ISO 21571:2005/Amd 1:2013

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Status
Published
Publication Date
06-Mar-2013
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
12-Feb-2013
Completion Date
07-Mar-2013
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ISO 21571:2005/Amd 1:2013
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ISO 21571:2005/Amd 1:2013
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21571
First edition
2005-02-15
AMENDMENT 1
2013-03-15
Foodstuffs — Methods of analysis for
the detection of genetically modified
organisms and derived products —
Nucleic acid extraction
AMENDMENT 1
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Extraction des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Reference number
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

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written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International

Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.

Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies

casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

Amendment 1 to ISO 21571:2005 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,

Subcommittee SC 16, Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
© ISO 2013 – All rights reserved iii
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Nucleic acid extraction
AMENDMENT 1
Page v, Introduction
Delete the reference to ISO 21568.
Replace the reference to ISO 24276 with the following:

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — General requirements and definitions
Page 1, Clause 2
Replace the reference to ISO 24276:—with the following:

ISO 24276:2006, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms

and derived products — General requirements and definitions
Delete the reference to Footnote 1) and the footnote itself.
Delete the reference to ISO 21568.
Page 2, 5.1.1, paragraph 3, line 2

Delete “(e.g. 3 000 particles at an LOD of 0,1 %) to allow a statistically valid conclusion to be made

(see ISO 21568)”.
Page 3, 5.1.2, paragraph 1, line 2

Replace “procedures described in ISO 24276” by “laboratory design specified in ISO 24276:2006, 5.3.2”.

Page 3, 5.1.2, paragraph 2

Replace by: “Laboratory samples shall be sufficiently homogeneous before reducing or grinding and

before taking the test portion.”
Page 3, 5.1.2, paragraph 4, lines 3 and 6
Delete “as specified in ISO 21568” and “as defined ISO 21568”.
Page 3, 5.1.2, paragraph 8, 1st sentence
© ISO 2013 – All rights reserved 1
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
Replace by “After such treatment, homogenize the whole laboratory sample.”
Page 4, 5.2.1
After paragraph 7, beginning “Re-suspend ...”, insert an example as follows:

EXAMPLE A tris/EDTA (TE, 1× or 0,1×) buffer adjusted to pH 8,0 is appropriate for re-suspending or diluting

DNA.
Page 5, 5.3.1, paragraph 1
Add a new final sentence:

The total amount of DNA used in the PCR should be determined as well as the total amount of target

taxon DNA shall be considered, as non-target taxon DNA can affect the efficiency of the PCR.

Page 6,Clause 6, paragraph 2

Replace the phrase in parentheses by: “(e.g. if the analysis to be performed is PCR, the quality of the

extracted DNA should be assessed using adequate PCR controls).”
Page 9, A.1.1.6.5
2) 1)
Replace by and renumber the footnote.
Page 10, A.1.1.8
3) 2)
Replace by and renumber the footnote.
Page 19, A.1.4.2

Delete paragraph 2: “This method applied to microbial pellets or mycelium mats has been submitted for

[17]
interlaboratory validation exercises .”
Page 33, after A.5.1.8, add A.5.2
A.5.2 Guanidine chloroform method: Protocol for soybean lecithin
A.5.2.1 Purpose, relevance and scientific basis

Soybean lecithin is a frequent ingredient and is used in many food products as an emulsifier. Soybean

lecithin can be either produced using genetically modified (GM) or non-modified soybeans. The method

described here can be used to extract DNA present in the sample in order to perform subsequent PCR

analyses for detection of genetically modified DNA sequences derived from GM soybeans.

The method is based on Reference [44], and a very similar procedure has been validated in a collaborative

trial in Switzerland. In that study, for the purpose of interpretation, the quantity of extracted DNA was

spectrometrically determined (Reference [35], section 1.3). The Chemical and Veterinary Institute

Freiburg, Germany, conducted an additional collaborative trial with 12 participating laboratories where

the amount of extractable and amplifiable soybean DNA was determined by means of quantitative real-

time PCR. For the results, see Reference [45].
2 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
A.5.2.2 Scope

This method describes a procedure for DNA extraction from soybean lecithins in raw and cold-pressed

vegetable oils, respectively. If the DNA content of the sample material is low, the real-time PCR approach

is used for quantitation of the amount of DNA isolated from a test portion and for the calculation of the

practical limit of detection achievable in PCR analysis of the extracted DNA, respectively.

A.5.2.3 Validation status and performance criteria
A.5.2.3.1 Validation criteria

The method described in this subclause has been validated in a collaborative trial by determining

the quantity of extractable, amplifiable soybean DNA by means of quantitative real-time PCR. The

collaborative study was performed in accordance with the IUPAC protocol (Rererence [46]).

A.5.2.3.2 Robustness of the method

The method has been routinely used in enforcement and private GMO testing laboratories in Germany and

Switzerland for more than 10 years and no problems have been reported. Although specific robustness

data (e.g. by modifying method parameters) are not available, the experiences of the laboratories showed

that small variations in conditions does not interfere with the performance of the method.

A.5.2.3.3 Intralaboratory trial

The materials used in the collaborative trial study were tested in the method developers’ laboratory

regarding the intralaboratory precision of the method.

For estimation of the precision, five DNA extractions from each of five soybean lecithins were prepared

and measured by real-time PCR under repeatability conditions using a soybean lectin gene specific

[41]
method according to ISO 21570:2005, C.2. The results are given in Table A.6.

Table A.6 — Intralaboratory validation of the DNA extraction method with five soybean lecithin

samples (n = 5 extractions each)
Repeatability standard devia- Coefficient of variation of
Lecithin sample
Mean lectin copy No. tion, s repeatability, C
r V, r
No.
copy No. %
1 20 464 5 367 26
2 3 203 620 19
3 2 005 306 15
4 6 978 331 5
5 14 8 61

Prior to the collaborative trial, DNA was extracted from five commercial soybean lecithins and tested for

PCR inhibition. The DNA prepared from each sample was further diluted using TE buffer (1 volume DNA

diluted with 4 volumes of TE; 1 volume of first DNA dilution diluted with 4 volumes of TE, 1 volume of

second DNA dilution diluted with 4 volumes of TE). The difference between the calculated (extrapolated)

C -value of the undiluted DNA sample and the measured C -value of each DNA dilution was below 0,1,

t t
showing that DNA preparations were free of PCR-inhibitors.
A.5.2.3.4 Collaborative trial

A collaborative trial (validation study) was carried out in 12 laboratories (Reference [45]). Five

commercial soybean lecithin samples were used. Each laboratory received 15 coded samples and a

standard DNA for calibration. The samples were distributed in a way that each participant received

three identical samples of each of the five soybean lecithins. A single DNA extraction was performed per

© ISO 2013 – All rights reserved 3
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)

sample by each laboratory. The returned results were assigned to the five different lecithin samples for

evaluation of the collaborative trial.

The extracted DNAs were tested in a real-time PCR amplifying a DNA sequence of the soybean lectin

[41]

gene according to the method in ISO 21570:2005, C.2. Standard-DNA for calibration was prepared

from soybean flour [ERM BF410a ] by using the Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden/Germany) starting

with a CTAB extraction (see A.3). The concentration of DNA was estimated fluorimetrically with

the PicoGreen dsDNA method (Reference [17]). DNA-standards were defined by the copy number

(cp) of haploid genome equivalents per microlitre. For the calculation, a haploid genome mass for

soybean of 1,13 pg was assumed. A dilution series was prepared ranging from about 50 000 cp/5 µl

to 80 cp/5 µl. Seven laboratories used ABI real-time PCR equipment (ABI 7000, 7500, 7700), and five

laboratories used the Light Cycler (Roche) with the following modifications to the protocol described

[41]

in ISO 21570:2005, C.2: PCR was performed in a 20 µl final volume containing QuantiTect Probe PCR

Master Mix (Qiagen), primers GM1-F and GM1-R at 500 nmol/l each and 150 nmol/l of probe GM1. Real-

time PCR program was: initial step with 900 s at 95 °C, then 45 cycles with 10 s at 95 °C, 30 s at 60 °C

and 30 s at 72 °C. Fluorescence signal acquisition was done within the elongation step. The temperature

ramping rate was set to 2°C/s.

As a criterion for the suitability of the method, the practical limit of detection, LOD , for genetically

prac

modified soya was determined in accordance with ISO 24276. The value was calculated individually for

each sample using Formula (A.1):
LOD
abs
LOD %= ×100 (A.1)
prac
s, DNA
where

LOD is the LOD of the event-specific real-time PCR method used for quantitation, in copies

abs
per PCR;
NOTE For the calculations in Table A.7, an LOD of 10 copies is assumed.

c is the amount of amplifiable soybean DNA in the sample, in copies per PCR, determined

s, DNA
by means of real-time PCR method specific for a soybean reference gene.

Table A.7 summarizes the results of the collaborative trial. In four out of five lecithin samples, mean

values of LOD below 0,9 % (example for an existing legislative threshold) were obtained. For lecithin

prac

sample 2, the LOD was above 0,9 % in only one laboratory, for lecithin sample 3 in two laboratories.

prac

For the lecithin sample 5, all laboratories amplified fewer than 80 copies of the lectin gene, and thus an

LOD of 0,9 % or less could not be achieved. In addition, the coefficient of variation of reproducibility

prac

for the lectin copy numbers reported for the five lecithin samples were calculated. In total, real-time

PCR data of 36 extractions per lecithin sample were used for the evaluation. No outliers were eliminated

for the calculations of the coefficient of variation of reproduciblity, C . Precision data for sample 5

V, R

cannot be given because of the low amount of lectin copies below the LOQ of the method. It is noted, that

the precision data reflect the coefficient of variation of reproducibility of the copy numbers extracted

from the lecithin samples under reproducibility conditions in the collaborative trial.

1) Product available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and

does not constitute an endorsement of this product by ISO. Equivalent products may be used if they can be shown to

lead to the same results.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
Table A.7 — Summary of the validation data
Coefficient of
variation of Mean practical limit No. laboratories
Lecithin sample Mean lectin copy
reproducibility, of detection, LOD with
prac
No. No.
C % LOD < 0,9 %
V, R prac
1 17 044 67 0,06 12/12
2 3 630 63 0,28 11/12
3 2 318 57 0,43 10/12
4 8 325 52 0,12 12/12
5 <80 not determined >10 0/12
A.5.2.4 Principle and summary

Viscous sample material is homogenized after heating and extracted with hexane after addition of a

guanidine thiocyanate buffer. Interfering accompanying substances are separated by extraction with

chloroform, and the RNA present in the solution is digested with RNase A. The DNA is precipitated

with isopropanol in the presence of glycogen, then washed with ethanol and dissolved in water. For

purification of the DNA, a subsequent gel filtration step (using a cross-linked dextran gel for size

exclusion chromatography) is carried out.
A.5.2.5 Terms and definitions
[43]
For the purposes of this sub
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21571
Première édition
2005-02-15
AMENDEMENT 1
2013-03-15
Produits alimentaires — Méthodes
d’analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Extraction
des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction
AMENDMENT 1
Numéro de référence
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives

ISO/CEI, Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de

Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.

Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités

membres votants.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de

ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L’Amendement 1 à l’ISO 21571:2005 a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,

sous-comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la
détection des organismes génétiquement modifiés et des
produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Page v, Introduction
Supprimer la référence à l’ISO 21568.
Remplacer la référence à l’ISO 24276 par ce qui suit:

ISO 24276:2006, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes

génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions

Page 1, Article 2
Remplacer la référence à l’ISO 24276:— par ce qui suit:

ISO 24276:2006, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes

génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions

Supprimer la référence à la note de bas de page 1) ainsi que la note de bas de page elle-même.

Supprimer la référence à l’ISO 21568.
Page 3, 5.1.1, alinéa 2, ligne 2

Supprimer «par exemple 3 000 particules pour une limite de détection de 0,1 %, afin de permettre une

analyse statistiquement valable (voir l’ISO 21568)».
Page 3, 5.1.2, alinéa 1, ligne 2

Remplacer «conformément aux procédures décrites dans l’ISO 24276» par «conformément à la conception

du laboratoire spécifiée dans l’ISO 24276:2006, 5.3.2».
Page 3, 5.1.2, alinéa 2

Remplacer le texte existant par «Les échantillons de laboratoire doivent être suffisamment homogènes

avant de les réduire ou broyer et avant de prélever la prise d’essai.»
Page 3, 5.1.2, alinéa 4, lignes 4 et 7
Supprimer «conformément à l’ISO 21568».
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
Page 3, 5.1.2, alinéa 8

Remplacer la première phrase par «Après ce traitement, homogénéiser l’ensemble de l’échantillon de

laboratoire.»
Page 5, 5.2.1, alinéa 7

Après la phrase «Remettre l’ADN en solution dans l’eau ou dans une solution tampon qui évite la

dégradation de l’ADN», insérer un exemple comme suit:

EXEMPLE Un tampon tris/EDTA (TE, 1× ou 0,1×) ajusté à pH 8,0 est approprié pour remettre l’ADN en

solution ou le diluer.
Page 5, 5.3.1, alinéa 1
Ajouter une nouvelle phrase à la fin de l’alinéa:

«Il convient de déterminer la quantité totale d’ADN utilisé pour la PCR. La quantité totale d’ADN

taxonomique cible doit également être considérée car l’ADN taxonomique non cible peut affecter le

rendement de la PCR.»
Page 6, Article 6, alinéa 2

Remplacer la phrase entre parenthèses par «(par exemple si l’analyse à effectuer est une PCR, il convient

d’évaluer la qualité de l’ADN extrait en utilisant des contrôles PCR appropriés).»

Page 10, A.1.1.6.5
2) 1)
Remplacer par et renuméroter la note de bas de page.
Page 11, A.1.1.8
3) 2)
Remplacer par et renuméroter la note de bas de page.
Page 20, A.1.4.2, alinéa 2

Supprimer la phrase: «Cette méthode appliquée aux fragments microbiens ou aux couches de mycélium

[17]
a été soumise à des essais de validation interlaboratoires .»
Page 35, après A.5.1.8, ajouter A.5.2
A.5.2 Méthode à la guanidine - chloroforme: protocole pour lécithine de soja
A.5.2.1 Objectif, pertinence et base scientifique

La lécithine de soja est un ingrédient couramment utilisé dans de nombreux produits alimentaires

comme émulsifiant. Elle peut être produite en utilisant du soja génétiquement modifié (GM) ou non. La

méthode décrite ici permet d’extraire l’ADN présent dans l’échantillon afin de procéder à des analyses

ultérieures par PCR pour détecter les séquences d’ADN génétiquement modifiées dérivées de sojas GM.

La méthode est fondée sur la Référence [44], et un mode opératoire très similaire a été validé dans

le cadre d’un essai interlaboratoires réalisé en Suisse. Lors de cette étude, la quantité d’ADN extrait a

été déterminée par spectrométrie (Référence [35], section 1.3) à des fins d’interprétation. L’Institut

chimique et vétérinaire de Fribourg (Allemagne) a réalisé un essai interlaboratoires complémentaire

2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)

avec 12 laboratoires participants et la quantité d’ADN de soja extractible et amplifiable a été déterminée

par une PCR quantitative en temps réel. Pour les résultats, voir la Référence [45].

A.5.2.2 Domaine d’application

Cette méthode décrit un mode opératoire pour extraire l’ADN des lécithines de soja des huiles végétales

brutes et pressées à froid. Si la teneur en ADN de l’échantillon est faible, la technique de PCR en temps

réel est utilisée pour quantifier l’ADN isolé à partir d’une prise d’essai, et pour calculer la limite de

détection pratique qui peut être obtenue lors de l’analyse par PCR de l’ADN extrait.

A.5.2.3 État de validation et critères de performance
A.5.2.3.1 Critères de validation

La méthode décrite dans le présent paragraphe a été validée dans le cadre d’un essai interlaboratoires

en déterminant la quantité d’ADN de soja extractible et amplifiable par une PCR quantitative en temps

réel. L’étude interlaboratoires a été réalisée selon le protocole IUPAC (Référence [46]).

A.5.2.3.2 Robustesse de la méthode

La méthode a été utilisée en routine pendant plus de 10 ans dans les laboratoires privés d’essais sur

les OGM et les laboratoires de contrôle allemands et suisses, et aucun problème n’a été rapporté. Bien

qu’aucune donnée spécifique sur la robustesse (par exemple en modifiant les paramètres de la méthode)

ne soit disponible, les expériences des laboratoires ont montré que de faibles variations des conditions

n’affectent pas les performances de la méthode.
A.5.2.3.3 Essai intralaboratoire

Les matériels utilisés dans le cadre de l’essai interlaboratoires ont été soumis à essai dans le laboratoire

des développeurs de la méthode afin de déterminer la fidélité intralaboratoire de la méthode.

Pour estimer la fidélité de la méthode, cinq extractions d’ADN de chacune des cinq lécithines de soja

ont été réalisées et mesurées par PCR en temps réel dans des conditions de répétabilité, en utilisant

[41]

une méthode spécifique aux gènes de lécithine de soja, conformément à l’ISO 21570:2005 , C.2. Les

résultats sont indiqués dans le Tableau A.6.

Tableau A.6 — Validation intralaboratoire de la méthode d’extraction d’ADN avec cinq

échantillons de lécithine de soja (n = 5 extractions chacun)
Écart-type de répétabilité, s Coefficient de variation de
Échantillon de Nombre moyen de
répétabilité, C
V,r
lécithine n ° copies de lectine
nombre de copies %
1 20 464 5 367 26
2 3 203 620 19
3 2 005 306 15
4 6 978 331 5
5 14 8 61

Avant l’essai interlaboratoires, l’ADN a été extrait de cinq lécithines de soja du commerce et l’effet

inhibiteur de PCR a été soumis à essai. L’ADN préparé à partir de chaque échantillon a été dilué dans un

tampon TE (1 volume d’ADN dilué dans 4 volumes de TE; 1 volume de première dilution d’ADN dilué dans

4 volumes de TE, 1 volume de seconde dilution d’ADN dilué dans 4 volumes de TE). Les préparations

d’ADN étaient exemptes d’inhibiteurs de PCR car il s’est avéré que la différence entre la valeur C calculée

(extrapolée) de l’échantillon non dilué d’ADN et la valeur C mesurée de chaque préparation d’ADN était

inférieure à 0,1.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 3
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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.2.3.4 Essai interlaboratoires

Un essai interlaboratoires (étude de validation) a été réalisé dans 12 laboratoires (Référence [45]). Cinq

échantillons de lécithine de soja du commerce ont été utilisés. Chaque laboratoire a reçu 15 échantillons

codés et un étalon d’ADN pour l’étalonnage. Les échantillons ont été répartis de manière que chaque

participant reçoive trois échantillons identiques de chacune des cinq lécithines de soja. Chaque

laboratoire a réalisé une seule extraction d’ADN par échantillon. Les résultats remis ont été affectés aux

cinq échantillons différents de lécithine pour l’évaluation de l’essai interlaboratoires.

Les ADN extraits ont été soumis à essai par PCR en temps réel en amplifiant une séquence d’ADN du

[41]

gène de lectine de soja conformément à la méthode l’ISO 21570:2005 , C.2. L’étalon d’ADN pour

l’étalonnage a été préparé à partir de farine de soja [ERM BF410a ] en utilisant le Plant Mini Kit

(Qiagen, Hilden/Allemagne) et en débutant par une extraction au CTAB (voir A.3). La concentration

d’ADN a été estimée par la méthode de fluorométrie PicoGreen dsDNA (Référence [17]). Les étalons

d’ADN ont été définis par le nombre de copies (cp) en équivalents génome haploïde par microlitre. Pour

les calculs, la masse supposée de génome haploïde du soja était de 1,13 pg. Une série de dilutions a été

réalisée, variant de 50 000 cp/5 µl environ à 80 cp/5 µl. Sept laboratoires ont utilisé des équipements de

3) 3)

PCR en temps réel ABI (ABI 7000, 7500, 7700), et cinq laboratoires ont utilisé le Light Cycler (Roche)

[41]

en apportant les modifications suivantes au protocole décrit dans l’ISO 21570:2005 , C.2: la PCR a été

réalisée dans un volume final de 20 µl contenant le mélange maître PCR QuantiTect Probe (Qiagen), les

amorces GM1-F et GM1-R à 500 nmol/l chacune et 150 nmol/l de sonde GM1. Le programme de PCR en

temps réel était: étape initiale de 900 s à 95 °C, puis 45 cycles de 10 s à 95 °C, 30 s à 60 °C et 30 s à 72 °C.

Les signaux de fluorescence ont été acquis à l’étape d’élongation. La vitesse de la rampe de température

était fixée à 2 °C/s.

Pour vérifier l’adéquation de la méthode, la limite de détection pratique, LOD , a été déterminée pour

prac

le soja génétiquement modifié, conformément à l’ISO 24276. La valeur a été calculée individuellement

pour chaque échantillon à l’aide de la Formule (A.1):
LOD
abs
LOD %= ×100 (A.1)
prac
s, DNA

LOD est la LOD de la méthode PCR en temps réel spécifique à l’événement et utilisée pour la

abs
quantification, en copies par PCR;
NOTE Pour les calculs du Tableau A.7, une LOD de 10 copies est supposée.

c est la quantité d’ADN de soja amplifiable dans l’échantillon, en copies par PCR,

s, DNA
déterminée par la méthode PCR en temps réel spécifique à un gène de référence du
soja.

Le Tableau A.7 récapitule les résultats de l’essai interlaboratoires. Dans quatre échantillons de lécithine

sur cinq, des valeurs moyennes de LOD inférieures à 0,9 % (exemple pour un seuil législatif en

prac

vigueur) ont été obtenues. Pour l’échantillon de lécithine n° 2, la LOD était supérieure à 0,9 % dans

prac

un seul laboratoire, pour l’échantillon de lécithine n° 3 dans deux laboratoires. Pour l’échantillon de

lécithine n° 5, tous les laboratoires ont amplifié moins de 80 copies du gène de lectine et, par conséquent,

une LOD inférieure ou égale à 0,9 % n’a pas pu être obtenue. De plus, les coefficients de variation de

prac

reproductibilité ont été calculés pour les nombres de copies de lectine rapportés pour les cinq échantillons

de lécithine. Au total, les données de PCR en temps réel de 36 extractions par échantillon de lécithine

ont été utilisées pour l’évaluation. Aucune valeur aberrante n’a été éliminée pour calculer le coefficient

de variation de reproductibilité, C . Pour l’échantillon n° 5, aucune donnée concernant la fidélité n’a pu

V,R

être déterminée en raison de la faible quantité de copies de lectine inférieures à la LOQ de la méthode.

Il faut noter que les données relatives à la fidélité reflètent le coefficient de variation de reproductibilité

3) Produit disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent

document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.

Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.

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ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)

des nombres de copies extraites des échantillons de lécithine, dans les conditions de reproductibilité de

l’essai interlaboratoires.
Tableau A.7 — Résumé des données de validation
Coefficient de Limite de détec-
variation de repro- tion pratique Nombre de labora-
Échantillon de léci- Nombre moyen de
ductibilité moyenne toires avec
thine n ° copies de lectine
C LOD LOD < 0,9 %
V,R prac prac
% %
1 17 044 67 0,06 12/12
2 3 630 63 0,28 11/12
3 2 318 57 0,43 10/12
4 8 325 52 0,12 12/12
5 <80 non déterminé >10 0/12
A.5.2.4 Principe et résumé

L’échantillon visqueux est homogénéisé après chauffage et extrait à l’aide d’hexane après addition d’un

tampon de thiocyanate de guanidine. Les substances susceptibles de perturber l’analyse sont séparées

par extraction à l’aide de chloroforme, et l’ARN présent dans la solution est digéré par la RNase A. L’ADN

est précipité à l’isopropanol en présence de glycogène, puis rincé à l’éthanol et dissout dans de l’eau.

Pour la purification de l’ADN, une étape ultérieure de filtration sur gel est réalisée (en utilisant un gel de

dextrane réticulé pour chromatographie d’exclusion stérique).
A.5.2.5 Termes et définitions
[43]

Pour les besoins du présent paragraphe, les termes et définitions donnés dans l’ISO 5725

...

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