ISO 20150:2019
(Main)Footwear and footwear components — Quantitative challenge test method to assess antifungal activity
Footwear and footwear components — Quantitative challenge test method to assess antifungal activity
This document specifies quantitative challenge test methods for evaluating the antifungal activity of footwear and footwear components. This document is applicable only to footwear and components that claim to have antifungal (antimycotic) properties or antimicrobial properties. Two methods can be applied. The choice of method depends on the material properties and test microorganisms. Dynamic challenge test method can be applied to all types of materials. For single absorbent materials, static challenge test method is recommended. Brief descriptions of each method are given in 11.2 and 11.3.
Chaussures et composants de chaussure — Méthode de test d'épreuve quantitatif pour évaluer l'activité antifongique
Le présent document spécifie des méthodes de test d'épreuve quantitatif permettant d'évaluer l'activité antifongique des chaussures et de leurs composants. Le présent document n'est applicable qu'aux chaussures et composants de chaussures pour lesquels des propriétés antifongiques (antimycotiques) ou antimicrobiennes sont revendiquées. Deux méthodes peuvent être appliquées. Le choix de la méthode dépend des propriétés du matériau et des micro-organismes d'essai. La méthode de test d'épreuve dynamique peut être appliquée à tous types de matériaux. Pour les matériaux absorbants non combinés, il est recommandé d'appliquer la méthode de test d'épreuve statique. Des descriptions succinctes de ces méthodes figurent en 11.2 et 11.3.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20150
First edition
2019-01
Footwear and footwear components —
Quantitative challenge test method to
assess antifungal activity
Chaussures et composants de chaussure — Méthode de test d'épreuve
quantitatif pour évaluer l'activité antifongique
Reference number
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ISO 2019
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ISO 20150:2019(E)
Contents Page
Foreword .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Safety . 2
6 Apparatus . 2
7 Reagents and culture medium . 3
7.1 General . 3
7.2 Water . 3
7.3 Malt medium . 3
7.3.1 Composition . 3
7.3.2 Preparation . 3
7.4 Malt extract agar (MEA) medium . 4
7.4.1 Composition . 4
7.4.2 Preparation . 4
7.5 Physiological saline (sodium chloride solution) . 4
7.5.1 Composition . 4
7.5.2 Preparation . 4
7.6 Wetting agent (nonionic surfactant) . 4
7.7 Buffer solution . 4
7.7.1 Buffer stock . 4
7.7.2 Preparation of buffer stock . 5
7.7.3 Preparation of buffer solution . 5
8 Test microorganisms . 5
9 Preparation of test inoculums . 5
9.1 Indications for use of strains . 5
9.2 Preparation of inoculums of Candida albicans . 6
9.3 Preparation of test spore suspension of filamentous micro-fungi . 6
10 Preparation of test specimens . 6
10.1 General . 6
10.2 Test specimen . 7
10.3 Pre-treatment of test specimen . 7
11 Test procedure . 7
11.1 Summary of test methods . 7
11.2 Dynamic challenge tests . 7
11.2.1 Inoculation . 7
11.2.2 Neutralization and elution after inoculation (time 0 h) . 8
11.2.3 Incubation . 8
11.2.4 Neutralization and elution after incubation (time 24 h) . 8
11.2.5 Determination of the number of viable micro-fungi . 8
11.3 Static challenge test . 8
11.3.1 Inoculation . 8
11.3.2 Neutralization and elution after inoculation (time 0 h) . 9
11.3.3 Incubation . 9
11.3.4 Neutralization and elution after incubation (time 24 h) . 9
11.3.5 Determination of the number of viable micro-fungi . 9
12 Expression of results . 9
12.1 Calculation of the number of viable micro-fungi . 9
12.2 Judgement of test effectiveness . 9
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ISO 20150:2019(E)
12.3 Calculation of antifungal activity ratio .10
13 Test report .10
Bibliography .12
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ISO 20150:2019(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 216, Footwear.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20150:2019(E)
Footwear and footwear components — Quantitative
challenge test method to assess antifungal activity
CAUTION — Test methods specified herein require the use of micro-fungi. These tests are only
to be carried out in facilities with containment techniques for handling microorganisms and by
persons with training and experience in the use of microbiological techniques.
1 Scope
This document specifies quantitative challenge test methods for evaluating the antifungal activity of
footwear and footwear components.
This document is applicable only to footwear and components that claim to have antifungal (antimycotic)
properties or antimicrobial properties.
Two methods can be applied. The choice of method depends on the material properties and test
microorganisms. Dynamic challenge test method can be applied to all types of materials. For single
absorbent materials, static challenge test method is recommended. Brief descriptions of each method
are given in 11.2 and 11.3.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 19952, Footwear — Vocabulary
3 Terms and definitions
For the purpose of this document, the terms and definitions given in ISO 19952 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
antifungal activity
antimycotic activity
efficacy of a material or finish used to prevent or mitigate the growth of micro-fungi, to reduce the
number of micro-fungi or to kill micro-fungi
3.2
control specimen
material identical to the test material but without antifungal treatment
Note 1 to entry: If no control specimen is available, sterilized conical flask can be used as control specimen.
© ISO 2019 – All rights reserved 1
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ISO 20150:2019(E)
3.3
neutralizer
chemical agents used to inactivate, neutralize, or quench the antifungal properties of antifungal agents
[SOURCE: ISO 20743:2013, 3.7, modified — “antibacterial” has been replaced with “antifungal”.]
4 Principle
The test specimens and control specimens are inoculated with a spore suspension of a selected test
strain of micro-fungi specified or claimed. Two test methods are available to assess antifungal activity.
Antifungal performance is quantitatively determined by counting the number of viable micro-fungi and
calculating the antifungal activity ratio.
5 Safety
The handling of microorganisms which are potentially hazardous requires a high degree of technical
competence and can be subject to current national legislation and regulations. Only personnel trained
in microbiological techniques should carry out such tests.
NOTE: Refer to country-specific codes of practice for personal hygiene, disinfection and sterilization.
It is recommended that the person who perform the test should consult IEC 60068-2-10:2005,
Appendix A, and ISO 7218.
6 Apparatus
6.1 General
Disposable apparatus is an acceptable alternative to re-usable glassware and plastic if it has suitable
specifications.
Usual microbiological laboratory equipment in accordance with ISO 7218 and in particular the
following.
6.2 Biological safety cabinet.
6.3 Incubator, capable of maintaining a temperature of (28 ± 2) °C.
6.4 Autoclave, capable of maintaining a temperature of (121 ± 2) °C and a pressure of (103 ± 5) kPa,
for wet sterilization, used in accordance with ISO 7218.
6.5 Humidity chamber, capable of maintaining a temperature of (28 ± 2) °C and a relative humidity of
(85 ± 5) %.
6.6 Ultraviolet lamp.
6.7 Wide mouth jars, with cap, 100 ml, capable of being used with an autoclave (6.4).
6.8 Vortex mixer.
6.9 Centrifugal machine, 2 000 × g.
6.10 Dimensional shaker, two dimensional or three dimensional, capable of adjusting to 50 r/min.
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6.11 Shaking incubator, capable of maintaining a temperature of (28 ± 2) °C and a rotational frequency
of (120 ± 10) r/min.
6.12 Glass beads, 2 mm to 3 mm in diameter, 10 beads to 15 beads per conical flask, for preparation of
fungal spore solutions.
6.13 Glass wool or medical gauze (double layers), for preparation of fungal spore solutions.
6.14 Oven, for dry sterilization.
6.15 pH-meter, capable of measuring to ±0,2 units.
6.16 Balance, capable of weighing to ±0,01 g.
6.17 Spectrophotometer, capable of measuring at 500 nm to 660 nm wavelength, or McFarland’s
nephelometer.
6.18 Petri dishes, that have been sterilized, made of glass or plastic, in diameter sizes of 90 mm to
100 mm or 55 mm to 60 mm.
6.19 Pipette, having the most suitable volume for each use.
7 Reagents and culture medium
7.1 General
The preparation and test shall be freshly prepared in order to ensure the culture quality.
NOTE This could be done according to ISO 11133, or according to national standards or regulations.
Reagents used in tests shall be of analytical grade and/or suited for microbiological purposes.
7.2 Water
Water used in tests shall be analytical-grade water for microbiological media preparation, which is
freshly distilled and/or ion-exchanged and/or ultra-filtered and/or filtered with reverse osmosis.
It shall be free from all toxic or microorganism inhibitory substances.
7.3 Malt medium
7.3.1 Composition
Malt extract 30,0 g
Soya peptone 3,0 g
Water 1 000 ml
7.3.2 Preparation
Dissolve the designated amounts of components in distilled water, stir and adjust pH to (5,5 ± 0,2) at
room temperature, sterilize at (121 ± 2) °C for 15 min in an autoclave (6.4) with saturated water vapour.
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7.4 Malt extract agar (MEA) medium
7.4.1 Composition
Malt extract 30,0 g
Soya peptone 3,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
7.4.2 Preparation
After mixing, stir and adjust pH to (5,5 ± 0,2) at room temperature. Heat with stirring on a hotplate
or in a boiling-water bath until the compo
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20150
Première édition
2019-01
Chaussures et composants de
chaussure — Méthode de test
d'épreuve quantitatif pour évaluer
l'activité antifongique
Footwear and footwear components — Quantitative challenge test
method to assess antifungal activity
Numéro de référence
ISO 20150:2019(F)
©
ISO 2019
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ISO 20150:2019(F)
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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ISO 20150:2019(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Sécurité . 2
6 Appareillage . 2
7 Réactifs et milieu de culture . 3
7.1 Généralités . 3
7.2 Eau . 3
7.3 Milieu à l’extrait de malt . 4
7.3.1 Composition . 4
7.3.2 Préparation . 4
7.4 Milieu de gélose à l’extrait de malt (MEA) . 4
7.4.1 Composition . 4
7.4.2 Préparation . 4
7.5 Solution physiologique (solution de chlorure de sodium). 4
7.5.1 Composition . 4
7.5.2 Préparation . 4
7.6 Agent mouillant (tensioactif non ionique) . 5
7.7 Solution tampon. 5
7.7.1 Solution tampon mère. 5
7.7.2 Préparation de la solution tampon mère . 5
7.7.3 Préparation de la solution tampon . 5
8 Micro-organismes d’essai . 5
9 Préparation des inoculums d’essai . 6
9.1 Indications relatives à l’utilisation des souches . 6
9.2 Préparation des inoculums de Candida albicans . 6
9.3 Préparation de la suspension de spores d’essai de micromycètes filamenteux . 7
10 Préparation des éprouvettes d’essai . 7
10.1 Généralités . 7
10.2 Éprouvette d’essai . 7
10.3 Prétraitement des éprouvettes d’essai . 8
11 Mode opératoire d’essai. 8
11.1 Résumé des méthodes d’essai . 8
11.2 Tests d’épreuve dynamiques . 8
11.2.1 Inoculation . 8
11.2.2 Neutralisation et élution après inoculation (temps zéro) . 8
11.2.3 Incubation . 9
11.2.4 Neutralisation et élution après incubation (temps 24 h) . 9
11.2.5 Détermination du nombre de micromycètes viables . 9
11.3 Test d’épreuve statique . 9
11.3.1 Inoculation . 9
11.3.2 Neutralisation et élution après inoculation (temps zéro) . 9
11.3.3 Incubation .10
11.3.4 Neutralisation et élution après incubation (temps 24 h) .10
11.3.5 Détermination du nombre de micromycètes viables .10
12 Expression des résultats.10
12.1 Calcul du nombre de micromycètes viables.10
12.2 Jugement de l’efficacité de l’essai.10
© ISO 2019 – Tous droits réservés iii
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ISO 20150:2019(F)
12.3 Calcul du taux d’activité antifongique .11
13 Rapport d’essai .11
Bibliographie .13
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 20150:2019(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 216, Chaussure.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
© ISO 2019 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 20150:2019(F)
Chaussures et composants de chaussure — Méthode de test
d'épreuve quantitatif pour évaluer l'activité antifongique
PRÉCAUTIONS — Les méthodes d’essai spécifiées dans le présent document nécessitent
l’utilisation de micromycètes. Ces essais doivent être réalisés exclusivement dans des
installations comportant des dispositifs de confinement adaptés à la manipulation des
micro-organismes et par des personnes formées et expérimentées dans la mise en œuvre des
techniques microbiologiques.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des méthodes de test d’épreuve quantitatif permettant d’évaluer l’activité
antifongique des chaussures et de leurs composants.
Le présent document n’est applicable qu’aux chaussures et composants de chaussures pour lesquels des
propriétés antifongiques (antimycotiques) ou antimicrobiennes sont revendiquées.
Deux méthodes peuvent être appliquées. Le choix de la méthode dépend des propriétés du matériau et
des micro-organismes d’essai. La méthode de test d’épreuve dynamique peut être appliquée à tous types
de matériaux. Pour les matériaux absorbants non combinés, il est recommandé d’appliquer la méthode
de test d’épreuve statique. Des descriptions succinctes de ces méthodes figurent en 11.2 et 11.3.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 19952, Chaussures — Vocabulaire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 19952 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
activité antifongique
activité antimycotique
efficacité d’un matériau ou d’un apprêt servant à empêcher ou à limiter la croissance des micromycètes,
à réduire leur nombre ou à les tuer
© ISO 2019 – Tous droits réservés 1
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ISO 20150:2019(F)
3.2
éprouvette témoin
matériau identique au matériau d’essai mais n’ayant pas subi de traitement antifongique
Note 1 à l'article: À défaut d’éprouvette témoin, une fiole conique stérilisée peut être utilisée en tant que telle.
3.3
neutralisant
agents chimiques servant à inactiver, neutraliser ou stopper les propriétés antifongiques des agents
antifongiques
[SOURCE: ISO 20743:2013, 3.7, modifiée — le terme «antibactérien(ne)s» a été remplacé par
«antifongiques».]
4 Principe
Des éprouvettes d’essai et des éprouvettes témoins sont ensemencées avec une suspension de spores
provenant d’une souche d’essai sélectionnée de micromycètes spécifiés ou revendiqués. Deux méthodes
d’essai sont disponibles afin d’évaluer l’activité antifongique.
L’efficacité antifongique est déterminée quantitativement en procédant au comptage des micromycètes
viables et en calculant le taux d’activité antifongique.
5 Sécurité
La manipulation de micro-organismes qui sont potentiellement dangereux nécessite un haut degré de
compétence technique et peut être soumise à la législation et aux règlementations nationales en vigueur.
Il convient que seul le personnel formé aux techniques microbiologiques puisse effectuer de tels essais.
NOTE Se référer aux codes nationaux de bonne pratique relatifs à l’hygiène personnelle, à la désinfection et à
la stérilisation.
Il convient que la personne réalisant les essais consulte l’IEC 60068-2-10:2005, Annexe A, et l’ISO 7218.
6 Appareillage
6.1 Généralités
Un appareillage jetable constitue une variante acceptable à la verrerie et au plastique réutilisables, si
ledit appareillage présente les spécifications appropriées.
Utiliser l’équipement de laboratoire microbiologique courant, conformément à l’ISO 7218, et notamment
les éléments suivants.
6.2 Poste de sécurité biologique.
6.3 Incubateur, permettant de maintenir une température de (28 ± 2) °C.
6.4 Autoclave, permettant de maintenir une température de (121 ± 2) °C et une pression de
(103 ± 5) kPa, pour stérilisation humide, utilisé conformément à l’ISO 7218.
6.5 Chambre en atmosphère humide, permettant de maintenir une température de (28 ± 2) °C et
une humidité relative de (85 ± 5) %.
6.6 Lampe à ultraviolets.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 20150:2019(F)
6.7 Récipients à large ouverture, d’une contenance de 100 ml, munis d’un bouchon, pouvant être
utilisés en autoclave (6.4).
6.8 Agitateur vortex.
6.9 Centrifugeuse, 2 000 × g.
6.10 Agitateur, bidimensionnel ou tridimensionnel, pouvant être réglé à 50 r/min.
6.11 Incubateur à agitation, permettant de maintenir une température de (28 ± 2) °C et une fréquence
de rotation de (120 ± 10) r/min.
6.12 Billes de verre, d’un diamètre compris entre 2 mm et 3 mm, entre 10 billes et 15 billes par fiole
conique, utilisées pour la préparation des solutions de spores fongiques.
6.13 Laine de verre ou gaze médicale (double couche), utilisée pour la préparation des solutions de
spores fongiques.
6.14 Four, pour stérilisation à sec.
6.15 pH-mètre, permettant de mesurer à ± 0,2 unités près.
6.16 Balance, permettant de peser à ± 0,01 g près.
6.17 Spectrophotomètre, permettant de mesurer aux longueurs d’ondes comprises entre 500 nm et
660 nm, ou néphélomètre de McFarland.
6.18 Boîtes de Petri, en verre ou en plastique, stérilisées et dont le diamètre est compris entre 90 mm
et 100 mm ou entre 55 mm et 60 mm.
6.19 Pipette, présentant le volume le mieux adapté pour chaque utilisation.
7 Réactifs et milieu de culture
7.1 Généralités
Le milieu de culture doit être fraîchement préparé avant l’essai de manière à garantir la qualité de la
mise en culture.
NOTE Pour ce faire, il est possible de procéder selon l’ISO 11133 ou selon des normes ou réglementations
nationales.
Les réactifs utilisés lors des essais doivent être de qualité analytique et/ou adaptés à des fins
microbiologiques.
7.2 Eau
L’eau utilisée lors des essais doit être de qualité analytique pour la préparation des milieux
microbiologiques; cette eau est fraîchement distillée et/ou déionisée et/ou ultrafiltrée et/ou filtrée par
osmose inverse.
Elle doit être exempte de toute substance toxique ou inhibitrice de micro-organismes.
© ISO 2019 – Tous droits réservés 3
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ISO 20150:2019(F)
7.3 Milieu à l’extrait de malt
7.3.1 Composition
Extrait de malt 30,0 g
Peptone de soja 3,0 g
Eau 1 000 ml
7.3.2 Préparation
Dissoudre les quantités de composants indiquées dans l’eau distillée, agiter et ajuster le pH à (5,5 ± 0,2)
à température ambiante. Stériliser à (121 ± 2) °C pendant 15 min en autoclave (6.4) à vapeur d’eau
saturée.
7.4 Milieu de gélose à l’extrait de malt (MEA)
7.4.1 Composition
Extrait de malt 30,0 g
Peptone de soja 3,0 g
Agar-agar 15,0 g
Eau 1 000 ml
7.4.2 Préparation
Après mélange, agiter et ajuster le pH à (5,5 ± 0,2) à température ambiante. Tout en agitant, chauffer sur
une plaque chauffante ou dans un bain-marie jusqu’à complète dissolution des composants. Stériliser
à (121 ± 2) °C pendant 15 min en autoclave (6.4) à vapeur d’eau saturée. Refroidir, bien agiter et verser
dans les boîtes de Petri.
NOTE La gélose dextrosée à la pomme de terre (PDA) peut également constituer un milieu de culture
complet pour la croissance de micromycètes. Le milieu PDA standard peut être obtenu dans le commerce, ce
qui permet de se dispenser des étapes préparatoires de cuisson et d’éviter les écarts liés à la composition des
différentes espèces de pommes de terre. Le milieu PDA du commerce, de composition standard, peut être utilisé
pour prévenir les influences dues à la composition des pommes de terre et à leur mode de préparation et de
cuisson. Le milieu de gélose à l’extrait de malt (MEA) peut également être obtenu dans le commerce.
7.5 Solution physiologique (solution de chlorure de sodium)
7.5.1 Composition
Chlorure de sodium, NaCl 8,5 g
Eau 1 000 ml
7.5.2 Préparation
Après avoir bien mélangé, ajuster le pH à (6,9 ± 0,2) à température ambiante et stériliser à (121 ± 2) °C
pendant 15 min.
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7.6 Agent mouillant (tensioactif non ionique)
Utilisé pour la récolte des spores, il est nécessaire qu’il ne réagisse pas avec d’autres réactifs et qu’il
n’entraîne ni augmentation ni réduction du nombre de micromycètes; par exemple: polysorbate 80
1)
TM
(TWEEN 80), N-méthyltauride, Triton X-100 , éther polyglycolique, etc.
NOTE L’agent mouillant (tensioactif non ionique) peut être utilisé lorsque l’éprouvette est enduite.
7.7 Solution tampon
7.7.1 Solution tampon mère
Dihydrogénophosphate de potassium, KH PO 34,0 g
2 4
Eau 1 000 ml
7.7.2 Préparation de la solution tampon mère
Préparer une solution tampon phosphatée en introduisant 34,0 g de dihydrogénophosphate de
potassium dans une fiole jaugée de 1 000 ml. Ajouter 500 ml d’eau et mélanger jusqu’à dissolution.
Ajuster le pH à (7,2 ± 0,2), à température ambiante, avec de l’hydroxyde de sodium. Ajouter de l’eau
distillée pour compléter au volume de 1 000 ml.
7.7.3 Préparation de la solution tampon
Transférer 1 ml de solution tampon mère et 0,08 g d’agent mouillant (tensioactif non ionique) (7.6),
soit 0,01 %, et diluer à 800 ml avec de l’eau distillée. Après avoir bien mélangé, stériliser à (121 ± 2) °C
pendant 15 min.
NOTE Si l’agent mouillant (tensioactif non ionique) n’est pas nécessaire, il est possible de s’en passer.
8 Micro-organismes d’essai
Les souches utilisées doivent être consignées dans le rapport d’essai.
Les espèces devant être utilisées pour les essais d’activité antifongique sont listées au Tableau 1.
1) TritonTM X-100 est l’appellation commerciale d’un produit distribué par SIGMA-ALDRICH. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou
recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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Tableau 1 — Souches d’essai
a o o o
Micromycètes Nom N WDCM N CGMCC N ATCC
TM b
Levure Candida albicans 00054 AS 1.2031 ATCC® 10231
TM b
Aspergillus niger 00144 AS 3.4463 ATCC® 6275
Micromycètes filamenteux/Moisissure
TM b
Aspergillus brasiliensis 00053 AS 3.5487 ATCC® 16404
TM b
Micromycètes filamenteux/Derma- Trichophyton menta- 00191 — ATCC® 9533
tophytes grophytes
Légende
WDCM: World Data Centre for Microogranisms (Centre mondial de données sur les micro-organismes)
CGMCC: China General Microbiological Culture Collection Centre (Centre général chinois de cultures microbiologiques)
ATCC®: American Type Culture Collection (Collection américaine de cultures types)
NOTE 1 Se référer au WDCM et à son site: http: //refs .wdcm .org.
NOTE 2 D’autres micromycètes (issus d’espèces ou d’autres souches appropriées) peuvent être utilisés après validation
appropriée.
a
Les souches d’essai doivent provenir des agences de la World Federation of Culture Collection (WFCC – Fédération
mondiale des collections de cultures). Les espèces de micromycètes et leur provenance doivent être consignées dans les
rapports d’essai.
b TM TM TM TM
ATCC® 10231 , ATCC® 6275 , ATCC® 16404 et ATCC® 9533 sont des exemples de produits appropriés
disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie
nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
L’essai à la levure (Candida albicans) est obligatoire.
Lorsqu’une activité antimoisissure est revendiquée, il doit être procédé à l’essai avec une souche de
moisissure.
Lorsqu’une activité antidermatophyte est revendiquée, il doit être procédé à l’essai au Trichophyton
mentagrophytes.
Les souches peuvent être conservées conformément aux indications du fournisseur ou selon l’EN 12353.
9 Préparation des inoculums d’essai
9.1 Indications relatives à l’utilisation des souches
Utiliser les souches sous 4 générations au maximum.
9.2 Préparation des inoculums de Candida albicans
9.2.1 À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, transférer une colonie de Candida albicans dans 20 ml
de milieu à l’extrait de malt (7.3) et incuber dans l’incubateur à agitation à (28 ± 2) °C pendant 16 h à
20 h environ (culture nocturne), ou incuber sur une plaque de milieu PDA standard à (28 ± 2) °C pendant
24 h à 48 h environ.
9.2.2 Préparer une solution tampon (7.7) fraîche, sans agent mouillant (tensioactif non ionique) (7.6),
et utiliser ce milieu pour préparer une suspension. Estimer le nombre de cellules de levure en utilisant
la méthode par dénombrement sur plaque de gélose, la méthode spectrophotométrique ou toute autre
méthode appropriée, avec des inoculums d’essai présentant une concentration en levure comprise entre
5 5
1,0 × 10 UFC/ml et 5,0 × 10 UFC/ml.
Si nécessaire, conserver les inoculums d’essai à température ambiante et les utiliser dans les 2 h.
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9.3 Préparation de la suspension de spores d’essai de micromycètes filamenteux
9.3.1 Ensemencer la surface du milieu MEA (7.4) (ou PDA) avec les spores de micromycètes et
incuber à (28 ± 2) °C jusqu’à ce que la surface soit totalement recouverte de spores de micromycètes
(1 semaine à 2 semaines environ pour Aspergillus et 2 semaines à 3 semaines environ pour Trichophyton).
9.3.2 Introduire, dans chaque tube ou plaque de culture, 5 ml de solution physiologique (7.5). Un agent
mouillant (tensioactif non ionique) (7.6) non toxique peut être ajouté, avec une concentration finale de
0,01 %. Racler doucement la surface de la culture sporulante à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile,
afin d’obtenir une suspension aqueuse de spores. Agiter doucement le tube ou la plaque de culture pour
disperser les spores dans le liquide. Évacuer les spores en versant le liquide dans une fiole conique stérile
contenant des billes de verre stériles. Répéter 2 fois ce mode opératoire avec chaque tube ou plaque
de culture. Agiter la fiole conique pour obtenir une suspension de spores parfaitement homogène. Pour
chaque culture fongique, la suspension de spores est filtrée au moins 2 fois à travers des doubles couches
de gaze médicale ou de laine de verre, afin de retirer les fragments mycéliens ou les blocs de gélose et de
séparer les spores agglomérés.
Centrifuger, en conditions d’asepsie, la suspension de spores filtrée avec une force centrifuge de 2 000 g
pendant 1 min; éliminer la couche supérieure de liquide. Remettre le résidu en suspension dans 20 ml de
solution physiologique (7.5) et centrifuger à nouveau. Répéter le lavage des spores au moins 3 fois selon
cette méthode. Diluer les suspensions de spores avec la solution tampon (7.7). Ajuster la concentration
6 6
à une valeur comprise entre 1,0 × 10 spores par millilitre et 5,0 × 10 spores par millilitre, en la
déterminant à l’aide d’une cellule de comptage. D’autres méthodes appropriées peuvent également être
employées pour déterminer la concentration en spores. Utiliser la suspension de spores fraîchement
préparée ou la stocker entre 2 °C et 8 °C au réfrigérateur dans les 3 jours suivant la préparation.
NOTE En raison du taux de récupération éventuellement plus faible des spores fongique
...
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