ISO 21569:2005
(Main)Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods
ISO 21569:2005 describes the procedure to qualitatively detect genetically modified organisms (GMOs) and derived products by analysing the nucleic acids extracted from the sample under study. The main focus is on polymerase chain reaction (PCR) based amplification methods. It gives general requirements for the specific detection and identification of target nucleic acid sequences (DNA) and for the confirmation of the identity of the amplified DNA sequence. Guidelines, minimum requirements and performance criteria laid down in ISO 21569:2005 are intended to ensure that comparable, accurate and reproducible results are obtained in different laboratories. ISO 21569:2005 has been established for food matrices, but could also be applied to other matrices (e.g. feed and plant samples from the environment). Specific examples of methods are provided in Annexes A to D.
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
L'ISO 21569:2005 décrit le mode opératoire pour la détection qualitative des organismes génétiquement modifiés (OGM) et produits dérivés par analyse des acides nucléiques extraits de l'échantillon à l'étude. Elle couvre principalement les méthodes d'amplification fondées sur la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Elle concerne les exigences générales relatives à la détection et l'identification spécifiques de séquences d'acides nucléiques cibles (ADN) et à la confirmation de l'identité de la séquence d'ADN amplifiée. Les lignes directrices, les exigences minimales et les critères de performance exposés dans l'ISO 21569:2005 ont pour but de garantir l'obtention de résultats comparables et reproductibles dans différents laboratoires. L'ISO 21569:2005 a été élaborée pour les matrices alimentaires mais pourrait également être appliquée pour d'autres matrices (par exemple des aliments pour animaux et des échantillons de plantes issus de l'environnement). Des exemples spécifiques de méthodes sont fournis dans les Annexes A à D.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21569
First edition
2005-06-15
Foodstuffs — Methods of analysis for the
detection of genetically modified
organisms and derived products —
Qualitative nucleic acid based methods
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
Reference number
ISO 21569:2005(E)
©
ISO 2005
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ISO 21569:2005(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle of the method. 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus and equipment. 3
7 Procedure. 3
8 Interpretation. 6
9 Expression of results and quality assurance . 6
10 Test report. 7
Annex A (informative) Target-taxon-specific methods. 8
Annex B (informative) Screening methods. 24
Annex C (informative) Construct-specific methods . 40
Annex D (informative) Event-specific methods. 62
Bibliography . 67
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ISO 21569:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
ISO 21569 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 34,
Food products, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna
Agreement).
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ISO 21569:2005(E)
Introduction
The search for a genetically modified origin of ingredients is performed by means of the following successive
(or simultaneous) steps. After sample collection, nucleic acids are extracted from the test portion. Extracted
nucleic acids can be further purified, simultaneously or after the extraction process. Afterwards, they are
quantified (if necessary), diluted (if necessary) and subjected to analytical procedures (such as PCR). These
steps are detailed in this International Standard and in the following series of International Standards with the
general title Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products:
Sampling (ISO 21568);
Quantitative nucleic acid based methods (ISO 21570);
Nucleic acid extraction (ISO 21571).
Further information about general requirements and definitions involving the steps cited above are collected in
ISO 24276.
The qualitative detection of DNA target sequences is performed in order to obtain a yes or no answer to the
question whether a certain target sequence is detected or not relative to appropriate controls and within the
detection limits of the analytical method used and test portion analysed.
The specificity of the methods, as described in Annexes A to D, ranges from screening methods to detect
common DNA sequences characteristic of GMOs, to specific identification of a genetic construct or a specific
transformation event.
The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that
compliance with this document may involve the use of a patent concerning the PCR technology.
ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of this patent right.
ISO has been informed that Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffman La Roche
Ltd. hold patent rights concerning the PCR technology. The companies have assured the ISO that they are
willing to negotiate licences under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants
throughout the world. In this respect, the statements of the holders of these patent rights are registered with
ISO. Information may be obtained from:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404
USA
and
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501
USA
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ISO 21569:2005(E)
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent
rights.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21569:2005(E)
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Qualitative nucleic acid based methods
1 Scope
This International Standard describes the procedure to qualitatively detect genetically modified organisms
(GMOs) and derived products by analysing the nucleic acids extracted from the sample under study. The main
focus is on polymerase chain reaction (PCR) based amplification methods.
It gives general requirements for the specific detection and identification of target nucleic acid sequences
(DNA) and for the confirmation of the identity of the amplified DNA sequence.
Guidelines, minimum requirements and performance criteria laid down in this International Standard are
intended to ensure that comparable, accurate and reproducible results are obtained in different laboratories.
This International Standard has been established for food matrices, but could also be applied to other
matrices (e.g. feed and plant samples from the environment).
Specific examples of methods are provided in Annexes A to D.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 21571:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Nucleic acid extraction
1)
ISO 24276:— , Foodstuffs — Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 24276 apply.
1) To be published.
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ISO 21569:2005(E)
4 Principle of the method
4.1 General
Qualitative analysis consists of specific detection of target nucleic acid sequences in the test samples. Each
method shall specify the target sequence.
A qualitative result shall clearly demonstrate the presence or absence of the genetic element under study,
relative to appropriate controls and within the detection limits of the analytical method used and test portion
analysed.
4.2 PCR amplification
Amplification of the target sequence occurs in vitro through a reaction catalysed by a DNA polymerase in the
[1], [2]
presence of oligonucleotide primers and deoxyribonucleoside triphosphates in a defined reaction buffer .
An important prerequisite for the amplification of the target sequence is that the reaction mixture contains no
polymerase inhibitors. Amplification of the DNA is a cyclical process consisting of
denaturation of the double-stranded DNA into single-stranded nucleic acid by means of heating,
annealing of the primers to the target sequence at a suitable temperature, and
extension of the primers, which are bound to both single strands, by a DNA polymerase suitable for PCR,
at an appropriate temperature.
4.3 Detection and confirmation of PCR products
PCR products are detected by gel electrophoresis or an appropriate alternative, if necessary, after isolation by
means of a suitable separation procedure.
The identity of any detected target sequence can be verified by an appropriate technique (e.g. by restriction
enzyme analysis, by hybridization or by DNA sequence analysis).
In the case of real-time PCR analysis, amplification and detection occur simultaneously.
5 Reagents
It is generally advisable to store the reaction solutions required for the analytical method at approximately
–20 °C if not specified otherwise.
It may also be appropriate to aliquot the reaction solutions required for the analytical method in order to avoid
subjecting them to repeated freeze-thaw cycles, and/or to reduce chances of cross contamination.
5.1 Target DNA/control
5.2 Water
5.3 Deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) solution, containing dATP, dCTP, dGTP, and dTTP or
dUTP.
NOTE The use of dUTP can interfere with restriction enzyme analyses of PCR products.
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5.4 PCR buffer solution
The PCR buffer solution is usually delivered with the DNA polymerase, which may or may not include MgCl
2
in a concentration specified by the manufacturer. The final MgCl concentrations are method specific and are
2
therefore listed in each annex. Ready-to-use reagents may be commercially available. The manufacturer’s
instructions for use should be considered.
5.5 Thermostable DNA polymerase
5.6 Forward primer
5.7 Reverse primer
6 Apparatus and equipment
See ISO 24276 and Annexes A to D for details.
7 Procedure
7.1 Quality, integrity and amplifiability of nucleic acid extracts
[3]
The nucleic acid solution shall be pure enough for subsequent analysis . The quality and amount of nucleic
acid extracted using a given method on a given matrix shall be both repeatable and reproducible.
NOTE The quality, integrity and amount of the DNA template influences the outcome of the PCR, and hence the
analytical results obtained. The limit of detection of a specific method may therefore depend on whether the material to be
analysed has been processed or refined, and on the degree of degradation of the DNA therein.
[4]
Nucleic acids for use in PCR should be substantially free of PCR inhibitors . PCR inhibition controls shall be
included as described in ISO 24276.
7.2 Performance criteria
General performance criteria are described in ISO 24276.
The values for the performance characteristics are given for each method as outlined in Annexes A to D and
should take into account the genome sizes; see Reference [5].
The reaction conditions, especially the MgCl concentration and the thermocycling conditions should be
2
optimized for every primer pair and/or system. When any primer system is used for the first time, it is
necessary to demonstrate beforehand that the cycle conditions chosen for the particular matrix to be studied
avoid undesirable competitive products that would otherwise reduce the sensitivity of the PCR detection.
In an optimal reaction, less than 40 cycles are required to amplify W 10 target molecules to produce a product
that is readily detectable by standard methods. As the cycle number increases, non-specific products could
accumulate. The optimized PCR should be able to amplify in 40 PCR cycles from a pure reference sample of
100 copies of template DNA enough copies of the PCR product to be detectable. The characteristic
temperature/time profile for each primer system and the reaction mixture appropriate for the apparatus used
and the number of cycles shall be strictly adhered to.
In general, the specificity of the reaction should be enhanced as much as possible (e.g. by using hot-start
PCR). Hot-start PCR is recommended as a means of reducing side reactions such as the amplification of non-
target sequences in background DNA (mispriming) and primer-oligomerization (it thus increases specificity).
The values derived from the validation study may not be applicable to analyte concentration ranges and
matrices other than given in the respective annexes.
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7.3 Aspects of PCR design
7.3.1 General
Because the performance of each specific PCR should be comparable with other specific PCRs, the following
aspects of PCR design shall be taken into account.
7.3.2 Size of PCR products
The size of the target sequence shall be selected to match the range of molecular mass available in the
nucleic acid extract being analysed.
EXAMPLE For highly degraded DNA from processed foodstuffs, the size of the PCR product should ideally be in the
range of 60 bp to 150 bp. For raw materials, a broader range of PCR products up to, for example, 250 bp is applicable.
However, if prior experimental studies are carried out to determine the validity of primer sets yielding different
sized PCR products, these may be used on the matrix for which they have been validated.
7.3.3 Primers
7.3.3.1 General
Primer sequence information is included in Annexes A to D.
7.3.3.2 Primer design
The primer sequences should preferably have the following characteristics wherever practicable:
length of each primer: 18 to 30 nucleotides;
optimal annealing temperature ≈ 60 °C (should be established experimentally), i.e. estimated melting
temperature u 65 °C;
GC:AT ratio = 50:50 if possible, or else as close to this ratio as possible;
high internal stability (avoid concentration of Gs and Cs in short segments of primers);
minimal 3' end complementarity to avoid primer-dimer formation;
minimal secondary structure;
minimal dimer formation with specific detection probe(s) designed for the PCR.
Software packages are available to help with primer design.
7.3.3.3 Validation of primers
7.3.3.3.1 General
The ability of the primers to detect the target sequence shall be validated.
Primer validation should be carried out in two steps: a first theoretical evaluation, and a second experimental
evaluation.
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7.3.3.3.2 Theoretical evaluation of the specificity
Theoretical evaluation shall as a minimum be carried out by performing a sequence similarity search (e.g.
® 2) ® 2)
FastA, Blast ) against one of the major nucleic acid sequence databases (e.g. EMBL, GenBank ).
Homologous gene sequences may be retrieved from the sequence databases and aligned to obtain an
estimate of the chance of finding similar sequences in the target taxon or other organisms.
7.3.3.3.3 Experimental evaluation of the specificity
Irrespective of the design criteria used, the specificity of primers shall always be experimentally evaluated to
confirm the primers’ ability to discriminate between the target and closely related non-target sequences.
Primers designed to detect taxon-specific target sequences should be shown to detect these sequences
reliably in a representative number of different members of the taxon.
7.4 PCR target descriptions
For the qualitative detection and identification of GMOs, various PCR tests may be performed, depending on
the type of matrices under study and/or the requirements of the analysis. These analyses may be directed at
sequences specific for target taxa, genetic constructs and transformation events, as well as elements suitable
for screening purposes.
7.5 Controls
Because of the risk of obtaining false positive and/or false negative results, appropriate controls shall be
included in each diagnostic PCR assay (see ISO 24276).
If available and appropriate, certified reference materials should be used as positive and negative controls.
7.6 PCR set-up, detection and confirmation of PCR products
Annexes A to D give details on the specific PCR procedure steps.
NOTE In the case of detection of the PCR products by gel electrophoresis, the size of the PCR products can be
estimated using a suitable DNA size marker of known length to run in parallel with the PCR products under test.
It may be desirable in some cases to confirm a positive or negative result for a particular genetic modification.
This may be achieved by employing primers to an alternative target sequence; this is particularly suitable for
confirmation of screening test results.
A positive identification of the specific target DNA sequence may be confirmed by an appropriate method
other than size determination of the PCR product, for example
by hybridization of the PCR product with specific probes, or
by carrying out restriction analyses of the PCR product; the length of the resulting fragments has to
correspond to the expected length of the target DNA sequence after restriction, or
by sequencing of the PCR product, or
other equivalent confirmation.
2) Blast and GenBank are examples of suitable products available commercially. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
Equivalent products may be used if they can be shown to give the same results.
© ISO 2005 – All rights reserved 5
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ISO 21569:2005(E)
If the primers used are designed to detect sequences derived from infectious organisms (a naturally occurring
non-genetically modified organism such as a virus or a bacterium), then it is highly recommended that it be
verified that the detected DNA is indeed derived from a GMO. This can be done by checking for the absence
of other DNA derived from the infectious organism.
EXAMPLE The 35S promoter is derived from cauliflower mosaic virus (CaMV), and consequently detection of the
[6]
CaMV 35S promoter could be due to the presence of either GMO-derived and/or CaMV-derived DNA . By checking for
presence of the other CaMV-derived DNA, it may be possible to confirm the GMO origin of the CaMV 35S promoter if no
other CaMV-derived DNA is detected.
8 Interpretation
8.1 General
The PCR result will be either
a) positive if a specific PCR product has been detected, and all the controls give results as specified in
ISO 24276:—, Table 2, or
b) negative if a specific PCR product has not been detected, and all the controls give results as specified in
ISO 24276:—, Table 2.
NOTE Event-specific target sequences are sometimes present together with other event-specific sequences in a
[7]
single GMO (e.g. due to gene stacking ).
If the results are ambiguous, the procedure shall be repeated; see ISO 24276.
8.2 Verification
Verification of positive or negative results for target sequences may be achieved as described in 7.6.
9 Expression of results and quality assurance
9.1 General
The results shall be expressed unambiguously, i.e. not as “±”.
A negative result shall never be expressed as “GMO not present”.
Ideally, the limit of detection (LOD) should be provided with reference to the test sample. However, this
requires particular materials, DNA of exceptionally high quality, and/or use of sophisticated laboratory
equipment that is not available to all laboratories. Consequently, the analysis can become very labour
intensive and/or expensive, and therefore not applicable in practice for routine purposes.
As a minimum, the LOD shall be provided with reference to a reference material, and a relative value based
on a specified matrix (preferably a given amount of genomic DNA solution, e.g. 100 ng of 0,01 % GTS 40-3-2
DNA).
9.2 Expression of a negative result
The following text shall appear in the test report:
“For sample X, target sequence Y was not detected.
The LOD of the method is x % determined with ABC (identify the reference material).”
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ISO 21569:2005(E)
If it cannot be demonstrated that the amount of target DNA included in the PCR is sufficient for the LOD to be
applicable, then the following sentence shall be added:
“However, the amount of the target DNA extracted from species X may be/was insufficient for the LOD to
be applicable for this sample.”
NOTE The LOD of the sample is determined by the quantity of DNA of the species included in the analytical reaction
[7]
(copy number), and the ratio relative to the absolute LOD of the GM target (copy number) .
9.3 Expression of a positive result
The following text shall appear in the test report:
“For sample X, target sequence Y was detected.”
The identity of the GMO may be included, if available.
9.4 Quality assurance requirements
Results from both test portions shall be consistent. If one test portion gives a positive result and the other
gives a negative result, then the analysis shall be repeated (see ISO 24276), if possible by increasing the
quantity of template nucleic acid in the reaction so as to obtain consistent results for both test portions.
Moreover, as a minimum, the purity of the template nucleic acid should be checked by including a PCR
inhibition control. Other controls to check the length and integrity of the template nucleic acid may be useful.
10 Test report
The test report shall be written in accordance with ISO 24276 and shall contain at least the following additional
information:
the limit of detection, and the matrix used to identify the limit of detection;
description of the specificity of the analytical method;
the result expressed according to Clause 9.
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Annex A
(informative)
Target-taxon-specific methods
A.1 Target-taxon-specific method for the detection of components derived from soya
beans
A.1.1 General
This is a routine procedure for the detection of a species-specific, single copy gene occurring in soya beans
(Glycine max).
This method may be used to assess the amplifiability of DNA from products derived from soya beans.
A.1.2 Validation status and performance criteria
A.1.2.1 Collaborative study
[8], [9]
This method has been validated in collaborative studies organized by the working group “Development of
methods for identifying foodstuffs produced by using genetic engineering techniques” of the German Federal
Institute for Health Protection of Consumers and Veterinary Medicine (BgVV) according to Article 35 of the
German Federal Foodstuffs Act. For DNA extraction, the CTAB method as outlined in ISO 21571:2005, A.3,
was used (but with a test portion of 100 mg).
The data from the collaborative studies are listed in Table A.1.
Table A.1 — Results of the collaborative studies
[8] [9]
Year of collaborative study 1997 1998/1999
Number of laboratories 25 27
Number of laboratories submitting results 22 20
Number of samples per laboratory 10 3
Number of accepted results 220 60
Number of samples containing soya beans 220 50
False positive results 0 1 (2 %)
False negative results 0 1 (2 %)
A.1.2.2 Molecular specificity
A.1.2.2.1 General
This annex fulfils the requirements as outlined in Clause 7.
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ISO 21569:2005(E)
®3)
The method has been designed for a target sequence described in GenBank accession No. K00821
= M30884.
A.1.2.2.2 Theoretical
[10]
The soya bean lectin gene Le1 obtained from gene databases was chosen as a target sequence.
No sequence similarity with DNA sequences of other crop plants (legumes, cereals, vegetables) has been
®2) th
found (NCBI BlastN search, European Molecular Biology Laboratory (EMBL) database, September 28 ,
2001). However, GM03 matched 100 % the sequences in the following database accessions: AX033509
(sequence 17 from patent DE19906169), AX033507 (sequence 15 from patent DE19906169) and AX033501
(sequence 9 from patent DE19906169), while GM04 matched only accession No. AX033509 (sequence 17
®
from patent DE19906169). Note that the accession No. M30884 is the same as K00821, a GenBank entry
originally submitted in 1993.
The number of target sequence copies was not determined, but was presumed to be a single copy gene.
A.1.2.2.3 Experimental
No amplification has been observed using DNA from other crop plants (legumes, cereals, vegetables) or from
[10], [11]
beef and pork. The soya bean PCR assay appears to be highly specific for soya bean DNA .
A.1.2.3 Limit of detection (LOD)
The absolute LOD has not been determined, but the method has been demonstrated to detect at least 0,1 ng
of soya bean DNA, determined fluorometrically.
A.1.3 Adaptation
No specific information is available.
A.1.4 Principle
A 118 bp fragment from the soya bean lectin gene is amplified by PCR and separated by agarose gel
electrophoresis.
A.1.5 Reagents
For the quality of the reagents used, see ISO 24276.
A.1.5.1 Water
4)
A.1.5.2 PCR buffer, (without MgCl ), 10× .
2
A.1.5.3 MgCl solution, c(MgCl ) = 25 mmol/l.
2 2
A.1.5.4 dNTP solution, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (each).
A.1.5.5 Oligonucleotides
3) GenBank and BlastN are examples of suitable products available commercially. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
Equival
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21569
Première édition
2005-06-15
Produits alimentaires — Méthodes
d'analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Méthodes
qualitatives basées sur l'utilisation
des acides nucléiques
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid
based methods
Numéro de référence
ISO 21569:2005(F)
©
ISO 2005
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ISO 21569:2005(F)
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Publié en Suisse
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ISO 21569:2005(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe de la méthode. 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage et équipements. 3
7 Mode opératoire . 3
8 Interprétation. 6
9 Expression des résultats et assurance qualité . 6
10 Rapport d’essai . 7
Annexe A (informative) Méthodes spécifiques au taxon. 8
Annexe B (informative) Méthodes de criblage . 25
Annexe C (informative) Méthodes spécifiques au construit. 41
Annexe D (informative) Méthodes spécifiques aux évènements . 64
Bibliographie . 69
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ISO 21569:2005(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'ISO 21569 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires —
Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, conformément à l'Accord de coopération technique entre l'ISO et
le CEN (Accord de Vienne).
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ISO 21569:2005(F)
Introduction
La recherche d’une origine génétiquement modifiée dans les ingrédients est réalisée au moyen des étapes
successives (ou simultanées) suivantes. Après la collecte d’échantillons, des acides nucléiques sont extraits
de la prise d’essai et peuvent être encore purifiés, simultanément ou après le processus d’extraction. Ensuite,
ces acides nucléiques sont quantifiés (si nécessaire), dilués (si nécessaire) et soumis à des procédures
d’analyse (comme la PCR). Ces étapes sont détaillées dans la présente Norme internationale et dans la série
de Normes internationales suivante, qui a pour titre général: Produits alimentaires — Méthodes d’analyse
pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés:
⎯ Échantillonnage (ISO 21568);
⎯ Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques (ISO 21570);
⎯ Extraction des acides nucléiques (ISO 21571).
D’autres informations relatives aux exigences générales et aux définitions incluant les étapes mentionnées
ci-dessus sont rassemblées dans l’ISO 24276.
La détection qualitative permet de déterminer si des séquences d’ADN cibles sont présentes ou non à l’aide
de témoins appropriés et dans les limites de détection de la méthode analytique employée et de la prise
d’essai analysée.
Les méthodes décrites dans les Annexes A à D vont des méthodes de criblage pour la détection des
séquences d’ADN communes caractéristiques des OGM aux méthodes d’identification spécifique d’un
construit ou d’évènement de transformation spécifique.
L’Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l’attention sur le fait que la conformité avec le
présent document peut impliquer l’utilisation d’un brevet relatif à la technologie PCR.
L’ISO ne prend pas position en ce qui concerne la preuve, la validité et le domaine d’application du droit de
propriété intellectuelle concerné.
L’ISO a été informée que Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. et F. Hoffman La Roche Ltd.
détiennent des droits de propriété intellectuelle relatifs à la technologie PCR. Ces sociétés ont garanti à l’ISO
qu’elles souhaitent négocier des licences à des conditions raisonnables et non discriminatoires avec les
demandeurs du monde entier. À cet égard, les déclarations des détenteurs de ces droits de propriété
intellectuelle sont enregistrés avec l’ISO. Il est possible d’obtenir des informations aux adresses suivantes:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404
USA
et
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501
USA
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ISO 21569:2005(F)
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues autres que ceux identifiés ci-devant. L’ISO ne saurait être
tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
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NORME INTERNATIONALE ISO 21569:2005(F)
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des
acides nucléiques
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit le mode opératoire pour la détection qualitative des organismes
génétiquement modifiés (OGM) et produits dérivés par analyse des acides nucléiques extraits de l’échantillon
à l’étude. Elle couvre principalement les méthodes d’amplification fondées sur la réaction de polymérisation
en chaîne (PCR).
Elle concerne les exigences générales relatives à la détection et l’identification spécifiques de séquences
d’acides nucléiques cibles (ADN) et à la confirmation de l’identité de la séquence d’ADN amplifiée.
Les lignes directrices, les exigences minimales et les critères de performance exposés dans la présente
Norme internationale ont pour but de garantir l’obtention de résultats comparables et reproductibles dans
différents laboratoires.
La présente Norme internationale a été élaborée pour les matrices alimentaires mais pourrait également être
appliquée pour d’autres matrices (par exemple des aliments pour animaux et des échantillons de plantes
issus de l’environnement).
Des exemples spécifiques de méthodes sont fournis dans les Annexes A à D.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 21571:2005, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
1)
ISO 24276:— , Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 24276 s’appliquent.
1) À publier.
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ISO 21569:2005(F)
4 Principe de la méthode
4.1 Généralités
Une analyse qualitative consiste en la détection spécifique des séquences d’acides nucléiques cibles dans les
échantillons pour essai. Chaque méthode doit spécifier la séquence cible.
Un résultat qualitatif doit clairement indiquer la présence ou l’absence de l’élément génétique à l’étude,
recherchée à l’aide de témoins appropriés, dans les limites de détection de la méthode analytique employée
et de la prise d’essai analysée.
4.2 Amplification par PCR
L’amplification de la séquence cible est réalisée in vitro par une réaction catalysée par une ADN polymérase
en présence d’amorces d’oligonucléotides et de désoxyribonucléosides triphosphates dans un tampon de
[1], [2]
réaction déterminé . Pour pouvoir réaliser l’amplification de la séquence cible, il est important de vérifier
auparavant que le mélange réactionnel ne contient pas d’inhibiteur de polymérase. L’amplification de l’ADN
est un processus cyclique comprenant:
⎯ la dénaturation de l’ADN double brin en acide nucléique simple brin par chauffage;
⎯ l’hybridation des amorces de la séquence cible à une température appropriée; et
⎯ l’élongation des amorces, qui sont liées à chacun des simples brins, par une ADN polymérase à une
température appropriée.
4.3 Détection et confirmation des produits de PCR
Les produits de PCR sont détectés par électrophorèse sur gel ou à l’aide d’une autre technique appropriée, si
besoin est, après isolation réalisée suivant un mode opératoire de séparation adéquat.
L’identité de toute séquence cible détectée peut être vérifiée au moyen d’une méthode appropriée (par
exemple par des analyses utilisant des enzymes de restriction, par hybridation ou par analyse des séquences
d’ADN).
Dans les analyses par PCR en temps réel, l’amplification et la détection sont simultanées.
5 Réactifs
Il est en général conseillé de stocker les solutions de réaction nécessaires pour la méthode d’analyse à
environ –20 °C, sauf indication contraire.
Il peut également être approprié d’aliquoter les solutions de réaction nécessaires pour la méthode d’analyse
afin d’éviter de les soumettre à des cycles répétés de congélation-décongélation et/ou de réduire les risques
de contamination croisée.
5.1 ADN cible/témoin
5.2 Eau
5.3 Solution de désoxynucléotide triphosphate (dNTP), contenant les nucléotides dATP, dCTP, dGTP,
et dTTP ou dUTP.
NOTE L’utilisation de dUTP peut avoir une incidence sur les analyses des produits de PCR avec des enzymes de
restriction.
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ISO 21569:2005(F)
5.4 Solution tampon pour PCR
La solution tampon pour PCR est généralement livrée avec l’ADN polymérase, qui peut contenir ou non du
MgCl dont la concentration répond aux spécifications du fabricant. Les concentrations finales de MgCl sont
2 2
spécifiques à chaque méthode et sont, par conséquent, répertoriées dans chaque annexe. Des réactifs prêts
à l’emploi peuvent être disponibles dans le commerce; il convient de se conformer aux instructions du
fabricant.
5.5 ADN polymérase thermostable
5.6 Amorce sens
5.7 Amorce antisens
6 Appareillage et équipements
Voir l’ISO 24276 et les Annexes A à D pour les détails.
7 Mode opératoire
7.1 Qualité, intégrité et amplifiabilité des acides nucléiques extraits
[3]
La solution d’acide nucléique doit être suffisamment pure pour l’analyse ultérieure . La qualité et la quantité
d’acides nucléiques extraits à l’aide d’une méthode donnée sur une matrice donnée doivent être à la fois
répétables et reproductibles.
NOTE La qualité, l’intégrité et la quantité de la matrice d’ADN influencent le résultat de la PCR, et donc les résultats
analytiques obtenus. La limite de détection d’une méthode spécifique peut donc dépendre du fait que le produit à analyser
a été transformé ou raffiné et du degré de dégradation de l’ADN qui en résulte.
Il convient que les acides nucléiques utilisés pour la PCR soient en grande partie exempts d’inhibiteurs de
[4]
PCR . Les témoins d’inhibition de PCR doivent toujours être prévus comme décrit dans l’ISO 24276.
7.2 Critères de performance
Les critères de performance généraux sont décrits dans l’ISO 24276.
Les valeurs des caractéristiques de performance sont fournies pour chaque méthode comme indiqué dans les
Annexes A à D. Il convient que ces valeurs prennent en compte la taille des génomes; voir la Référence [5].
Il convient que les conditions de réactions, en particulier la concentration de MgCI et les conditions
2
thermiques, soient optimisées pour chaque paire et/ou système d’amorces. Lorsqu’un système d’amorces est
utilisé pour la première fois, il est nécessaire de vérifier au préalable que les conditions du cycle choisi pour la
matrice particulière à étudier ne favorisent pas la formation de produits concurrents indésirables qui
réduiraient la sensibilité de la détection PCR.
Dans une réaction optimale, moins de 40 cycles sont nécessaires pour amplifier 10 molécules cibles afin
d’obtenir un produit qui soit facilement détectable à l’aide des méthodes normalisées. Plus le nombre de
cycles augmente, plus les co-produits peuvent s’accumuler. Il convient que la PCR optimisée permette
d’amplifier, en 40 cycles PCR, à partir d’un échantillon de référence pur de 100 copies d’ADN matrice,
suffisamment de produit de PCR pour être détecté. Le profil température/temps caractéristique de chaque
système d’amorces, le mélange réactionnel approprié à l’appareil utilisé et le nombre de cycles doivent être
respectés scrupuleusement.
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En général, il convient que la spécificité de la réaction soit accentuée autant que possible, par exemple en
utilisant la PCR à démarrage à chaud (PCR «hot start»). La PCR à démarrage à chaud est recommandée
comme moyen pour réduire les réactions parallèles telles que l’amplification de séquences d’ADN non cibles
(mispriming) et l’oligomérisation des amorces (augmentant ainsi la spécificité).
Les valeurs dérivées de l’étude de validation peuvent ne pas être applicables pour les gammes de
concentrations d’analyte et les matrices autres que celles données dans les annexes respectives.
7.3 Aspects de la conception de la PCR
7.3.1 Généralités
Comme il convient que les performances de chaque PCR soient comparables à celles d’autres PCR
spécifiques, les aspects suivants de la conception de PCR doivent être pris en compte.
7.3.2 Taille des produits de PCR
La taille de la séquence cible doit être sélectionnée de façon à ce qu’elle corresponde à la gamme de poids
moléculaires présente dans l’extrait d’acide nucléique à l’étude.
EXEMPLE Pour de l’ADN fortement dégradé provenant d’aliments transformés, il convient que la taille du produit de
PCR soit comprise entre 60 bp et 150 bp. Pour les aliments bruts, une gamme de tailles de produits de PCR plus étendue
s’applique, allant par exemple jusqu’à 250 bp.
Toutefois, si des études expérimentales sont réalisées au préalable pour déterminer la validité de systèmes
d’amorces permettant d’obtenir des produits de PCR de tailles différentes, ces amorces peuvent être utilisées
avec la matrice pour laquelle elles ont été validées.
7.3.3 Amorces
7.3.3.1 Généralités
Les Annexes A à D contiennent des informations relatives à la séquence d’amorces.
7.3.3.2 Conception d’amorces
Il convient, de préférence, que les séquences d’amorces aient, si possible, les caractéristiques suivantes:
⎯ longueur de chaque amorce: 18 à 30 nucléotides;
⎯ température optimale d’hybridation ≈ 60 °C (qu’il convient d’établir expérimentalement), c’est-à-dire une
température de dénaturation par la chaleur estimée u 65 °C;
⎯ rapport GC:AT = 50:50 si possible, ou aussi proche que possible de ce rapport;
⎯ stabilité interne élevée (éviter la concentration de Gs et de Cs dans les segments d’amorce courts);
⎯ complémentarité minimale avec l’extrémité 3’ pour éviter la formation de dimères d’amorces;
⎯ structure secondaire interne minimale;
⎯ formation de dimère minimale avec une ou plusieurs sondes de détection spécifiques conçues pour la
PCR.
Il existe des logiciels d’aide à la conception d’amorces.
4 © ISO 2005 – Tous droits réservés
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ISO 21569:2005(F)
7.3.3.3 Validation des amorces
7.3.3.3.1 Généralités
La capacité des amorces à détecter la séquence cible doit être validée.
Il convient d’effectuer la validation des amorces en deux étapes: une première étape d’évaluation théorique,
et une seconde étape de validation expérimentale.
7.3.3.3.2 Évaluation théorique de la spécificité
L’évaluation théorique doit au moins consister en une recherche d’homologies de séquences [par exemple à
® 2)
l’aide de FastA, Blast ] sur l’une des principales base de données de séquences d’acides nucléiques [par
®2)
exemple, EMBL, GenBank ]. Des séquences de gène homologues peuvent être récupérées dans les bases
de données de séquences et alignées afin d’obtenir une estimation de la probabilité de trouver des séquences
homologues dans le taxon cible ou dans d’autres organismes.
7.3.3.3.3 Évaluation expérimentale de la spécificité
Quels que soient les critères de conception retenus, la spécificité des amorces doit toujours être évaluée
expérimentalement pour confirmer leur capacité à faire la distinction entre la cible et les séquences non-cibles
fortement apparentées.
Il convient de démontrer que les amorces conçues pour détecter les séquences cibles spécifiques au taxon
sont capables de détecter de manière fiable ces séquences dans un nombre représentatif de membres
différents du taxon.
7.4 Description des cibles PCR
Pour la détection qualitative et l’identification des OGM, différentes PCR peuvent être effectuées selon le type
de matrice à étudier et/ou les exigences analytiques. Ces analyses peuvent être orientées vers des
séquences spécifiques aux taxons cibles, construits génétiques et évènements de transformation, ainsi que
vers des éléments appropriés aux besoins du criblage.
7.5 Témoins
Du fait du risque d’obtenir des résultats de type faux positifs et/ou faux négatifs, des témoins appropriés
doivent être inclus lors des analyses de routine (voir l’ISO 24276).
Il convient d’utiliser, dans la mesure du possible, du matériel de référence certifié comme témoins positif et
négatif.
7.6 Réaction PCR, détection et confirmation des produits de PCR
Les Annexes A à D décrivent en détail les étapes du mode opératoire de PCR spécifique.
NOTE En cas de détection de produits de PCR par électrophorèse sur gel, la taille des produits de PCR peut être
estimée à l’aide d’un marqueur de taille d’ADN approprié, de longueur connue, à analyser en parallèle des autres produits
de PCR soumis à essai.
2) Blast et GenBank sont des exemples de produits adaptés disponibles dans le commerce. Ces informations sont
données pour le confort de l’utilisateur de la présente Norme internationale mais ne constitue aucunement une
approbation de ces produits de la part de l’ISO. Des produits équivalent peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
permettent d’obtenir les mêmes résultats.
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ISO 21569:2005(F)
Il peut être souhaitable, dans certains cas, d’avoir confirmation d’un résultat positif ou négatif concernant une
modification génétique. Cela peut être fait en employant des amorces conçues pour une autre séquence cible;
ceci est particulièrement approprié pour la confirmation des résultats des essais de criblage.
L’identification positive d’une séquence d’ADN cible spécifique peut être confirmée au moyen d’une méthode
appropriée autre que la détermination de la taille du produit de PCR, par exemple
⎯ par hybridation du produit de PCR avec des sondes d’ADN; ou
⎯ par des analyses de digestion enzymatiques du produit de PCR. La longueur des fragments qui en
résultent doit correspondre à la longueur attendue de la séquence d’ADN cible après digestion; ou
⎯ par séquençage du produit de PCR; ou
⎯ par un autre moyen de confirmation équivalent.
Si les amorces utilisées sont conçues pour détecter les séquences dérivées d’organismes infectieux
(organisme non génétiquement modifié présent dans la nature tel qu’un virus ou une bactérie), il est fortement
recommandé de vérifier que l’ADN détecté est effectivement dérivé d’un OGM. Pour ce faire, il est possible de
vérifier l’absence d’autre ADN, dérivé d’un organisme infectieux.
EXEMPLE Le promoteur 35S est dérivé du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), donc la détection du
promoteur 35S du CaMV peut être due à la présence d’ADN dérivé d’un OGM comme à la présence d’ADN dérivé d’un
[6]
CaMV . Si aucun autre ADN dérivé du CaMV n’est détecté, il peut être possible de confirmer que le promoteur 35S du
CaMV provient d’un OGM.
8 Interprétation
8.1 Généralités
Le résultat de la PCR sera soit
a) positif si un produit de PCR spécifique est détecté et que tous les résultats des témoins sont conformes à
l’ISO 24276:—, Tableau 2; soit
b) négatif si un produit de PCR spécifique n’a pas été détecté et que tous les résultats des témoins sont
conformes à l’ISO 24276:—, Tableau 2.
NOTE Les séquences cibles spécifiques à un évènement sont parfois présentes en association avec d’autres
[7]
séquences spécifiques à un évènement dans un OGM unique (par exemple en raison d’un empilement de gènes ).
Si les résultats obtenus sont ambigus, le mode opératoire doit être répété; voir l’ISO 24276.
8.2 Vérification
La vérification de résultats positifs ou négatifs concernant les séquences cibles peut être effectuée comme
décrit en 7.6.
9 Expression des résultats et assurance qualité
9.1 Généralités
Les résultats doivent être exprimés sans ambiguïté, c’est-à-dire jamais sous la forme «±».
Un résultat négatif ne doit jamais être exprimé sous la forme «absence d’OGM».
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ISO 21569:2005(F)
Idéalement, il convient d’indiquer la limite de détection (LOD) avec une référence à l’échantillon pour essai.
Cependant, ceci requiert du matériel particulier, de l’ADN de qualité exceptionnelle et/ou des équipements de
laboratoires sophistiqués qui ne sont pas disponibles dans tous les laboratoires. C’est pourquoi l’analyse peut
s’avérer très laborieuse et/ou coûteuse et donc non applicable en pratique aux tâches de routine.
La LOD doit faire référence à au moins un matériel de référence et à une valeur relative fondée sur une
matrice donnée (de préférence une quantité donnée de solution d’ADN génomique, par exemple 100 ng
d’ADN GTS 40-3-2 à 0,01 %).
9.2 Expression d’un résultat négatif
Le texte suivant doit apparaître dans le rapport d’essai:
«Pour l’échantillon X, la séquence cible Y n’a pas été détectée.
La LOD de la méthode est de x % déterminé sur ABC (identifier le matériel de référence).»
S’il n’est pas possible de démontrer que la quantité d’ADN cible présent dans la PCR est suffisante pour que
la limite de détection soit atteinte, alors la mention suivante doit être ajoutée:
«Toutefois, la quantité d’ADN cible extraite de l’espèce X n’était/n’est peut être pas suffisante pour que la
LOD s’applique à cet échantillon.»
NOTE La LOD de l’échantillon est déterminée par la quantité d’ADN des espèces comprises dans la réaction
[7]
analytique (nombre de copies) et par le rapport relatif à la LOD absolue de la cible GM (nombre de copies) .
9.3 Expression d’un résultat positif
Le texte suivant doit apparaître dans le rapport d’essai:
«Pour l’échantillon X, la séquence cible Y a été détectée.»
L’identité de l’OGM peut être mentionnée, le cas échéant.
9.4 Exigences relatives à l’assurance qualité
Les résultats obtenus avec les différentes prises d’essai doivent être cohérents. Si une prise d’essai donne un
résultat positif et que l’autre donne un résultat négatif, alors l’analyse doit être répétée (voir l’ISO 24276), si
possible en augmentant la quantité d’acide nucléique matrice dans la réaction afin d’obtenir des résultats
cohérents pour les deux prises d’essai. En outre, il convient de vérifier au moins la pureté de l’acide nucléique
matrice en incluant un témoin d’inhibition de PCR. D’autres témoins destinés à vérifier la longueur et l’intégrité
de l’acide nucléique matrice peuvent être utiles.
10 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit être rédigé conformément à l’ISO 24276 et doit au moins contenir les informations
suivantes:
⎯ la limite de détection et la matrice utilisée pour déterminer cette limite;
⎯ la description de la spécificité de la méthode analytique;
⎯ les résultats exprimés conformément à l’Article 9.
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Annexe A
(informative)
Méthodes spécifiques au taxon
A.1 Méthodes spécifiques au taxon pour la détection de composés dérivés du soja
A.1.1 Généralités
Il s’agit d’un mode opératoire de routine pour la détection d’un gène monocopie spécifique à l’espèce soja
(Glycine max).
Cette méthode peut être utilisée afin d’évaluer l’amplifiabilité de l’ADN provenant de produits dérivés du soja.
A.1.2 État de validation et critères de performance
A.1.2.1 Essai interlaboratoire
,
[8] [9]
La méthode a été validée dans le cadre d’essais interlaboratoires organisés par le groupe de travail
«Développement de méthodes pour l’identification des aliments produits à l’aide de techniques de génie
génétique» de l’institut fédéral allemand pour la protection de la santé des consommateur
...
Questions, Comments and Discussion
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