ISO 22718:2006

Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus

ISO 22718:2006 gives general guidelines for the detection and identification of the specified micro-organism Staphylococcus aureus in cosmetic products. Micro-organisms considered as specified in this International Standard might differ from country to country according to national practices or regulations. In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic product to which ISO 22718:2006 is applicable. Products considered to present a low microbiological risk include those with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc. The method described in ISO 22718:2006 is based on the detection of Staphylococcus aureus in a non-selective liquid medium (enrichment broth), followed by isolation on a selective agar medium. Other methods may be appropriate dependent on the level of detection required. Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method may not be appropriate for some products in every detail (e.g. certain water immiscible products). Other International Standards (ISO 18415) may be appropriate. Other methods (e.g. automated) may be substituted for the tests presented here provided that their equivalence has been demonstrated or the method has been otherwise validated.

Cosmétiques — Microbiologie — Détection de Staphylococcus aureus

L'ISO 22718:2006 donne des lignes directrices générales pour la détection et l'identification du microorganisme spécifié Staphylococcus aureus dans les produits cosmétiques. Les microorganismes considérés comme spécifiés dans la présente Norme internationale peuvent différer d'un pays à l'autre, suivant les pratiques ou réglementations nationales. Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est préférable d'effectuer une analyse appropriée du risque microbiologique afin de déterminer les types de produits cosmétiques qui relèvent de l'ISO 22718:2006. Les produits considérés présenter un faible risque microbiologique comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydro-alcooliques, ceux ayant des valeurs de pH extrêmes, etc. La méthode décrite dans l'ISO 22718:2006 repose sur la détection de Staphylococcus aureus dans un milieu liquide non sélectif (milieu liquide d'enrichissement), suivie de son isolement sur un milieu gélosé sélectif. D'autres méthodes peuvent être appropriées en fonction du niveau de détection exigé.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 14-Mar-2006
• Withdrawal Date: 14-Mar-2006
• ICS: 07.100.40 - Cosmetics microbiology
• ICS: 07.100.99 - Other standards related to microbiology
• ICS: 71.100.70 - Cosmetics. Toiletries
• Technical Committee: ISO/TC 217 - Cosmetics
• Drafting Committee: ISO/TC 217/WG 1 - Microbiological standards and limits
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 25-Nov-2015

Relations

• Revised: ISO 22718:2015 - Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus
• Effective Date: 04-Nov-2015

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22718
First edition
2006-02-01
Cosmetics — Microbiology — Detection
of Staphylococcus aureus
Cosmétiques — Microbiologie — Détection de Staphylococcus aureus
Reference number
ISO 22718:2006(E)
ISO 2006
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ISO 22718:2006(E)
PDF disclaimer

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Published in Switzerland
ii © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 22718:2006(E)
Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................ iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Scope ..................................................................................................................................................... 1

2 Normative references ........................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions........................................................................................................................... 1

4 Principle................................................................................................................................................. 2

5 Diluents and culture media.................................................................................................................. 2

5.1 General................................................................................................................................................... 2

5.2 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution)..................................... 3

5.3 Culture media ........................................................................................................................................ 3

6 Apparatus and glassware .................................................................................................................... 6

7 Strains of microorganisms .................................................................................................................. 6

8 Handling of cosmetic products and laboratory samples ................................................................. 6

9 Procedure .............................................................................................................................................. 7

9.1 General recommendation .................................................................................................................... 7

9.2 Preparation of the initial suspension in the enrichment broth ........................................................ 7

9.3 Incubation of the inoculated enrichment broth ................................................................................. 7

9.4 Detection and Identification of Staphylococcus aureus................................................................... 7

10 Expression of the results (detection of Staphylococcus aureus) ................................................... 8

11 Neutralization of the antimicrobial properties of the product.......................................................... 9

11.1 General................................................................................................................................................... 9

11.2 Preparation of inoculum ...................................................................................................................... 9

11.3 Validation of the detection method..................................................................................................... 9

12 Test report ........................................................................................................................................... 10

Annex A (informative) Other media ................................................................................................................ 11

Annex B (informative) Neutralizers of antimicrobial activity of preservatives and rinsing liquids ......... 14

Bibliography ..................................................................................................................................................... 15

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ISO 22718:2006(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 22718 was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.
iv © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 22718:2006(E)
Introduction

Microbiological examinations of cosmetic products shall be carried out according to an appropriate

microbiological risk analysis in order to ensure their quality and safety for consumers.

Microbiological risk analysis depends on several parameters such as:
⎯ potential alteration of cosmetic products;
⎯ pathogenicity of micro-organisms;

⎯ site of application of the cosmetic product (hair, skin, eyes, mucous membranes, etc.);

⎯ type of users (adults, children under 3 years).

For cosmetics and other topical products, the detection of skin pathogens such as Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans may be relevant. The detection of other kinds of

micro-organism might be of interest since these micro-organisms (including indicators of faecal contamination

e.g. Escherichia coli) suggest hygienic failure during manufacturing process.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 22718:2006(E)
Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus
aureus
1 Scope

This International Standard gives general guidelines for the detection and identification of the specified

micro-organism Staphylococcus aureus in cosmetic products. Micro-organisms considered as specified in this

International Standard might differ from country to country according to national practices or regulations.

In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate

microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic product to which this International Standard is

applicable. Products considered to present a low microbiological risk include those with low water activity,

hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc.

The method described in this International Standard is based on the detection of Staphylococcus aureus in a

non-selective liquid medium (enrichment broth), followed by isolation on a selective agar medium. Other

methods may be appropriate dependent on the level of detection required.

NOTE For the detection of Staphylococcus aureus, subcultures can be performed on non-selective culture media

followed by suitable identification steps (e.g. using identification kits).

Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method may not be

appropriate for some products in every detail (e.g. certain water immiscible products). Other International

[10]

Standards (ISO 18415 ) may be appropriate. Other methods (e.g. automated) may be substituted for the

tests presented here provided that their equivalence has been demonstrated or the method has been

otherwise validated.
2 Normative references

The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated

references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced

document (including any amendments) applies.

ISO 21148:2005, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination

EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of microbial strains used for the

determination of bactericidal and fungicidal activity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
product
portion of an identified cosmetic product received in the laboratory for testing
3.2
sample

portion of the product (at least 1 g or 1 ml) that is used in the test to prepare the initial suspension

© ISO 2006 – All rights reserved 1
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ISO 22718:2006(E)
3.3
initial suspension

suspension (or solution) of the sample in a defined volume of an appropriate enrichment broth

3.4
sample dilution(s)
dilution(s) of the initial suspension
3.5
specified micro-organism

aerobic mesophilic bacteria or yeast that is undesirable in a cosmetic product and is recognized as a skin

pathogen species that may be harmful for human health or as indication of hygienic failure in the

manufacturing process
3.6
Staphylococcus aureus

Gram-positive cocci, mainly joined in grape-like clusters, smooth colonies generally pigmented in yellow

NOTE 1 The main characteristics for identification are: growth on specific selective medium, catalase positive,

coagulase positive.

NOTE 2 Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen bacterium for humans that can be also present on the

skin of healthy people without causing disorder for them. It is undesirable in cosmetic products due to its potential

pathogenicity.
3.7
enrichment broth

non-selective liquid medium containing suitable neutralizers and/or dispersing agents and validated for the

product under test
4 Principle

The first step of the procedure is to perform an enrichment by using a non-selective broth medium to increase

the number of micro-organisms without the risk of inhibition by the selective ingredients that are present in

selective/differential growth media.

The second step (isolation) of the test is performed on a selective medium followed by identification tests.

The possible inhibition of microbial growth by the sample shall be neutralized to allow the detection of viable

[1]

micro-organisms . In all cases and whatever the methodology, the neutralization of the antimicrobial

[2], [3], [4]
properties of the product shall be checked and validated .
5 Diluents and culture media
5.1 General

General instructions are given in ISO 21148. When water is mentioned in this document, use distilled water or

purified water as specified in ISO 21148.

The enrichment broth is used to disperse the sample and to increase the initial microbial population. It may

contain neutralizers if the specimen to be tested has antimicrobial properties. The efficacy of the neutralization

shall be demonstrated (see Clause 11). Information relative to suitable neutralizers is given in Annex B.

The following enrichment broth is suitable for checking the presence of Staphylococcus aureus in accordance

with this International Standard provided that it is validated in accordance with Clause 11.

Other diluents and culture media may be used if they can be demonstrated to be suitable for use.

2 © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 22718:2006(E)
5.2 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution)
5.2.1 General

The diluent is used for the preparation of bacterial suspension used for the validation procedure

(see Clause 11).
5.2.2 Composition
⎯ tryptone, pancreatic digest of casein 1,0 g
⎯ sodium chloride 8,5 g
⎯ water 1 000 ml
5.2.3 Preparation

Dissolve the components in water by mixing whilst heating. Dispense into suitable containers. Sterilize in the

autoclave at 121 °C for 15 min.

After sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at room

temperature.
5.3 Culture media
5.3.1 General

Culture media may be prepared using the descriptions provided below or from dehydrated culture media

according to the instructions from the manufacturer. The instructions provided by the supplier of the media

should be followed.

NOTE Ready to use media may be used when their composition and/or growth yields are comparable to those of the

formulas given herein.

5.3.2 Agar medium for validation (see Clause 11) [soybean-casein digest agar medium (SCDA) or

tryptic soy agar (TSA)]
5.3.2.1 Composition
⎯ pancreatic digest of casein 15,0 g
⎯ papaic digest of soybean meal 5,0 g
⎯ sodium chloride 5,0 g
⎯ agar 15,0 g
⎯ water 1 000 ml
5.3.2.2 Preparation

Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating. Dispense

the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min.

After sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room

temperature.
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ISO 22718:2006(E)
5.3.3 Enrichment broth
5.3.3.1 Eugon LT 100 broth
5.3.3.1.1 General

This medium contains ingredients which neutralize inhibitory substances present in the sample: lecithin and

polysorbate 80, and dispersing agent: octoxynol 9.
5.3.3.1.2 Composition
⎯ pancreatic digest of casein 15,0 g
⎯ papaic digest of soybean meal 5,0 g
⎯ L-cystine 0,7 g
⎯ sodium chloride 4,0 g
⎯ sodium sulfite 0,2 g
⎯ glucose 5,5 g
⎯ egg lecithin 1,0 g
⎯ polysorbate 80 5,0 g
⎯ octoxynol 9 1,0 g
⎯ water 1 000 ml
5.3.3.1.3 Preparation

Dissolve the components, one after another, in boiling water – polysorbate 80, octoxynol 9 and egg lecithin

until their complete dissolution. Dissolve the other components by mixing whilst heating. Dispense the medium

into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min.

After sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at room

temperature.
5.3.3.2 Other enrichment broths
Other enrichment broths may be used as appropriate (see Annex A).
5.3.4 Selective agar medium for isolation of Staphylococcus aureus
5.3.4.1 Baird Parker agar medium
5.3.4.1.1 Base medium
5.3.4.1.1.1 Composition
⎯ pancreatic digest of casein 10,0 g
⎯ yeast extract 1,0 g
4 © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 22718:2006(E)
⎯ meat extract 5,0 g
⎯ sodium pyruvate 10,0 g
⎯ L-glycine 12,0 g
⎯ lithium chloride 5,0 g
⎯ agar 12 g to 22 g
⎯ water to a final volume of 950 ml
5.3.4.1.1.2 Preparation

Dissolve the components or the complete dehydrated base in the water by boiling. Transfer the medium in

quantities of 100 ml to flasks or bottles of appropriate capacity. Sterilize the medium in the autoclave at 121 °C

for 15 min.

After sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,2 ± 0,2 when measured at room

temperature.
5.3.4.1.2 Potassium tellurite solution
5.3.4.1.2.1 Composition
⎯ potassium tellurite (K TeO) 1,0 g
2 3
⎯ water 100 ml
5.3.4.1.2.2 Preparation
Dissolve the potassium tellurite completely in the water with minimal heating.

Sterilize by filtration using 0,22 µm pore size membranes. The solution may be stored at the maximum for one

month at 3 °C ± 2 °C. Discard the solution if a white precipitate forms.

The solid should be readily soluble. If a white insoluble material is present in the water, the powder should be

discarded.

5.3.4.1.3 Egg yolk emulsion (concentration approximately 20 % or according to the manufacturer's

instructions)
If a commercial preparation is not available, prepare the medium as follows.

Use fresh hens' eggs, the shells being intact. Clean the eggs with a brush using a liquid detergent. Rinse them

under running water, then disinfect the shells either by immersing them in 70 % (volume fraction) ethanol for

30 s and allow them to dry in the air, or by spraying them with alcohol followed by flame sterilization.

Proceeding under aseptic conditions, break each egg and separate the yolk from its white by repeated

transfer of the yolk from one half of the shell to the other. Place the yolks in a sterile flask and add four times

their volume of sterile water. Mix thoroughly. Heat the mixture at 47 °C for 2 h
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 22718
Première édition
2006-02-01
Cosmétiques — Microbiologie —
Détection de Staphylococcus aureus
Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus
Numéro de référence
ISO 22718:2006(F)
ISO 2006
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ISO 22718:2006(F)
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l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,

veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit

de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 22718:2006(F)
Sommaire Page

Avant-propos..................................................................................................................................................... iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1

2 Références normatives ........................................................................................................................ 1

3 Termes et définitions............................................................................................................................ 1

4 Principe.................................................................................................................................................. 2

5 Diluants et milieux de culture.............................................................................................................. 2

5.1 Généralités ............................................................................................................................................ 2

5.2 Diluant pour la suspension bactérienne (solution de tryptone et de chlorure de sodium).......... 3

5.3 Milieux de culture.................................................................................................................................. 3

6 Appareillage et verrerie........................................................................................................................ 6

7 Souches de microorganismes............................................................................................................. 6

8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire ................................. 7

9 Mode opératoire .................................................................................................................................... 7

9.1 Recommandations générales.............................................................................................................. 7

9.2 Préparation de la suspension initiale dans le milieu liquide d'enrichissement............................. 7

9.3 Incubation du milieu liquide d'enrichissement ensemencé............................................................. 8

9.4 Détection et identification de Staphylococcus aureus..................................................................... 8

10 Expression des résultats (détection de Staphylococcus aureus)................................................... 9

11 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit ............................................................ 9

11.1 Généralités ............................................................................................................................................ 9

11.2 Préparation de l'inoculum.................................................................................................................... 9

11.3 Validation de la méthode de recherche.............................................................................................. 9

12 Rapport d'essai ................................................................................................................................... 10

Annexe A (informative) Autres milieux .......................................................................................................... 11

Annexe B (informative) Neutralisants de l'activité antimicrobienne des conservateurs et liquides

de rinçage ............................................................................................................................................ 14

Bibliographie .................................................................................................................................................... 15

© ISO 2006 – Tous droits réservés iii
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ISO 22718:2006(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 22718 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 22718:2006(F)
Introduction

Les examens microbiologiques des produits cosmétiques doivent être réalisés conformément à une analyse

de risque appropriée afin de garantir leur qualité et la sécurité des consommateurs.

L'analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramètres tels que
⎯ l'altération potentielle des produits cosmétiques,
⎯ le caractère pathogène des microorganismes,

⎯ le site d'application du produit cosmétique (cheveux, peau, yeux, muqueuses, etc.),

⎯ la catégorie d'utilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans).

Pour les cosmétiques et autres produits topiques, la détection d'agents pathogènes pour la peau tels que

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans peut être justifiée. La recherche

d'autres sortes de microorganismes peut aussi présenter un intérêt car ceux-ci (y compris des indicateurs de

contamination fécale, par exemple Escherichia coli) laissent penser à une défaillance de l'hygiène au cours du

processus de fabrication.
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NORME INTERNATIONALE ISO 22718:2006(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Détection de Staphylococcus
aureus
1 Domaine d'application

La présente Norme internationale donne des lignes directrices générales pour la détection et l'identification du

microorganisme spécifié Staphylococcus aureus dans les produits cosmétiques. Les microorganismes

considérés comme spécifiés dans la présente Norme internationale peuvent différer d'un pays à l'autre,

suivant les pratiques ou réglementations nationales.

Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est préférablr d'effectuer une analyse

appropriée du risque microbiologique afin de déterminer les types de produits cosmétiques qui relèvent de la

présente Norme internationale. Les produits considérés présenter un faible risque microbiologique

comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydro-alcooliques, ceux ayant des valeurs de

pH extrêmes, etc.

La méthode décrite dans la présente Norme internationale repose sur la détection de Staphylococcus aureus

dans un milieu liquide non sélectif (milieu liquide d'enrichissement), suivie de son isolement sur un milieu

gélosé sélectif. D'autres méthodes peuvent être appropriées en fonction du niveau de détection exigé.

NOTE Pour la détection de Staphylococcus aureus, il est possible de réaliser des sous-cultures sur des milieux de

culture non sélectifs avant de procéder aux étapes appropriées d'identification (en utilisant, par exemple des kits

d'identification).

En raison de la grande variété de produits cosmétiques entrant dans le présent domaine d'application, il se

peut que la présente méthode ne soit pas adaptée, en tous points, à quelques produits (par exemple certains

[10]

produits non miscibles à l'eau). Une autre Norme internationale (l'ISO 18415 ) peut convenir. Il est possible

de remplacer les essais présentés ici par d'autres méthodes (automatisées, par exemple) sous réserve que

leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été validée par ailleurs.

2 Références normatives

Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les

références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du

document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).

ISO 21148:2005, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques

EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des souches microbiennes utilisées

pour la détermination de l'activité bactéricide et fongicide
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

3.1
produit
portion d'un produit cosmétique identifié, reçue au laboratoire pour essais
© ISO 2006 – Tous droits réservés 1
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ISO 22718:2006(F)
3.2
échantillon

portion du produit (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée dans l'essai pour préparer la suspension initiale

3.3
suspension initiale

suspension (ou solution) de l'échantillon dans un volume défini d'un milieu liquide d'enrichissement approprié

3.4
dilution(s) de l'échantillon
dilution(s) de la suspension initiale
3.5
microorganisme spécifié

bactérie aérobie mésophile ou levure dont la présence dans un produit cosmétique est indésirable parce

qu'elle est reconnue comme une espèce pathogène pour la peau susceptible d'être néfaste pour la santé

humaine ou parce que c'est un indicateur de défaillance de l'hygiène dans le processus de fabrication

3.6
Staphylococcus aureus

cocci Gram positif, principalement regroupés en grappes, colonies lisses généralement pigmentées en jaune

NOTE 1 Les principales caractéristiques pour l'identification sont les suivantes: croissance sur milieu sélectif spécifique,

catalase positive, coagulase positive.

NOTE 2 Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène opportuniste chez l'homme, qui peut également être

présente sur la peau d'individus sains sans engendrer de troubles. Sa présence est indésirable dans les produits

cosmétiques en raison de son caractère potentiellement pathogène.
3.7
milieu liquide d'enrichissement

milieu liquide non sélectif contenant des neutralisants et/ou agents dispersants appropriés, validé pour le

produit soumis à essai
4 Principe

La première étape du mode opératoire est de procéder à l'enrichissement en utilisant un milieu liquide non

sélectif pour augmenter le nombre de microorganismes, de façon à éviter le risque d'inhibition par les

ingrédients sélectifs présents dans les milieux de culture sélectifs/différentiels.

La seconde étape de l'essai (isolement) est réalisée sur un milieu sélectif, avant les essais d'identification.

L'inhibition potentielle de la croissance microbienne par l'échantillon doit être neutralisée pour permettre la

[1]

recherche des microorganismes viables . Dans tous les cas et quelle que soit la méthode employée, la

[2], [3], [4]

neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit doit être vérifiée et validée .

5 Diluants et milieux de culture
5.1 Généralités

Des instructions générales sont données dans l'ISO 21148. Lorsque le présent document mentionne

l'utilisation d'eau, utiliser de l'eau distillée ou de l'eau purifiée comme spécifié dans l'ISO 21148.

Le milieu liquide d'enrichissement est utilisé pour disperser l'échantillon et pour augmenter la population

microbienne initiale. Il peut contenir des neutralisants si l'échantillon à soumettre à essai possède des

propriétés antimicrobiennes. L'efficacité de la neutralisation doit être démontrée (voir Article 11). L'Annexe B

fournit des informations relatives aux neutralisants appropriés.
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ISO 22718:2006(F)

Le milieu liquide d'enrichissement suivant peut être utilisé pour vérifier la présence de Staphylococcus aureus

conformément à la présente Norme internationale, à condition d'avoir été validé conformément à l'Article 11.

D'autres diluants et milieux de culture sont utilisables s'il a été démontré que leur emploi convient.

5.2 Diluant pour la suspension bactérienne (solution de tryptone et de chlorure de sodium)

5.2.1 Généralités

Le diluant est utilisé pour préparer la suspension bactérienne utilisée pour la validation (voir Article 11).

5.2.2 Composition
⎯ tryptone, peptone de caséine 1,0 g
⎯ chlorure de sodium 8,5 g
⎯ eau 1 000 ml
5.2.3 Préparation

Dissoudre les composants dans l'eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients

appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température

ambiante.
5.3 Milieux de culture
5.3.1 Généralités

Les milieux de culture peuvent être préparés comme indiqué ci-dessous ou à partir de milieux de culture

déshydratés conformément aux instructions du fabricant. Il convient de suivre les instructions données par le

fournisseur de ces milieux.

NOTE Il est possible d'utiliser des milieux prêts à l'emploi quand leur composition et/ou leurs performances de

croissance sont comparables à celles des formules indiquées ici.

5.3.2 Milieu gélosé pour validation (voir Article 11) milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja

(SCDA) ou gélose trypto-caséine soja (TSA)
5.3.2.1 Composition
⎯ peptone de caséine 15,0 g
⎯ peptone de soja 5,0 g
⎯ chlorure de sodium 5,0 g
⎯ gel d'agar 15,0 g
⎯ eau 1 000 ml
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ISO 22718:2006(F)
5.3.2.2 Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau en mélangeant tout en chauffant.

Répartir dans des récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température

ambiante.
5.3.3 Milieu liquide d'enrichissement
5.3.3.1 Bouillon Eugon LT 100
5.3.3.1.1 Généralités

Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans l'échantillon:

lécithine et polysorbate 80 ainsi qu'un agent dispersant: octoxynol 9.
5.3.3.1.2 Composition
⎯ peptone de caséine 15,0 g
⎯ peptone de soja 5,0 g
⎯ L-cystine 0,7 g
⎯ chlorure de sodium 4,0 g
⎯ sulfite de sodium 0,2 g
⎯ glucose 5,5 g
⎯ lécithine d'œuf 1,0 g
⎯ polysorbate 80 5,0 g
⎯ octoxynol 9 1,0 g
⎯ eau 1 000 ml
5.3.3.1.3 Préparation

Dissoudre les composants dans l'eau bouillante dans l'ordre suivant: polysorbate 80, octoxynol 9 et lécithine

d'oeuf jusqu'à dissolution complète. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant.

Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être égal à 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à

température ambiante.
5.3.3.2 Autres milieux liquides d'enrichissement

D'autres milieux liquides d'enrichissement peuvent être utilisés s'ils sont appropriés (voir Annexe A).

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5.3.4 Milieu gélosé sélectif pour isolement de Staphylococcus aureus
5.3.4.1 Gélose Baird Parker
5.3.4.1.1 Milieu de base
5.3.4.1.1.1 Composition
⎯ peptone de caséine 10,0 g
⎯ extrait de levure 1,0 g
⎯ extrait de viande 5,0 g
⎯ pyruvate de sodium 10,0 g
⎯ L-glycine 12,0 g
⎯ chlorure de lithium 5,0 g
⎯ gélose 12 g à 22 g
⎯ eau compléter au volume final de 950 ml
5.3.4.1.1.2 Préparation

Dissoudre tous ces composants ou la base complète déshydratée dans l'eau à ébullition. Transférer le milieu

par portions de 100 ml dans des fioles ou flacons de capacité appropriée. Stériliser à l'autoclave à 121 °C

pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,2 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température

ambiante.
5.3.4.1.2 Solution de tellurite de potassium
5.3.4.1.2.1 Composition
⎯ tellurite de potassium (K TeO) 1,0 g
2 3
⎯ eau 100 ml
5.3.4.1.2.2 Préparation

Dissoudre le tellurite de potassium complètement dans l'eau en chauffant au minimum.

Stériliser par filtration sur des membranes ayant une porosité de 0,22 µm. La solution peut être conservée à

3 °C ± 2 °C pendant une période maximale de un mois. Rejeter la solution en cas de formation d'un précipité

blanc.

En principe, la poudre se dissout facilement. S'il persiste dans l'eau une substance blanche insoluble, il

convient de rejeter la poudre.
1) En fonction des propriétés gélifiantes de l'agar.
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5.3.4.1.3 Émulsion de jaune d'oeuf (concentration de 20 % approximativement ou selon les

instructions du fabricant)

Si l'on ne dispose pas d'une préparation commerciale, préparer le milieu de la façon suivante.

Utiliser des oeufs de poule frais aux coquilles intactes. Les laver à la brosse avec un détergent liquide. Les

rincer à l'eau courante, désinfecter les coquilles soit en les plongeant dans de l'éthanol à 70 % (fraction

volumique) pendant 30 s et en les laissant sécher à l'air, soit en les vaporisant d'alcool et en les stérilisant à la

flamme. Dans des conditions aseptiques, casser chaque oeuf et séparer le jaune du blanc en faisant passer

le jaune d'une moitié de c
...