ISO 18415:2017

Cosmetics — Microbiology — Detection of specified and non-specified microorganisms

ISO 18415:2017 gives general guidelines for the detection and identification of specified microorganisms in cosmetic products as well as for the detection and identification of other kinds of aerobic mesophilic non-specified microorganisms in cosmetic products. Microorganisms considered as specified in this document might differ from country to country according to national practices or regulations. Most of them considered as specified microorganisms include one or more of the following species: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans. In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic products to which this document is applicable. Products considered to present a low microbiological risk (see ISO 29621) include those with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc. The method described in this document is based on the detection of microbial growth in a non-selective liquid medium (enrichment broth) suitable to detect microbial contamination, followed by isolation of microorganisms on non-selective agar media. Other methods can be appropriate depending on the level of detection required. In ISO 18415:2017 specific indications are given for identification of Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans. Other microorganisms that grow under the conditions described in this document may be identified by using suitable tests according to a general scheme (see Annex A). Other standards (e.g. ISO 18416, ISO 21150, ISO 22717, ISO 22718) may be appropriate. Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method might not be suited in every detail to some products (e.g. certain water-immiscible products). Other methods (e.g. automated) can be substituted for the tests presented here provided that their equivalence has been demonstrated or the method has been otherwise shown to be suitable.

Cosmétiques — Microbiologie — Détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés

ISO 18416:2017 donne des lignes directrices générales pour la détection et l'identification de micro-organismes spécifiés dans les produits cosmétiques, et aussi pour la détection et l'identification d'autres sortes de micro-organismes mésophiles aérobies non spécifiés, dans les produits cosmétiques. Les micro-organismes considérés comme spécifiés dans le présent document peuvent différer d'un pays à l'autre, suivant les pratiques ou réglementations nationales. La plupart des micro-organismes considérés comme spécifiés comprennent une ou plusieurs espèces, parmi les suivantes: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Candida albicans. Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d'effectuer une analyse appropriée du risque microbiologique afin de déterminer les types de produits cosmétiques qui relèvent du présent document. Les produits considérés comme présentant un faible risque microbiologique comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydro-alcooliques, les produits ayant des valeurs de pH extrêmes, etc. La méthode décrite dans le présent document est fondée sur la détection d'une croissance microbienne dans un milieu liquide non sélectif (bouillon d'enrichissement) qui permet de détecter une contamination microbienne, suivie d'un isolement des micro-organismes sur un milieu gélosé non sélectif. D'autres méthodes peuvent être appropriées, en fonction du niveau de détection exigé. Dans le présent document, des indications spécifiques sont données pour l'identification de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Candida albicans. D'autres micro-organismes qui se développent dans les conditions décrites dans le présent document peuvent être identifiés en mettant en ?uvre des essais appropriés conformes à un schéma général (voir Annexe A). D'autres Normes internationales (par exemple, l'ISO 18416, l'ISO 21150, l'ISO 22717 et l'ISO 22718) peuvent convenir. En raison de la grande variété de produits cosmétiques relevant du présent domaine d'application, la présente méthode pourrait ne pas être, en tous points, applicable à certains produits (par exemple certains produits non miscibles à l'eau). D'autres méthodes (par exemple automatisées) peuvent se substituer aux essais présentés ici, sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été validée par ailleurs.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 28-May-2017
• ICS: 07.100.40 - Cosmetics microbiology
• ICS: 07.100.99 - Other standards related to microbiology
• ICS: 71.100.70 - Cosmetics. Toiletries
• Technical Committee: ISO/TC 217 - Cosmetics
• Drafting Committee: ISO/TC 217/WG 1 - Microbiological standards and limits
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 07-Dec-2022

Relations

• Consolidates: ISO 6887-4:2017 - Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 4: Specific rules for the preparation of miscellaneous products
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Amended By: ISO 18415:2017/Amd 1:2022 - Cosmetics — Microbiology — Detection of specified and non-specified microorganisms — Amendment 1
• Effective Date: 04-Dec-2021
• Revises: ISO 18415:2007 - Cosmetics — Microbiology — Detection of specified and non-specified microorganisms
• Effective Date: 27-Aug-2016

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18415
Second edition
2017-06
Cosmetics — Microbiology —
Detection of specified and non-
specified microorganisms
Cosmétiques — Microbiologie — Détection des micro-organismes
spécifiés et non spécifiés
Reference number
ISO 18415:2017(E)
ISO 2017
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 18415:2017(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2017, Published in Switzerland

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ii © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 18415:2017(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 3

5 Diluents and culture media ....................................................................................................................................................................... 3

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 3

5.2 Diluent for the microbial suspension (tryptone sodium chloride solution) ..................................... 3

5.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 3

5.2.2 Composition ......................................................................................................................................................................... 4

5.2.3 Preparation ........................................................................................................................................................................... 4

5.3 Culture media ........................................................................................................................................................................................... 4

5.3.1 General...................................................................................................................................................................................... 4

5.3.2 Enrichment broth ............................................................................................................................................................ 4

5.3.3 Non-selective agar medium .................................................................................................................................... 5

6 Apparatus and glassware ............................................................................................................................................................................ 5

7 Strains of microorganism ............................................................................................................................................................................ 6

8 Handling of cosmetic products and laboratory samples ............................................................................................ 6

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 General recommendations............................................................................................................................................................ 6

9.2 Preparation of the initial suspension in the enrichment broth .................................................................... 6

9.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

9.2.2 Water-miscible products........................................................................................................................................... 7

9.2.3 Water-immiscible products .................................................................................................................................... 7

9.2.4 Filterable products ......................................................................................................................................................... 7

9.3 Incubation of the initial suspension ..................................................................................................................................... 7

9.4 Isolation of specified and non-specified microorganisms ................................................................................. 7

9.5 Procedure for identification of the specified microorganism: Pseudomonas aeruginosa ....... 7

9.5.1 Gram staining ...................................................................................................................................................................... 7

9.5.2 Oxidase test .......................................................................................................................................................................... 7

9.5.3 Identification test ............................................................................................................................................................ 8

9.6 Procedure for identification of the specified microorganism: Escherichia coli ............................... 8

9.6.1 Gram staining ...................................................................................................................................................................... 8

9.6.2 Oxidase test .......................................................................................................................................................................... 8

9.6.3 Identification test ............................................................................................................................................................ 8

9.7 Procedure for identification of the specified microorganism: Staphylococcus aureus ............. 8

9.7.1 Gram staining ...................................................................................................................................................................... 8

9.7.2 Catalase test ......................................................................................................................................................................... 8

9.7.3 Identification test ............................................................................................................................................................ 8

9.8 Procedure for the identification of the specified microorganism: Candida albicans ................. 9

9.8.1 Gram staining ...................................................................................................................................................................... 9

9.8.2 Identification test ............................................................................................................................................................ 9

9.9 Procedure for the identification of non-specified microorganisms .......................................................... 9

9.9.1 Gram staining ...................................................................................................................................................................... 9

9.9.2 Oxidase test .......................................................................................................................................................................... 9

9.9.3 Catalase test ......................................................................................................................................................................... 9

9.9.4 Identification test ............................................................................................................................................................ 9

10 Expression of the results ...........................................................................................................................................................................10

10.1 Detection of specified microorganisms ..........................................................................................................................10

© ISO 2017 – All rights reserved iii
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ISO 18415:2017(E)

10.2 Detection of non-specified microorganisms...............................................................................................................10

10.3 Absence of microorganisms ......................................................................................................................................................10

11 Neutralization of the antimicrobial properties of the product .........................................................................10

11.1 General ........................................................................................................................................................................................................10

11.2 Preparation of inoculum ..............................................................................................................................................................10

11.3 Suitability of detection method by enrichment .......................................................................................................10

11.3.1 Principle ...............................................................................................................................................................................10

11.3.2 Procedure ............................................................................................................................................................................11

11.3.3 Interpretation of suitability test results ...................................................................................................11

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................11

Annex A (informative) General scheme for identification of microorganisms......................................................13

Annex B (informative) Other media ...................................................................................................................................................................14

Annex C (informative) Neutralizers of antimicrobial activity of preservatives and rinsing liquids 17

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................19

iv © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 18415:2017(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following

URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 18415:2007), of which it constitutes a

minor revision with the following changes:

— in the Scope, “see ISO 29621” has been added and the reference has been added to the Bibliography;

— in the Scope, “used” has been changed to “substituted” and “validated” has been changed to “shown

to be suitable”;

— in 3.8, the term “validated” has been changed to “demonstrated to be suitable”;

— in Clause 4, the term “validated” has been changed to “demonstrated”;
— in 5.1, “specifications” has been changed to “instructions”;

— in 5.1, the phrase “are validated” has been changed to “have been demonstrated to be suitable”;

— in 5.2.1, 5.3.3.1, 11.3.1, 11.3.2, instances of the term “validation” and in the heading title of 11.3.3

have been changed to “suitability test”;

— in 11.3, the term “validation” in the heading title has been changed to “suitability”;

— in 11.3.3, instances of “validated” have been changed to “satisfactory”;

— in Clause 12 f), the term “validation” has been changed to “demonstration of the suitability”.

© ISO 2017 – All rights reserved v
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ISO 18415:2017(E)
Introduction

Microbiological examinations of cosmetic products are carried out according to an appropriate

microbiological risk analysis in order to ensure their quality and safety for consumers.

Microbiological risk analysis depends on several parameters such as:
— potential alteration of cosmetic products;
— pathogenicity of microorganisms;

— site of application of the cosmetic product (hair, skin, eyes, mucous membranes);

— type of user (adults, children including under 3 years).

For cosmetics and other topical products, the detection of skin pathogens such as Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans may be relevant because they can cause skin

or eye infection. The detection of other kinds of microorganisms might be of interest since these

microorganisms (including indicators of faecal contamination e.g. Escherichia coli) suggest hygienic

failure during manufacturing process.
vi © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 18415:2017(E)
Cosmetics — Microbiology — Detection of specified and
non-specified microorganisms
1 Scope

This document gives general guidelines for the detection and identification of specified microorganisms

in cosmetic products as well as for the detection and identification of other kinds of aerobic mesophilic

non-specified microorganisms in cosmetic products.

Microorganisms considered as specified in this document might differ from country to country

according to national practices or regulations. Most of them considered as specified microorganisms

include one or more of the following species: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus

aureus and Candida albicans.

In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate

microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic products to which this document is

applicable. Products considered to present a low microbiological risk (see ISO 29621) include those

with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc.

The method described in this document is based on the detection of microbial growth in a non-selective

liquid medium (enrichment broth) suitable to detect microbial contamination, followed by isolation of

microorganisms on non-selective agar media. Other methods can be appropriate depending on the level

of detection required.

In this document specific indications are given for identification of Pseudomonas aeruginosa, Escherichia

coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans. Other microorganisms that grow under the conditions

described in this document may be identified by using suitable tests according to a general scheme (see

Annex A). Other standards (e.g. ISO 18416, ISO 21150, ISO 22717, ISO 22718) may be appropriate.

Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method might not

be suited in every detail to some products (e.g. certain water-immiscible products). Other methods (e.g.

automated) can be substituted for the tests presented here provided that their equivalence has been

demonstrated or the method has been otherwise shown to be suitable.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 21148:2017, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination

EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of test organisms used for the

determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal

(including bacteriophages) activity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
© ISO 2017 – All rights reserved 1
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ISO 18415:2017(E)
3.1
product
portion of an identified cosmetic product received in the laboratory for testing
3.2
sample

portion of the product (3.1) (at least 1 g or 1 ml) that is used in the test to prepare the initial

suspension (3.3)
3.3
initial suspension

suspension (or solution) of the sample (3.2) in a defined volume of an appropriate enrichment broth (3.8)

3.4
sample dilution
dilution of the initial suspension (3.3)
3.5
aerobic mesophilic microorganism

mesophilic bacterium or yeast growing aerobically under the conditions specified in this document

Note 1 to entry: In the described conditions, other types of microorganism (e.g. moulds) are detectable.

3.6
specified microorganism

aerobic mesophilic bacterium or yeast undesirable in a cosmetic product and recognized as a skin

pathogen species that may be harmful for human health or as an indication of hygienic failure in the

manufacturing process
3.6.1
Pseudomonas aeruginosa
Gram-negative rod (bacilli), motile, smooth colonies pigmented brown or greenish

Note 1 to entry: The main characteristics for identification are growth on a selective cetrimide agar medium,

oxidase positive, production of diffusible fluorescent pigments and production of a soluble phenazine pigment

(pyocyanin) in suitable media.

Note 2 to entry: Pseudomonas aeruginosa can be isolated from a wide variety of environmental sources, especially

in water and has a very high potential to spoil many different substrates. It can produce infections of human skin

or eye areas. It is undesirable in cosmetic products for its potential pathogenicity and its capacity to affect the

physico-chemical properties of the cosmetic formula.
3.6.2
Escherichia coli
Gram-negative rod (bacilli), motile, smooth colonies

Note 1 to entry: The main characteristics are catalase positive, oxidase negative, fermentation of lactose,

production of indole, growth on selective medium containing bile salts with characteristic colonies.

Note 2 to entry: Escherichia coli can be isolated from the moist environmental sources (air, water, soil) and is a

faecal contamination indicator.
3.6.3
Staphylococus aureus

Gram-positive cocci, mainly aggregated in grape-like clusters, smooth colonies generally pigmented

in yellow

Note 1 to entry: The main characteristics for identification are growth on a specific selective medium, catalase

positive, coagulase positive.

Note 2 to entry: Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen for humans, which often can be also present

on the skin of healthy individuals without causing them any apparent illness. It is a specified microorganism and

undesirable in cosmetic products.
2 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 18415:2017(E)
3.6.4
Candida albicans

yeast that forms white to beige, creamy and convex colonies on the surface of a non-selective agar medium

Note 1 to entry: The main characteristics for identification are production of germ tube and/or pseudomycelium

and chlamydospore when the test is performed following the method specified in this document.

3.7
non-specified microorganism

aerobic mesophilic bacterium or yeast found in cosmetic products, not defined in 3.6

3.8
enrichment broth

non-selective liquid medium containing suitable neutralizers and/or dispersing agents and

demonstrated to be suitable for the product (3.1) under test
4 Principle

The first step of the procedure is to perform an enrichment by using a non-selective broth medium to

increase the number of microorganisms without the risk of inhibition by the selective ingredients that

are present in selective/differential growth media.

The following steps (isolation and identification) are performed according to need by using appropriate

conditions of incubation and suitable identification test, as described in this document.

The possible inhibition of microbial growth by the sample shall be neutralized to allow the detection

[9]

of viable microorganisms . In all cases and whatever the methodology, the neutralization of the

[9][10][11]
antimicrobial properties of the product shall be checked and demonstrated .
5 Diluents and culture media
5.1 General

General instructions are given in ISO 21148. When water is mentioned in this document, use distilled

water or purified water as specified in ISO 21148.

The enrichment broth is used to disperse the sample and to increase the initial microbial population. It

may contain neutralizers if the specimen to be tested has antimicrobial properties. The efficacy of the

neutralization shall be demonstrated (see Clause 11). Information relative to suitable neutralizers is

given in Annex C.

The enrichment broth (see 5.3.2.1) or any of the ones listed in Annex B is suitable for checking the

presence of specified and non-specified microorganisms in accordance with this document provided

that they have been demonstrated to be suitable in accordance with Clause 11.

Other diluents and culture media may be used if it has been demonstrated that they are suitable for use.

5.2 Diluent for the microbial suspension (tryptone sodium chloride solution)
5.2.1 General

The diluent is used for the preparation of bacteria and yeast suspensions used for the suitability test

procedure (see Clause 11).
© ISO 2017 – All rights reserved 3
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ISO 18415:2017(E)
5.2.2 Composition
Tryptone, pancreatic digest of casein 1,0 g
Sodium chloride 8,5 g
Water 1 000 ml
5.2.3 Preparation

Dissolve the components in water by mixing while heating. Dispense into suitable containers. Sterilize

in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when

measured at room temperature.
5.3 Culture media
5.3.1 General

Culture media may be prepared as follows, or from dehydrated culture media according to the

manufacturer’s instructions.

Ready-to-use media may be used when their composition and/or growth yields are comparable with

those of the formulae given herein.
5.3.2 Enrichment broth
5.3.2.1 Eugon LT100 broth
5.3.2.1.1 General

This medium contains ingredients which neutralize inhibitory substances present in the sample:

lecithin and polysorbate 80, and dispersing agent: octoxynol 9.
5.3.2.1.2 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
L-cystine 0,7 g
Sodium chloride 4,0 g
Sodium sulfite 0,2 g
glucose 5,5 g
egg lecithin 1,0 g
polysorbate 80 5,0 g
octoxynol 9 1,0 g
water 1 000 ml
4 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 18415:2017(E)
5.3.2.1.3 Preparation

Dissolve the components polysorbate 80, octoxynol 9 and egg lecithin, one after another in boiling

water to complete dissolution. Dissolve the other components by mixing while heating. Dispense the

medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the

pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.3.2.2 Other enrichment broths
Other enrichment broths may be used as appropriate (see Annex B).
5.3.3 Non-selective agar medium
5.3.3.1 General

This medium is used for the isolation and detection of specified and non-specified microorganisms

present in the initial suspension after enrichment and for the preparation of inoculum used in the

suitability test procedure.
5.3.3.2 Soybean-casein digest agar medium (SCDA) or tryptic soy agar (TSA)
5.3.3.2.1 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.3.3.2.2 Preparation

Dissolve the components or the dehydrated complete medium in water by mixing while heating.

Dispense the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After

sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room

temperature.
5.3.3.3 Other non-selective agar medium
Other non-selective, non-neutralizing agar media may be used (see Annex B).
6 Apparatus and glassware
The laboratory equipment, apparatus and glassware are described in ISO 21148.
© ISO 2017 – All rights reserved 5
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ISO 18415:2017(E)
7 Strains of microorganism

For testing the recovery efficiency of the test conditions, three specified microorganisms are used: two

strains representative of both Gram-negative and Gram-positive bacteria and a strain of yeast.

1) 2) 3)

— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (equivalent strain: CIP 82.118 or NCIMB 8626 or

4) 5)
NBRC 13275 or KCTC 2513 or other equivalent national collection strain).

An alternative to the Gram-negative strain may be: Escherichia coli ATCC 8739 (equivalent strain:

CIP 53.126 or NCIMB 8545 or NBRC 3972 or KCTC 2571 or other equivalent national collection strain).

— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (equivalent strain: CIP 4.83 or NCIMB 9518 or NBRC 13276 or

KCTC 1916 or other equivalent national collection strain);
6) 7)

— Candida albicans ATCC 10231 (equivalent strain: IP 48.72 or NCPF 3179 or NBRC 1594 or

KCTC 17205 or other equivalent national collection strain).

The culture should be reconstituted according to the procedures provided by the supplier of

reference strain.
The strains can be kept in the laboratory in accordance with EN 12353.
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples

If necessary, store products to be tested at room temperature. Do not incubate, refrigerate or free

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 18415
Deuxième édition
2017-06
Cosmétiques — Microbiologie —
Détection des micro-organismes
spécifiés et non spécifiés
Cosmetics — Microbiology — Detection of specified and non-specified
microorganisms
Numéro de référence
ISO 18415:2017(F)
ISO 2017
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ISO 18415:2017(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2017, Publié en Suisse

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

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l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 18415:2017(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principes ....................................................................................................................................................................................................................... 3

5 Diluants et milieux de culture ................................................................................................................................................................ 3

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 3

5.2 Diluant pour la suspension microbienne (solution tryptone sel) ......... ...................................................... 4

5.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 4

5.2.2 Composition ......................................................................................................................................................................... 4

5.2.3 Préparation ........................................................................................................................................................................... 4

5.3 Milieux de culture ................................................................................................................................................................................. 4

5.3.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 4

5.3.2 Bouillon d’enrichissement ....................................................................................................................................... 4

5.3.3 Milieu gélosé non sélectif ......................................................................................................................................... 5

6 Matériel et verrerie............................................................................................................................................................................................ 6

7 Souches de micro-organismes ................................................................................................................................................................ 6

8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire ........................................6

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 Recommandations générales...................................................................................................................................................... 6

9.2 Préparation de la suspension initiale dans le bouillon d’enrichissement ........................................... 7

9.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 7

9.2.2 Produits miscibles dans l’eau................................................................................................................................ 7

9.2.3 Produits non miscibles dans l’eau .................................................................................................................... 7

9.2.4 Produits filtrables ........................................................................................................................................................... 7

9.3 Incubation de la suspension initiale ..................................................................................................................................... 7

9.4 Isolement des micro-organismes spécifiés et non spécifiés ............................................................................ 7

9.5 Mode opératoire d’identification du micro-organisme spécifié:

Pseudomonas aeruginosa ................................................................................................................................................................ 8

9.5.1 Coloration de Gram ........................................................................................................................................................ 8

9.5.2 Recherche de l’oxydase .............................................................................................................................................. 8

9.5.3 Essai d’identification .................................................................................................................................................... 8

9.6 Mode opératoire d’identification du micro-organisme spécifié: Escherichia coli ......................... 8

9.6.1 Coloration de Gram ........................................................................................................................................................ 8

9.6.2 Recherche de l’oxydase .............................................................................................................................................. 8

9.6.3 Essai d’identification .................................................................................................................................................... 8

9.7 Mode opératoire d’identification du micro-organisme spécifié: Staphylococus aureus .......... 9

9.7.1 Coloration de Gram ........................................................................................................................................................ 9

9.7.2 Recherche de la catalase............................................................................................................................................ 9

9.7.3 Essai d’identification .................................................................................................................................................... 9

9.8 Mode opératoire d’identification du micro-organisme spécifié: Candida albicans ..................... 9

9.8.1 Coloration de Gram ........................................................................................................................................................ 9

9.8.2 Essai d’identification .................................................................................................................................................... 9

9.9 Mode opératoire d’identification des micro-organismes non spécifiés ................................................ 9

9.9.1 Coloration de Gram ........................................................................................................................................................ 9

9.9.2 Recherche de l’oxydase ...........................................................................................................................................10

9.9.3 Recherche de la catalase.........................................................................................................................................10

9.9.4 Essai d’identification .................................................................................................................................................10

10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................10

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ISO 18415:2017(F)

10.1 Détection des micro-organismes spécifiés ..................................................................................................................10

10.2 Détection de micro-organismes non spécifiés ..........................................................................................................10

10.3 Absence de micro-organismes ...............................................................................................................................................10

11 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit .............................................................................11

11.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................11

11.2 Préparation de l’inoculum ..........................................................................................................................................................11

11.3 Applicabilité de la méthode de détection par enrichissement ...................................................................11

11.3.1 Principes ..............................................................................................................................................................................11

11.3.2 Mode opératoire ............................................................................................................................................................11

11.3.3 Interprétation des résultats d’essai d’applicabilité ........................................................................12

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................12

Annexe A (informative) Schéma général pour l’identification des micro-organismes .................................13

Annexe B (informative) Autres milieux ..........................................................................................................................................................14

Annexe C (informative) Neutralisants de l’activité antimicrobienne des conservateurs et

des liquides de rinçage ...............................................................................................................................................................................17

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................19

iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 18415:2017(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: http:// www .iso .org/ iso/ fr/ foreword .html.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 217, Cosmétiques.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 18415:2007), qui a fait l’objet d’une

révision mineure comprenant les modifications suivantes:

— en le domaine d’application, «voir ISO 29621» a été ajouté et le référence a été ajouté au Bibliographie;

— en le domaine d’application, «validée» a été remplacé par «indiquée comme adéquate»;

— en 3.8, le terme «validé» a été remplacé par «démontré comme étant applicable»;

— en l’Article 4, le terme «validée» a été remplacé par «démontrée»;
— en 5.1, «spécifications» a été remplacé par «instructions»;

— en 5.1, le syntagme «d’avoir été validés» a été remplacé par «qu’ils aient été démontrés comme étant

applicables»;

— en 5.2.1, 5.3.3.1, 11.3.1, 11.3.2, les occurrences du terme «validation» et dans le titre de 11.3.3 ont

été remplacées par «essai d’applicabilité»;

— en 11.3, le terme «validation» dans le titre a été remplacé par «applicabilité»;

— en 11.3.3, les occurrences de «validées» ont été remplacées par «satisfaisantes»;

— en l’Article 12, le terme «validation» a été remplacé par «démonstration de l’applicabilité».

© ISO 2017 – Tous droits réservés v
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ISO 18415:2017(F)
Introduction

Les examens microbiologiques des produits cosmétiques sont réalisés conformément à une analyse de

risque appropriée afin de garantir leur qualité et la sécurité des consommateurs.

L’analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramètres tels que:
— l’altération potentielle des produits cosmétiques;
— le caractère pathogène des micro-organismes;
— le site d’application du produit cosmétique (cheveux, peau, yeux, muqueuses);
— la catégorie d’utilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans).

Pour les cosmétiques et d’autres produits topiques, la détection d’agents pathogènes pour la peau,

tels que Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans, peut être justifiée, car ils

peuvent engendrer des infections cutanées ou ophtalmiques. La détection d’autres sortes de micro-

organismes peut aussi présenter un intérêt, car ces micro-organismes (y compris des indicateurs de

contamination fécale, par exemple Escherichia coli) peuvent indiquer une défaillance de l’hygiène au

cours du processus de fabrication.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 18415:2017(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Détection des micro-
organismes spécifiés et non spécifiés
1 Domaine d’application

Le présent document donne des lignes directrices générales pour la détection et l’identification de

micro-organismes spécifiés dans les produits cosmétiques, et aussi pour la détection et l’identification

d’autres sortes de micro-organismes mésophiles aérobies non spécifiés, dans les produits cosmétiques.

Les micro-organismes considérés comme spécifiés dans le présent document peuvent différer

d’un pays à l’autre, suivant les pratiques ou réglementations nationales. La plupart des micro-

organismes considérés comme spécifiés comprennent une ou plusieurs espèces, parmi les suivantes:

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Candida albicans.

Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d’effectuer une

analyse de risque microbiologique appropriée, afin de déterminer les types de produits cosmétiques

qui relèvent du présent document. Les produits considérés comme présentant un faible risque

microbiologique (voir ISO 29621) comprennent ceux ayant une faible activité de l’eau, les produits

hydro-alcooliques, les produits ayant des valeurs de pH extrêmes, etc.

La méthode décrite dans le présent document est fondée sur la détection d’une croissance microbienne

dans un milieu liquide non sélectif (bouillon d’enrichissement) qui permet de détecter une contamination

microbienne, suivie d’un isolement des micro-organismes sur un milieu gélosé non sélectif. D’autres

méthodes peuvent être appropriées, en fonction du niveau de détection exigé.

Dans le présent document, des indications spécifiques sont données pour l’identification de Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Candida albicans. D’autres micro-organismes qui se

développent dans les conditions décrites dans le présent document peuvent être identifiés en mettant

en œuvre des essais appropriés conformes à un schéma général (voir Annexe A). D’autres Normes

internationales (par exemple, l’ISO 18416, l’ISO 21150, l’ISO 22717 et l’ISO 22718) peuvent convenir.

En raison de la grande variété de produits cosmétiques relevant du présent domaine d’application, la

présente méthode pourrait ne pas être, en tous points, applicable à certains produits (par exemple

certains produits non miscibles à l’eau). Il est possible de remplacer les essais présentés ici par

d’autres méthodes (par exemple des méthodes automatisées) sous réserve que leur équivalence ait été

démontrée ou que la méthode ait été par ailleurs indiquée comme adéquate.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 21148:2017, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques

EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des microorganismes d’essai utilisés

pour la détermination de l’activité bactéricide (Legionella incluses), mycobactéricide, sporicide, fongicide et

virucide (bactériophages inclus)
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

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ISO 18415:2017(F)

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp

3.1
produit
portion d’un produit cosmétique identifié reçue au laboratoire pour essais
3.2
échantillon

portion du produit (3.1) (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée dans l’essai pour préparer la suspension initiale (3.3)

3.3
suspension initiale

suspension (ou solution) de l’échantillon (3.2) dans un volume défini d’un bouillon d’enrichissement (3.8)

approprié
3.4
dilution de l’échantillon
dilution de la suspension initiale (3.3)
3.5
micro-organisme mésophile aérobie

bactérie ou levure mésophile se développant en aérobiose dans les conditions spécifiées dans le présent

document

Note 1 à l’article: Dans les conditions décrites, la détection d’autres types de micro-organismes (par exemple

moisissures) est admise.
3.6
micro-organisme spécifiés

bactérie aérobie mésophile ou levure dont la présence dans un produit cosmétique est indésirable parce

qu’elle peut causer une infection cutanée ou ophtalmique ou peut être considérée comme un indicateur

de défaillance de l’hygiène dans le processus de fabrication
3.6.1
Pseudomonas aeruginosa

bâtonnet (bacille) à Gram négatif, mobile, colonies lisses pigmentées brunes ou verdâtres

Note 1 à l’article: Les principales caractéristiques pour l’identification sont les suivantes: croissance sur milieu

sélectif gélosé cétrimide, oxydase positive, production de pigments fluorescents diffusibles et production d’un

pigment phénazine soluble (pyocyanine) dans les milieux appropriés.

Note 2 à l’article: Pseudomonas aeruginosa peut être isolé d’une grande variété de sources environnementales,

notamment dans l’eau, et il est très largement capable de détériorer nombre de substrats différents. Il peut

engendrer, chez l’Homme, des infections cutanées ou ophtalmiques. Sa présence est indésirable dans les produits

cosmétiques en raison de son caractère potentiellement pathogène et de sa capacité à altérer les propriétés

physicochimiques de la formule du cosmétique.
3.6.2
Escherichia coli
bâtonnet (bacille) à Gram négatif, mobile; colonies lisses

Note 1 à l’article: Les principales caractéristiques sont les suivantes: catalase positive, oxydase négative,

fermentation du lactose, production d’indole, croissance sur milieu sélectif contenant des sels biliaires avec

colonies caractéristiques.

Note 2 à l’article: Escherichia coli peut être isolé à partir de sources environnementales humides (air, eau, sol) et

constitue un indicateur de contamination fécale.
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 18415:2017(F)
3.6.3
Staphylococus aureus

cocci à Gram positif, principalement regroupés en grappes, colonies lisses généralement pigmentées

en jaune

Note 1 à l’article: Les principales caractéristiques pour l’identification sont les suivantes: croissance sur milieu

sélectif spécifique, catalase positive, coagulase positive.

Note 2 à l’article: Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène opportuniste chez l’homme qui peut également

souvent être présente sur la peau d’individus sains chez lesquels elle n’engendre apparemment aucune maladie.

C’est un micro-organisme spécifié dont la présence est indésirable dans les produits cosmétiques.

3.6.4
Candida albicans

levure qui forme des colonies convexes et d’aspect crémeux, de couleur blanche à beige, à la surface

d’un milieu gélosé non sélectif

Note 1 à l’article: Les principales caractéristiques pour l’identification sont la production de filaments et/ou de

pseudomycélium et de chlamydospores, lorsque l’essai est réalisé conformément à la méthode spécifiée dans le

présent document.
3.7
micro-organisme non spécifié

levure ou bactérie aérobie mésophile trouvée dans des produits cosmétiques, non définie en 3.6

3.8
bouillon d’enrichissement

milieu liquide non sélectif contenant des neutralisants et/ou agents dispersants appropriés et

démontrés comme étant applicables pour le produit (3.1) soumis à essai
4 Principes

La première étape du mode opératoire est de procéder à l’enrichissement en utilisant un milieu liquide

non sélectif pour augmenter le nombre de micro-organismes, sans risque d’inhibition par les ingrédients

sélectifs présents dans les milieux de culture sélectifs/différentiels.

Les étapes suivantes (isolement et identification) sont réalisées en fonction des besoins, en utilisant des

conditions appropriées d’incubation et des essais d’identification appropriés, tels que décrits dans le

présent document.

L’inhibition potentielle de la croissance microbienne par l’échantillon doit être neutralisée pour

[9]

permettre la détection de micro-organismes viables. Dans tous les cas et quelle que soit la méthode

[9]

utilisée, la neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit doit être vérifiée et démontrée

[10][11]
5 Diluants et milieux de culture
5.1 Généralités

Les instructions générales sont indiquées dans l’ISO 21148. Lorsque de l’eau est mentionnée dans ce

document, utiliser de l’eau distillée ou purifiée tel qu’indiqué dans l’ISO 21148.

Le bouillon d’enrichissement sert à disperser l’échantillon et à accroître la population microbienne

initiale. Il peut contenir des agents neutralisants si l’échantillon à soumettre à essai possède des

propriétés antimicrobiennes. L’efficacité de la neutralisation doit être démontrée (voir Article 11).

L’Annexe C fournit des informations relatives aux neutralisants appropriés.
© ISO 2017 – Tous droits réservés 3
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ISO 18415:2017(F)

Le bouillon d’enrichissement (5.3.2.1) ou tout bouillon parmi ceux listés dans l’Annexe B est applicable

pour vérifier la présence de micro-organismes spécifiés et non spécifiés conformément au présent

document, à condition qu’il ait été démontré comme étant applicable conformément à l’Article 11.

D’autres diluants et d’autres milieux de culture peuvent être utilisés s’il a été démontré qu’ils sont

applicables pour cet usage.
5.2 Diluant pour la suspension microbienne (solution tryptone sel)
5.2.1 Généralités

Le diluant est utilisé pour la préparation des suspensions bactériennes et de levure utilisées pour le

mode opératoire de l’essai d’applicabilité (voir Article 11).
5.2.2 Composition
Tryptone, hydrolysat pancréatique de caséine 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.3 Préparation

Dissoudre les composants dans l’eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients

appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être

de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.3 Milieux de culture
5.3.1 Généralités

Les milieux de culture peuvent être préparés comme indiqué ci-dessous ou à partir de milieux de

culture déshydratés conformément aux instructions du fabricant.

Il est permis d’utiliser des milieux prêts à l’emploi quand leur composition et/ou leurs performances de

croissance sont comparables à celles des formules indiquées ici.
5.3.2 Bouillon d’enrichissement
5.3.2.1 Bouillon Eugon LT100
5.3.2.1.1 Généralités

Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans

l’échantillon (lécithine et polysorbate 80); et un agent de dispersion (octoxynol 9).

5.3.2.1.2 Composition
Hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g
Hydrolysat papaïque de soja 5,0 g
L-cystine 0,7 g
Chlorure de sodium 4,0 g
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ISO 18415:2017(F)
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’œuf 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
Eau 1 000 ml
5.3.2.1.3 Préparation

Dissoudre successivement dans l’eau bouillante le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf

jusqu’à dissolution complète. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant.

Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après

stérilisation, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.

5.3.2.2 Autres bouillons d’enrichissement

D’autres bouillons d’enrichissement peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe B).

5.3.3 Milieu gélosé non sélectif
5.3.3.1 Généralités

Ce milieu est utilisé pour l’isolement et la détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés,

présents dans la suspension initiale après l’enrichissement et pour la préparation de l’inoculum utilisé

pour l’essai
...