Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods

ISO 21569:2005 describes the procedure to qualitatively detect genetically modified organisms (GMOs) and derived products by analysing the nucleic acids extracted from the sample under study. The main focus is on polymerase chain reaction (PCR) based amplification methods. It gives general requirements for the specific detection and identification of target nucleic acid sequences (DNA) and for the confirmation of the identity of the amplified DNA sequence. Guidelines, minimum requirements and performance criteria laid down in ISO 21569:2005 are intended to ensure that comparable, accurate and reproducible results are obtained in different laboratories. ISO 21569:2005 has been established for food matrices, but could also be applied to other matrices (e.g. feed and plant samples from the environment). Specific examples of methods are provided in Annexes A to D.

Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques

L'ISO 21569:2005 décrit le mode opératoire pour la détection qualitative des organismes génétiquement modifiés (OGM) et produits dérivés par analyse des acides nucléiques extraits de l'échantillon à l'étude. Elle couvre principalement les méthodes d'amplification fondées sur la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Elle concerne les exigences générales relatives à la détection et l'identification spécifiques de séquences d'acides nucléiques cibles (ADN) et à la confirmation de l'identité de la séquence d'ADN amplifiée. Les lignes directrices, les exigences minimales et les critères de performance exposés dans l'ISO 21569:2005 ont pour but de garantir l'obtention de résultats comparables et reproductibles dans différents laboratoires. L'ISO 21569:2005 a été élaborée pour les matrices alimentaires mais pourrait également être appliquée pour d'autres matrices (par exemple des aliments pour animaux et des échantillons de plantes issus de l'environnement). Des exemples spécifiques de méthodes sont fournis dans les Annexes A à D.

General Information

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Published
Publication Date
19-Jun-2005
Current Stage
9092 - International Standard to be revised
Completion Date
29-Aug-2024
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ISO 21569:2005 - Foodstuffs -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -- Qualitative nucleic acid based methods
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ISO 21569:2005 - Produits alimentaires -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés -- Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21569
First edition
2005-06-15
Foodstuffs — Methods of analysis for the
detection of genetically modified
organisms and derived products —
Qualitative nucleic acid based methods
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques

Reference number
©
ISO 2005
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Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
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Web www.iso.org
Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle of the method. 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus and equipment. 3
7 Procedure. 3
8 Interpretation. 6
9 Expression of results and quality assurance . 6
10 Test report. 7
Annex A (informative) Target-taxon-specific methods. 8
Annex B (informative) Screening methods. 24
Annex C (informative) Construct-specific methods . 40
Annex D (informative) Event-specific methods. 62
Bibliography . 67

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
ISO 21569 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 34,
Food products, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna
Agreement).
iv © ISO 2005 – All rights reserved

Introduction
The search for a genetically modified origin of ingredients is performed by means of the following successive
(or simultaneous) steps. After sample collection, nucleic acids are extracted from the test portion. Extracted
nucleic acids can be further purified, simultaneously or after the extraction process. Afterwards, they are
quantified (if necessary), diluted (if necessary) and subjected to analytical procedures (such as PCR). These
steps are detailed in this International Standard and in the following series of International Standards with the
general title Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products:
 Sampling (ISO 21568);
 Quantitative nucleic acid based methods (ISO 21570);
 Nucleic acid extraction (ISO 21571).
Further information about general requirements and definitions involving the steps cited above are collected in
ISO 24276.
The qualitative detection of DNA target sequences is performed in order to obtain a yes or no answer to the
question whether a certain target sequence is detected or not relative to appropriate controls and within the
detection limits of the analytical method used and test portion analysed.
The specificity of the methods, as described in Annexes A to D, ranges from screening methods to detect
common DNA sequences characteristic of GMOs, to specific identification of a genetic construct or a specific
transformation event.
The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that
compliance with this document may involve the use of a patent concerning the PCR technology.
ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of this patent right.
ISO has been informed that Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffman La Roche
Ltd. hold patent rights concerning the PCR technology. The companies have assured the ISO that they are
willing to negotiate licences under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants
throughout the world. In this respect, the statements of the holders of these patent rights are registered with
ISO. Information may be obtained from:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404
USA
and
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501
USA
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent
rights.
vi © ISO 2005 – All rights reserved

INTERNATIONAL STANDARD ISO 21569:2005(E)

Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Qualitative nucleic acid based methods
1 Scope
This International Standard describes the procedure to qualitatively detect genetically modified organisms
(GMOs) and derived products by analysing the nucleic acids extracted from the sample under study. The main
focus is on polymerase chain reaction (PCR) based amplification methods.
It gives general requirements for the specific detection and identification of target nucleic acid sequences
(DNA) and for the confirmation of the identity of the amplified DNA sequence.
Guidelines, minimum requirements and performance criteria laid down in this International Standard are
intended to ensure that comparable, accurate and reproducible results are obtained in different laboratories.
This International Standard has been established for food matrices, but could also be applied to other
matrices (e.g. feed and plant samples from the environment).
Specific examples of methods are provided in Annexes A to D.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 21571:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Nucleic acid extraction
1)
ISO 24276:— , Foodstuffs — Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 24276 apply.

1) To be published.
4 Principle of the method
4.1 General
Qualitative analysis consists of specific detection of target nucleic acid sequences in the test samples. Each
method shall specify the target sequence.
A qualitative result shall clearly demonstrate the presence or absence of the genetic element under study,
relative to appropriate controls and within the detection limits of the analytical method used and test portion
analysed.
4.2 PCR amplification
Amplification of the target sequence occurs in vitro through a reaction catalysed by a DNA polymerase in the
[1], [2]
presence of oligonucleotide primers and deoxyribonucleoside triphosphates in a defined reaction buffer .
An important prerequisite for the amplification of the target sequence is that the reaction mixture contains no
polymerase inhibitors. Amplification of the DNA is a cyclical process consisting of
 denaturation of the double-stranded DNA into single-stranded nucleic acid by means of heating,
 annealing of the primers to the target sequence at a suitable temperature, and
 extension of the primers, which are bound to both single strands, by a DNA polymerase suitable for PCR,
at an appropriate temperature.
4.3 Detection and confirmation of PCR products
PCR products are detected by gel electrophoresis or an appropriate alternative, if necessary, after isolation by
means of a suitable separation procedure.
The identity of any detected target sequence can be verified by an appropriate technique (e.g. by restriction
enzyme analysis, by hybridization or by DNA sequence analysis).
In the case of real-time PCR analysis, amplification and detection occur simultaneously.
5 Reagents
It is generally advisable to store the reaction solutions required for the analytical method at approximately
–20 °C if not specified otherwise.
It may also be appropriate to aliquot the reaction solutions required for the analytical method in order to avoid
subjecting them to repeated freeze-thaw cycles, and/or to reduce chances of cross contamination.
5.1 Target DNA/control
5.2 Water
5.3 Deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) solution, containing dATP, dCTP, dGTP, and dTTP or
dUTP.
NOTE The use of dUTP can interfere with restriction enzyme analyses of PCR products.
2 © ISO 2005 – All rights reserved

5.4 PCR buffer solution
The PCR buffer solution is usually delivered with the DNA polymerase, which may or may not include MgCl
in a concentration specified by the manufacturer. The final MgCl concentrations are method specific and are
therefore listed in each annex. Ready-to-use reagents may be commercially available. The manufacturer’s
instructions for use should be considered.
5.5 Thermostable DNA polymerase
5.6 Forward primer
5.7 Reverse primer
6 Apparatus and equipment
See ISO 24276 and Annexes A to D for details.
7 Procedure
7.1 Quality, integrity and amplifiability of nucleic acid extracts
[3]
The nucleic acid solution shall be pure enough for subsequent analysis . The quality and amount of nucleic
acid extracted using a given method on a given matrix shall be both repeatable and reproducible.
NOTE The quality, integrity and amount of the DNA template influences the outcome of the PCR, and hence the
analytical results obtained. The limit of detection of a specific method may therefore depend on whether the material to be
analysed has been processed or refined, and on the degree of degradation of the DNA therein.
[4]
Nucleic acids for use in PCR should be substantially free of PCR inhibitors . PCR inhibition controls shall be
included as described in ISO 24276.
7.2 Performance criteria
General performance criteria are described in ISO 24276.
The values for the performance ch
...


NORME ISO
INTERNATIONALE 21569
Première édition
2005-06-15
Produits alimentaires — Méthodes
d'analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Méthodes
qualitatives basées sur l'utilisation
des acides nucléiques
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid
based methods
Numéro de référence
©
ISO 2005
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l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.

©  ISO 2005
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Version française parue en 2006
Publié en Suisse
ii © ISO 2005 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe de la méthode. 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage et équipements. 3
7 Mode opératoire . 3
8 Interprétation. 6
9 Expression des résultats et assurance qualité . 6
10 Rapport d’essai . 7
Annexe A (informative) Méthodes spécifiques au taxon. 8
Annexe B (informative) Méthodes de criblage . 25
Annexe C (informative) Méthodes spécifiques au construit. 41
Annexe D (informative) Méthodes spécifiques aux évènements . 64
Bibliographie . 69

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'ISO 21569 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires —
Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, conformément à l'Accord de coopération technique entre l'ISO et
le CEN (Accord de Vienne).
iv © ISO 2005 – Tous droits réservés

Introduction
La recherche d’une origine génétiquement modifiée dans les ingrédients est réalisée au moyen des étapes
successives (ou simultanées) suivantes. Après la collecte d’échantillons, des acides nucléiques sont extraits
de la prise d’essai et peuvent être encore purifiés, simultanément ou après le processus d’extraction. Ensuite,
ces acides nucléiques sont quantifiés (si nécessaire), dilués (si nécessaire) et soumis à des procédures
d’analyse (comme la PCR). Ces étapes sont détaillées dans la présente Norme internationale et dans la série
de Normes internationales suivante, qui a pour titre général: Produits alimentaires — Méthodes d’analyse
pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés:
⎯ Échantillonnage (ISO 21568);
⎯ Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques (ISO 21570);
⎯ Extraction des acides nucléiques (ISO 21571).
D’autres informations relatives aux exigences générales et aux définitions incluant les étapes mentionnées
ci-dessus sont rassemblées dans l’ISO 24276.
La détection qualitative permet de déterminer si des séquences d’ADN cibles sont présentes ou non à l’aide
de témoins appropriés et dans les limites de détection de la méthode analytique employée et de la prise
d’essai analysée.
Les méthodes décrites dans les Annexes A à D vont des méthodes de criblage pour la détection des
séquences d’ADN communes caractéristiques des OGM aux méthodes d’identification spécifique d’un
construit ou d’évènement de transformation spécifique.
L’Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l’attention sur le fait que la conformité avec le
présent document peut impliquer l’utilisation d’un brevet relatif à la technologie PCR.
L’ISO ne prend pas position en ce qui concerne la preuve, la validité et le domaine d’application du droit de
propriété intellectuelle concerné.
L’ISO a été informée que Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. et F. Hoffman La Roche Ltd.
détiennent des droits de propriété intellectuelle relatifs à la technologie PCR. Ces sociétés ont garanti à l’ISO
qu’elles souhaitent négocier des licences à des conditions raisonnables et non discriminatoires avec les
demandeurs du monde entier. À cet égard, les déclarations des détenteurs de ces droits de propriété
intellectuelle sont enregistrés avec l’ISO. Il est possible d’obtenir des informations aux adresses suivantes:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404
USA
et
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501
USA
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues autres que ceux identifiés ci-devant. L’ISO ne saurait être
tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

vi © ISO 2005 – Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 21569:2005(F)

Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des
acides nucléiques
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit le mode opératoire pour la détection qualitative des organismes
génétiquement modifiés (OGM) et produits dérivés par analyse des acides nucléiques extraits de l’échantillon
à l’étude. Elle couvre principalement les méthodes d’amplification fondées sur la réaction de polymérisation
en chaîne (PCR).
Elle concerne les exigences générales relatives à la détection et l’identification spécifiques de séquences
d’acides nucléiques cibles (ADN) et à la confirmation de l’identité de la séquence d’ADN amplifiée.
Les lignes directrices, les exigences minimales et les critères de performance exposés dans la présente
Norme internationale ont pour but de garantir l’obtention de résultats comparables et reproductibles dans
différents laboratoires.
La présente Norme internationale a été élaborée pour les matrices alimentaires mais pourrait également être
appliquée pour d’autres matrices (par exemple des aliments pour animaux et des échantillons de plantes
issus de l’environnement).
Des exemples spécifiques de méthodes sont fournis dans les Annexes A à D.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 21571:2005, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
1)
ISO 24276:— , Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 24276 s’appliquent.

1) À publier.
4 Principe de la méthode
4.1 Généralités
Une analyse qualitative consiste en la détection spécifique des séquences d’acides nucléiques cibles dans les
échantillons pour essai. Chaque méthode doit spécifier la séquence cible.
Un résultat qualitatif doit clairement indiquer la présence ou l’absence de l’élément génétique à l’étude,
recherchée à l’aide de témoins appropriés, dans les limites de détection de la méthode analytique employée
et de la prise d’essai analysée.
4.2 Amplification par PCR
L’amplification de la séquence cible est réalisée in vitro par une réaction catalysée par une ADN polymérase
en présence d’amorces d’oligonucléotides et de désoxyribonucléosides triphosphates dans un tampon de
[1], [2]
réaction déterminé . Pour pouvoir réaliser l’amplification de la séquence cible, il est important de vérifier
auparavant que le mélange réactionnel ne contient pas d’inhibiteur de polymérase. L’amplification de l’ADN
est un processus cyclique comprenant:
⎯ la dénaturation de l’ADN double brin en acide nucléique simple brin par chauffage;
⎯ l’hybridation des amorces de la séquence cible à une température appropriée; et
⎯ l’élongation des amorces, qui sont liées à chacun des simples brins, par une ADN polymérase à une
température appropriée.
4.3 Détection et confirmation des produits de PCR
Les produits de PCR sont détectés par électrophorèse sur gel ou à l’aide d’une autre technique appropriée, si
besoin est, après isolation réalisée suivant un mode opératoire de séparation adéquat.
L’identité de toute séquence cible détectée peut être vérifiée au moyen d’une méthode appropriée (par
exemple par des analyses utilisant des enzymes de restriction, par hybridation ou par analyse des séquences
d’ADN).
Dans les analyses par PCR en temps réel, l’amplification et la détection sont simultanées.
5 Réactifs
Il est en général conseillé de stocker les solutions de réaction nécessaires pour la méthode d’analyse à
environ –20 °C, sauf indication contraire.
Il peut également être approprié d’aliquoter les solutions de réaction nécessaires pour la méthode d’analyse
afin d’éviter de les soumettre à des cycles répétés de congélation-décongélation et/ou de réduire les risques
de contamination croisée.
5.1 ADN cible/témoin
5.2 Eau
5.3 Solution de désoxynucléotide triphosphate (dNTP), contenant les nucléotides dATP, dCTP, dGTP,
et dTTP ou dUTP.
NOTE L’utilisation de dUTP peut avoir une incidence sur les analyses des produits de PCR avec des enzymes de
restriction.
2 © ISO 2005 – Tous droits réservés

5.4 Solution tampon pour PCR
La solution tampon pour PCR est généralement livrée avec l’ADN polymérase, qui peut contenir ou non du
MgCl dont la concentration répond aux spécifications du fabricant. Le
...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.