Horizontal methods for molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products

ISO/TS 21569-6:2016 specifies a procedure for the detection of a DNA sequence of the modified cry1Ab/Ac gene and a procedure for the detection of the DNA transition sequence between the maize ubiquitin promoter (Pubi) and the cry1Ab/Ac gene. The modified cry1Ab/Ac gene and the Pubi-cry construct are frequently found in genetically modified Bt plants. Both detection methods are based on real-time PCR and can be used for qualitative screening purposes. For identification and quantification of a specific genetically modified plant (event) a follow-up analysis has to be carried out. ISO/TS 21569-6:2016 is applicable for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It may also be suitable for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of these methods requires the extraction of an adequate amount of amplifiable DNA from the relevant matrix.

Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés

L'ISO/TS 21569-6:2016 spécifie une méthode de détection d'une séquence d'ADN du gčne cry1Ab/Ac modifié et une méthode de détection de la séquence d'ADN de transition entre le promoteur de l'ubiquitine du maďs (Pubi) et le gčne cry1Ab/Ac. Le gčne cry1Ab/Ac modifié et le construit Pubi-cry sont fréquemment observés dans les plantes génétiquement modifiées contenant le gčne Bt. Les deux méthodes sont basées sur une méthode par PCR en temps réel et peuvent ętre utilisées ŕ des fins de criblage qualitatif. Pour l'identification et la quantification d'une plante génétiquement modifiée (événement) spécifique, une analyse complémentaire doit ętre effectuée. L'ISO/TS 21569-6:2016 est applicable ŕ l'analyse de l'ADN extrait de produits alimentaires. Il peut ętre également utilisé pour analyser l'ADN extrait d'autres produits tels que des aliments pour animaux et des semences. L'application de ces méthodes exige qu'une quantité adéquate d'ADN amplifiable soit extraite de la matrice étudiée.

General Information

Status
Published
Publication Date
01-Nov-2016
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
06-Oct-2016
Completion Date
02-Nov-2016
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Technical specification
ISO/TS 21569-6:2016 - Horizontal methods for molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products
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ISO/TS 21569-6:2016 - Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés
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Standards Content (sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21569-6
First edition
2016-11-01
Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of
genetically modified organisms and
derived products —
Part 6:
Real-time PCR based screening
methods for the detection of
cry1Ab/Ac and Pubi-cry DNA
sequences
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Partie 6: Méthodes de dépistage PCR en temps réel pour la détection
de séquences ADN cry1Ab/Ac et Pubi-cry
Reference number
ISO/TS 21569-6:2016(E)
ISO 2016
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 21569-6:2016(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2016, Published in Switzerland

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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ISO/TS 21569-6:2016(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 PCR reagents ............................................................................................................................................................................................. 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Preparation of test samples ......................................................................................................................................................... 3

7.2 Preparation of DNA extracts ........................................................................................................................................................ 3

7.3 PCR setup ..................................................................................................................................................................................................... 3

7.4 Temperature-time programme ................................................................................................................................................. 4

8 Accept/reject criteria ...................................................................................................................................................................................... 4

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 4

9 Validation status and performance criteria ............................................................................................................................. 4

9.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

9.2 Robustness ................................................................................................................................................................................................. 5

9.3 Collaborative trial ................................................................................................................................................................................. 5

9.4 Sensitivity .................................................................................................................................................................................................... 7

9.5 Specificity .................................................................................................................................................................................................... 8

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................10

© ISO 2016 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-6:2016(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,

as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the

Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www.iso.org/iso/foreword.html.

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

A list of all the parts in the ISO/TS 21569 series can be found on the ISO website.

iv © ISO 2016 – All rights reserved
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21569-6:2016(E)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products —
Part 6:
Real-time PCR based screening methods for the detection
of cry1Ab/Ac and Pubi-cry DNA sequences
1 Scope

This document specifies a procedure for the detection of a DNA sequence of the modified cry1Ab/Ac

gene and a procedure for the detection of the DNA transition sequence between the maize ubiquitin

promoter (Pubi) and the cry1Ab/Ac gene. The modified cry1Ab/Ac gene and the Pubi-cry construct are

frequently found in genetically modified Bt plants. Both detection methods are based on real-time PCR

and can be used for qualitative screening purposes. For identification and quantification of a specific

genetically modified plant (event) a follow-up analysis has to be carried out.

This document is applicable for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It may also be suitable for

the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of these

methods requires the extraction of an adequate amount of amplifiable DNA from the relevant matrix.

2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Qualitative nucleic acid based methods

ISO 21570, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Quantitative nucleic acid based methods

ISO 21571:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Nucleic acid extraction

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: available at http://www.iso.org/obp
© ISO 2016 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 21569-6:2016(E)
4 Principle

DNA is extracted from the test portion applying a suitable method (see ISO 21571). The DNA analysis

consists of two parts:

a) verification of the amount and amplifiability of the extracted DNA, e.g. by means of a target taxon

specific real-time PCR (according to ISO 21570, see also Reference [1];

b) detection of the cry1Ab/Ac and/or the Pubi-cry DNA sequence in a real-time PCR, see References [2]

and [3].
5 Reagents and materials
5.1 General

For the purpose of this document, only chemicals and water of recognized analytical grade, appropriate

for molecular biology shall be used. Unless stated otherwise, solutions should be prepared by dissolving

the corresponding reagents in water and be autoclaved. For all operations in which gloves are used, it

should be ensured that these are powder-free. The use of aerosol-protected pipette tips as protection

against cross contamination is recommended.
5.2 PCR reagents
5.2.1 Thermostable DNA polymerase, (for hot-start PCR).

5.2.2 PCR buffer solution, containing magnesium chloride and deoxyribonucleoside triphosphates

(dNTPs).

Ready-to-use reagent mixtures or mixes of individual components can be used. Reagents and

polymerases which lead to equal or better results may also be used.
5.2.3 Oligonucleotides (see Tables 1 and 2).
Table 1 — Oligonucleotides for detection of cry1Ab/Ac
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in the PCR
[2]
cry1Ab/Ac as target sequence :
Bt-F1(mod) 5’-gAg gAA ATg CgT ATT CAA TTC AAC-3’ 400 nmol/l
Bt-R 5’-TTC Tgg ACT gCg AAC AAT gg-3’ 400 nmol/l
Bt-P 5’-(FAM)-ACA TgA ACA gCg CCT TgA CCA CAg C-(NFQ)-3’ 100 nmol/l
FAM: 6-Carboxyfluorescein, NFQ: non-fluorescent quencher (dark quencher).
Table 2 — Oligonucleotides for detection of Pubi-cry
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in the PCR
[2]
Pubi-cry as target sequence :
Pubi-F2 5’-ATT TgC TTg gTA CTg TTT CTT TTg TC-3’ 300 nmol/l
Cry-rr-R 5’-TTg TTg TCC ATg gAT CCT CTA gAg T-3’ 600 nmol/l
a,b
Pubi-T2 5’- (FAM)- ACC CTg TTg TTT ggT gTT ACT TCT gCA-(NFQ)-3’ 100 nmol/l
FAM: 6-Carboxyfluorescein, NFQ: non-fluorescent quencher (dark quencher).

The Pubi-T2 probe is three bases shorter than the probe described in Reference [3] but identical specificity and

sensitivity is achieved.
2 © ISO 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 21569-6:2016(E)

Equivalent reporter dyes and/or quencher dyes may be used for the probe if they can be shown to yield

similar or better results.
6 Apparatus

Requirements concerning apparatus and materials shall be according to ISO 21569. In addition to the

usual laboratory equipment, the following equipment is required.

6.1 Real-time PCR device, suitable for the excitation of fluorescent molecules and the detection of

fluorescence signals generated during PCR.
7 Procedure
7.1 Preparation of test samples

It should be ensured that the test portion used for DNA extraction is representative of the laboratory

sample, e.g. by grinding or homogenizing of the samples. Measures and operational steps to be taken

into consideration should be as described in ISO 21571 and ISO 24276.
7.2 Preparation of DNA extracts

Concerning the preparation of DNA from the test portion, the general instructions and measures

described in ISO 21571 shall be followed. It is recommended to choose one of the DNA extraction

methods described in ISO 21571:2005, Annex A.
7.3 PCR setup

The method is described for a total volume of 25 μl per PCR. The reaction setup is given in Table 3.

Completely thaw reagents at room temperature. Each reagent should be carefully mixed and briefly

centrifuged immediately before pipetting. A PCR reagent mixture is prepared which contains all

components except for the sample DNA. The required amount of the PCR reagent mixture depends

on the number of reactions to be performed, including at least one additional reaction as a pipetting

reserve. Add 5 µl of sample DNA to each reaction.
Table 3 — Reaction setup for the amplification
Total reaction volume 25 µl
Sample DNA (up to 200 ng) or controls 5 µl

PCR buffer solution (including MgCl , dNTP’s and hot-start DNA polymerase) 12,5 µl

Primers Bt-F1(mod) and Bt-R or primers Pubi-F2 and Cry-rr-R see Table 1 or 2
Probe Bt-P or probe Pubi-T2 see Table 1 or 2
Water add to obtain 25 µl

In the interlaboratory trial TaqMan® Universal PCR Mastermix (Life Technologies) was used as PCR buffer solution.

This information is given for convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the

product names. Equivalent products from other manufacturers may be used if they can be shown to give equivalent or

better results. If necessary, adapt the amounts of the reagents and the temperature-time programme.

Mix the PCR reagent mixture, centrifuge briefly and pipette 20 µl into each reaction vial. For the

amplification reagent control, add 5 µl of water into the respective reaction setup. Pipette either 5 µl

of sample DNA or 5 µl of the respective control solution (extraction blank control, positive DNA target

control). If necessary, prepare a PCR inhibition control as described in ISO 24276.

Transfer the reaction setups into the thermal cycler and start the temperature-time programme.

© ISO 2016 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO/TS 21569-6:2016(E)
7.4 Temperature-time programme

The temperature-time programme as outlined in Table 4 has been used in the validation study. The use

of different reaction conditions and real-time PCR cyclers may require specific optimization. The time

for initial denaturation depen
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 21569-6
Première édition
2016-11-01
Méthodes horizontales d’analyse
moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 6:
Méthodes de criblage par PCR en
temps réel pour la détection des
séquences ADN cry1Ab/Ac et Pubi-cry
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products —
Part 6: Real-time PCR based screening methods for the detection of
cry1Ab/Ac and Pubi-cry DNA sequences
Numéro de référence
ISO/TS 21569-6:2016(F)
ISO 2016
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 21569-6:2016(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2016, Publié en Suisse

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2016 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 21569-6:2016(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 2

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

5.2 Réactifs PCR ............................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Préparation des échantillons pour essai .......................................................................................................................... 3

7.2 Préparation des extraits d’ADN ................................................................................................................................................. 3

7.3 Réaction PCR ............................................................................................................................................................................................. 3

7.4 Programme d’amplification ......................................................................................................................................................... 4

8 Critères d’acceptation/rejet ..................................................................................................................................................................... 4

8.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 5

9 État de validation et critères de performance ....................................................................................................................... 5

9.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 5

9.2 Robustesse .................................................................................................................................................................................................. 5

9.3 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................... 5

9.4 Sensibilité .................................................................................................................................................................................................... 7

9.5 Spécificité ..................................................................................................................................................................................................... 8

10 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................10

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................11

© ISO 2016 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-6:2016(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation

de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation

mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien

suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

Une liste de toutes les parties de l’ISO/TS 21569 est disponible sur le site de l’ISO.

iv © ISO 2016 – Tous droits réservés
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 21569-6:2016(F)
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés —
Partie 6:
Méthodes de criblage par PCR en temps réel pour la
détection des séquences ADN cry1Ab/Ac et Pubi-cry
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode de détection d’une séquence d’ADN du gène cry1Ab/Ac modifié

et une méthode de détection de la séquence d’ADN de transition entre le promoteur de l’ubiquitine du

maïs (Pubi) et le gène cry1Ab/Ac. Le gène cry1Ab/Ac modifié et le construit Pubi-cry sont fréquemment

observés dans les plantes génétiquement modifiées contenant le gène Bt. Les deux méthodes sont

basées sur une méthode par PCR en temps réel et peuvent être utilisées à des fins de criblage qualitatif.

Pour l’identification et la quantification d’une plante génétiquement modifiée (événement) spécifique,

une analyse complémentaire doit être effectuée.

Le présent document est applicable à l’analyse de l’ADN extrait de produits alimentaires. Il peut être

également utilisé pour analyser l’ADN extrait d’autres produits tels que des aliments pour animaux

et des semences. L’application de ces méthodes exige qu’une quantité adéquate d’ADN amplifiable soit

extraite de la matrice étudiée.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 21569, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques

ISO 21570, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques

ISO 21571:2005, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes

génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques

ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 16577 s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
© ISO 2016 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 21569-6:2016(F)
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp
4 Principe

L’ADN est extrait de la prise d’essai en appliquant une méthode appropriée (voir l’ISO 21571). L’analyse

de l’ADN comprend deux parties:

a) vérification de la quantité et de l’amplificabilité de l’ADN extrait, par exemple au moyen d’une

PCR en temps réel spécifique pour le taxon cible (conformément à l’ISO 21570), voir également la

Référence [1];

b) détection de la séquence d’ADN cry1Ab/Ac et/ou la séquence d’ADN Pubi-cry par une PCR en temps

réel, voir les Références [2] et [3].
5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités

Pour les besoins du présent document, seules des substances chimiques et de l’eau de qualité analytique

reconnue, appropriées pour la biologie moléculaire, doivent être utilisées. Sauf indication contraire,

il convient de préparer les solutions par dissolution des réactifs correspondants dans l’eau et par

traitement à l’autoclave. Pour toutes les opérations nécessitant le port de gants, il convient de s’assurer

que ceux-ci ne sont pas poudrés. Pour éviter toute contamination croisée, il est recommandé d’utiliser

des embouts de pipette protégés contre les aérosols.
5.2 Réactifs PCR
5.2.1 ADN polymérase thermostable (pour PCR «à démarrage à chaud»).

5.2.2 Solution tampon pour PCR contenant du chlorure de magnésium et des désoxyribonucléosides

triphosphates (dNTP).

Il est possible d’utiliser des mélanges de réactifs ou des préparations de composants individuels prêts

à l’emploi. Des réactifs et des polymérases conduisant à des résultats équivalents ou meilleurs peuvent

être également utilisés.
5.2.3 Oligonucléotides (voir Tableaux 1 et 2).
Tableau 1 — Oligonucléotides pour la détection de la séquence cry1Ab/Ac
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[2]
cry1Ab/Ac comme séquence cible :
Bt-F1(mod) 5’-gAg gAA ATg CgT ATT CAA TTC AAC-3’ 400 nmol/l
Bt-R 5’-TTC Tgg ACT gCg AAC AAT gg-3’ 400 nmol/l
Bt-P 5’-(FAM)-ACA TgA ACA gCg CCT TgA CCA CAg C-(NFQ)-3’ 100 nmol/l

FAM: carboxy-6-fluorescéine, NFQ: chromophore extincteur non fluorescent (Dark Quencher).

2 © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO/TS 21569-6:2016(F)
Tableau 2 — Oligonucléotides pour la détection de la séquence Pubi-cry
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[2]
Pubi-cry en tant que séquence cible :
Pubi-F2 5’-ATT TgC TTg gTA CTg TTT CTT TTg TC-3’ 300 nmol/l
Cry-rr-R 5’-TTg TTg TCC ATg gAT CCT CTA gAg T-3’ 600 nmol/l
a,b
Pubi-T2 5’- (FAM)- ACC CTg TTg TTT ggT gTT ACT TCT gCA-(NFQ)-3’ 100 nmol/l

FAM: carboxy-6-fluorescéine, NFQ: chromophore extincteur non fluorescent (Dark Quencher).

La sonde Pubi-T2 a trois bases de moins que la sonde décrite dans la Référence [3] mais une spécificité et une sensibilité

identiques sont obtenues.

Des chromophores rapporteurs et/ou des chromophores extincteurs équivalents peuvent être utilisés

pour la sonde s’il peut être démontré qu’ils donnent des résultats similaires ou meilleurs.

6 Appareillage

Les exigences concernant l’appareillage et les matériaux doivent être conformes à l’ISO 21569. Outre le

matériel courant de laboratoire, l’équipement suivant est requis.

6.1 Appareil de PCR en temps réel, approprié pour l’excitation des molécules fluorescentes et pour

la détection des signaux de fluorescence générés pendant la PCR.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des échantillons pour essai

Il convient de s’assurer que la prise d’essai utilisée pour l’extraction de l’ADN soit représentative de

l’échantillon pour laboratoire, par exemple en broyant ou homogénéisant les échantillons. Il convient

que les mesures et étapes opératoires à prendre en considération soient telles que décrites dans

l’ISO 21571 et l’ISO 24276.
7.2 Préparation des extraits d’ADN

Concernant la préparation d’ADN à partir de la prise d’essai, il convient de suivre les instructions

générales et les mesures spécifiées dans ISO 21571. Il est recommandé de choisir l’une des méthodes

d’extraction d’ADN décrites dans l’ISO 21571:2005, Annexe A.
7.3 Réaction PCR

La méthode est décrite pour un volume total de 25 µl par réaction PCR. Le mélange réactionnel est

indiqué dans le Tableau 3.

Décongeler totalement les réactifs à température ambiante. Il convient de s’assurer que chaque réactif

est soigneusement mélangé et brièvement centrifugé juste avant d’être pipeté. Un mélange de réactifs

pour PCR, contenant tous les composants, sauf l’ADN échantillon, est préparé. La quantité nécessaire

de mélange de réactifs pour PCR dépend du nombre de réactions à réaliser, en incluant au moins une

réaction supplémentaire comme réserve de pipetage. Ajouter 5 µl d’ADN échantillon à chaque réaction.

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ISO/TS 21569-6:2016(F)
Tableau 3 — Mélange réactionnel pour l’amplification
Volume réactionnel total 25 µl
ADN échantillon (jusqu’à 200 ng) ou témoins 5 µl
Solution tampon pour PCR (contenant du MgCl , des dNTPs et de l’ADN polymérase
12,5 µl
à «démarrage à chaud»)
Amorces Bt-F1(mod) et Bt-R ou amorces Pubi-F2 et Cry-rr-R voir Tableau 1 ou 2
Sonde Bt-P ou sonde Pubi-T2 voir Tableau 1 ou 2
Eau compléter à 25 µl

Dans le cadre de l’essai interlaboratoires, le mélange maître TaqMan® Universal (Life Technologies) a été utilisé

comme solution tampon pour PCR. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne

signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents

commercialisés par d’autres fabricants peuvent être utilisés s’il peut être démontré qu’ils donnent des résultats similaires

ou meilleurs. Si nécessaire, adapter les quantités de réactifs ainsi que le programme d’amplification.

Agiter le mélange de réactifs pour PCR, le centrifuger brièvement et introduire à l’aide d’une

pipette 20 µl dans chaque tube de réaction. Pour le témoin de réactif pour amplification, ajouter 5 µl

d’eau au mélange réactionnel correspondant. À l’aide d’une pipette, ajouter 5 µl d’ADN échantillon

ou 5 µl de la solution témoin correspondante (témoin de blanc d’extraction, témoin positif d’ADN cible).

Si nécessaire, préparer un témoin d’inhibition de PCR tel que décrit dans l’ISO 24276.

Transférer les mélanges réactionnels dans le thermocycleur et lancer le programme d’amplification.

7.4 Programme d’amplification

Le programme d’amplification indiqué dans le Tableau 4 a été utilisé pour l’étude de validation.

L’utilisation de diverses conditions de réaction et de divers cycleurs pour PCR en temps réel peut

nécessiter une optimisation spécifique. Le temps nécessaire pour la dénaturation initiale dépend du

mélange maître utilisé.
Tableau 4 — Programme d’amplification
Mesurage de la
Étape Paramètre Température Durée Cycles
fluorescence
1 Dénaturation initiale 95 °C 10 min non 1
Dénaturation 94 °C 15 s non
2 Amplification 45
Hybridation et 60 °C 60 s oui
élongation
8 Critères d’acceptati
...

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