target amplification. This determination should be performed in silico potentially
using a primer design application before primers are tested experimentally. The nucleic acid sequence
specificity of detection methods for a particular target depends on the specific properties of the targeted
DNA sequence and can vary considerably between isoPCR applications. It is, therefore, important to
ensure that the chosen method(s) provides the desired nucleic acid sequence specificity and nucleic
acid selectivity (DNA or RNA). When RNA is the target, sometimes additional considerations need to be
addressed.
5.6.6 Precision
5.6.6.1 General
The precision of the isoPCR amplification method shall be determined. Single laboratory validation and
collaborative trials should be applied to the entire range of matrices and target species.
5.6.6.2 Reference and certified reference material
Certified reference material should be analysed multiple times in the single-laboratory validation of an
isoPCR method to assess laboratory and method bias. Other reference materials, i.e. those left over from
proficiency tests, can also be used for this purpose if the associated uncertainty is known. Spiking and
recovery information can also be used although the measurement uncertainty is not always known.
5.6.6.3 Repeatability standard deviation (s )
r
The repeatability standard deviation shall be determined for a range of analyte concentrations for
laboratory verification and single laboratory validation.
5.6.6.4 Reproducibility standard deviation (s )
R
The reproducibility standard deviation shall be determined for a range of analyte concentrations for
validation and collaborative trials.
5.6.7 Accuracy
The accuracy of an isoPCR method should be determined by comparison to the results from a different
method for the same target or results from a calibrator. The accuracy is sometimes given based upon
the extraction recovery, however, bias contributed by the amplification should also be included in this
estimate.
5.6.8 Selectivity
Selectivity of the method should be tested against the most likely potential interference of target
analytes, e.g. rRNA, similar DNA, polyglycosides, protein. An isoPCR method should be sufficiently
selective for any interferences to be ignored.
5.6.9 Linearity
The calibration function should be linearizable, pass through the origin, and be unaffected by the
cellular matrix of the test material. The linearizable component of the response from a dynamic range
determination shall permit the concentration of the analyte in the test samples to be determined, if a
quantification is performed. At least six calibration standards should be used to determine linearity.
The POD should be known for a qualitative determination.
5.6.10 Limit of detection (LOD)
Method LOD is determined for both qualitative and quantitative analysis. The LOD is the true net
concentration or amount of the analyte in the material to be analysed that will lead, with probability (1-
β), to the conclusion that the concentration or amount of the analyte in the analysed material is larger
than that in the blank material. It is defined as shown by Formula (1):

PLL≤=|LL =β (1)
()
rc D
where
L is the LOD;
D

is the estimated value;
L
L is the expectation or true value;
L is the critical value.
c
NOTE 1 The limit of detection is estimated by:
L ≈ 2t σ
D 1-αν o
where
L is the LOD;
D
αβ= ;
t is Student’s t-distribution value, based on ν degrees of freedom for a one-sided confidence
1-αν
interval of 1-α;
σ is the standard deviation of the true value (expectation).
o
L = 3,29 σ , when the uncertainty in the mean (expected) value of the blank is negligible, α = β = 0,05
D o
and L is normally distributed with known constant variance. However, L is not defined simply as a
D
fixed coefficient (e.g. 3, 6) times the standard deviation of a pure solution background. To do so can be
extremely misleading. The correct estimation of L can take into account degrees of freedom, α and
D
β, and the distribution of L as influenced by factors such as analyte concentration, matrix effects and
interference.
This definition provides a basis for taking into account exceptions to the simple case that is described,
i.e. involving non-normal distributions and heteroscedasticity (e.g. “counting” (Poisson) processes as
those used for real time PCR).
It is essential to specify the measurement process under consideration, since distributions, standard
deviations and blanks can be dramatically different for different measurement processes.
At the L , a positive identification can be achieved with reasonable or previously determined confidence
D
or both in a defined matrix using a specific analytical method.
NOTE 2 An empirically derived determination based on the results of a collaborative trial is called the
“practical LOD”. It is defined as the lowest relative quantity of the target DNA that can be detected, given a known
(determined/estimated) number of target taxon copies. The practical LOD is related to the test portion, and the
quality/quantity of the template DNA, and L = 3,29 σ which has also been called the absolute LOD of the method
D o
with 95 % confidence.
NOTE 3 In qualitative testing, an estimate of the L is measured at the chosen POD. The L can only be
D D
discretely determined for a quantitative method.
5.6.11 Limit of quantification (LOQ)
The LOQ is a method performance characteristic generally expressed in terms of the signal or
measurement (true) value that will produce estimates having a specified reproducibility coefficient of
variation (C ), commonly less than 25 % for isoPCR. LOQ is estimated as shown by Formula (2):
V,R
L = k σ , k = 1/C (2)
Q Q Q Q V,R
where
L is the LOQ;
Q
σ is the standard deviation at that point;
Q
k is the multiplier whose reciprocal equals the selected C .
Q V,R
The approximate C of an estimated σ, based on ν-degrees of freedom is 1/√2ν.
V,R
NOTE If σ is known and constant, then σ = σ , since the standard deviation of the estimated quantity is
Q o
independent of concentration. Substituting 25 % in for k gives:
Q
LOQ = (25 * σ ) = 25 σ
Q o
In this case, the LOQ is just 7,60 times the limit of detection, given normality and α = β = 0,05.
At the LOQ, a positive identification can be achieved with reasonable or previously determined
confidence or both in a defined matrix using a specific analytical method.
This definition provides a basis for taking into account exceptions to the simple case that is described,
i.e. involving non-normal distributions and heteroscedasticity (e.g. “counting” (Poisson) processes as
those used for real time PCR).
5.6.12 Range
5.6.12.1 General
In general, the operative range of applicability for an isoPCR method should be established. The
approach to establish the applicable range depends on whether the method will be used qualitatively or
quantitatively or both.
5.6.12.2 Quantitative methods
For quantitative isoPCR methods, the dynamic range shall be established. The dynamic range shall
satisfy conditions for repeatability and reproducibility coefficients of variation, C and C .
V,r V,R
NOTE 1 Mitochondrial and chloroplast isoPCR amplification targets cannot be used for reliable quantification
of haploid genome copy number ratios of different species, because the number of mitochondrial DNA targets
differs with tissue type.
NOTE 2 Different plant and animal tissue types can have variable DNA contents per mass equivalent.
5.6.12.3 Qualitative methods
5.6.12.3.1 General
Qualitative (binary) analytical isoPCR amplification methods for use in the analysis of food or food
products (including seeds of food crops) with the purpose of demonstrating the presence or absence of
a given biomarker in a sample shall include objective evidence that they are adequate for their intended
purpose. The POD for the test method should be determined in accordance with ISO/TS 16393 or
equivalent.
5.6.12.3.2 Probability of detection (POD)
The POD is the probability of a positive analytical outcome of a qualitative method for a given matrix
at a given concentration in a single laboratory. The LPOD is the mean probability of detection across
laboratories. The hybrid modified Wilson interval or other suitable model can be used to establish a
validation experiment to determine the LPOD for isoPCR amplification methods (see ISO/TS 16393).
The following criteria described in ISO/TS 16393 should be taken into consideration when validating a
qualitative method of analysis:
— applicability;
— robustness;
— specificity;
— POD at specific measurand concentrations.
The number of replicate samples required to get a good estimation of the LPOD (at 95 % confidence) for
a two-sided coverage is 12 per level for the range 25 % to 75 % LPOD for the case where 8 laboratories
are included. If more participants are available, the number of replicate samples can be lowered in
consultation with a statistician. Although the use of larger numbers of replicates is helpful to obtain
ideal estimates of the LPOD at high and low measurand concentrations, a large number of replicates
can be impracticable in a multi-laboratory trial. Two other models have also been evaluated (see
ISO/TS 16393) for determining the POD, the maximum profile likelihood based on the probit model and
the maximum likelihood estimate based on beta binomial distribution.
5.6.13 Robustness
Robustness, the capacity of the isoPCR method to resist small, but deliberate, deviations from
the experimental conditions described in the procedure, shall be evaluated for the method with
a specific target sequence in a specific m
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 22942-1
Première édition
2022-03
Analyse de biomarqueurs
moléculaires — Méthodes de
réaction de polymérisation en chaîne
isotherme (isoPCR) —
Partie 1:
Exigences générales
Molecular biomarker analysis — Isothermal polymerase chain
reaction (isoPCR) methods —
Part 1: General requirements
Numéro de référence
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction . vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Mise au point d’une méthode isoPCR . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Finalité prévue. 4
5.3 Fondement scientifique . . 4
5.4 Unités de mesure . 7
5.5 Validation de la méthode . 7
5.6 Critères de performance . 7
5.6.1 Généralités . 7
5.6.2 Sensibilité . 8
5.6.3 Qualité de l’extrait d’acide nucléique . 8
5.6.4 Applicabilité . 8
5.6.5 Spécificité vis-à-vis de la séquence d’acide nucléique . 8
5.6.6 Fidélité . 8
5.6.7 Exactitude. 9
5.6.8 Sélectivité . 9
5.6.9 Linéarité . 9
5.6.10 Limite de détection (LOD) . 9
5.6.11 Limite de quantification (LOQ) . 10
5.6.12 Gamme . 11
5.6.13 Robustesse . 12
6 Exigences générales du laboratoire et du mode opératoire .12
6.1 Compétence . 12
6.2 Préparation des échantillons . 13
6.2.1 Généralités .13
6.2.2 Obtention d’un échantillon représentatif .13
6.2.3 Préparation de la prise d’essai . 13
6.2.4 Extraction de l’acide nucléique . 13
6.3 Utilisation de témoins . 14
6.3.1 Généralités . 14
6.3.2 Témoins environnementaux . 14
6.3.3 Témoins positifs . 14
6.3.4 Témoins négatifs . 14
6.3.5 Témoins d’extraction . 14
6.4 Organisation de l’espace de travail. 15
6.4.1 Généralités .15
6.4.2 Conception de l’espace de travail — Conception du laboratoire .15
6.4.3 Conception des espaces de travail hors du laboratoire .15
6.4.4 Personnel . 15
6.4.5 Appareillage et équipement . 16
7 Matériaux et réactifs .16
8 Interprétation des résultats .16
8.1 Généralités . 16
8.2 Interprétation des témoins. 16
8.3 Expression des résultats . 17
8.3.1 Généralités . 17
iii
8.3.2 Expression d’un résultat négatif . 17
8.3.3 Expression d’un résultat positif . 18
8.3.4 Expression des résultats quantitatifs. 18
8.3.5 Expression des résultats ambigus . 19
9 Rapport d’essai .19
Annexe A (informative) Informations minimales à fournir pour une expérience isoPCR
(MIIPCRE) .20
Annexe B (normative) Utilisation de témoins.23
Annexe C (informative) Exemples de résultats d’amplification isotherme isoPCR d’acide
nucléique .24
Annexe D (informative) LAMP (loop mediated isothermal amplification) .25
Annexe E (informative) RCA (rolling circle amplification) .28
Annexe F (informative) HDA (helicase dependent amplification) .29
Annexe G (informative) RPA (recombinase polymerase amplification) .32
Annexe H (informative) SDA (strand displacement amplification) .34
Annexe I (informative) NASBA (nucleic acid sequence based amplification) .36
Annexe J (informative) Amplification Cas9nAR .40
Bibliographie .42
iv
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 16, Méthodes horizontales pour l'analyse moléculaire de biomarqueurs.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 22942 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
Introduction
L’amplification isotherme d’acide nucléique désigne des méthodes qui utilisent des réactions catalysées
[1][2][3][4][5]
par polymérase à température constante pour amplifier une séquence cible d’acide nucléique
[6]
. Contrairement aux réactions de polymérisation en chaîne reposant sur l’emploi d’un thermocycleur,
l’amplification isotherme d’acide nucléique ne nécessite pas de cycle de variation de la température pour
la dénaturation, l’hybridation et la polymérisation même si, dans certains cas, la liaison de l’amorce
nécessite une dénaturation à une seule température élevée et une étape d’hybridation. Les méthodes
d’amplification isotherme peuvent être désignées par le terme «PCR isotherme (isoPCR)».
Les organismes vivants répliquent naturellement l’ADN lors de la division cellulaire et transcrivent
l’ARN pour produire des éléments structurels et régulateurs de manière isotherme. L’isoPCR s’appuie
sur des processus enzymatiques isothermes aussi bien naturels que synthétiques. L’ADN polymérase,
l’ARN polymérase, l’hélicase, la recombinase, l’exonucléase et la nickase comptent parmi les enzymes
mises en jeu. L’isoPCR ne nécessitant pas de cycle de variation de la température pour la dénaturation,
la polymérisation et l’hybridation, elle ne nécessite pas de thermocycleur de précision. Les réactions
sont menées à une seule température, sauf lorsqu’une nickase ou une enzyme de déplacement n’est
pas présente dans la réaction et qu’une dénaturation initiale est requise. De plus, diverses protéines
de liaison d’acide nucléique non enzymatiques peuvent être nécessaires. L’amplification isoPCR peut
dans bon nombre d’applications être réalisée sur des lysats cellulaires sans extraction de l’acide
[7]
nucléique. La LAMP (de l’anglais, «loop-mediated isothermal amplification ») , la RCA (« rolling circle
[8] [9]
amplification ») , la HDA (« helicase dependent amplification ») , la RPA (« recombinase polymerase
[10] [11]
amplification ») , la SDA (« strand displacement amplification ») , la NASBA (« nucleic acid sequence-
[12] [13]
based amplification ») et la Cas9nAR (« Cas9 nickase-based amplification reaction ») sont
quelques exemples de stratégies d’amplification. Les stratégies LAMP, RCA, HDA, RPA, SDA et NASBA
peuvent intégrer aussi bien de l’acide désoxyribonucléique (ADN) que de l’acide ribonucléique (ARN)
dans les acides nucléiques amplifiés. La Cas9nAR n’utilise que de l’ADN comme matrice de départ pour
l’amplification.
Les méthodes isoPCR peuvent être utilisées pour l’amplification, la détection, l’identification,
la quantification et l’analyse d’acides nucléiques spécifiques en faible concentration dans les aliments
et les produits alimentaires. Ces méthodes peuvent, dans la plupart des cas, amplifier des acides
nucléiques d’extraits nucléotidiques non purifiés. La détection de la séquence cible est réalisée
au moyen de techniques en temps réel ou au point final utilisant l’une des différentes stratégies
d’amplification et différentes chimies de détection. Les chimies de détection incluent la turbidimétrie,
la chromatographie, l’électrophorèse sur gel et la fluorescence, et peuvent, dans certaines applications,
être réalisées dans un système de dispositif à débit latéral fermé.
Les caractéristiques clés des méthodes isoPCR sont l’amplification d’acide nucléique à température
constante, l’utilisation d’extraits bruts, des méthodes de détection simples, et des temps de réaction
courts sans nécessiter de thermocycleur de précision.
Les méthodes isoPCR gagnant en popularité et ayant une applicabilité de plus en plus diversifiée, il est
important de normaliser les critères d’acceptation de ces méthodes pour les produits alimentaires.
vi
NORME INTERNATIONALE ISO 22942-1:2022(F)
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Méthodes
de réaction de polymérisation en chaîne isotherme
(isoPCR) —
Partie 1:
Exigences générales
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des critères généraux pour la mise au point, la validation et l’utilisation
de méthodes d’analyse d’acide nucléique fondées sur la réaction de polymérisation en chaîne isotherme
(isoPCR). Il délivre des informations supplémentaires et des recommandations pour des technologies
isoPCR particulières.
Le présent document est applicable aux aliments, aux aliments pour animaux, aux matrices végétales
et à leurs propagules, aux agents phytopathogènes, et aux animaux pour lesquels une amplification
d’une séquence biomoléculaire cible spécifique est requise.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO/TS 16393, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Détermination des caractéristiques de
performance des méthodes de mesure qualitatives et validation des méthodes
ISO 16577, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Vocabulaire pour les méthodes d’analyse de
biomarqueurs moléculaires dans l’agriculture et la production agroalimentaire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l'ISO 16577 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
témoin négatif d’extraction
témoin négatif obtenu après avoir effectué toutes les étapes requises d’un mode opératoire d’extraction
ne comprenant toutefois pas l’ajout de la prise d’essai
EXEMPLE En remplaçant la prise d’essai par de l’eau.
Note 1 à l'article: Ce témoin permet de démontrer l’absence de contamination durant l’extraction.
3.2
témoin d’extraction
témoin positif obtenu après avoir effectué toutes les étapes requises d’un mode opératoire d’extraction
sur une prise d’essai toutefois connue dont la quantité d’acide nucléique ou de tissu cible est connue
Note 1 à l'article: Ce témoin permet de démontrer la performance du processus d’extraction.
3.3
réaction de polymérisation en chaîne isotherme
isoPCR
amplification isotherme d’acide nucléique
technologie d’amplification isotherme d’acide nucléique
amplification isotherme
réaction de polymérisation en chaîne qui polymérise des acides nucléiques sans cycle thermique (3.10),
par exemple à température constante
Note 1 à l'article: Dans certaines applications isoPCR, les acides nucléiques sont dénaturés à une température
plus élevée avant de commencer la réaction d’amplification.
Note 2 à l'article: Sept stratégies isoPCR sont décrites dans le présent document. Ces stratégies peuvent être
appliquées à un certain nombre de méthodes différentes intégrant une extraction d’ADN, une amplification et des
chimies de détection.
3.4
méthode isoPCR
méthode d’analyse qui applique une stratégie isoPCR (3.3)
3.5
conditions de terrain hors du laboratoire
espace de travail ne bénéficiant ni de conditions maîtrisées concernant la contamination par un aérosol
environnemental, ni d’un appareillage sophistiqué de purification de l’acide nucléique
3.6
spécificité vis-à-vis d’une séquence nucléotidique
aptitude à ne reconnaître exclusivement qu’une séquence cible d’acide nucléique à amplifier, en la
différenciant des autres acides nucléiques et contaminants
3.7
gamme dynamique de pourcentage
gamme d’applicabilité de pourcentage
domaine de quantification de pourcentage
rapport exprimé sous la forme d’un pourcentage des limites supérieure et inférieure de quantification
présentées par un groupe de matériaux (ou dilutions) de référence avec un niveau approprié de fidélité
et d’exactitude
3.8
échantillon représentatif
unités d’échantillonnage (échantillons ou groupes) qui ont été extraites du lot au moyen d’un processus
garantissant que toutes les unités d’échantillonnage ont les mêmes chances d’être sélectionnées et n’ont
pas été modifiées au point de fausser le résultat d’analyse
Note 1 à l'article: Le processus d’extraction peut être un processus à multiples étapes.
[SOURCE: ISO 22753:2021, 3.15]
3.9
sélectivité
limite jusqu’à laquelle une méthode peut déterminer la présence d’un ou plusieurs analytes particuliers
en mélange ou dans une ou plusieurs matrices sans interférences d’autres composants de comportement
similaire
Note 1 à l'article: La sélectivité d’une méthode isoPCR (3.4) destinée à l’ARN ou à l’ADN ou aux deux peut être
déterminée par rapport à des inhibiteurs tels que les polyamines, les polysaccharides et les polyphénols, car
ceux-ci interfèrent sur l’aptitude de la réaction à amplifier et déceler une séquence cible spécifique.
Note 2 à l'article: Il est nécessaire de bien faire la distinction entre sélectivité et spécificité vis-à-vis d’une séquence
nucléotidique (3.6), la spécificité caractérisant le degré de reconnaissance de la séquence cible par l’analyse aux
niveaux moléculaires ou taxonomiques.
3.10
cycle thermique
thermocycle
processus incluant de nombreuses étapes de chauffage et de refroidissement d’un programme de
température prédéterminé utilisé pour dénaturer, hybrider et allonger des acides nucléiques dans une
réaction de polymérisation en chaîne
4 Principe
La détection de la séquence cible est réalisée au moyen de techniques en temps réel ou au point final
qui appliquent une stratégie d’amplification donnée et s’appuient sur différentes chimies de détection.
Les chimies de détection incluent la turbidimétrie, la chromatographie, l’électrophorèse sur gel et la
fluorescence. Dans certaines applications isoPCR, un produit peut être détecté dans un système de
dispositif à débit latéral fermé ou dans un instrument de détection de fluorescence.
Une vue d’ensemble de sept exemples de stratégies d’amplification isoPCR est donnée dans le Tableau 1.
Les Annexes D à J fournissent une description et précisent les domaines d’application, les avantages et
les inconvénients de chaque stratégie isoPCR.
5 Mise au point d’une méthode isoPCR
5.1 Généralités
Une méthode isoPCR sur ADN ou ARN peut être utilisée pour détecter, identifier et, si besoin, quantifier
un ou plusieurs acides nucléiques cibles spécifiques voulus. Une méthode comprend:
— une extraction propre à la matrice (si besoin);
— une ou plusieurs éventuelles étapes de purification complémentaire;
— les constituants enzymatiques et réactifs;
— une description des amorces et sondes oligonucléotidiques (marquées et non marquées) qui seront
utilisées (notamment la façon dont les séquences oligonucléotidiques et cibles ont été choisies);
— une description de la méthode de détection des produits amplifiés;
— un protocole décrivant les conditions selon lesquelles la méthode isoPCR est utilisée notamment
l’utilisation de témoins et des exemples de calcul.
Un cadre directeur pour les informations minimales à fournir en vue d’une publication d’expériences
isoPCR (MIIPCRE, de l’anglais «minimum information for publication of isoPCR experiments ») est donné
à l’Annexe A. Le MIIPCRE constitue un cadre directeur pour les informations minimales nécessaires
à l’évaluation des expériences isoPCR. L’Annexe A est une liste de points de contrôle destinée aux
laboratoires.
5.2 Finalité prévue
Des informations concernant la finalité prévue et les limites d’une méthode doivent être fournies.
L’adéquation de la méthode quant à la finalité doit notamment être évaluée sur la base des critères et
exigences spécifiés dans le présent document.
5.3 Fondement scientifique
Une vue d’ensemble des principes et de l’application de la méthode doit être fournie. Il convient d’inclure
des références appropriées à des publications scientifiques pertinentes.
Tableau 1 — Vue d’ensemble générale des sept stratégies d’amplification isoPCR
Stra- Acide nu- Enzymes Chauf- Durée Amplification Méthode(s) LOD Analyte Méthode(s) de Matériel nécessaire
tégie cléique impliquées fage (h) de mesure (co- détection
Type Tempéra-
isoPCR cible initial pies)
ture (°C)
LAMP ADN, Polymérase Oui < 1 Exponen- 60 à 65 Qualita- ~5 ADN, Turbidimétrie de Détection visuelle, turbi-
ARN tielle tive, quan- ARN, pyrophosphate, dimètre (en temps réel);
titative petites marqueur fluores- fluorimètre isotherme;
molé- cent, électrochimie, puce microfluidique LAMP
cules hybridation de mar- électrochimique, dispositifs
queur nucléotidique de détection à débit latéral
simple brin ou membrane à réseau de
bandes pré-imprimé
RCA ADN, Polymérase Oui 1 à 4 Linéaire 30 à 65 Qualita- 10 ADN, Marqueurs fluores- Spectrophotomètre, fluori-
ARN tive, quan- ARN, cents, fluorimétrie mètre isotherme
titative protéine,
ADN
méthylé,
petites
molé-
cules,
cellules
HDA ADN, Hélicase, Non 0,5 à 2 Exponen- 64 Qualita- 1 ADN, pro- Électrophorèse sur Cuve d’électrophorèse, tran-
ARN polymérase tielle tive, quan- téine gel; immunohisto- silluminateur UV; système
titative chimie, marqueurs de dispositif à débit latéral
fluorescents fermé, fluorimètre isotherme
RPA ADN, Recombi- Non < 1 Exponen- 37 à 42 Qualita- 1 ADN, Électrophorèse sur Cuve d’électrophorèse, tran-
ARN nase, poly- tielle tive, quan- ARN, pro- gel; immunohisto- silluminateur UV; système
mérase titative téine chimie, fluorimétrie de dispositif à débit latéral
fermé, fluorimètre isotherme
SDA ADN, Polymérase, Oui 1 à 2 Exponen- 30 à 55 Qualitative 10 ADN, Électrophorèse Cuve d’électrophorèse, tran-
ARN enzyme de tielle ARN, sur gel; marqueurs silluminateur UV; détection
restriction petites indicateurs de pH; visuelle; spectrophotomètre
molé- fluorescence ou fluorimètre isotherme
cules
NASBA ARN, Trans- Non 1 à 3 Exponen- 41 Qualita- 1 ADN, Électrophorèse sur Cuve d’électrophorèse,
ADN criptase tielle tive, quan- ARN, gel; sondes fluo- transilluminateur UV; lecteur
inverse, ARN titative micro- rescentes; ELISA, de microplaque, fluorimètre
polymérase, ARN, pro- fluorimétrie isotherme
RNase H téine
NOTE Adapté de la Référence [19].

Tableau 1 (suite)
Stra- Acide nu- Enzymes Chauf- Durée Amplification Méthode(s) LOD Analyte Méthode(s) de Matériel nécessaire
tégie cléique impliquées fage (h) de mesure (co- détection
Type Tempéra-
isoPCR cible initial pies)
ture (°C)
Cas9nAR ADN Cas9 poly- Non Exponen- 37 Qualitative ADN Électrophorèse sur Cuve d’électrophorèse, tran-
mérase tielle gel; marqueurs fluo- silluminateur UV; fluorimètre
rescents isotherme ou détection
visuelle
NOTE Adapté de la Référence [19].

5.4 Unités de mesure
Le mesurage qualitatif (binaire) avec des méthodes isoPCR fournit un résultat binaire fondé sur une
probabilité de détection (POD) prédéterminée. Les mesurages qualitatifs sont utilisés pour déterminer
la présence ou l’absence de biomarqueurs moléculaires dans les aliments ou les produits alimentaires
(y compris dans les graines et les propagules de cultures vivrières). La caractérisation de la performance
d’une méthode qualitative doit être réalisée conformément à l’ISO/TS 16393.
Les méthodes quantitatives déterminent la quantité de l’analyte cible présente dans un échantillon.
Les unités de mesure quantitatives (par exemple, nombre de copies cibles), les critères de performance
et les critères concernant le compte-rendu des données doivent être spécifiés. Les résultats quantitatifs
peuvent être exprimés dans le compte-rendu:
— en nombre de copies d’acide nucléique (c);
— sous la forme d’un rapport de nombres de copies (c/c , où c est un nombre de copies de référence
r r
connu);
— sous la forme du pourcentage de l’analyte;
— selon d’autres critères décrits par la méthode.
Les principes de calcul de tout rapport utilisé doivent être indiqués. Pour les méthodes de quantification,
la stratégie de quantification dépendra de l’application. L’application d’une évaluation d’une méthode
de détermination du nombre de copies ou d’une droite d’étalonnage peut être effectuée conformément
[15]
à l’ISO 20395 .
5.5 Validation de la méthode
La méthode isoPCR doit être mise au point en prenant en compte son adéquation à la finalité. La validation
et la vérification doivent inclure suffisamment d’essais pour qu’il puisse être statué avec suffisamment
de certitude que le mode opératoire est sélectif et répétable et qu’il peut détecter la cible dans une
gamme d’applicabilité connue. Même si les études interlaboratoires sont préférables, les validations
[16]
menées par un seul laboratoire peuvent être acceptables. La publication de Thompson et al. fournit
des critères relatifs à la validation d’une méthode par un seul laboratoire et l’ISO/TS 16393 donne des
recommandations complémentaires pour la validation interlaboratoires de méthodes qualitatives.
L’ISO 20395 donne des exigences générales applicables à l’évaluation de la performance et visant
à garantir la qualité des méthodes utilisées pour la quantification de séquences d’acides nucléiques
spécifiques (cibles) couvrant la validation de la méthode (fidélité, linéarité, limite de quantification,
limite de détection, justesse et robustesse).
Il convient de mener les essais interlaboratoires de méthodes isoPCR lors de l’étape de validation.
[17]
Pour les méthodes quantitatives, le protocole harmonisé ISO/AOAC/IUPAC décrit un processus pour
la validation d’une méthode par des essais interlaboratoires. Il convient d’analyser les résultats de
l’ensemble des essais interlaboratoires et/ou des essais intralaboratoires, ainsi que les caractéristiques
[16]
de performance obtenues, de les décrire et de les joindre à la méthode publiée .
Le Rapport technique du JRC intitulé «Verification of analytical methods for GMO testing when
implementing interlaboratory validated methods» (disponible en anglais seulement) donne des
recommandations relatives à la manière de mener la vérification de méthode dans le cas de méthodes
[18]
validées par des essais interlaboratoires pour la détection qualitative et quantitative d’OGM .
5.6 Critères de performance
5.6.1 Généralités
Les critères de performance doivent être déterminés et définis pour la validation de la méthode.
Les critères de performance incluent la sensibilité, la qualité de l’extrait d’acide nucléique, l’applicabilité,
la spécificité vis-à-vis de la séquence d’acide nucléique, la fidélité (répétabilité, fidélité intermédiaire,
reproductibilité), l’exactitude, la sélectivité, la linéarité, la limite de détection, la limite de quantification,
la gamme, l’incertitude de mesure et la robustesse.
5.6.2 Sensibilité
La sensibilité d’une méthode d’amplification isoPCR pour l’analyse de biomarqueurs doit être établie en
déterminant la pente d’une droite d’étalonnage. La droite d’étalonnage peut être construite en analysant
une série d’échantillons préparés à différentes dilutions au dixième de sorte à abaisser la concentration
en ADN cible. Un minimum de cinq concentrations d’échantillon, chacune analysée en triple, est requis.
5.6.3 Qualité de l’extrait d’acide nucléique
Il convient d’extraire les acides nucléiques de matrices des types les plus pertinents, incluant les types
reflétant le domaine d’application de la méthode, contenant une teneur massique connue de la ou des
cibles par rapport à l’acide nucléique génomique des espèces (uniformément répartis sur la gamme
dynamique de pourcentage de la méthode) et des tissus pertinents pour l’application.
Le mode opératoire d’extraction des acides nucléiques utilisé pour la validation et la vérification de
la méthode isoPCR d’une cible spécifique dans une matrice spécifique doit être identifié. La méthode
d’extraction doit produire des acides nucléiques de longueur, de pureté chimique et d’intégrité
structurelle suffisantes pour l’amplification et l’analyse ultérieures. Dans le cas d’une amplification
directement à partir d’extraits cellulaires, la détermination de la qualité de l’extrait d’acide nucléique
dépend de la matrice donnée. Il convient de déterminer la performance sur la base des résultats de
chaque matrice cellulaire soumise à essai. La qualité de l’extrait d’acide nucléique est influencée par la
concentration en acide nucléique, l’intégrité structurelle, la pureté, la présence d’inhibiteurs, etc.
5.6.4 Applicabilité
L’applicabilité, ou adéquation à la finalité, des méthodes isoPCR doit couvrir la finalité prévue,
un protocole, la cible, la position cellulaire de la cible (noyau ou mitochondrie), et la gamme de nombres
de copies ou la gamme de concentration dans laquelle la cible est détectable. Il convient de tenir compte
également de la nature de la matrice (par exemple, organisme, tissus, aliment transformé).
5.6.5 Spécificité vis-à-vis de la séquence d’acide nucléique
Les spécificités théoriques vis-à-vis de la séquence d’acide nucléique des amorces et des sondes doivent
être évaluées par une recherche dans des bases de données pertinentes.
Les amorces d’amplification doivent être conçues pour reconnaître et s’hybrider sur leurs séquences
complémentaires et permettre une amplification de cible spécifique. Il convient de réaliser cette
détermination in silico éventuellement à l’aide d’une application de conception d’amorce avant de
soumettre à essai les amorces. La spécificité vis-à-vis de la séquence d’acide nucléique de méthodes
de détection pour une cible donnée dépend des propriétés spécifiques de la séquence d’ADN ciblée et
peut fortement fluctuer d’une application isoPCR à l’autre. Il est donc primordial de veiller à ce que la
ou les méthodes choisies fournissent les niveaux voulus de spécificité vis-à-vis de la séquence d’acide
nucléique et de sélectivité vis-à-vis de l’acide nucléique (ADN ou ARN). Dans le cas où l’ARN est la cible,
il est parfois nécessaire de tenir compte d’autres aspects.
5.6.6 Fidélité
5.6.6.1 Généralités
La fidélité de la méthode d’amplification isoPCR doit être déterminée. Il convient que la validation
par un seul laboratoire et les essais interlaboratoires couvrent l’ensemble de la gamme de matrices et
d’espèces cibles.
5.6.6.2 Matériau de référence et matériau de référence certifié
Il convient d’analyser plusieurs fois un matériau de référence certifié dans le cadre de la validation
par un seul laboratoire d’une méthode isoPCR pour évaluer le biais attribuable au laboratoire et à la
méthode. D’autres matériaux de référence, c’est-à-dire les matériaux destinés aux essais d’aptitude qui
n’ont pas été utilisés, peuvent également être utilisés à cette fin si l’incertitude associée est connue.
Les informations relatives à un dopage et au taux de récupération peuvent également être utilisées
même si l’incertitude de mesure n’est pas toujours connue.
5.6.6.3 Écart-type de répétabilité (s )
r
L’écart-type de répétabilité doit être déterminé pour une gamme de concentrations d’analyte pour la
vérification par le laboratoire et la validation par un seul laboratoire.
5.6.6.4 Écart-type de reproductibilité (s )
R
L’écart-type de reproductibilité doit être déterminé pour une gamme de concentrations d’analyte pour
la validation et les essais interlaboratoires.
5.6.7 Exactitude
Il convient de déterminer l’exactitude d’une méthode isoPCR par comparaison aux résultats obtenus
avec une autre méthode pour la même cible ou à des résultats d’un calibrateur. L’exactitude est parfois
fondée sur la récupération d’extraction, mais il convient toutefois d’inclure également dans cette
estimation le biais dû à l’amplification.
5.6.8 Sélectivité
Il convient d’évaluer la sélectivité de la méthode par rapport aux molécules les plus susceptibles
d’induire des interférences sur les analytes cibles, par exemple ARNr, ADN similaire, polyglycosides,
protéine. Il convient qu’une méthode isoPCR soit suffisamment sélective pour ignorer toute molécule
interférente.
5.6.9 Linéarité
Il convient que la fonction d’étalonnage soit linéarisable, passe par l’origine et ne soit pas influencée
par la matrice cellulaire du matériau soumis à essai. La composante linéarisable de la réponse d’une
détermination de gamme dynamique doit permettre de déterminer la concentration de l’analyte dans
les échantillons pour essai lorsqu’une quantification est réalisée. Il convient d’utiliser au moins six
solutions d’étalonnage pour déterminer la linéarité. Il convient de connaître la probabilité de détection
(POD) pour une détermination qualitative.
5.6.10 Limite de détection (LOD)
La LOD d’une méthode est déterminée tant pour l’analyse qualitative que pour l’analyse quantitative.
La LOD est la quantité ou concentration nette vraie de l’analyte dans le matériau à analyser qui conduira,
avec une probabilité (1-β), à la conclusion selon laquelle la concentration ou quantité d’analyte dans le
matériau analysé est supérieure à celle présente dans le matériau à blanc. Elle est définie conformément
à la Formule (1):

PL≤=LL| L =β (1)
()
rc D
où
L est la LOD;
D

est la valeur estimée;
L
L est la valeur attendue ou la valeur vraie;
L est la valeur critique.
c
NOTE 1 La limite de détection est estimée par:
L ≈ 2t σ
D 1-αν o
où
L est la LOD;
D
α = β;
t la valeur de la loi de distribution du t de Student, correspondant à ν degrés de liberté pour
1-αν
un intervalle de confiance unilatéral de 1-α;
σ est l’écart-type de la valeur vraie (valeur attendue).
o
L = 3,29 σ , lorsque l’incertitude de la valeur moyenne (attendue) du blanc est négligeable, α = β = 0,05
D o
et L suit une loi normale de distribution avec une variance constante connue. Toutefois, la L n’est pas
D
simplement définie comme un facteur fixe (par exemple, 3, 6) de multiplication de l’écart-type d’un bruit
de fond de solution pure. Une LOD calculée de cette façon peut être fortement faussée. L’estimation
correcte de L peut prendre en compte les degrés de liberté, α et β, et la distribution de L en fonction de
D
facteurs d’influence tels que la concentration de l’analyte, les effets de la matrice et les interférences.
Cette définition sert de fondement au traitement des exceptions par rapport au cas simple qui est
décrit, c’est-à-dire qui impliquent des distributions autres que la loi normale et une hétéroscédasticité
(par exemple, processus (de Poisson) de «comptage» tels que ceux utilisés pour une PCR en temps réel).
Il est essentiel de spécifier le processus de mesure pris en compte, car les distributions, les écarts-types
et les blancs peuvent être considérablement différents d’un processus de mesure à l’autre.
À la limite de quantification L , une identification positive peut être faite avec un niveau de confiance
D
raisonnable et/ou préalablement déterminé dans une matrice définie en utilisant une méthode
d’analyse spécifique.
NOTE 2 Une détermination obtenue de manière empirique à partir des résultats d’un essai interlaboratoires
est appelée «LOD pr
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