ISO 11781:2025
(Main)Molecular biomarker analysis — Requirements and guidance for single-laboratory validation of qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods
Molecular biomarker analysis — Requirements and guidance for single-laboratory validation of qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods
This document specifies minimum requirements and minimum performance criteria for conducting a single-laboratory validation study for qualitative (binary) real-time polymerase chain reaction (PCR) methods applied to the detection of specific DNA sequences present in foods. The document is applicable to any single-laboratory validation of a qualitative real-time PCR method used for the detection of specific DNA sequences in food and food products (e.g. for the detection of genetically modified foodstuffs and for species determination, including species known to produce allergenic proteins). The document does not apply to single laboratory validation of qualitative microbiological real-time PCR methods. The document does not apply to the evaluation of applicability and practicability with respect to the specific scope of the PCR method.
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Exigences et recommandations pour la validation intralaboratoire des méthodes de PCR qualitative en temps réel
Le présent document spécifie les exigences minimales et les critères de performance minimaux pour la réalisation d’une étude de validation intralaboratoire relative aux méthodes de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) qualitative (binaire) en temps réel appliquées à la détection de séquences d’ADN spécifiques présentes dans les aliments. Le document est applicable à toute validation intralaboratoire de méthode de PCR qualitative en temps réel utilisée pour la détection de séquences d’ADN spécifiques dans les aliments et les produits alimentaires (par exemple pour la détection de produits alimentaires génétiquement modifiés et la détermination d’espèces, y compris les espèces connues pour produire des protéines allergènes). Le document ne s’applique pas à la validation intralaboratoire de méthodes de PCR qualitative en temps réel utilisées en microbiologie. Le document ne s’applique pas à l’évaluation de l’applicabilité et de la faisabilité en ce qui concerne le domaine d’application spécifique de la méthode de PCR.
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ISO 11781
First edition
Molecular biomarker analysis —
2025-04
Requirements and guidance for
single-laboratory validation of
qualitative real-time polymerase
chain reaction (PCR) methods
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Exigences et
recommandations pour la validation intralaboratoire des
méthodes de PCR qualitative en temps réel
Reference number
© ISO 2025
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Single-laboratory validation of the performance characteristics . 2
5.1 General .2
5.2 Limit of detection .2
5.3 Determining copies of DNA target sequences in DNA test materials .3
5.4 Evaluation of data for the limit of detection .3
5.5 PCR efficiency and variability of the measured copy number around the limit of
detection .4
5.6 Specificity .4
5.6.1 General .4
5.6.2 Bioinformatic (in silico) test for specificity .4
5.6.3 Practical test for specificity .4
5.6.4 Robustness . .5
6 Validation report . 6
Annex A (informative) Estimation of the number of copies of the DNA target sequence . 7
Annex B (informative) Determination of limit of detection, precision and PCR efficiency . 9
Annex C (informative) Generalized linear mixed model with log-log link .13
Annex D (informative) Robustness testing . 19
Bibliography .21
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis, in collaboration with the European Committee for
Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 275, Food analysis - Horizontal methods, in accordance
with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
Qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods currently find broad application for the
detection of specific DNA sequences in food (e.g. for the detection and identification of genetically modified
organisms and the products derived thereof, for food authentication and speciation and for other purposes). It
is important that a newly developed food analytical method is fit for purpose and meets certain performance
characteristics and quality criteria as demonstrated by a particular set of validation experiments.
The data determined by the single laboratory validation are the basis for the decision to apply a method
in-house. Furthermore, it helps to decide whether the method in question should be fully validated in
the framework of a collaborative study. The statistical model described has been practically applied, e.g.
[1][2] [3]
some parts of the ISO/TS 21569 series and ISO/TS 20224 series . Other models can be applicable, see
[4]
ISO/TS 16393 .
The aim of this document is to provide a protocol for single-laboratory validation of qualitative real-time
PCR methods that are applied for food analysis. Procedures for DNA extraction from the food matrix are not
included in this document. The procedure described is a recommendation which is underpinned by practical
experience in several laboratories. Alternate approaches may be applied if they can be shown to meet the
performance criteria set in this document.
v
International Standard ISO 11781:2025(en)
Molecular biomarker analysis — Requirements and guidance
for single-laboratory validation of qualitative real-time
polymerase chain reaction (PCR) methods
1 Scope
This document specifies minimum requirements and minimum performance criteria for conducting a single-
laboratory validation study for qualitative (binary) real-time polymerase chain reaction (PCR) methods
applied to the detection of specific DNA sequences present in foods.
The document is applicable to any single-laboratory validation of a qualitative real-time PCR method used
for the detection of specific DNA sequences in food and food products (e.g. for the detection of genetically
modified foodstuffs and for species determination, including species known to produce allergenic proteins).
The document does not apply to single laboratory validation of qualitative microbiological real-time PCR
methods.
The document does not apply to the evaluation of applicability and practicability with respect to the specific
scope of the PCR method.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Vocabulary for molecular biomarker analytical methods in
agriculture and food production
ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Nucleic acid extraction
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
probability of detection
POD
probability of a positive analytical outcome of a qualitative method for a given matrix at a given concentration
in a single laboratory
Note 1 to entry: For a qualitative real-time PCR method, it describes the probability that, for a given number of DNA
copies of the target sequence, PCR amplification will take place.
[SOURCE: ISO 16577:2022, 3.9.12, modified — Note 1 to entry replaced Notes 1 and 2 to entry.]
3.2
polymerase chain reaction efficiency
PCR efficiency
measured amplification rate for a DNA copy of the target sequence per PCR cycle in relation to the
theoretically achievable value of 1
Note 1 to entry: The PCR efficiency is calculated from the slope of a standard curve resulting from the decadic
semi-logarithmic plot of quantification cycle (Cq) values over the DNA concentration. The slope from the calculated
regression line can be used. The PCR efficiency can either be expressed as absolute number or as percentage.
3.3
limit of detection
LOD
95 %
mean number of DNA copies of the target sequence yielding a probability of detection (3.1) of 0,95
3.4
specificity
property of a method to respond exclusively to the characteristic or analyte under investigation
[SOURCE: ISO 24276:2006, 3.1.4]
4 Principle
Specific primers and also probes, depending on the detection system applied, are designed for specific
amplification and detection of a DNA target sequence by a qualitative real-time PCR method. In the next step
for single laboratory validation, the method’s performance characteristics shall be assessed to show that the
[5][6]
method complies with the quality criteria stipulated in relevant documents.
For a qualitative real-time PCR method, the main focus of the validation shall be the limit of detection
(LOD ) (at which the probability of detection (POD) is ≥ 95 %), the specificity for the DNA target sequence
95 %
and the robustness to small but deliberate variations in the method parameters.
On the basis of single laboratory validation data, fulfilment of the minimum required performance criteria
for a qualitative real-time PCR method can be verified and should comprise the basis for applicability of
the method by a single laboratory. A further decision whether to conduct a validation of the method in the
framework of a collaborative study can then be taken.
Determination of the repro
...
Norme
internationale
ISO 11781
Première édition
Analyse de biomarqueurs
2025-04
moléculaires — Exigences
et recommandations pour la
validation intralaboratoire des
méthodes de PCR qualitative en
temps réel
Molecular biomarker analysis — Requirements and guidance for
single-laboratory validation of qualitative real-time polymerase
chain reaction (PCR) methods
Numéro de référence
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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Tél.: +41 22 749 01 11
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Validation intralaboratoire des caractéristiques de performance . 3
5.1 Généralités .3
5.2 Limite de détection .3
5.3 Détermination du nombre de copies de séquences cibles d’ADN dans les matériaux
d’essai d’ADN .3
5.4 Évaluation des données relatives à la limite de détection .3
5.5 Efficacité de la PCR et variabilité du nombre mesuré de copies autour de la limite de
détection .4
5.6 Spécificité .4
5.6.1 Généralités .4
5.6.2 Essai bioinformatique (in silico) de spécificité .4
5.6.3 Essai pratique de spécificité .5
5.6.4 Robustesse .5
6 Rapport de validation . 6
Annexe A (informative) Estimation du nombre de copies de la séquence cible d’ADN . 8
Annexe B (informative) Détermination de la limite de détection, de la fidélité et de l’efficacité
de la PCR . 10
Annexe C (informative) Modèle mixte linéaire généralisé avec lien log-log . 14
Annexe D (informative) Essai de robustesse .20
Bibliographie .22
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse de biomarqueurs moléculaires, en collaboration avec le comité
technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires - Méthodes horizontales, du Comité européen de
normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de
Vienne).
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Les méthodes de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) qualitative en temps réel sont aujourd’hui
largement utilisées pour la détection de séquences d’ADN spécifiques dans les aliments (par exemple
pour la détection et l’identification d’organismes génétiquement modifiés et de leurs produits dérivés,
pour l’authentification et la spéciation des aliments et pour d’autres fins). Il est important qu’une méthode
d’analyse des aliments récemment mise au point soit adaptée à l’usage prévu et réponde à certaines
caractéristiques de performance et certains critères de qualité définis par un ensemble particulier
d’expériences de validation.
Les données déterminées par la validation intralaboratoire servent à décider de l’application d’une
méthode en interne. De plus, elles permettent de déterminer s’il convient que la méthode en question
soit intégralement validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires. Le modèle statistique décrit a été
[1][2]
appliqué dans la pratique, par exemple dans certaines parties de la série ISO/TS 21569 et de la série
[3] [4]
ISO/TS 20224 . D’autres modèles sont applicables, voir l’ISO/TS 16393 .
Le présent document vise à fournir un protocole de validation intralaboratoire des méthodes de PCR
qualitative en temps réel qui sont appliquées dans le domaine de l’analyse des aliments. Les procédures
d’extraction d’ADN de la matrice alimentaire ne figurent pas dans le présent document. Le mode
opératoire décrit est une recommandation étayée par l’expérience pratique dans plusieurs laboratoires.
D’autres approches peuvent être appliquées s’il peut être démontré qu’elles satisfont aux critères de
performance définis dans le présent document.
v
Norme internationale ISO 11781:2025(fr)
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Exigences et
recommandations pour la validation intralaboratoire des
méthodes de PCR qualitative en temps réel
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les exigences minimales et les critères de performance minimaux pour la
réalisation d’une étude de validation intralaboratoire relative aux méthodes de réaction de polymérisation
en chaîne (PCR) qualitative (binaire) en temps réel appliquées à la détection de séquences d’ADN spécifiques
présentes dans les aliments.
Le document est applicable à toute validation intralaboratoire de méthode de PCR qualitative en temps réel
utilisée pour la détection de séquences d’ADN spécifiques dans les aliments et les produits alimentaires
(par exemple pour la détection de produits alimentaires génétiquement modifiés et la détermination
d’espèces, y compris les espèces connues pour produire des protéines allergènes).
Le document ne s’applique pas à la validation intralaboratoire de méthodes de PCR qualitative en temps réel
utilisées en microbiologie.
Le document ne s’applique pas à l’évaluation de l’applicabilité et de la faisabilité en ce qui concerne le domaine
d’application spécifique de la méthode de PCR.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 16577, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Vocabulaire pour les méthodes d’analyse de biomarqueurs
moléculaires dans l’agriculture et la production agroalimentaire
ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16577 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
probabilité de détection
POD
probabilité d’obtenir un résultat d’analyse positif à partir d’une méthode qualitative pour une matrice
donnée à une concentration donnée dans un seul laboratoire
Note 1 à l'article: Pour une méthode de PCR qualitative en temps réel, elle décrit la probabilité que pour un nombre
donné de copies d’ADN de la séquence cible, l’amplification par PCR ait lieu.
[SOURCE: ISO 16577:2022, 3.9.12, modifié — La Note 1 à l’article remplace les Notes 1 et 2 à l’article.]
3.2
efficacité de la réaction de polymérisation en chaîne
efficacité de la PCR
taux d’amplification mesuré pour une copie d’ADN de la séquence cible par cycle PCR par rapport à la valeur
théorique de 1
Note 1 à l'article: L’efficacité de la PCR est calculée d’après la pente d’une courbe d’étalonnage résultant du graphique
semi-logarithmique décimal des valeurs du cycle de quantification (Cq) au-dessus de la concentration d’
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.