Foodstuffs -- Molecular biomarker analysis -- Protein-based methods

ISO 21572:2013 provides general guidelines and performance criteria for methods for the detection and/or quantification of specific proteins or protein(s) of interest [POI(s)] in a specified matrix. These general guidelines address existing antibody based methods. Methods other than those described in Annex A or Annex B can also detect the POI. The same criteria as outlined in ISO 21572:2013 apply generally.

Produits alimentaires -- Analyse des biomarqueurs moléculaires -- Méthodes basées sur les protéines

L'ISO 21572:2013 énonce des lignes directrices et des critčres de performances généraux pour les méthodes de détection et/ou de quantification de protéines spécifiques ou de protéine(s) d'intéręt [POI] dans une matrice donnée. Ces lignes directrices générales concernent les méthodes basées sur des anticorps existants. Il existe d'autres méthodes que celles décrites en Annexe A ou B susceptibles de détecter des POI. Les męmes critčres que ceux répertoriés dans l'ISO 21572:2013 sont applicables de façon générale.

General Information

Status
Replaced
Publication Date
04-Feb-2013
Withdrawal Date
04-Feb-2013
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
20-Dec-2012
Completion Date
05-Feb-2013
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ISO 21572:2013 - Foodstuffs -- Molecular biomarker analysis -- Protein-based methods
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ISO 21572:2013 - Produits alimentaires -- Analyse des biomarqueurs moléculaires -- Méthodes basées sur les protéines
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21572
Second edition
2013-02-01
Foodstuffs — Molecular biomarker
analysis — Protein-based methods
Produits alimentaires — Analyse des biomarqueurs moléculaires —
Méthodes basées sur les protéines
Reference number
ISO 21572:2013(E)
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21572:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

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Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21572:2013(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

3.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 1

3.2 Terms relating to antibodies ....................................................................................................................................................... 2

3.3 Terms relating to techniques ...................................................................................................................................................... 2

3.4 Terms relating to control ................................................................................................................................................................ 3

3.5 Terms relating to validation ........................................................................................................................................................ 3

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 6

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 6

6 Laboratory equipment ................................................................................................................................................................................... 6

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 6

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 7

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7

8.2 Preparation of sample solution ................................................................................................................................................ 7

8.3 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 7

8.4 Preparation of calibration curves, positive controls and reference materials ................................. 7

8.5 Assay procedure .................................................................................................................................................................................... 7

9 Interpretation and expression of results .................................................................................................................................... 8

9.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 8

9.2 Quantitative and semiquantitative analysis ................................................................................................................... 8

9.3 Qualitative analysis ............................................................................................................................................................................. 8

10 Specific parameters which may influence results ............................................................................................................. 8

10.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 8

10.2 Special considerations ...................................................................................................................................................................... 9

10.3 Assay applicability ............................................................................................................................................................................... 9

11 Confirmation method ...................................................................................................................................................................................10

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................10

Annex A (informative) Detection of a protein by ELISA .................................................................................................................12

Annex B (informative) Detection of protein(s) by lateral flow devices .........................................................................22

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................29

© ISO 2013 – All rights reserved iii
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ISO 21572:2013(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International

Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.

Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies

casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 21572 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 21572:2004), which has been technically

revised. It also incorporates the Technical Corrigendum ISO 21572:2004/Cor. 1:2005.

iv © ISO 2013 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21572:2013(E)
Foodstuffs — Molecular biomarker analysis — Protein-
based methods

WARNING — Follow all instructions provided by the kit/reagent manufacturers and other standard

laboratory safety procedures. Read and implement the material safety data sheets (MSDS).

1 Scope

This International Standard provides general guidelines and performance criteria for methods for the

detection and/or quantification of specific proteins or protein(s) of interest [POI(s)] in a specified matrix.

These general guidelines address existing antibody based methods. Methods other than those described

in Annex A or Annex B can also detect the POI. The same criteria as outlined in this International

Standard apply generally.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived

products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 24276 and the following apply.

3.1 General
3.1.1
sample
subset of a population made up of one or more sampling units
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 1.2.17]
3.1.2
laboratory sample

sample (3.1.1) as prepared for sending to the laboratory and intended for inspection or testing

[SOURCE: ISO 78-2:1999, 3.1]
3.1.3
test sample

sample (3.1.1) as prepared for testing or analysis, the whole quantity or part of it being used for testing

or analysis at one time
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 5.3.11]
3.1.4
test portion
part of a test sample (3.1.3) which is used for testing or analysis at one time
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 5.3.12]
© ISO 2013 – All rights reserved 1
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ISO 21572:2013(E)
3.1.5
matrix

products submitted for analysis, which might have differences in chemical composition and physical state

[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.4]
3.1.6
denaturation of proteins

physical and/or (bio)chemcial treatment which destroys or modifies the structural, functional,

enzymatic, or antigenic properties of the POI or the analyte
3.2 Terms relating to antibodies
3.2.1
antibody

protein (immunoglobulin) produced and secreted by B lymphocytes in response to a molecule recognized

as foreign (antigen) and capable of binding to that specific antigen (3.2.2)
3.2.2
antigen

substance that stimulates the production of antibodies (3.2.1) and reacts with them

3.2.3
clone
population of identical cells derived from a single cell
3.2.4
cross-reactivity

binding of the antibody (3.2.1) to substances other than the analyte of primary interest

3.2.5
monoclonal antibody

antibody (3.2.1) produced from a single hybridoma clone (3.2.3) and directed to a single antigen

(3.2.2) determinant
3.2.6
polyclonal antibody

mixture of immunoglobulin molecules, secreted against a specific immunogenic substance, each

recognizing a different epitope
[SOURCE: ISO 19001:2013, 3.11]
3.2.7
selectivity of an antibody

ability of an antibody (3.2.1) to specifically bind to an antigen (3.2.2) determinant and not to other

similar structures or other antigens
3.3 Terms relating to techniques
3.3.1
conjugate

material produced by attaching two or more substances together by covalent bond via chemical groups

EXAMPLE Conjugates of antibodies with fluorochromes (e.g. chemical entity, such as a molecule or group,

which emits light that is in response to being stimulated by absorption of incident light), radiolabelled substances,

gold or enzymes are often used in immunoassays.
2 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21572:2013(E)
3.3.2
western blotting protocol
protein immunoblot

transfer of a protein to a binding surface following separation by electrophoresis that may be visualised

using a variety of methods

EXAMPLE One example of such a method is with a specific radiolabelled or enzyme-conjugated antibody

followed by the addition of an enzyme-specific substrate to form a coloured reaction product.

3.3.3
enzyme linked immunosorbent assay
ELISA

in vitro assay used for qualitative, semi-quantitative, or quantitative purposes that combines enzyme-

linked antibodies and a substrate to form a coloured reaction product
3.3.4
test kit

set of chemicals, materials and instructions for use, packaged together and intended for use as specified

by the manufacturer of the kit
3.3.5
lateral flow immunochromatographic assay
lateral flow device/strip

qualitative or semiquantitative, simple rapid assay formats intended to detect the presence (or absence)

of a POI in a sample where an antibody (3.2.1) or an analyte is coated to a solid surface and dipped into

a test liquid to provide a measure of the POI in the liquid

Note 1 to entry: The test sample flows along a solid substrate via capillary action. After the liquid sample enters the

test strip, it encounters a coloured reagent which mixes with the sample and transits the substrate encountering

lines or zones which have been pretreated with an antibody or antigen. Depending on the analytes present in

the sample the coloured reagent can become bound at the test line or zone. These assays can operate as either

competitive or sandwich assays.
3.4 Terms relating to control
3.4.1
reference material

material, sufficiently homogeneous and stable with respect to one or more specified properties, which

has been established to be fit for its intended use in a measurement process or in examination of

nominal properties
[SOURCE: ISO/IEC Guide 99]
3.4.2
measurement standard

measured material, measuring instrument, reference material (3.4.1) or measuring system intended

to define, realize, conserve or reproduce one or more values to serve as a reference or preparation of

known characteristics used to standardize the analysis
3.5 Terms relating to validation
3.5.1
accuracy

closeness of agreement between a test result or measurement result and a reference value

Note 1 to entry: The term “accuracy”, when applied to a set of test results or measurement results, involves a

combination of random components and a common systematic error or bias (3.5.3) component.

Note 2 to entry: When applied to a test method, the term accuracy refers to a combination of trueness and

precision (3.5.2).
© ISO 2013 – All rights reserved 3
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ISO 21572:2013(E)

[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.1, modified — Notes 1 and 2 differ from the original and there is no Note 3.]

3.5.2
precision

closeness of agreement between independent test/measurement results obtained under stipulated

conditions
Note 1 to entry: Precision is normally expressed in terms of standard deviation.
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.4]
3.5.3
bias

difference between the expectation of a test result or measurement result and a true value

Note 1 to entry: Bias is the total systematic error as contrasted to random error. There may be one or more

systematic error components contributing to the bias. A larger systematic difference from the true value is

reflected by a larger bias value.
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.2]
3.5.4
sensitivity

quotient of the change in the indication of a measuring system and the corresponding change in the

value of the quantity being measured

Note 1 to entry: The sensitivity can depend on the value of the quantity being measured. Sensitivity usually is

meant as the smallest quantity or concentration of the analyte that can be reliably distinguished from background.

[SOURCE: ISO/IEC Guide 99]
3.5.5
selectivity

extent to which a method can determine particular analyte(s) in a mixture(s) or matrice(s) without

interferences from other components of similar behaviour

Note 1 to entry: Selectivity is the recommended term in analytical chemistry to express the extent to which a

particular method can determine analyte(s) in the presence of other components. Selectivity can be graded.

[SOURCE: Pure Appl. Chem.]
3.5.6
detection limit
limit of detection
LOD

lowest concentration or content of the POI per defined amount of matrix that can be consistently detected

under the experimental conditions specified in the method

[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.8, modified — “LOD” has been added and “of the target organism” became

“of the POI”.]
3.5.7
determination limit
limit of quantification
LOQ

lowest concentration or content of the POI per defined amount of matrix that can be measured with

reasonable statistical certainty consistently under the experimental conditions specified in the method

4 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21572:2013(E)
3.5.8
applicability range
range of quantification
range of linearity
dynamic range

upper and lower limits of quantification as expressed by a set of reference materials (or dilutions) with

a suitable level of precision and accuracy (3.5.1)
3.5.9
repeatability conditions

observation conditions where independent test/measurement results are obtained with the same

method on identical test/measurement items in the same test or measuring facility by the same operator

using the same equipment within short intervals of time

Note 1 to entry: Repeatability conditions include: the same measurement procedure or test procedure; the same

operator; the same measuring or test equipment used under the same conditions; the same location and repetition

over a short period of time.
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.6, modified — the Note has been deleted.]
3.5.10
repeatability
precision under repeatability conditions (3.5.9)
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.5]
3.5.11
repeatability limit

value less than or equal to which the absolute difference between two test results obtained under

repeatability conditions (3.5.9) may be expected to be with a probability of 95 %

[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.1.6]
3.5.12
repeatability standard deviation

standard deviation of test results or measurement results obtained under repeatability conditions (3.5.9)

Note 1 to entry: It is a measure of the dispersion of the distribution of test or measurement results under

repeatability conditions.

Note 2 to entry: Similarly, “repeatability variance” and “repeatability coefficient of variation” can be defined and

used as measures of the dispersion of test or measurement results under repeatability conditions.

[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.7]
3.5.13
reproducibility conditions

observation conditions where independent test/measurement results are obtained with the same

method on identical test/measurement items in different test or measurement facilities with different

operators using different equipment
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.11]
3.5.14
reproducibility
precision under reproducibility conditions (3.5.13)
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.10; ISO 78-2:1999, 3.13]
© ISO 2013 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 21572:2013(E)
3.5.15
reproducibility limit

value less than or equal to which the absolute difference between two test results obtained under

reproducibility conditions (3.5.13) may be expected to be with a probability of 95 %

[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.20]
3.5.16
reproducibility standard deviation

standard deviation of test results or measurement results obtained under reproducibility conditions (3.5.13)

Note 1 to entry: It is a measure of the dispersion of the distribution of test or measurement results under

reproducibility conditions.

Note 2 to entry: Similarly, “reproducibility variance” and “reproducibility coefficient of variation” can be defined

and used as measures of the dispersion of test or measurement results under reproducibility conditions.

[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.12]
4 Principle

The POI is extracted according to the procedure described for that specific matrix, and a specific

antibody is used to detect or measure the concentration of the POI in the sample. For the detection of

specific proteins in ingredients, the basic principle of a protein-based method is to:

— take a representative sample of the matrix;
— extract the proteins;
— detect and/or quantify the POI derived from the matrix under study.
5 Reagents

During the analysis, use only reagents of recognized analytical grade and only deionized or distilled

water or water that has been purified, or equivalent, unless indicated otherwise by the manufacturer of

the reagents or the kit.

Other reagents, such as antibodies, conjugates, substrates, stop solutions and buffer components are

method specific. Please refer to the method for specifics regarding reagents, such as protein standards

or reference materials, antibodies or pre-coated solid surfaces, controls and samples.

Reagents are specified in A.4.2, A.4.3, B.4.2 and B.4.3.
6 Laboratory equipment
Laboratory equipment is specified in A.5 and B.5.
7 Sampling

Sampling is not part of the method specified in this International Standard, although Annex A and

Annex B do provide sampling instructions according to the relevant methods. It is recommended that

the parties concerned come to an agreement on this subject.
6 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21572:2013(E)
8 Procedure
8.1 General

Storage conditions and shelf-life of lateral flow strips, antibodies, conjugates, substrates, etc. shall be

clearly specified by the provider.

Use appropriate laboratory equipment with low protein binding capacity (e.g. polypropylene tubes) to

prevent protein adsorption during the whole procedure.

For the use of this International Standard, general requirements of quality assurance for laboratories

shall be observed (e.g. concerning calibration of apparatus, double determination, blanks, use of

reference materials, preparation of calibration curves). Carefully clean all equipment coming into direct

contact with the sample to prevent contamination. See ISO/IEC 17025 for more information.

8.2 Preparation of sample solution

Once a representative sample is obtained, specific sample preparation procedures may be found in the

annexes.

Grind samples as specified in the method before test portions are taken, if necessary. Powders/flour

might have swelling properties and may require more extraction solution if a manufacturer’s method

does not specify this information. If the sample is not immediately used, follow your laboratory’s

procedure for storage (e.g. –20 °C or below).

Laboratory samples containing high amounts of fat may be nonhomogeneous and a larger test sample

should be extracted. If applicable, instructions may be found in the annexes.

Weigh an appropriate amount (as specified in the relevant annex) of a representative test sample for

analysis to create a test portion for extraction. Add extraction solution and homogenize or mix.

8.3 Extraction

Use an extraction procedure suitable for the matrix. Details of appropriate conditions for the

extraction/dilution of the test portions, controls and reference materials are provided in Annex A for ELISA

and Annex B for lateral flow strips. Care should be taken to use extraction procedures validated for the

matrix. Extracted samples should be immediately used or treated as specified in the procedure for storage.

8.4 Preparation of calibration curves, positive controls and reference materials

For the preparation of calibration curves, positive controls and reference materials for Annex A, it is

recommended to use matrix matched reference materials or reference materials that have been validated

for the matrix. Calibration curves are not routinely required for qualitative application such as lateral

flow strips, however, positive and negative controls can be prepared at the discretion of the analyst.

8.5 Assay procedure

For a quantitative test, select the required number of wells, (e.g. in ELISA) for the test portion(s) to be

analysed, including blanks, measurement standards, and add each of them at minimum in duplicate,

properly diluted to the assay.

For a qualitative test or semiquantitative test, select the required number of test (e.g. lateral flow strips

or ELISA) needed for the test portions to be analysed. The stability of the final signal can vary. Read the

results in a timely manner as specified in the annexes.

According to the method chosen, follow the instructions of each method for sample analyses, including

blanks and measurement standards (if necessary). Allow the reaction to occur at a specified temperature

range and time. If necessary, terminate the reaction according to the method described in the relevant

© ISO 2013 – All rights reserved 7
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ISO 21572:2013(E)

annex. For example, if ELISA method requires acquiring data on a spectrophotometer, perform this step.

In the case of qualitative tests, generally these are interpreted visually, follow the kit instructions.

9 Interpretation and expression of results
9.1 General

The parameters to interpret vary depending on whether the assay is qualitative, semiquantitative or

quantitative.

For quantitative methods, the coefficient of variation (CV) of optical density values resulting from replicate

measurements of a sample test solution, in general, should not exceed 15 %. The CV of calculated concentrations

resulting from replicate measurements of a sample test solution, in general, should not exceed 20 %.

If the CV limit is exceeded, the analyses should be repeated on freshly prepared sample test solution.

To establish a CV, in this case, at least three determinations shall be carried out (e.g. values from three

microtitre wells).

Negative results shall be reported as “negative at the limit of detection” and the limit of detection

shall be reported.

Positive results below the limit of quantification shall be reported as “positive above the limit of detection,

but below the limit of quantification”. The limits of quantification and detection shall be reported.

9.2 Quantitative and semiquantitative analysis

The following parameters shall be evaluated: raw data of sample test solution, blanks, reference materials

or measurement standards, and negative controls; percentage CV between replicates, percentage CV of

standard and percentage CV of control samples.

According to ISO/IEC 17025:2005, 5.10.3.1 c), measurement uncertainty should be reported where applicable.

Quantitative results shall not be reported by extrapolating above the highest or below the lowest

calibration point.
9.3 Qualitative analysis

For qualitative tests, including all applications thereof, the corresponding parameters are described in

the annexes. The limit of detection shall always be reported and negative results shall be reported as

“negative at the limit of detection”.
Positive results shall also report the limit of detection.
10 Specific parameters which may influence results
10.1 General

The performance criteria listed in the method of Annex A are a set of performance specifications

established for each method during the development, validation and routine use of the method. These

parameters shall be estimated and evaluated for each method and are reliable and of consistently high

quality. Each time a method is implemented the data generated shall be evaluated and compared with

the established method performance criteria.

When a value (e.g. CV of replicate determinations) does not agree with the assay specifications, it signals

that the result is atypical and warrants closer evaluation of the data. The list of specifications shall be

taken as whole, individual parameters may in certain instances not meet the specifications, but the data

may still be perfectly acceptable. If any of the criteria are not met, it should, however, be acknowledged in

writing and the data evaluated to determine if the analysis of results should be adjusted, or if a particular

8 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21572:2013(E)

sample or a set of samples should be repeated. These decisions should be based on the judgement of the

technical expert interpreting the entire set of criteria.
10.2 Special considerations
10.2.1 Selectivity

Adequate selectivity of the assay for a particular analyte shall be demonstrated for each POI or analyte

(protein) to be measured in each matrix to be tested
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21572
Deuxième édition
2013-02-01
Produits alimentaires — Analyse
des biomarqueurs moléculaires —
Méthodes basées sur les protéines
Foodstuffs — Molecular biomarker analysis — Protein-based methods
Numéro de référence
ISO 21572:2013(F)
ISO 2013
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ISO 21572:2013(F)
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Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21572:2013(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

3.1 Termes généraux ................................................................................................................................................................................... 1

3.2 Termes relatifs aux anticorps ..................................................................................................................................................... 2

3.3 Termes relatifs aux techniques ................................................................................................................................................. 3

3.4 Termes relatifs au contrôle ........................................................................................................................................................... 3

3.5 Termes relatifs à la validation .................................................................................................................................................... 4

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 6

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 6

6 Matériel de laboratoire .................................................................................................................................................................................. 6

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 7

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 7

8.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 7

8.2 Préparation de la solution d’échantillon .......................................................................................................................... 7

8.3 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 7

8.4 Préparation des courbes d’étalonnage, des contrôles positifs et des matériaux

de référence ............................................................................................................................................................................................... 7

8.5 Mode opératoire d’analyse ........................................................................................................................................................... 8

9 Interprétation et expression des résultats ............................................................................................................................... 8

9.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 8

9.2 Analyses quantitative et semi-quantitative .................................................................................................................... 8

9.3 Analyse qualitative............................................................................................................................................................................... 8

10 Paramètres spécifiques pouvant influer sur les résultats ........................................................................................ 9

10.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 9

10.2 Considérations particulières ....................................................................................................................................................... 9

10.3 Applicabilité d’analyse ..................................................................................................................................................................10

11 Méthode de confirmation .........................................................................................................................................................................10

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................11

Annexe A (informative) Détection d’une protéine par ELISA ...................................................................................................12

Annexe B (informative) Détection de protéine(s) à l’aide de

dispositifs d’immunochromatographie .....................................................................................................................................23

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................31

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ISO 21572:2013(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives

ISO/CEI, Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de

Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.

Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités

membres votants.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de

ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L’ISO 21572 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 16,

Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 21572:2004), qui a fait l’objet d’une

révision technique. Elle incorpore également le Corrigé technique ISO 21572:2004/Cor. 1:2005.

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NORME INTERNATIONALE ISO 21572:2013(F)
Produits alimentaires — Analyse des biomarqueurs
moléculaires — Méthodes basées sur les protéines

AVERTISSEMENT — Suivre les instructions données par le fournisseur du kit/réactif et les

procédures normalisées relatives à la sécurité en laboratoire. Lire et mettre en œuvre les fiches

de données de sécurité des matériaux (MSDS).
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale énonce des lignes directrices et des critères de performances généraux

pour les méthodes de détection et/ou de quantification de protéines spécifiques ou de protéine(s)

d’intérêt [POI] dans une matrice donnée.

Ces lignes directrices générales concernent les méthodes basées sur des anticorps existants. Il existe

d’autres méthodes que celles décrites en Annexe A ou B susceptibles de détecter des POI. Les mêmes

critères que ceux répertoriés dans la présente Norme internationale sont applicables de façon générale.

2 Références normatives

Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent

document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée

s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y

compris les éventuels amendements).

ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 24276 ainsi que les

suivants s’appliquent.
3.1 Termes généraux
3.1.1
échantillon

sous-ensemble d’une population constitué d’une ou de plusieurs unités d’échantillonnage

[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 1.2.17]
3.1.2
échantillon pour laboratoire

échantillon (3.1.1) dans l’état de préparation où il est envoyé au laboratoire et destiné à être utilisé pour

un contrôle ou pour des essais
[SOURCE: ISO 78-2:1999, 3.1]
3.1.3
échantillon pour essai

échantillon (3.1.1), préparé pour essai ou analyse, dont la totalité ou une partie est utilisée pour l’essai

ou l’analyse en une seule fois
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 5.3.11]
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ISO 21572:2013(F)
3.1.4
prise d’essai

partie d’échantillon pour essai (3.1.3) utilisée pour l’analyse ou l’essai en une seule fois

[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 5.3.12]
3.1.5
matrice

produits soumis à analyse et pouvant présenter des différences de composition chimique et d’état physique

[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.4]
3.1.6
dénaturation de protéines

traitement physique et/ou (bio)chimique détruisant ou modifiant les propriétés structurelles,

fonctionnelles, enzymatiques ou antigéniques de la POI ou de l’analyte
3.2 Termes relatifs aux anticorps
3.2.1
anticorps

protéine (immunoglobuline) produite et secrétée par des lymphocytes B en réponse à la présence d’une

molécule reconnue comme étrangère (antigène) et capable de se lier à cet antigène (3.2.2) spécifique

3.2.2
antigène
substance stimulant la production d’anticorps (3.2.1) et réagissant avec eux
3.2.3
clone
population de cellules identiques issues d’une seule lignée cellulaire
3.2.4
réactivité croisée

liaison d’un anticorps (3.2.1) à des substances autres que l’analyte de premier intérêt

3.2.5
anticorps monoclonal

anticorps (3.2.1) produit à partir d’un seul clone (3.2.3) d’hybridome et dirigé vers un déterminant

antigénique (3.2.2) unique
3.2.6
anticorps polyclonal

mélange de molécules d’immunoglobuline, sécrétées en réponse à une substance immunogène

particulière, reconnaissant chacune un épitope différent
[SOURCE: ISO 19001:2013, 3.11]
3.2.7
sélectivité d’un anticorps

capacité d’un anticorps (3.2.1) à se lier spécifiquement à un déterminant antigénique (3.2.2) et non à

d’autres structures similaires ou à d’autres antigènes
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 21572:2013(F)
3.3 Termes relatifs aux techniques
3.3.1
conjugué

matériel produit en liant deux substances ou plus par liaison covalente par l’intermédiaire de

groupes chimiques

EXEMPLE Les conjugués d’anticorps couplés à des fluorochromes (par exemple entité chimique telle qu’une

molécule ou un groupe, qui émet de la lumière en réponse à une stimulation par absorption de lumière incidente),

des substances marquées, de l’or ou des enzymes sont souvent utilisés dans des immunoanalyses.

3.3.2
western blot
immunodétection de protéines

transfert d’une protéine vers une surface de liaison après séparation par électrophorèse, qui peut être

visualisée au moyen de plusieurs méthodes

EXEMPLE Un exemple de cette méthode consiste à utiliser un anticorps spécifique marqué ou conjugué avec

une enzyme suivi de l’ajout d’un substrat spécifique à l’enzyme pour former un produit de réaction coloré.

3.3.3
essai par immunosorbant lié à une enzyme
ELISA

essai in vitro utilisé à des fins qualitatives, semi-quantitatives ou quantitatives via l’utilisation d’anticorps

liés à des enzymes et d’un substrat constituant un produit de réaction coloré
3.3.4
kit d’essai

ensemble constitué de produits chimiques, de matériaux et d’un mode d’emploi rassemblés en un tout et

destiné à être utilisé conformément aux instructions du fabricant du kit
3.3.5
bandelettes/dispositifs d’immunochromatographie

formats d’analyse qualitatifs ou semi-quantitatifs simples et rapides, destinés à détecter la présence (ou

l’absence) d’une POI dans un échantillon dans lequel un anticorps (3.2.1) ou un analyte recouvre une surface

solide et est plongé dans un liquide d’essai pour fournir une mesure de la quantité de POI dans le liquide

Note 1 à l’article: L’échantillon pour essai circule le long d’un substrat solide par capillarité. Une fois que l’échantillon

liquide a pénétré dans la bandelette d’essai, il rencontre un réactif coloré qui se mélange avec l’échantillon et

transporte le substrat qui est confronté à des lignes ou des zones prétraitées avec un anticorps ou un antigène.

Selon les analytes présents dans l’échantillon, le réactif coloré peut se lier à la ligne ou à la zone d’essai. Ces

analyses peuvent être des analyses compétitives ou en sandwich.
3.4 Termes relatifs au contrôle
3.4.1
matériau de référence

matériau, dont une ou plusieurs propriétés spécifiées sont suffisamment homogènes et stables, reconnu

pour être adapté à son usage prévu lors d’un procédé de mesure ou lors de l’examen des propriétés nominales

[SOURCE: Guide ISO/CEI 99]
3.4.2
étalon de mesure

mesure matérialisée, appareil de mesure, matériau de référence (3.4.1) ou système de mesure destiné à

définir, réaliser, conserver ou reproduire une ou plusieurs valeurs pour servir de référence ou pour la

préparation de caractéristiques connues utilisées pour normaliser l’analyse
© ISO 2013 – Tous droits réservés 3
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ISO 21572:2013(F)
3.5 Termes relatifs à la validation
3.5.1
exactitude

étroitesse de l’accord entre un résultat d’essai ou un résultat de mesure et une valeur de référence

Note 1 à l’article: Le terme «exactitude», lorsqu’il est appliqué à un ensemble de résultats d’essais ou de mesure,

implique une combinaison de composantes aléatoires et d’une erreur systématique commune ou d’une composante

de biais (3.5.3).

Note 2 à l’article: Lorsqu’il s’applique à une méthode d’essai, le terme «exactitude» fait référence à une combinaison

de justesse et de fidélité (3.5.2).

[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.1, modifiée — Les Notes 1 et 2 diffèrent de l’original et la Note 3 a

été supprimée.]
3.5.2
fidélité

étroitesse d’accord entre des résultats d’essai/de mesure indépendants obtenus sous des conditions stipulées

Note 1 à l’article: La fidélité est normalement exprimée en termes d’écart-type.
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.4]
3.5.3
biais

différence entre l’espérance mathématique d’un résultat d’essai ou résultat de mesure et une valeur vraie

Note 1 à l’article: Le biais est une erreur systématique totale par opposition à l’erreur aléatoire. Il peut y avoir

une ou plusieurs composantes d’erreurs systématiques qui contribuent au biais. Une différence systématique

importante par rapport à la valeur vraie est reflétée par une grande valeur du biais.

[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.2]
3.5.4
sensibilité

quotient de la modification de l’indication d’un système de mesure et de la modification correspondante

de la valeur de la quantité mesurée

Note 1 à l’article: La sensibilité peut dépendre de la valeur de la quantité mesurée. La sensibilité indique habituellement

la plus petite quantité ou concentration d’analyte pouvant être différenciée du bruit de fond avec fiabilité.

[SOURCE: Guide ISO/CEI 99]
3.5.5
sélectivité

capacité d’une méthode à doser un ou des analytes particuliers dans un (ou des) mélange(s) ou matrice(s)

sans interférence d’autres composés de comportement similaire

Note 1 à l’article: La sélectivité est le terme recommandé en chimie analytique pour exprimer la capacité d’une

méthode particulière à doser un (ou des) analyte(s) en présence d’autres composés. La sélectivité peut être graduée.

[SOURCE: Pure Appl. Chem.]
3.5.6
limite de détection
LOD

plus petite concentration ou teneur en POI par quantité définie de matrice pouvant être immanquablement

détectée dans les conditions expérimentales spécifiées dans la méthode

[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.8, modifiée — «LOD» a été ajouté et «en organisme cible» a été remplacé

par «en POI».]
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 21572:2013(F)
3.5.7
limite de détermination
limite de quantification
LOQ

plus petite concentration ou teneur en POI par quantité définie de matrice qui peut être constamment

mesurée avec une certitude statistique raisonnable dans les conditions expérimentales spécifiées

dans la méthode
3.5.8
plage d’applicabilité
plage de quantification
plage de linéarité
plage dynamique

plage définie par les limites supérieure et inférieure de quantification, telles qu’exprimées par un ensemble

de matériaux (ou de dilutions) de référence avec un niveau de fidélité et d’exactitude (3.5.1) approprié

3.5.9
conditions de répétabilité

conditions d’observation où les résultats d’essai/de mesure indépendants sont obtenus par la même

méthode sur des individus d’essai/de mesure identiques sur la même installation d’essai ou de mesure,

par le même opérateur, utilisant le même équipement et pendant un court intervalle de temps

Note 1 à l’article: Les conditions de répétabilité comprennent: le même mode opératoire ou procédure d’essai; le

même opérateur; le même instrument de mesure ou d’essai utilisé dans les mêmes conditions; le même lieu et la

répétition pendant une courte période de temps.
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.6, modifiée — La Note a été supprimée.]
3.5.10
répétabilité
fidélité dans des conditions de répétabilité (3.5.9)
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.5]
3.5.11
limite de répétabilité

valeur au-dessous ou au niveau de laquelle est située, avec une probabilité de 95 %, la valeur absolue de

la différence entre deux résultats d’essai, obtenus sous des conditions de répétabilité (3.5.9)

[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.16]
3.5.12
écart-type de répétabilité

écart-type des résultats d’essai ou résultats de mesure obtenus sous des conditions de répétabilité (3.5.9)

Note 1 à l’article: C’est une mesure de la dispersion de la loi des résultats d’essai ou de mesure sous des conditions

de répétabilité.

Note 2 à l’article: On peut définir de façon similaire la «variance de répétabilité» et le «coefficient de variation de

répétabilité» et les utiliser comme mesures de la dispersion des résultats d’essai ou de mesure sous des conditions

de répétabilité.
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.7]
3.5.13
conditions de reproductibilité

conditions d’observation où les résultats d’essai/de mesure indépendants sont obtenus par la même

méthode sur des individus d’essai/de mesure identiques sur différentes installations d’essai ou de

mesure avec différents opérateurs utilisant des équipements différents
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.11]
© ISO 2013 – Tous droits réservés 5
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ISO 21572:2013(F)
3.5.14
reproductibilité
fidélité sous des conditions de reproductibilité (3.5.13)
[SOURCES: ISO 3534-2:2006, 3.3.10; ISO 78-2:1999, 3.13]
3.5.15
limite de reproductibilité

valeur au-dessous ou au niveau de laquelle est située, avec une probabilité de 95 %, la valeur absolue de

la différence entre deux résultats d’essai obtenus sous des conditions de reproductibilité (3.5.13)

[SOURCE: ISO 5725-1:1994, 3.20]
3.5.16
écart-type de reproductibilité

écart-type des résultats d’essai ou résultats de mesure obtenus sous des conditions de reproductibilité (3.5.13)

Note 1 à l’article: C’est une mesure de la dispersion de la loi des résultats d’essai ou de mesure sous des conditions

de reproductibilité.

Note 2 à l’article: On peut définir de façon similaire la «variance de reproductibilité» et le «coefficient de variation

de reproductibilité» et les utiliser comme mesures de la dispersion des résultats d’essai ou de mesure sous des

conditions de reproductibilité.
[SOURCE: ISO 3534-2:2006, 3.3.12]
4 Principe

La POI est extraite selon le mode opératoire décrit pour cette matrice spécifique et un anticorps

spécifique est utilisé pour détecter ou mesurer la concentration de la POI présente dans l’échantillon.

La détection des protéines spécifiques dans les ingrédients selon une méthode fondée sur les protéines

repose sur les principes de base suivants:
— prélèvement d’un échantillon représentatif de la matrice;
— extraction des protéines;
— détection et/ou quantification de la POI dérivée de la matrice étudiée.
5 Réactifs

Au cours de l’analyse, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau

désionisée, distillée, purifiée ou ayant subi un traitement équivalent, sauf indication contraire du

fabricant des réactifs ou du kit.

D’autres réactifs, tels que les anticorps, les conjugués, les substrats, les solutions de blocage et les tampons

sont propres à la méthode. Pour des cas spécifiques de réactifs, tels que des étalons protéiniques ou des

matériaux de référence, des anticorps libres ou sensibilisés sur une surface solide, des contrôles et des

échantillons, se référer à la méthode concernée.
Les réactifs sont spécifiés en A.4.2, A.4.3, B.4.2 et B.4.3.
6 Matériel de laboratoire
Le matériel de laboratoire est spécifié en A.5 et B.5.
6 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 21572:2013(F)
7 Échantillonnage

L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale,

bien que les Annexes A et B donnent des instructions d’échantillonnage conformément aux méthodes

appropriées. À cet égard, il est recommandé que les parties concernées concluent un accord.

8 Mode opératoire
8.1 Généralités

Les conditions de stockage et la durée de conservation des bandelettes d’immunochromatographie, des

anticorps, des conjugués, des substrats, etc., doivent être clairement spécifiées par le fournisseur.

Utiliser un matériel de laboratoire approprié ayant une faible capacité de liaison des protéines (par

exemple tubes en polypropylène) afin d’empêcher l’adsorption des protéines pendant toute la durée du

mode opératoire.

Dans le cadre de la présente Norme internationale, les exigences générales relatives à l’assurance qualité

des laboratoires doivent être respectées (par exemple étalonnage de l’appareillage, dosage en double,

essais à blanc, utilisation de matériaux de référence, préparation de courbes d’étalonnage). Nettoyer

avec soin l’ensemble de l’équipement se trouvant en contact direct avec l’échantillon afin d’éviter toute

contamination. Pour plus d’informations, voir l’ISO/CEI 17025.
8.2 Préparation de la solution d’échantillon

Des modes opératoires spécifiques pour la préparation des échantillons représentatifs obtenus sont

proposés dans les annexes.

Si nécessaire, broyer les échantillons tel que spécifié dans la méthode avant de prélever les prises

d’essai. Les poudres et la farine peuvent présenter des propriétés de gonflement et peuvent nécessiter

un volume de solution d’extraction plus élevé si la méthode du fabricant ne précise pas cette information.

Si l’échantillon n’est pas utilisé immédiatement, respecter la procédure de stockage de votre laboratoire

(par exemple −20 °C ou moins).

Les échantillons pour laboratoire renfermant d’importantes quantités de matières grasses peuvent ne

pas s’avérer suffisamment homogènes et, par conséquent, requérir l’extraction d’un échantillon plus

important. Le cas échéant, des instructions sont présentées dans les annexes.

Peser une quantité appropriée (spécifiée dans l’annexe pertinente) d’un échantillon pour essai

représentatif pour analyse en vue d’obtenir une prise d’essai pour extraction. Ajouter la solution

d’extraction, puis homogénéiser ou mélanger.
8.3 Extraction

Suivre un mode opératoire d’extraction adapté à la matrice. Les détails des conditions requises pour

l’extraction ou la dilution des prises d’essai, des contrôles et des matériaux de référence sont indiqués dans

l’Annexe A pour la méthode ELISA et dans l’Annexe B pour les bandelettes d’immunochromatographie. Il

convient de suivre soigneusement les modes opératoires d’extraction validés pour la matrice. Il convient

d’utiliser immédiatement les échantillons extraits ou de les traiter conformément à la procédure de stockage.

8.4 Préparation des courbes d’étalonnage, des contrôles positifs et des matériaux de

référence

Pour la préparation des courbes d’étalonnage, des contrôles positifs et des matériaux de référence pour

l’Annexe A, il est recommandé d’utiliser des matériaux de référence adaptés à la matrice ou des matériaux

de référence qui ont été validés pour la matrice. Des courbes d’étalonnage ne sont pas requises en

routine pour une application qualitative telle que les bandelettes d’immunochromatographie. Toutefois,

des contrôles positifs et négatifs peuvent être préparés à la discrétion de l’analyste.

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ISO 21572:2013(F)
8.5 Mode opératoire d’analyse

Pour un essai quantitatif, sélectionner le nombre de puits requis (par exemple dans la méthode ELISA)

pour la (ou les) prise(s) d’essai à analyser, y compris les témoins, les étalons de mesure, et ajouter chacun

d’entre eux au moins en double, en les diluant correctement en fonction de l’analyse.

Pour un essai qualitatif ou semi-quantitatif, sélectionner le nombre requis d’essais (par exemple

bandelettes d’immunochromatographie ou méthode ELISA) nécessaires pour les prises d’essai à

analyser. La stabilité du signal final peut varier. Relever les résultats au temps indiqué dans les annexes.

Selon la méthode choisie, respecter les instructions de chaque méthode pour l’analyse des échantillons,

y compris pour les témoins et les étalons de mesure (si nécessaire). Laisser la réaction se dérouler

pendant le laps de temps et dans la plage de température indiqués. Si nécessaire, interrompre la

réaction selon la méthode décrite dans l’annexe pertinente. Par exemple, si la méthode ELISA nécessite

l’acquisition de données sur un spectrophotomètre, effectuer cette étape. En cas d’essais qualitatifs, qui

sont généralement interprétés visuellement, respecter les instructions fournies avec le kit.

9 Interprétation et expression des résultats
9.1 Généralités

Les paramètres à interpréter varient selon que l’analyse est qualitative, semi-quantitative ou quantitative.

Pour les méthodes quantitatives, il convient que le coefficient de variation (CV) des valeurs de densité

optique résultant de mesures en double d’une solution d’essai d’échantillon ne dépasse en général pas

15 %. Il convient que le CV des concentrations calculées résultant de mesures en double d’une solution

d’essai d’échantillon ne dépasse en général pas 20 %.

Si la limite du CV est dépassée, il convient de répéter les analyses avec une solution d’essai d’échantillon

fraîchement préparée. Dans ce cas, trois dosages au moins doivent être réalisés pour é

...

Questions, Comments and Discussion

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