ISO 21572:2004
(Main)Foodstuffs — Methods for the detection of genetically modified organisms and derived products — Protein based methods
Foodstuffs — Methods for the detection of genetically modified organisms and derived products — Protein based methods
ISO 21572:2004 provides general guidelines and performance criteria for methods for the detection and/or quantitation of specific proteins derived from genetically modified (GM) plant material in a specified matrix. These general guidelines address existing antibody based methods. Methods other than those described in annex A may also detect the protein. The same criteria as outlined in this standard generally apply.
Produits alimentaires — Méthodes pour la détection d'organismes génétiquement modifiés et de produits dérivés — Méthodes basées sur les protéines
L'ISO 21572:2004 énonce des lignes directrices et des critères de performances généraux pour les méthodes de détection et/ou de quantification de protéines spécifiques dérivées de matériel végétal génétiquement modifié dans une matrice donnée. Ces directives générales concernent les méthodes axées sur des anticorps existants. Il existe d'autres méthodes que celles décrites en Annexe A susceptibles de détecter des protéines. Les mêmes critères que ceux répertoriés dans la présente norme sont applicables de façon générale.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21572
First edition
2004-03-15
Foodstuffs — Methods for the detection
of genetically modified organisms and
derived products — Protein based
methods
Produits alimentaires — Méthodes pour la détection d'organismes
génétiquement modifiés et de produits dérivés — Méthodes basées sur
les protéines
Reference number
ISO 21572:2004(E)
©
ISO 2004
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ISO 21572:2004(E)
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ISO 21572:2004(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21572 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) in collaboration with
Technical Committee ISO/TC 34, Food products, in accordance with the Agreement on technical cooperation
between ISO and CEN (Vienna Agreement).
Throughout the text of this document, read “.this European Standard.” to mean “.this International
Standard.”.
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ISO 21572:2004(E)
Contents
page
Foreword.v
Introduction .vi
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions.1
4 Principle.5
5 Reagents.5
6 Apparatus and equipment.5
7 Sampling.5
8 Procedure .5
9 Interpretation and expression of results .6
10 Specific parameters which may influence results.7
11 Confirming method.8
12 Test report .8
®
Annex A (normative) Detection of genetically modified soybeans (Roundup Ready tolerant).10
Bibliography .21
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ISO 21572:2004(E)
Foreword
This document (EN ISO 21572:2004) has been prepared by Technical Committee CEN/TC 275 “Food analysis -
Horizontal methods”, the secretariat of which is held by DIN, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 34
“Agricultural food products”.
This European Standard shall be given the status of a national standard, either by publication of an identical text or
by endorsement, at the latest by September 2004, and conflicting national standards shall be withdrawn at the
latest by September 2004.
The demonstration of the presence of genetically modified proteins can either be qualitative or quantitative. These
steps are laid down in this draft European Standard.
Other standards dealing with methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products in foodstuffs are the following:
prEN ISO 21568 Foodstuffs – Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products – Sampling (ISO/DIS 21568:2003).
prEN ISO 21571 Foodstuffs – Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products - Nucleic acid extraction (ISO/DIS 21571:2002)
prEN ISO 21569 Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products - Qualitative nucleic acid based methods (ISO/DIS 21569:2002)
prEN ISO 21570 Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products - Quantitative nucleic acid based methods (ISO/DIS 21570:2003)
Further information about definitions and general items involving the steps cited above are collected in:
prEN ISO 24276 Foodstuffs – Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products – General requirements and definitions (ISO/DIS 24276:2002)
Annex A is normative.
This document may touch copyrights and patents: for further information, contact your National Standardisation
Institute.
According to the CEN/CENELEC Internal Regulations, the national standards organizations of the following
countries are bound to implement this European Standard: Austria, Belgium, Czech Republic, Denmark, Finland,
France, Germany, Greece, Hungary, Iceland, Ireland, Italy, Luxembourg, Malta, Netherlands, Norway, Portugal,
Slovakia, Spain, Sweden, Switzerland and the United Kingdom.
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ISO 21572:2004(E)
Introduction
Analyses to detect genetically modified organisms (GMOs) and derived products can either be performed to
screen, identify or quantify GMOs and their derived products in a given matrix.
For the detection of the transgenic origin of ingredients, the basic principle of a protein-based method is to:
take a representative sample of the matrix;
extract the proteins;
detect and/or quantify the specific protein derived from GMO(s) under study.
As new methods become validated and accepted, they will be annexed to this standard.
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ISO 21572:2004(E)
1 Scope
This European Standard provides general guidelines and performance criteria for methods for the detection and/or
quantitation of specific proteins derived from genetically modified (GM) plant material in a specified matrix.
These general guidelines address existing antibody based methods. Methods other than those described in annex
A may also detect the protein. The same criteria as outlined in this standard generally apply.
2 Normative references
This European Standard incorporates by dated or undated reference, provisions from other publications. These
normative references are cited at the appropriate places in the text and the publications are listed hereafter. For
dated references, subsequent amendments to or revisions of any of these publications apply to this European
Standard only when incorporated in it by amendment or revision. For undated references the latest edition of the
publication referred to applies (including amendments).
prEN ISO 21568 Foodstuffs – Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products – Sampling (ISO/DIS 21568:2003).
3 Terms and definitions
For the purposes of this European Standard, the following terms and definitions apply.
3.1 General terms
3.1.1
sample
One or more sampling units taken from a population and intended to provide information of the population.
[ISO 3534-1:1993]
3.1.2
laboratory sample
Sample intended for laboratory inspection or testing.
3.1.3
test sample (test portion)
Sample, as prepared for testing or analysis, the whole quantity being used for analysis or testing at one time.
[ISO 3534-1]
3.1.4
matrix
All components in the sample with the analyte. Each matrix generally has a common name which permits
classification.
3.1.5
denaturation of proteins
Physical and/or (bio)chemical treatment which destroys or modifies the structure of the analyte. The denaturation
may modify structural, functional, enzymatic or antigenic properties of the protein.
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ISO 21572:2004(E)
3.2 Terms relative to antibodies
3.2.1
antibody
Protein (immunoglobulin) produced and secreted by B lymphocytes in response to a molecule recognised as
foreign (antigen). The antibody is capable of binding to that specific antigen.
3.2.2
antigen
Substance that is recognised as foreign by the immune system and elicits an immune response.
3.2.3
clone
Population of identical cells derived from a single cell line.
3.2.4
cross-reactivity
Binding of the antibody to substances other than the analyte of primary interest.
3.2.5
monoclonal antibody
Antibody produced from a single hybridoma clone and directed to a single antigen determinant.
3.2.6
polyclonal antibody
Antibody produced by several clones of lymphocytes.
3.2.7
Specificity of an antibody
Ability of an antibody to specifically bind to an antigen determinant and not to other similar structures on that or
other antigens.
3.3 Terms relative to techniques
3.3.1
conjugate
Material produced by attaching two or more substances together.
NOTE Conjugates of antibodies with fluorochromes (e.g. coloured particles), radiolabelled substances, or enzymes are
often used in immunoassays.
3.3.2
Western blotting
Transfer of an antigen (i.e. the protein of interest), following electrophoretic separation, to a binding surface. The
antigen may be visualised with a specific radiolabelled or enzyme-conjugated antibody.
3.3.3
ELISA – enzyme linked immunosorbent assay
In vitro assay that combines enzyme-linked antibodies and a substrate to form a coloured reaction product.
Depending on the application, this assay can be used for qualitative or quantitative purposes.
3.3.4
test kit
Set of chemicals, materials and instructions for use, packaged together and intended for in vitro measurement for
detection of a specified analyte.
3.3.5
dip stick format
Qualitative and rapid assay formats, including lateral flow strips, where an antibody or an analyte is coated to a
solid surface.
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ISO 21572:2004(E)
3.4 Terms relative to control
3.4.1
reference material
Material or substance one or more of whose property values are sufficiently homogeneous and well established to
be used for the calibration of an apparatus, the assessment of a measurement method, or for assigning values to
materials.
[ISO Guide 30]
3.4.2
standard
Measured material, measuring instrument, reference material or measuring system intended to define, realise,
conserve or reproduce a unit of one or more values of a quantity to serve as a reference or preparation of known
characteristics used to standardise the analysis.
3.5 Terms relative to validation
3.5.1
accuracy
Closeness of agreement between a test result and the accepted reference value.
NOTE The term accuracy, when applied to a set of test results involves a combination of random components and a
common systematic error or a bias component.
[ISO 3534-1:1993]
3.5.2
precision
Closeness of agreement between independent test results obtained under stipulated conditions.
NOTE 1 Precision depends only on the distribution of random errors and does not relate to the true value or the specified
value.
NOTE 2 The measure of precision usually is expressed in terms of imprecision and computed as a standard deviation of the
test results. Less precision is reflected by a larger standard deviation.
NOTE 3 "Independent test result" means results obtained in a manner not influenced by any previous result on the same or
similar test object. Quantitative measures of precision depend critically on the stipulated conditions. Repeatability and
reproducibility conditions are particular sets of extreme stipulated conditions.
[ISO 3534-1:1993]
3.5.3
Bias
Estimate of the systematic (consistent) deviation of the measured result from the true result of a given sample.
3.5.4
sensitivity
Capacity to record a small variation in concentration of a substance in the test material.
In this context, sensitivity usually is meant as the smallest quantity or concentration of the analyte that can be
reliably distinguished from background.
3.5.5
specificity
Property of a method to respond exclusively to the characteristic or analyte defined in the Codex standard.
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ISO 21572:2004(E)
3.5.6
Limit of detection (LOD)
Limit of detection for qualitative methods is the lowest concentration or content of the analyte that can be detected
reliably, but not necessarily quantified, as demonstrated by satisfactory collaborative trial or single-laboratory
validation [1], [2].
3.5.7
Limit of quantitation (LOQ)
Limit of quantitation of an analytical procedure is the lowest amount or concentration of analyte in a sample which
can be quantitatively determined with an acceptable level of precision and accuracy as demonstrated by
satisfactory collaborative trial or single-laboratory validation according to ISO 5725, [2], or [3].
3.5.8
Applicability range (range of quantification/linearity/dynamic range)
Upper and lower limits of quantitation as expressed by a set of reference materials (or dilutions).
3.5.9
Repeatability [Reproducibility] limit
Value less than or equal to the absolute difference between two test results, as expected under repeatability
[reproducibility] conditions with a probability of 95 %.
NOTE The symbol used is r [R].
[ISO 3534-1]
When examining two single test results obtained under repeatability [reproducibility] conditions, the comparison
should be made with the repeatability [reproducibility] limit r [R] = 2,8 s [s ].
r R
3.5.10
Reproducibility
Precision under reproducibility conditions.
[ISO 3534-1:1993]
3.5.11
Reproducibility conditions
Conditions where test results are obtained with the same method on identical test items in different laboratories
with different operators using different equipment.
[ISO 3534-1:1993]
3.5.12
Repeatability
Precision under repeatability conditions.
[ISO 3534-1:1993]
3.5.13
Repeatability conditions
Conditions where independent results are obtained with the same method on identical test items in the same
laboratory by the same operator using the same equipment within short intervals of time.
[ISO 3534-1:1993]
3.5.14
Repeatability [Reproducibility] standard deviation
The standard deviation of test results obtained under repeatability [reproducibility] conditions.
NOTE Repeatability [Reproducibility] standard deviation is a measure of the dispersion of the distribution of test results
under repeatability [reproducibility] conditions. Similarly “repeatability [reproducibility] variance” and “repeatability [reproducibility]
coefficient of variation” could be defined and used as measures of the dispersion of test results under repeatability
[reproducibility] conditions.
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ISO 21572:2004(E)
[ISO 3534-1]
3.5.15
Recovery
Ability to measure or recover a known amount of analyte from fortified samples over a range of quantitation.
4 Principle
The target protein is extracted according to the procedure described for that specific matrix, and a specific antibody
is used to detect or measure the concentration of the protein in the sample.
5 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognised analytical grade and only de-ionised
or distilled water or water that has been purified, or equivalent.
Other reagents, such as antibodies, conjugates, substrate, stop solutions and buffer components are method
specific. Please refer to the method for specifics regarding reagents such as protein standards or reference
materials, antibodies coated to a solid surface or free, controls and samples.
6 Apparatus and equipment
Apparatus and equipment is specified in A.5.
7 Sampling
Sampling is described in detail in prEN ISO 21568.
8 Procedure
8.1 General
Storage conditions and shelf-life of antibodies, conjugate, substrate, etc shall be clearly specified by the provider.
For the use of this standard, general requirements of quality assurance for laboratories shall be observed
(e.g. concerning calibration of apparatus, double determination, blanks, use of reference materials, preparation of
calibration curves, etc). Carefully clean all equipment coming into direct contact with the sample to prevent
contamination.
Use appropriate laboratory equipment with low protein binding capacity (e. g. polypropylene tubes) to prevent
protein adsorption during the whole procedure.
8.2 Preparation of sample solution
Once a representative sample is obtained, specific sample preparation procedures may be found in annex A.
Grind samples as specified in the method before test portions are taken, if necessary. Powders/flour might have
swelling properties and need sometimes to be extracted with double volume of extraction solution.
Laboratory samples containing high amounts of fat may be inhomogeneous and a larger test sample should be
extracted. If applicable, instructions may be found in annex A.
Weigh an appropriate amount (as specified in the annex) of a representative analytical sample for analysis to
create a test portion for extraction. Add extraction solution and homogenise or mix.
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ISO 21572:2004(E)
8.3 Extraction
Use an extraction procedure suitable for the matrix. Appropriate conditions for the extraction/dilution of the test
portions, controls and reference materials, are detailed in annex A.
Care should be taken to use extraction procedures validated for the matrix and, if necessary, to add binding agents
or special buffers to aid in extraction of the protein (e.g. tannin binder to be added for analysis of dark chocolate).
8.4 Preparation of calibration curves
For preparation of calibration curves, it is recommended to use matrix matched reference materials or reference
materials that have been validated for the matrix.
8.5 Assay procedure
According to the procedure chosen from annex A of this standard, select the required number of strips/tests/etc for
the set of sample test solution to be analysed including blanks, references, standards and controls, and add the
sample test solution, standards etc., at minimum in duplicate, properly diluted to the assay.
According to the method chosen, mix gently and allow reaction to occur at a given time and temperature range. If
necessary, terminate the reaction according to the method described in the annex.
The stability of the final signal may vary. Read the results in a timely manner as specified in the annex.
9 Interpretation and expression of results
9.1 General
The parameters to interpret vary depending on whether the assay is qualitative, semi-quantitative or quantitative.
For quantitative methods, the coefficient of variation of optical density values resulting from replicate
measurements of a sample test solution, in general, shall not exceed 15 %. The coefficient of variation of
calculated concentrations resulting from replicate measurements of a sample test solution, in general, shall not
exceed 20 %.
If the % coefficient of variation limit is exceeded, the analyses should be repeated on freshly prepared sample test
solution. To establish a coefficient of variation, in this case, at least three determinations shall be carried out (e.g.,
values from 3 microtiter wells).
No affirmation shall be made stating that there is no GMO present in the sample analysed. Negative results shall
be reported as “negative at the limit of detection”, or “less than the limit of detection”.
Positive results below the limit of quantitation shall be reported as “positive above limit of detection, but below limit
of quantification”.
9.2 Quantitative and semi-quantitative analysis
The following parameters are evaluated: raw data (continuous numerical values) of sample test solution, of blank,
of reference material or analytical standard, and of negative control, % CV between replicates, % coefficient of
variation of standard and % coefficient of variation of control samples.
All final results shall be reported including the measurement uncertainty previously established.
Quantitative results may not be reported by extrapolating above the highest or below the lowest calibration
standard measure.
6 © ISO 2004 – All rights reserved
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ISO 21572:2004(E)
9.3 Qualitative analysis
For qualitative tests, including all applications thereof, the corresponding parameters are described in the annex.
Results should be reported as detected or not detected and include the limit of detection.
10 Specific parameters which may influence results
10.1 General
The performance criteria listed in the method of annex A are a set of performance specifications established for
each method during the development, validation and routine use of the method. These parameters were developed
for each method and are intended to ensure that data generated by the method are reliable and of consistently high
quality. Each time a method is performed, evaluate and compare the data generated with the established method
performance criteria.
When a value (e. g. % coefficient of variation of replicate determinations) does not agree with the assay specific-
ations, it signals that the result is atypical and warrants closer evaluation of the data. The list of specifications shall
be taken as a whole, individual parameters may in certain instances not meet the specifications, but the data may
still be perfectly acceptable. If any of the criteria are not met, it should, however, be acknowledged in writing and
the data evaluated to determine if the analysis of results should be adjusted, or if a particular sample or a set of
samples should be repeated. These decisions should be based on the judgement of the researcher interpreting the
entire set of criteria.
10.2 Special considerations
10.2.1 Specificity
Adequate specificity of the assay for a particular analyte needs to be demonstrated for each analyte (protein) to be
measured and in each matrix to be tested. Where appropriate, cross reactivity should be evaluated for analogues
(proteins present with a similar sequence). To test for the absence of the analyte in non-GMO, assay the non-GMO
containing ingredient and GM-containing ingredient at the appropriate dilutions and compare.
This is generally done during the development and validation of the method and is not necessary during routine
analysis of samples for which the method has previously been validated. The method in annex A lists all of the
specific substances and matrices for which cross reactivity has been determined.
10.2.2 Extraction efficiency
Special care has to be taken to assess the influence of process parameters applied for the production of a given
laboratory sample.
In order to provide for the greatest sensitivity of the immunoassay, extraction efficiency shall be as high as
possible. The assay performance is matrix dependent. Extraction efficiency should be determined and documented
for each matrix.
The extraction procedure shall be demonstrated to be reproducible and the method of calibration account for
incomplete extraction.
10.2.3 Matrix effects
The scope of application clearly and exactly defines the matrices for which the given immunoassay is applicable.
The use of matrix matched reference materials allows for direct comparison between reference materials and
samples. However, if samples are to be analysed against reference materials which are not the same matrix, then
matrix effects will have to be evaluated.
For example, prepare a negative extract for each sample type (matrix) to be analysed by the method and an extract
of a positive control of known concentration. Prepare a series of dilutions of the positive control in the negative
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ISO 21572:2004(E)
extract and compare the resulting dose response curve with the calibration curve from the method. If the two
curves are different, then there is a matrix effect. Use a matrix that most closely represents the true samples that
will be tested. A dilution curve with a positive control of known concentration should also be included as a
reference. The shape of the calibration curve should not change due to a matrix effect.
10.2.4 Parallelism/Linearity
For quantitative analyses, the expected linear range of the immunoassay shall be explicitly stated in the scope of
applications for all the matrices covered by it.
The number of calibration points supplied should reflect the linear portion of the curve (i.e. if the calibration curve is
non – linear more calibration points will need to be generated).
If the calibration curves do not appear “parallel” or of the same slope when graphed side by side, the data should
be statistically analysed for a test of dilution comparability.
10.2.5 Limits of detection
Results should not be interpreted below the limit of detection. In this case, reporting of results should be stated to
be at or less than the limit of detection.
10.2.6 Limits of quantitation
The limits of quantitation for each set of calibrants (or dilution) need to be stated explicitly.
The estimated concentration of unknown sample test solutions should be interpolated and not extrapolated.
Results should not be interpreted below the limit of quantitation or above the highest or below the lowest calibration
points.
11 Confirming method
To establish the credibility of assays, another method such as western blot, HPLC or functional assay can be used
to measure split analytical samples of known concentration. The results of both methods are then qualitati-
vely/quantitatively compared. This is especially important for immunoassays, since antibodies could cross react
with other analytes present in a matrix.
12 Test report
The test report shall contain at least the following information:
all information needed to identify the laboratory sample;
reference to this standard and to the method used, and an indication of whether it was a qualitative,
quantitative or semi-quantitative method;
limit of detection;
upper and lower limits of quantification;
date and the type of sampling procedure used (if known);
d
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21572
Première édition
2004-03-15
Produits alimentaires — Méthodes pour
la détection d'organismes génétiquement
modifiés et de produits dérivés —
Méthodes basées sur les protéines
Foodstuffs — Methods for the detection of genetically modified
organisms and derived products — Protein based methods
Numéro de référence
ISO 21572:2004(F)
©
ISO 2004
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ISO 21572:2004(F)
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ISO 21572:2004(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 21572 a été élaborée par le Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, conformément à l'Accord de coopération technique entre l'ISO et
le CEN (Accord de Vienne).
Tout au long du texte du présent document, lire «… la présente Norme européenne …» avec le sens de
«… la présente Norme internationale …».
© ISO 2004 – Tous droits réservés iii
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ISO 21572:2004(F)
Sommaire Page
Avant-propos . v
Introduction.vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 5
5 Réactifs. 5
6 Appareillage et équipement . 5
7 Échantillonnage. 5
8 Mode opératoire . 5
9 Interprétation et expression des résultats . 6
10 Paramètres spécifiques pouvant influer sur les résultats. 7
11 Méthode de confirmation . 9
12 Rapport d'essai. 9
Annexe A (normative) Détection de graines de soja génétiquement modifiées (résistantes au
®
Roundup-Ready ). 10
Bibliographie. 22
iv © ISO 2004 – Tous droits réservés
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ISO 21572:2004(F)
Avant-propos
Le présent document (EN ISO 21572:2004) a été élaboré par le Comité Technique CEN/TC 275 “Analyse des
produits alimentaires - Méthodes horizontales”, dont le secrétariat est tenu par DIN, en collaboration avec le
Comité Technique ISO/TC 34 “Produits alimentaires”.
Cette Norme européenne devra recevoir le statut de norme nationale, soit par publication d'un texte identique, soit
par entérinement, au plus tard en septembre 2004, et toutes les normes nationales en contradiction devront être
retirées au plus tard en septembre 2004.
La preuve de la présence de protéines génétiquement modifiées peut être d'ordre qualitatif ou quantitatif. Ces
étapes figurent dans la présente Norme européenne.
Parmi les autres normes traitant de méthodes d’analyse pour la détection d’organismes génétiquement modifiés et
de produits dérivés présents dans les produits alimentaires figurent les projets de norme suivants :
prEN ISO 21568, Produits alimentaires – Méthodes d’analyse pour la détection d’organismes génétiquement
modifiés et de produits dérivés – Echantillonnage (ISO/DIS 21568 :2003)
prEN ISO 21571, Produits alimentaires - Méthodes d’analyse pour la détection d’organismes génétiquement
modifiés et de produits dérivés - Extraction des acides nucléiques (ISO/DIS 21571 :2002)
prEN ISO 21569, Produits alimentaires - Méthodes d’analyse pour la détection d’organismes génétiquement
modifiés et de produits dérivés - Méthode qualitative basée sur la recherche des acides nucléiques
(ISO/DIS 21569 :2002)
prEN ISO 21570, Produits alimentaires - Méthodes d’analyse pour la détection d’organismes génétiquement
modifiés et de produits dérivés - Méthode quantitative basée sur la recherche des acides nucléiques
(ISO/DIS 21570 :2003)
Pour plus d'informations sur les définitions et les éléments à caractère général inclus dans les étapes citées ci-
dessus, se référer au :
prEN ISO 24276, Produits alimentaires - Détection d’organismes génétiquement modifiés et de produits
dérivés - Exigences générales et définitions (ISO/DIS 24276 :2002)
L’Annexe A est normative.
Le présent document traite de méthodes qui peuvent faire l’objet de droits d’auteur et de brevets : pour plus
d'informations, contacter l'institut national de normalisation.
Selon le Règlement Intérieur du CEN/CENELEC, les instituts de normalisation nationaux des pays suivants sont
tenus de mettre cette Norme européenne en application : Allemagne, Autriche, Belgique, Danemark, Espagne,
Finlande, France, Grèce, Hongrie, Irlande, Islande, Italie, Luxembourg, Malte, Norvège, Pays-Bas, Portugal,
République Tchèque, Royaume-Uni, Slovaquie, Suède et Suisse.
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ISO 21572:2004(F)
Introduction
Les analyses effectuées pour détecter les organismes génétiquement modifiés (OGM) et leurs produits dérivés
peuvent avoir pour objet de cribler, d'identifier ou de quantifier les OGM et leurs produits dérivés dans une matrice
donnée.
La détection de l'origine transgénique d'ingrédients selon une méthode fondée sur les protéines repose sur les
principes de base suivants :
prélèvement d'un échantillon représentatif de la matrice ;
extraction des protéines ;
détection et/ou identification de la protéine spécifique dérivée du ou des OGM étudiés.
Au fur et à mesure de la validation et de l’acceptation de nouvelles méthodes, celles-ci viendront s’ajouter en
annexe à la présente norme.
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1 Domaine d’application
Le présent document énonce des lignes directrices et des critères de performances généraux pour les méthodes
de détection et/ou de quantification de protéines spécifiques dérivées de matériel végétal génétiquement modifié
dans une matrice donnée.
Ces directives générales concernent les méthodes axées sur des anticorps existants. Il existe d'autres méthodes
que celles décrites en Annexe A susceptibles de détecter des protéines. Les mêmes critères que ceux répertoriés
dans la présente norme sont applicables de façon générale.
2 Références normatives
Cette Norme européenne comporte par référence datée ou non datée des dispositions d'autres publications. Ces
références normatives sont citées aux endroits appropriés dans le texte et les publications sont énumérées
ci-après. Pour les références datées, les amendements ou révisions ultérieurs de l'une quelconque de ces
publications ne s'appliquent à cette Norme européenne que s'ils y ont été incorporés par amendement ou révision.
Pour les références non datées, la dernière édition de la publication à laquelle il est fait référence s'applique (y
compris les amendements).
prEN ISO 21568, Produits alimentaires – Méthodes d’analyse pour la détection d’organismes génétiquement
modifiés et de produits dérivés – Échantillonnage (ISO/DIS 21568 :2003).
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme européenne, les termes et définitions suivants s'appliquent :
3.1 Termes généraux
3.1.1
échantillon
une ou plusieurs unités d'échantillonnage prélevées dans une population et destinées à fournir des informations
sur cette population
[ISO 3534-1:1993]
3.1.2
échantillon pour laboratoire
échantillon destiné à être utilisé pour un contrôle ou pour des essais en laboratoire
3.1.3
échantillon pour essai (prise d’essai)
échantillon préparé pour essai ou analyse, la quantité totale étant utilisée pour l’essai ou l’analyse en une seule
fois
[ISO 3534-1:1993]
3.1.4
matrice
ensemble des composants présents dans l'échantillon contenant l'analyte. Chaque matrice porte habituellement un
nom ordinaire permettant sa classification
3.1.5
dénaturation de protéines
traitement physique et/ou (bio)chimique détruisant ou modifiant la structure de l'analyte. La dénaturation peut
modifier les propriétés fonctionnelles, enzymatiques ou antigéniques de la protéine
© ISO 2004 – Tous droits réservés 1
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ISO 21572:2004(F)
3.2 Termes relatifs aux anticorps
3.2.1
anticorps
protéine (immunoglobuline) produite et secrétée par des lymphocytes B en réponse à la présence d'une molécule
reconnue comme étrangère (antigène). L'anticorps est capable de se lier à cet antigène spécifique
3.2.2
antigène
substance reconnue comme étant un corps étranger par le système immunitaire et provoquant une réponse
immunitaire
3.2.3
clone
population de cellules identiques issues d'une seule lignée cellulaire
3.2.4
réactivité croisée
anticorps lié à des substances autres que l'analyte de premier intérêt
3.2.5
anticorps monoclonal
anticorps produit à partir d'un seul clone d'hybridome et dirigé vers un déterminant antigénique unique
3.2.6
anticorps polyclonal
anticorps produit par plusieurs clones de lymphocytes
3.2.7
spécificité d'un anticorps
capacité d'un anticorps à se lier spécifiquement à un déterminant antigénique et non à d'autres structures similaires
de cet antigène ou d'autres antigènes
3.3 Termes relatifs aux techniques
3.3.1
conjugué
matériau formé par liaison de deux ou plusieurs substances
NOTE Les conjugués d’anticorps couplés à des fluorochromes (par exemple particules colorées), des substances
marquées ou des enzymes sont souvent utilisés dans des immunoessais.
3.3.2
western blot
transfert d’un antigène (c’est-à-dire le protéine d’intérêt) séparé par électrophorèse vers une surface de liaison
L’antigène peut être visualisé avec un anticorps spécifique marqué ou conjugué avec une enzyme
3.3.3
ELISA – Essai par immunosorbant lié à une enzyme
essai in vitro de quantification via l'utilisation d'anticorps liés à des enzymes et d'un substrat constituant un produit
de réaction coloré
En fonction de l’application, cet essai peut être utilisé à des fins qualitatives ou quantitatives.
3.3.4
kit d'essai
ensemble constitué de produits chimiques, de matériaux et d’un mode d'emploi rassemblés en un tout et destiné à
la mesure in vitro en vue de la détection d'un analyte particulier
2 © ISO 2004 – Tous droits réservés
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ISO 21572:2004(F)
3.3.5
format bandelette
formats de dosages qualitatives et rapides, comprenant des bandelettes pour lesquelles un anticorps ou un analyte
recouvre une surface solide en bandes perpendiculaires à la bandelette principale
3.4 Termes relatifs au contrôle
3.4.1
matériau de référence
matériau ou substance dont une ou plusieurs valeurs de propriété sont suffisamment homogènes et correctement
définies pour permettre de l’utiliser pour l'étalonnage d'un appareil, l'évaluation d'une méthode de mesurage ou
l'attribution de valeurs aux matériaux
[Guide ISO 30]
3.4.2
étalon
mesure matérialisée, appareil de mesure, matériau de référence ou système de mesure destiné à définir, réaliser,
conserver ou reproduire une unité ou une ou plusieurs valeurs d’une grandeur pour servir de référence
L’étalon peut servir de préparation, dont les caractéristiques sont connues, pour normaliser l'analyse.
3.5 Termes relatifs à la validation
3.5.1
exactitude
étroitesse de l’accord entre le résultat d'essai et la valeur de référence acceptée
NOTE Le terme "exactitude", appliqué à un ensemble de résultats d'essai implique une combinaison de composants
aléatoires et d’une erreur systématique commune ou d’une composante de biais.
[ISO 3534-1:1993]
3.5.2
fidélité
étroitesse d’accord entre des résultats d’essai indépendants obtenus sous des conditions stipulées
NOTE 1 La fidélité dépend uniquement de la distribution des erreurs aléatoires et n’a aucune relation avec la valeur vraie ou
la valeur spécifiée.
NOTE 2 La mesure de la fidélité est exprimée en termes d'infidélité et est calculée à partir de l’écart-type des résultats
d'essais. Une fidélité faible est reflétée par un grand écart-type.
NOTE 3 Des résultats d'essais indépendants signifient des résultats obtenus d’une façon non influencée par un résultat
précédent sur le même matériel ou similaire. Les mesures quantitatives de la fidélité dépendent de façon critique des conditions
stipulées. Les conditions de répétabilité et de reproductibilité sont des ensembles particuliers de conditions extrêmes stipulées.
[ISO 3534-1:1993]
3.5.3
biais
estimation de l'écart systématique du résultat mesuré par rapport au résultat réel d'un échantillon donné
3.5.4
sensibilité
capacité à enregistrer de faibles variations de concentration d'une substance dans le matériau d'essai
Dans ce contexte, la sensibilité indique habituellement la plus petite quantité ou concentration d'analyte pouvant
être différenciée du bruit de fond avec fiabilité.
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ISO 21572:2004(F)
3.5.5
spécificité
capacité d’une méthode à réagir exclusivement à la caractéristique ou à l'analyte défini dans le Codex
3.5.6
limite de détection
pour les méthodes qualitatives, plus petite concentration ou quantité de l’analyte pouvant être détectée de manière
fiable mais pas nécessairement quantifiée, démontré par un essai interlaboratoire satisfaisant ou par une validation
effectuée par un seul laboratoire [1], [2]
3.5.7
limite de quantification
pour un mode opératoire d’analyse, plus petite quantité ou concentration d’analyte présente dans un échantillon
pouvant être déterminée quantitativement avec un niveau de fidélité et d'exactitude acceptable démontré par un
essai interlaboratoire satisfaisant ou par une validation effectuée par un seul laboratoire conformément à
l’ISO 5725, [2], ou [3]
3.5.8
plage d’applicabilité (plage de quantification/ de linéarité/plage dynamique
plage définie par les limites supérieure et inférieure de quantification, telles qu'exprimées par un ensemble de
matériaux de référence (ou de dilutions)
3.5.9
limite de répétabilité [reproductibilité]
valeur au-dessous de laquelle est située, avec une probabilité de 95 %, la valeur absolue de la différence entre
deux résultats d’essais, obtenus sous des conditions de répétabilité (de reproductibilité)
NOTE Le symbole utilisé est r [R].
[ISO 3534-1:1993]
Lors de l’examen de deux résultats d’essais individuels obtenus sous des conditions de répétabilité [de
reproductibilité], il convient de faire la comparaison avec la limite de répétabilité (reproductibilité) r [R] = 2,8 s [S ]
r R
3.5.10
reproductibilité
fidélité dans des conditions de reproductibilité
[ISO 3534-1:1993]
3.5.11
conditions de reproductibilité
conditions où les résultats d'essais sont obtenus par la même méthode sur des individus d'essai identiques dans
différents laboratoires, avec différents opérateurs et utilisant des équipements différents
[ISO 3534-1:1993]
3.5.12
répétabilité
fidélité dans des conditions de répétabilité
[ISO 3534-1:1993]
3.5.13
conditions de répétabilité
conditions où les résultats d'essais indépendants sont obtenus par la même méthode sur des individus d'essai
identiques dans le même laboratoire, par le même opérateur, utilisant le même équipement et pendant un court
intervalle de temps
[ISO 3534-1:1993]
4 © ISO 2004 – Tous droits réservés
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ISO 21572:2004(F)
3.5.14
écart-type de répétabilité [de reproductibilité]
écart-type des résultats d’essais obtenus sous des conditions de répétabilité [de reproductibilité]
NOTE L’écart-type de répétabilité [de reproductibilité] est une mesure de la dispersion de la loi des résultats d’essais sous
des conditions de répétabilité [de reproductibilité]. On peut définir de façon similaire la « variance de répétabilité
(reproductibilité) et le coefficient de variation de répétabilité [de reproductibilité] et les utiliser comme mesures de la dispersion
des résultats d’essais dans des conditions de répétabilité [de reproductibilité].
3.5.15
récupération
capacité à mesurer ou récupérer une quantité connue d’analyte à partir d'échantillons dopés dans une plage de
quantification
4 Principe
La protéine cible est extraite selon le mode opératoire décrit pour cette matrice spécifique et un anticorps
spécifique est utilisé pour détecter ou mesurer la concentration de la protéine présente dans l’échantillon.
5 Réactifs
Sauf indication contraire, au cours de l'analyse utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et
de l'eau déminéralisée, distillée, purifiée ou ayant subi un traitement équivalent.
D'autres réactifs, tels que les anticorps, les anticorps conjugués, les substrats, les solutions de blocage et les
tampons sont propres à la méthode. Pour des cas spécifiques de réactifs, tels que des étalons protéiniques ou des
matériaux de référence, des anticorps libres ou sensibilisés sur une surface solide, des contrôles et des
échantillons, se référer à la méthode concernée.
6 Appareillage et équipement
L’appareillage et l’équipement sont spécifiés en A.5.
7 Échantillonnage
L'échantillonnage est décrit en détail dans le prEN ISO 21568.
8 Mode opératoire
8.1 Généralités
Les conditions de stockage et la durée de conservation des anticorps, du conjugué, du substrat, etc., doivent être
clairement spécifiées par le fournisseur.
Dans le cadre de cette norme, les exigences générales relatives à l'assurance qualité des laboratoires doivent être
respectées (par exemple : étalonnage de l'appareillage, dosage en double, essais à blanc, utilisation de matériaux
de référence, préparation de courbes d'étalonnage, etc.). Nettoyer avec soin l'ensemble de l'équipement placé en
contact direct avec l'échantillon afin d'éviter toute contamination.
Utiliser un matériel de laboratoire approprié ayant une faible capacité de liaison des protéines (par exemple tubes
en polypropylène) afin d’empêcher l’adsorption des protéines pendant toute la durée du mode opératoire.
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ISO 21572:2004(F)
8.2 Préparation de la solution d’échantillon
Des modes opératoires spécifiques pour la préparation des échantillons représentatifs obtenus sont proposés en
Annexe A.
Si nécessaire, broyer les échantillons tel que spécifié dans la méthode avant de prélever les prises d'essai. Les
poudres et la farine peuvent présenter des propriétés de gonflement et parfois nécessiter une extraction à l'aide
d'un double volume de solution d'extraction.
Les échantillons de laboratoire renfermant d’importantes quantités de matières grasses peuvent ne pas s'avérer
suffisamment homogènes et par conséquent requérir l'extraction d'un échantillon plus important. Le cas échéant,
des instructions sont présentées en Annexe A.
Peser une quantité appropriée (spécifiée en Annexe A) d'un échantillon analytique représentatif pour analyse en
vue d'obtenir une prise d'essai pour extraction. Ajouter la solution d'extraction, puis homogénéiser ou mélanger.
8.3 Extraction
Suivre une procédure d'extraction adaptée à la matrice. Les conditions requises pour l'extraction ou la dilution de la
prise d'essai, des contrôles et des matériaux de référence sont présentés en détail en Annexe A.
Il convient de veiller à l’utilisation de procédures d'extraction validées pour la matrice et, si besoin est, d’utiliser des
agents liants ou des tampons spéciaux en vue de faciliter l'extraction de la protéine (par exemple, le liant de tanin à
ajouter pour l'analyse de chocolat noir).
8.4 Préparation des courbes d'étalonnage
Pour la préparation des courbes d'étalonnage, il est recommandé d'utiliser des matériaux de référence adaptés à la
matrice ou des matériaux de référence qui ont été validés pour la matrice.
8.5 Mode opératoire de dosage
En fonction du mode opératoire choisi dans l’Annexe A de cette norme, sélectionner le nombre requis de bandes,
d'essais, etc., nécessaires pour la série de solutions d'essai d’échantillon à analyser, y compris les témoins, les
références, les étalons et les contrôles, puis ajouter la solution d'essai d’échantillon, les étalons etc., au moins en
double en les diluant correctement en fonction du dosage.
Selon la méthode choisie, mélanger délicatement, puis laisser la réaction se dérouler pendant le laps de temps et
dans la plage de température indiqués. Si nécessaire, interrompre la réaction selon la méthode décrite en annexe.
La stabilité du signal final peut varier. Relever les résultats aux intervalles de temps spécifiés en annexe.
9 Interprétation et expression des résultats
9.1 Généralités
Les paramètres à interpréter varient selon que l'analyse est qualitative, semi-quantitative ou quantitative.
Pour les méthodes quantitatives, le coefficient de variation des valeurs de densité optique résultant de mesures en
double d'une solution d'essai d’échantillon ne doit pas dépasser en général 15 %. Le coefficient de variation des
concentrations calculées résultant de mesures en double d'une solution d'essai d’échantillon ne doit pas dépasser
en général 20 % du coefficient de variation.
Si la limite du coefficient de variation en pourcentage est dépassé, il convient de répéter les analyses avec une
solution d'essai d’échantillon fraîchement préparée. Dans ce cas, trois dosages au moins doivent être réalisés pour
définir un coefficient de variation (exemple : valeurs de 3 puits à microtitration).
6 © ISO 2004 – Tous droits réservés
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ISO 21572:2004(F)
Aucune affirmation quant à l'absence d'OGM dans l'échantillon analysé ne doit être émise. Les résultats négatifs
doivent être consignés comme étant “négatifs à la limite de détection” ou “inférieurs à la limite de détection”.
Les résultats positifs situés sous la limite de quantification doivent être consignés comme étant “positifs au-delà de
la limite de détection, mais en deçà de la limite de quantification”.
9.2 Analyses quantitative et semi-quantitative
Les paramètres suivants sont évalués : données brutes (valeurs numériques continues) de la solution d'essai
d’échantillon, du témoin, du matériau de référence ou de l'étalon analytique, ainsi que du contrôle négatif, le
coefficient de variation en pourcentage entre les mesures en double, le coefficient de variation en pourcentage de
l'étalon et celui des échantillons contrôle.
L'ensemble des résultats finaux, y compris l'incertitude de mesure précédemment définie, doit être consigné.
Il n’est pas possible de consigner les résultats quantitatifs en extrapolant les chiffres au-delà du point le plus haut
et en deçà du point le plus bas de la courbe d’étalonnage.
9.3 Analyse qualitative
Pour les essais qualitatifs et toutes les applications s'y rapportant, les paramètres correspondants sont décrits en
annexe.
Il est recommandé de consigner les résultats comme étant ou non détectés, et d’inclure la limite de détection.
10 Paramètres spécifiques pouvant influer sur les résultats
10.1 Généralités
Les critères de performances répertoriés dans la méthode figurant en Annexe A constituent un ensemble de
spécifications de performances établies pour chaque méthode au cours du développement, de la validation et de
l'utilisation habituelle de la méthode. Ces paramètres ont été définis pour chaque méthode et ont pour objet de
garantir que les données générées sont fiables et toujours de grande qualité. À chaque exécution d'une méthode,
évaluer les paramètres générés, puis les comparer aux critères de performances définies pour la méthode.
Lorsque une valeur (par exemple le coefficient de variation en pourcentage entre mesures en double) ne répond
pas aux spécifications d'analyse, le résultat est indiqué comme atypique et une évaluation plus fine des données
est engagée. La liste des spécifications doit être considérée globalement, car si certains paramètres peuvent ne
pas répondre aux spécifications, les données peuvent néanmoins demeurer parfaitement acceptables. Lorsqu'un
critère quelconque n'est pas satisfait, il convient de le noter par écrit et d'évaluer les données afin de déterminer si
l'analyse des résultats doit être ajustée ou si un échantillon particulier ou un ensemble d'échantillons doit à
nouveau être soumis à essai. De telles décisions dépendent du jugement du chercheur interprétant l'ensemble des
critères.
10.2 Considérations particulières
10.2.1 Spécificité
L'adéquation de la spécificité de l'analyse pour un analyte particulier doit être prouvée pour chaque analyte
(protéine) à mesurer et dans chaque matrice soumise à essai. Le cas échéant, il convient d'évaluer la réactivité
croisée lorsqu'il existe des analogues (protéines présentant une séquence similaire). Pour déceler l’absence de
l’analyte dans un organisme non génétiquement modifié, analyser l'ingrédient non génétiquement modifié et
l'ingrédient génétiquement modifié selon les dilutions appropriées, puis comparer les analyses.
Ceci est généralement fait au cours du développement et de la validation de la méthode et ne s’avère p
...
Questions, Comments and Discussion
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