ISO 21571:2005/Amd 1:2013
(Amendment)Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction — Amendment 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction — Amendment 1
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques — Amendement 1
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 21571
Первое издание
2005-02-15
АМЕNDMENT 1
2013-03-15
Продукты пищевые. Методы анализа
для обнаружения генетически
модифицированных организмов и
полученных из них продуктов.
Экстракция нуклеиновых кислот
ИЗМЕНЕНИЕ 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Nucleic acid extraction
AMENDMENT 1
Ответственность за подготовку русской версии несѐт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьѐй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(R)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(R)
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2013
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright @ iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, то
ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами Директив ISO/IEC,
Часть 2.
Основная задача технических комитетов заключается в подготовке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-
членам на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения
не менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. ISO не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного
или всех патентных прав.
Изменение 1 к ISO 21571:2005 подготовлено Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты,
Подкомитетом SC 16 Горизонтальные методы молекулярного анализа с помощью биомаркеров.
© ISO 2013 — Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(R)
Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения
генетически модифицированных организмов и полученных
из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот
ИЗМЕНЕНИЕ 1
Страница v, Введение
Исключить ссылку на ISO 21568.
Заменить ссылку на ISO 24276 следующей:
ISO 24276, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически
модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и
определения
Страница 1, Раздел 2
Заменить ссылку на ISO 24276 следующей:
ISO 24276:2006, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически
модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и
определения
Исключить ссылку на Сноску 1) и саму сноску.
Исключить ссылку на ISO 21568.
Страница 3, 5.1.1, абзац 3, строка 2
Исключить фразу "(например, 3 000 частиц на LOD 0,1 %), чтобы можно было сделать статистически
обоснованный вывод (см. ISO 21568)".
Страница 3, 5.1.2, абзац 1, строка 2
Заменить фразу "методиками, описанными в ISO 24276" на "проектированием лаборатории,
установленным в ISO 24276:2006, 5.3.2‖.
Страница 3, 5.1.2, абзац 2
Заменить на фразу: ―Лабораторные пробы должны быть достаточно гомогенными перед их
сокращением или размолом и отбором пробы для анализа.‖
Страница 4, 5.1.2, абзац 4, строки 4 и 7
Исключить фразы ―как установлено в ISO 21568‖ и ―как определено в ISO 21568‖.
© ISO 2013 — Все права сохраняются
1
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(R)
Страница 4, 5.1.2, абзац 8, 1-ое предложение
Заменить на фразу ―После такой обработки гомогенизируют всю лабораторную пробу."
Страница 5, 5.2.1
После абзаца 7, который начинается с фразы "Повторно суспендируют ." вставить следующий
пример:
ПРИМЕР Буфер tris/EDTA (TE, 1× или 0,1×), отрегулированный до значения pH 8,0 пригоден для
повторного суспендирования или разбавления ДНК.
Страница 6, 5.3.1, абзац 1
Добавить в конце новое предложение:
Следует определить общее количество ДНК, используемой в ПСР, а также необходимо учитывать
общее количество целевого таксона ДНК, поскольку нецелевой таксон ДНК может оказывать
влияние на эффективность ПСР.
Страница 8, Раздел 6, абзац 2
Заменить фразу в скобках на: ―(например, если выполняемый анализ представляет собой реакцию
ПСР, качество экстрагированной ДНК следует оценивать, используя соответствующие контроли ПСР).‖
Страница 11, A.1.1.6.5
2) 1)
Заменить сноску на сноску и перенумеровать ее.
Страница 12, A.1.1.8
3) 2)
Заменить сноску на сноску и перенумеровать ее.
Страница 23, A.1.4.2
Исключить абзац 2: ―Этот метод, примененный к микробиологическим осадкам после
[17]
центрифугирования и мицелиальной пленке, был подвергнут международной проверке .‖
Страница 41, после A.5.1.8 добавить A.5.2
A.5.2 Метод на основе гуанидина и хлороформа: Протокол для соевого лецитина
A.5.2.1 Назначение, релевантность и научная основа
Соевый лецитин является часто встречающимся компонентом, который используется во многих
пищевых продуктах в качестве эмульгатора. Соевый лецитин можно получить, используя либо
генетически модифицированные (GM), либо генетически немодифицированные соевые бобы.
Описанный здесь метод можно использовать для экстракции присутствующей в пробе ДНК, чтобы
выполнить последовательные анализы ПСР для обнаружения генетически модифицированных
последовательностей ДНК, полученных из генетически модифицированных соевых бобов.
Настоящий метод основан на Ссылке [44], а аналогичная методика была валидирована в ходе
совместных испытаний, проведенных в Швейцарии. В этом исследовании с целью интерпретации
результатов испытания количество экстрагированной ДНК было определено спектрометрическим
методом (Ссылка [35], раздел 1.3). Институт химии и ветеринарии (Фрейбург, Германия) провел
© ISO 2013 — Все права сохраняются
2
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(R)
дополнительные совместные испытания с участием 12 лабораторий, в которых количество
экстрагируемой и амплифицируемой ДНК соевых бобов было определено с помощью количественного
анализа методом ПСР в реальном времени. Относительно результатов — см. Ссылку [45].
A.5.2.2 Область применения
Данный метод описывает методику экстрагирования ДНК из соевых лецитинов растительных сырых
масел и масел однократного прессования соответственно. В том случае, если содержание ДНК в
пробе низкое, то метод ПСР в реальном времени используют для количественного определения ДНК,
выделенной из пробы для анализа, и для расчета фактического предела детектирования
экстрагированной ДНК, который может быть реально достигнут при анализе методом ПСР,
соответственно.
A.5.2.3 Статус валидации и характеристики рабочих параметров
A.5.2.3.1 Критерии валидации
Метод, описанный в этом подразделе, был валидирован в ходе совместных испытаний по
определению количества экстрагируемой и амплифицируемой ДНК сои с применением
количественного анализа методом ПСР в реальном времени. Совместные испытания проводились в
соответствии с протоколом IUPAC (Ссылка [46]).
A.5.2.3.2 Устойчивость метода
Данный метод регулярно использовался надзорными и частными лабораториями по испытанию
генетически модифицированных организмов в Германии и Швейцарии более 10 лет, на протяжении
которых не возникало никаких проблем по его применению. Хотя отсутствуют данные по
специфической устойчивости метода (например, при изменении параметров метода), опыт работы
лабораторий показал, что незначительные изменения условий не влияют на рабочие характеристики
метода.
A.5.2.3.3 Межлабораторные испытания
Материалы, используемые в этих совместных испытаниях, были протестированы в лаборатории
разработчика этого метода для определения его межлабораторной прецизионности.
Для оценки прецизионности метода пять экстрактов ДНК от каждого из пяти соевых лецитинов были
приготовлены и измерены с использованием ПСР в реальном времени в условиях повторяемости с
[41]
помощью метода, специфичного для гена соевого лецитина, в соответствии с ISO 21570:2005, C.2.
Результаты представлены в Таблице A.6.
Таблица A.6 — Данные межлабораторной валидации для метода экстракции ДНК
с использованием пяти проб соевого лецитина (n = 5 экстракций каждой)
Стандартное отклонение Коэффициент вариации
Проба лецитина Среднее число копий
повторяемости, s повторяемости, C
r V, r
№ лецитина
число копий %
1 20 464 5 367 26
2 3 203 620 19
3 2 005 306 15
4 6 978 331 5
5 14 8 61
© ISO 2013 — Все права сохраняются
3
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(R)
До проведения совместных испытаний ДНК была экстрагирована из пяти коммерческих соевых
лецитинов и протестирована на ингибирование реакции ПСР. Экстракты ДНК, приготовленные из каждой
пробы, были затем разбавлены, используя буфер TE (1 объем ДНК, разбавленный 4 объемами буфера
TE; 1 объем первого разведения ДНК, разбавленный 4 объемами буфера TE, 1 объем второго
разведения ДНК, разбавленный 4 объемами буфера TE). Расхождение между расчетным
(экстраполированным) значением C неразбавленной пробы ДНК и измеренным значением C каждого
t t
разведения ДНК было ниже 0,1, что указывает на то, что препараты ДНК не содержали ингибиторов ПСР.
A.5.2.3.4 Совместные испытания
Совместные испытания (испытание на валидацию) были проведены в 12 лабораториях (Ссылка [45]).
Были использованы пять проб коммерческих соевых лецитинов. Каждая лаборатория получила 15
закодированных проб и один стандартный образец ДНК для калибровки. Пробы были распределены
таким образом, что каждый участник получил по три идентичных пробы каждого их пяти соевых
лецитинов. В каждой лаборатории было выполнено по одной экстракции ДНК на пробу. Возвращаемые
результаты были присвоены пяти различным пробам лецитина для оценки совместных испытаний.
Экстрагированная ДНК была протестирована с помощью ПСР в реальном времени, амплифицируя
последовательность ДНК гена соевого лецитина в соответствии с методом, указанным в
[41]
ISO 21570:2005, C.2. Стандартный образец ДНК для калибровки был приготовлен из соевой муки
3)
1)
[ERM BF410a с использованием Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden/Germany), начиная с экстракции CTAB
3)
(см. A.3). Концентрацию ДНК оценивали флуорометрическим методом PicoGreen dsДНК (Ссылка [17]).
Стандартные образцы ДНК определяли по числу копий (cp) эквивалентов гаплоидного генома на
микролитр. Для расчета была принята масса гаплоидного генома сои равная 1,13 пг. Была
приготовлена серия разбавлений в диапазоне от приблизительно 50 000 cp/5 мкл до 80 cp/5 мкл. В
3)
семи лабораториях использовали оборудование ABI для ПСР в реальном времени (ABI 7000, 7500,
3)
7700), а в пяти лабораториях — термоциклер Light Cycler (Roche) с учетом следующих изменений к
[41]
протоколу, описанному в ISO 21570:2005, C.2.Реакция ПСР проводилась в окончательном объеме
20 мкл, содержащем универсальную реакционную смесь для постановки ПСР QuantiTect Probe ПСР
3)
Master Mix (Qiagen), праймеры GM1-F и GM1-R с концентрацией 500 нмоль/л каждого и зонд GM1
концентрацией 150 нмоль/л. Температурно-временная программа ПСР в реальном времени была
следующей: начальная стадия 900 с при 95 °C, затем 45 циклов по 10 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 30 с
при 72 °C. Сигнал флуоресценции был обнаружен на стадии элонгации. Была установлена скорость
изменения температуры 2°C/с.
В качестве критерия пригодности метода был определен фактический предел детектирования, LOD ,
prac
для генетически модифицированной сои в соответствии с ISO 24276. Его значение было рассчитано
отдельно для каждой пробы по Формуле (A.1):
LOD
abs
LOD % Ч100 (A.1)
prac
c
s, DNA
где
LOD значение LOD метода ПСР в реальном времени, специфичного для трансформационного
abs
события, используемого для количественного определения, в копиях на ПСР;
ПРИМЕЧАНИЕ Для расчетов в Таблице A.7 принято значение LOD равное 10 копиям.
c количество амплифицируемой соевой ДНК в пробе, определенное методом ПСР в
s, ДНК
реальном времени, специфичным для референсного гена сои, в копиях на ПСР.
1) Это пример доступного на рынке подходящего продукта. Приведенная информация дана для удобства
пользователей этого международного стандарта и не является подтверждением ISO названного продукта. Можно
использовать эквивалентные продукты, если было продемонстрировано, что их применение приводит к тем же
самым результатам.
© ISO 2013 — Все права сохраняются
4
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(R)
В Таблице A.7 приводятся результаты совместных испытаний. В четырех из пяти проб лецитина были
получены средние значения LOD ниже 0,9 % (пример существующей законодательной пороговой
prac
величины). Для пробы лецитина № 2 значение LOD было выше 0,9 % только в одной лаборатории,
prac
для пробы лецитина № 3 — в двух лабораториях. Для пробы лецитина № 5 во всех лабораторях было
амплифицировано менее 80 копий гена лецитина, поэтому не могло быть достигнуто значение LOD
prac
0,9 % или ниже. Кроме того, были рассчитаны коэффициенты вариации воспроизводимости для
зарегистрированного числа копий лецитина в пяти пробах лецитина. В общем, для оценки были
использованы данные ПСР в реальном времени для 36 экстракций на пробу лецитина. При расчете
коэффициента вариации воспроизводимости, C , не было исключено ни одного выброса. Для пробы
V, R
5 нельзя привести показатели прецизионности из-за низкого количества копий лецитина, которое
менее значения LOQ метода. Необходимо отметить, что показатели прецизионности отображает
коэффициент вариации воспроизводимости числа копий, экстрагированных из проб лецитина в
условиях воспроизводимости при совместных испытаниях.
Таблица A.7 — Данные валидации
Средний
Коэффициент
практический
вариации Число лабораторий
Проба лецитина Среднее число предел
воспроизводимости с
№ копий детектирования,
C LOD < 0,9 %
V, R prac
LOD
prac
%
%
1 17 044 67 0,06 12/12
2 3 630 63 0,28 11/12
3 2 318 57 0,43 10/12
4 8 325 52 0,12 12/12
5 <80 не определен >10 0/12
A.5.2.4 Принцип и резюме
Вязкую пробу гомогенизируют после нагревания и экстрагируют гексаном после добавления буфера
гуанидинтиоцианата. Интеферирующие сопутствующие вещества отделяют путем экстракции
хлороформом, а присутствующая в растворе RNA подвергается деградации рибонуклеазой А. ДНК
осаждают изопропанолом в присутствии гликогена, затем промывают этанолом и растворяют в воде.
Для очистки ДНК выполняют дополнительную гель-фильтрацию (используя гель декстрана с
поперечными сшивками для ситовой эксклюзионной хроматографии).
A.5.2.5 Термины и определения
[43]
Применительно к данному подразделу используют термины и определения, приведенные в ISO 5725-1
и ISO 24276.
A.5.2.6 Тип и количество пробы
Гарантируют, что проба для испыта
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21571
First edition
2005-02-15
AMENDMENT 1
2013-03-15
Foodstuffs — Methods of analysis for
the detection of genetically modified
organisms and derived products —
Nucleic acid extraction
AMENDMENT 1
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Extraction des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Reference number
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Amendment 1 to ISO 21571:2005 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 16, Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Nucleic acid extraction
AMENDMENT 1
Page v, Introduction
Delete the reference to ISO 21568.
Replace the reference to ISO 24276 with the following:
ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — General requirements and definitions
Page 1, Clause 2
Replace the reference to ISO 24276:—with the following:
ISO 24276:2006, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms
and derived products — General requirements and definitions
Delete the reference to Footnote 1) and the footnote itself.
Delete the reference to ISO 21568.
Page 2, 5.1.1, paragraph 3, line 2
Delete “(e.g. 3 000 particles at an LOD of 0,1 %) to allow a statistically valid conclusion to be made
(see ISO 21568)”.
Page 3, 5.1.2, paragraph 1, line 2
Replace “procedures described in ISO 24276” by “laboratory design specified in ISO 24276:2006, 5.3.2”.
Page 3, 5.1.2, paragraph 2
Replace by: “Laboratory samples shall be sufficiently homogeneous before reducing or grinding and
before taking the test portion.”
Page 3, 5.1.2, paragraph 4, lines 3 and 6
Delete “as specified in ISO 21568” and “as defined ISO 21568”.
Page 3, 5.1.2, paragraph 8, 1st sentence
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
Replace by “After such treatment, homogenize the whole laboratory sample.”
Page 4, 5.2.1
After paragraph 7, beginning “Re-suspend .”, insert an example as follows:
EXAMPLE A tris/EDTA (TE, 1× or 0,1×) buffer adjusted to pH 8,0 is appropriate for re-suspending or diluting
DNA.
Page 5, 5.3.1, paragraph 1
Add a new final sentence:
The total amount of DNA used in the PCR should be determined as well as the total amount of target
taxon DNA shall be considered, as non-target taxon DNA can affect the efficiency of the PCR.
Page 6,Clause 6, paragraph 2
Replace the phrase in parentheses by: “(e.g. if the analysis to be performed is PCR, the quality of the
extracted DNA should be assessed using adequate PCR controls).”
Page 9, A.1.1.6.5
2) 1)
Replace by and renumber the footnote.
Page 10, A.1.1.8
3) 2)
Replace by and renumber the footnote.
Page 19, A.1.4.2
Delete paragraph 2: “This method applied to microbial pellets or mycelium mats has been submitted for
[17]
interlaboratory validation exercises .”
Page 33, after A.5.1.8, add A.5.2
A.5.2 Guanidine chloroform method: Protocol for soybean lecithin
A.5.2.1 Purpose, relevance and scientific basis
Soybean lecithin is a frequent ingredient and is used in many food products as an emulsifier. Soybean
lecithin can be either produced using genetically modified (GM) or non-modified soybeans. The method
described here can be used to extract DNA present in the sample in order to perform subsequent PCR
analyses for detection of genetically modified DNA sequences derived from GM soybeans.
The method is based on Reference [44], and a very similar procedure has been validated in a collaborative
trial in Switzerland. In that study, for the purpose of interpretation, the quantity of extracted DNA was
spectrometrically determined (Reference [35], section 1.3). The Chemical and Veterinary Institute
Freiburg, Germany, conducted an additional collaborative trial with 12 participating laboratories where
the amount of extractable and amplifiable soybean DNA was determined by means of quantitative real-
time PCR. For the results, see Reference [45].
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
A.5.2.2 Scope
This method describes a procedure for DNA extraction from soybean lecithins in raw and cold-pressed
vegetable oils, respectively. If the DNA content of the sample material is low, the real-time PCR approach
is used for quantitation of the amount of DNA isolated from a test portion and for the calculation of the
practical limit of detection achievable in PCR analysis of the extracted DNA, respectively.
A.5.2.3 Validation status and performance criteria
A.5.2.3.1 Validation criteria
The method described in this subclause has been validated in a collaborative trial by determining
the quantity of extractable, amplifiable soybean DNA by means of quantitative real-time PCR. The
collaborative study was performed in accordance with the IUPAC protocol (Rererence [46]).
A.5.2.3.2 Robustness of the method
The method has been routinely used in enforcement and private GMO testing laboratories in Germany and
Switzerland for more than 10 years and no problems have been reported. Although specific robustness
data (e.g. by modifying method parameters) are not available, the experiences of the laboratories showed
that small variations in conditions does not interfere with the performance of the method.
A.5.2.3.3 Intralaboratory trial
The materials used in the collaborative trial study were tested in the method developers’ laboratory
regarding the intralaboratory precision of the method.
For estimation of the precision, five DNA extractions from each of five soybean lecithins were prepared
and measured by real-time PCR under repeatability conditions using a soybean lectin gene specific
[41]
method according to ISO 21570:2005, C.2. The results are given in Table A.6.
Table A.6 — Intralaboratory validation of the DNA extraction method with five soybean lecithin
samples (n = 5 extractions each)
Repeatability standard devia- Coefficient of variation of
Lecithin sample
Mean lectin copy No. tion, s repeatability, C
r V, r
No.
copy No. %
1 20 464 5 367 26
2 3 203 620 19
3 2 005 306 15
4 6 978 331 5
5 14 8 61
Prior to the collaborative trial, DNA was extracted from five commercial soybean lecithins and tested for
PCR inhibition. The DNA prepared from each sample was further diluted using TE buffer (1 volume DNA
diluted with 4 volumes of TE; 1 volume of first DNA dilution diluted with 4 volumes of TE, 1 volume of
second DNA dilution diluted with 4 volumes of TE). The difference between the calculated (extrapolated)
C -value of the undiluted DNA sample and the measured C -value of each DNA dilution was below 0,1,
t t
showing that DNA preparations were free of PCR-inhibitors.
A.5.2.3.4 Collaborative trial
A collaborative trial (validation study) was carried out in 12 laboratories (Reference [45]). Five
commercial soybean lecithin samples were used. Each laboratory received 15 coded samples and a
standard DNA for calibration. The samples were distributed in a way that each participant received
three identical samples of each of the five soybean lecithins. A single DNA extraction was performed per
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
sample by each laboratory. The returned results were assigned to the five different lecithin samples for
evaluation of the collaborative trial.
The extracted DNAs were tested in a real-time PCR amplifying a DNA sequence of the soybean lectin
[41]
gene according to the method in ISO 21570:2005, C.2. Standard-DNA for calibration was prepared
1)
3)
from soybean flour [ERM BF410a ] by using the Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden/Germany) starting
with a CTAB extraction (see A.3). The concentration of DNA was estimated fluorimetrically with
3)
the PicoGreen dsDNA method (Reference [17]). DNA-standards were defined by the copy number
(cp) of haploid genome equivalents per microlitre. For the calculation, a haploid genome mass for
soybean of 1,13 pg was assumed. A dilution series was prepared ranging from about 50 000 cp/5 µl
3)
to 80 cp/5 µl. Seven laboratories used ABI real-time PCR equipment (ABI 7000, 7500, 7700), and five
3)
laboratories used the Light Cycler (Roche) with the following modifications to the protocol described
[41]
in ISO 21570:2005, C.2: PCR was performed in a 20 µl final volume containing QuantiTect Probe PCR
3)
Master Mix (Qiagen), primers GM1-F and GM1-R at 500 nmol/l each and 150 nmol/l of probe GM1. Real-
time PCR program was: initial step with 900 s at 95 °C, then 45 cycles with 10 s at 95 °C, 30 s at 60 °C
and 30 s at 72 °C. Fluorescence signal acquisition was done within the elongation step. The temperature
ramping rate was set to 2°C/s.
As a criterion for the suitability of the method, the practical limit of detection, LOD , for genetically
prac
modified soya was determined in accordance with ISO 24276. The value was calculated individually for
each sample using Formula (A.1):
LOD
abs
LOD %= ×100 (A.1)
prac
c
s, DNA
where
LOD is the LOD of the event-specific real-time PCR method used for quantitation, in copies
abs
per PCR;
NOTE For the calculations in Table A.7, an LOD of 10 copies is assumed.
c is the amount of amplifiable soybean DNA in the sample, in copies per PCR, determined
s, DNA
by means of real-time PCR method specific for a soybean reference gene.
Table A.7 summarizes the results of the collaborative trial. In four out of five lecithin samples, mean
values of LOD below 0,9 % (example for an existing legislative threshold) were obtained. For lecithin
prac
sample 2, the LOD was above 0,9 % in only one laboratory, for lecithin sample 3 in two laboratories.
prac
For the lecithin sample 5, all laboratories amplified fewer than 80 copies of the lectin gene, and thus an
LOD of 0,9 % or less could not be achieved. In addition, the coefficient of variation of reproducibility
prac
for the lectin copy numbers reported for the five lecithin samples were calculated. In total, real-time
PCR data of 36 extractions per lecithin sample were used for the evaluation. No outliers were eliminated
for the calculations of the coefficient of variation of reproduciblity, C . Precision data for sample 5
V, R
cannot be given because of the low amount of lectin copies below the LOQ of the method. It is noted, that
the precision data reflect the coefficient of variation of reproducibility of the copy numbers extracted
from the lecithin samples under reproducibility conditions in the collaborative trial.
1) Product available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and
does not constitute an endorsement of this product by ISO. Equivalent products may be used if they can be shown to
lead to the same results.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(E)
Table A.7 — Summary of the validation data
Coefficient of
variation of Mean practical limit No. laboratories
Lecithin sample Mean lectin copy
reproducibility, of detection, LOD with
prac
No. No.
C % LOD < 0,9 %
V, R prac
%
1 17 044 67 0,06 12/12
2 3 630 63 0,28 11/12
3 2 318 57 0,43 10/12
4 8 325 52 0,12 12/12
5 <80 not determined >10 0/12
A.5.2.4 Principle and summary
Viscous sample material is homogenized after heating and extracted with hexane after addition of a
guanidine thiocyanate buffer. Interfering accompanying substances are separated by extraction with
chloroform, and the RNA present in the solution is digested with RNase A. The DNA is precipitated
with isopropanol in the presence of glycogen, then washed with ethanol and dissolved in water. For
purification of the DNA, a subsequent gel filtration step (using a cross-linked dextran gel for size
exclusion chromatography) is carried out.
A.5.2.5 Terms and definitions
[43]
For the purposes of this sub
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21571
Première édition
2005-02-15
AMENDEMENT 1
2013-03-15
Produits alimentaires — Méthodes
d’analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Extraction
des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction
AMENDMENT 1
Numéro de référence
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’Amendement 1 à l’ISO 21571:2005 a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.
© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la
détection des organismes génétiquement modifiés et des
produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Page v, Introduction
Supprimer la référence à l’ISO 21568.
Remplacer la référence à l’ISO 24276 par ce qui suit:
ISO 24276:2006, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
Page 1, Article 2
Remplacer la référence à l’ISO 24276:— par ce qui suit:
ISO 24276:2006, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
Supprimer la référence à la note de bas de page 1) ainsi que la note de bas de page elle-même.
Supprimer la référence à l’ISO 21568.
Page 3, 5.1.1, alinéa 2, ligne 2
Supprimer «par exemple 3 000 particules pour une limite de détection de 0,1 %, afin de permettre une
analyse statistiquement valable (voir l’ISO 21568)».
Page 3, 5.1.2, alinéa 1, ligne 2
Remplacer «conformément aux procédures décrites dans l’ISO 24276» par «conformément à la conception
du laboratoire spécifiée dans l’ISO 24276:2006, 5.3.2».
Page 3, 5.1.2, alinéa 2
Remplacer le texte existant par «Les échantillons de laboratoire doivent être suffisamment homogènes
avant de les réduire ou broyer et avant de prélever la prise d’essai.»
Page 3, 5.1.2, alinéa 4, lignes 4 et 7
Supprimer «conformément à l’ISO 21568».
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
Page 3, 5.1.2, alinéa 8
Remplacer la première phrase par «Après ce traitement, homogénéiser l’ensemble de l’échantillon de
laboratoire.»
Page 5, 5.2.1, alinéa 7
Après la phrase «Remettre l’ADN en solution dans l’eau ou dans une solution tampon qui évite la
dégradation de l’ADN», insérer un exemple comme suit:
EXEMPLE Un tampon tris/EDTA (TE, 1× ou 0,1×) ajusté à pH 8,0 est approprié pour remettre l’ADN en
solution ou le diluer.
Page 5, 5.3.1, alinéa 1
Ajouter une nouvelle phrase à la fin de l’alinéa:
«Il convient de déterminer la quantité totale d’ADN utilisé pour la PCR. La quantité totale d’ADN
taxonomique cible doit également être considérée car l’ADN taxonomique non cible peut affecter le
rendement de la PCR.»
Page 6, Article 6, alinéa 2
Remplacer la phrase entre parenthèses par «(par exemple si l’analyse à effectuer est une PCR, il convient
d’évaluer la qualité de l’ADN extrait en utilisant des contrôles PCR appropriés).»
Page 10, A.1.1.6.5
2) 1)
Remplacer par et renuméroter la note de bas de page.
Page 11, A.1.1.8
3) 2)
Remplacer par et renuméroter la note de bas de page.
Page 20, A.1.4.2, alinéa 2
Supprimer la phrase: «Cette méthode appliquée aux fragments microbiens ou aux couches de mycélium
[17]
a été soumise à des essais de validation interlaboratoires .»
Page 35, après A.5.1.8, ajouter A.5.2
A.5.2 Méthode à la guanidine - chloroforme: protocole pour lécithine de soja
A.5.2.1 Objectif, pertinence et base scientifique
La lécithine de soja est un ingrédient couramment utilisé dans de nombreux produits alimentaires
comme émulsifiant. Elle peut être produite en utilisant du soja génétiquement modifié (GM) ou non. La
méthode décrite ici permet d’extraire l’ADN présent dans l’échantillon afin de procéder à des analyses
ultérieures par PCR pour détecter les séquences d’ADN génétiquement modifiées dérivées de sojas GM.
La méthode est fondée sur la Référence [44], et un mode opératoire très similaire a été validé dans
le cadre d’un essai interlaboratoires réalisé en Suisse. Lors de cette étude, la quantité d’ADN extrait a
été déterminée par spectrométrie (Référence [35], section 1.3) à des fins d’interprétation. L’Institut
chimique et vétérinaire de Fribourg (Allemagne) a réalisé un essai interlaboratoires complémentaire
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
avec 12 laboratoires participants et la quantité d’ADN de soja extractible et amplifiable a été déterminée
par une PCR quantitative en temps réel. Pour les résultats, voir la Référence [45].
A.5.2.2 Domaine d’application
Cette méthode décrit un mode opératoire pour extraire l’ADN des lécithines de soja des huiles végétales
brutes et pressées à froid. Si la teneur en ADN de l’échantillon est faible, la technique de PCR en temps
réel est utilisée pour quantifier l’ADN isolé à partir d’une prise d’essai, et pour calculer la limite de
détection pratique qui peut être obtenue lors de l’analyse par PCR de l’ADN extrait.
A.5.2.3 État de validation et critères de performance
A.5.2.3.1 Critères de validation
La méthode décrite dans le présent paragraphe a été validée dans le cadre d’un essai interlaboratoires
en déterminant la quantité d’ADN de soja extractible et amplifiable par une PCR quantitative en temps
réel. L’étude interlaboratoires a été réalisée selon le protocole IUPAC (Référence [46]).
A.5.2.3.2 Robustesse de la méthode
La méthode a été utilisée en routine pendant plus de 10 ans dans les laboratoires privés d’essais sur
les OGM et les laboratoires de contrôle allemands et suisses, et aucun problème n’a été rapporté. Bien
qu’aucune donnée spécifique sur la robustesse (par exemple en modifiant les paramètres de la méthode)
ne soit disponible, les expériences des laboratoires ont montré que de faibles variations des conditions
n’affectent pas les performances de la méthode.
A.5.2.3.3 Essai intralaboratoire
Les matériels utilisés dans le cadre de l’essai interlaboratoires ont été soumis à essai dans le laboratoire
des développeurs de la méthode afin de déterminer la fidélité intralaboratoire de la méthode.
Pour estimer la fidélité de la méthode, cinq extractions d’ADN de chacune des cinq lécithines de soja
ont été réalisées et mesurées par PCR en temps réel dans des conditions de répétabilité, en utilisant
[41]
une méthode spécifique aux gènes de lécithine de soja, conformément à l’ISO 21570:2005 , C.2. Les
résultats sont indiqués dans le Tableau A.6.
Tableau A.6 — Validation intralaboratoire de la méthode d’extraction d’ADN avec cinq
échantillons de lécithine de soja (n = 5 extractions chacun)
Écart-type de répétabilité, s Coefficient de variation de
r
Échantillon de Nombre moyen de
répétabilité, C
V,r
lécithine n ° copies de lectine
nombre de copies %
1 20 464 5 367 26
2 3 203 620 19
3 2 005 306 15
4 6 978 331 5
5 14 8 61
Avant l’essai interlaboratoires, l’ADN a été extrait de cinq lécithines de soja du commerce et l’effet
inhibiteur de PCR a été soumis à essai. L’ADN préparé à partir de chaque échantillon a été dilué dans un
tampon TE (1 volume d’ADN dilué dans 4 volumes de TE; 1 volume de première dilution d’ADN dilué dans
4 volumes de TE, 1 volume de seconde dilution d’ADN dilué dans 4 volumes de TE). Les préparations
d’ADN étaient exemptes d’inhibiteurs de PCR car il s’est avéré que la différence entre la valeur C calculée
t
(extrapolée) de l’échantillon non dilué d’ADN et la valeur C mesurée de chaque préparation d’ADN était
t
inférieure à 0,1.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.2.3.4 Essai interlaboratoires
Un essai interlaboratoires (étude de validation) a été réalisé dans 12 laboratoires (Référence [45]). Cinq
échantillons de lécithine de soja du commerce ont été utilisés. Chaque laboratoire a reçu 15 échantillons
codés et un étalon d’ADN pour l’étalonnage. Les échantillons ont été répartis de manière que chaque
participant reçoive trois échantillons identiques de chacune des cinq lécithines de soja. Chaque
laboratoire a réalisé une seule extraction d’ADN par échantillon. Les résultats remis ont été affectés aux
cinq échantillons différents de lécithine pour l’évaluation de l’essai interlaboratoires.
Les ADN extraits ont été soumis à essai par PCR en temps réel en amplifiant une séquence d’ADN du
[41]
gène de lectine de soja conformément à la méthode l’ISO 21570:2005 , C.2. L’étalon d’ADN pour
3)
3)
l’étalonnage a été préparé à partir de farine de soja [ERM BF410a ] en utilisant le Plant Mini Kit
(Qiagen, Hilden/Allemagne) et en débutant par une extraction au CTAB (voir A.3). La concentration
3)
d’ADN a été estimée par la méthode de fluorométrie PicoGreen dsDNA (Référence [17]). Les étalons
d’ADN ont été définis par le nombre de copies (cp) en équivalents génome haploïde par microlitre. Pour
les calculs, la masse supposée de génome haploïde du soja était de 1,13 pg. Une série de dilutions a été
réalisée, variant de 50 000 cp/5 µl environ à 80 cp/5 µl. Sept laboratoires ont utilisé des équipements de
3) 3)
PCR en temps réel ABI (ABI 7000, 7500, 7700), et cinq laboratoires ont utilisé le Light Cycler (Roche)
[41]
en apportant les modifications suivantes au protocole décrit dans l’ISO 21570:2005 , C.2: la PCR a été
3)
réalisée dans un volume final de 20 µl contenant le mélange maître PCR QuantiTect Probe (Qiagen), les
amorces GM1-F et GM1-R à 500 nmol/l chacune et 150 nmol/l de sonde GM1. Le programme de PCR en
temps réel était: étape initiale de 900 s à 95 °C, puis 45 cycles de 10 s à 95 °C, 30 s à 60 °C et 30 s à 72 °C.
Les signaux de fluorescence ont été acquis à l’étape d’élongation. La vitesse de la rampe de température
était fixée à 2 °C/s.
Pour vérifier l’adéquation de la méthode, la limite de détection pratique, LOD , a été déterminée pour
prac
le soja génétiquement modifié, conformément à l’ISO 24276. La valeur a été calculée individuellement
pour chaque échantillon à l’aide de la Formule (A.1):
LOD
abs
LOD %= ×100 (A.1)
prac
c
s, DNA
où
LOD est la LOD de la méthode PCR en temps réel spécifique à l’événement et utilisée pour la
abs
quantification, en copies par PCR;
NOTE Pour les calculs du Tableau A.7, une LOD de 10 copies est supposée.
c est la quantité d’ADN de soja amplifiable dans l’échantillon, en copies par PCR,
s, DNA
déterminée par la méthode PCR en temps réel spécifique à un gène de référence du
soja.
Le Tableau A.7 récapitule les résultats de l’essai interlaboratoires. Dans quatre échantillons de lécithine
sur cinq, des valeurs moyennes de LOD inférieures à 0,9 % (exemple pour un seuil législatif en
prac
vigueur) ont été obtenues. Pour l’échantillon de lécithine n° 2, la LOD était supérieure à 0,9 % dans
prac
un seul laboratoire, pour l’échantillon de lécithine n° 3 dans deux laboratoires. Pour l’échantillon de
lécithine n° 5, tous les laboratoires ont amplifié moins de 80 copies du gène de lectine et, par conséquent,
une LOD inférieure ou égale à 0,9 % n’a pas pu être obtenue. De plus, les coefficients de variation de
prac
reproductibilité ont été calculés pour les nombres de copies de lectine rapportés pour les cinq échantillons
de lécithine. Au total, les données de PCR en temps réel de 36 extractions par échantillon de lécithine
ont été utilisées pour l’évaluation. Aucune valeur aberrante n’a été éliminée pour calculer le coefficient
de variation de reproductibilité, C . Pour l’échantillon n° 5, aucune donnée concernant la fidélité n’a pu
V,R
être déterminée en raison de la faible quantité de copies de lectine inférieures à la LOQ de la méthode.
Il faut noter que les données relatives à la fidélité reflètent le coefficient de variation de reproductibilité
3) Produit disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent
document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)
des nombres de copies extraites des échantillons de lécithine, dans les conditions de reproductibilité de
l’essai interlaboratoires.
Tableau A.7 — Résumé des données de validation
Coefficient de Limite de détec-
variation de repro- tion pratique Nombre de labora-
Échantillon de léci- Nombre moyen de
ductibilité moyenne toires avec
thine n ° copies de lectine
C LOD LOD < 0,9 %
V,R prac prac
% %
1 17 044 67 0,06 12/12
2 3 630 63 0,28 11/12
3 2 318 57 0,43 10/12
4 8 325 52 0,12 12/12
5 <80 non déterminé >10 0/12
A.5.2.4 Principe et résumé
L’échantillon visqueux est homogénéisé après chauffage et extrait à l’aide d’hexane après addition d’un
tampon de thiocyanate de guanidine. Les substances susceptibles de perturber l’analyse sont séparées
par extraction à l’aide de chloroforme, et l’ARN présent dans la solution est digéré par la RNase A. L’ADN
est précipité à l’isopropanol en présence de glycogène, puis rincé à l’éthanol et dissout dans de l’eau.
Pour la purification de l’ADN, une étape ultérieure de filtration sur gel est réalisée (en utilisant un gel de
dextrane réticulé pour chromatographie d’exclusion stérique).
A.5.2.5 Termes et définitions
[43]
Pour les besoins du présent paragraphe, les termes et définitions donnés dans l’ISO 5725
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.