ISO 21569:2005/Amd 1:2013

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Status
Published
Publication Date
03-Apr-2013
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
20-Feb-2013
Completion Date
04-Apr-2013
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ISO 21569:2005/Amd 1:2013
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21569
First edition
2005-06-15
AMENDMENT 1
2013-04-01
Foodstuffs — Methods of analysis for
the detection of genetically modified
organisms and derived products —
Qualitative nucleic acid based methods
AMENDMENT 1
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Reference number
ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
ISO 2013
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013

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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International

Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.

Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies

casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

Amendment 1 to ISO 21569:2005was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,

Subcommittee SC 16, Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
© ISO 2013 – All rights reserved iii
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Qualitative nucleic acid based methods
AMENDMENT 1

No attempt has been made in this amendment to update the footnote numbering to fit in with the scheme

adopted in ISO 21569:2005. The footnote numbers given are for use refer solely within this amendment.

Page v, Introduction, paragraph 1
Delete “— Sampling (ISO 21568)”.
Page 2, Clause 2, ISO 24276
Delete the footnote and update the entry to read:

ISO 24276:2006, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms

and derived products — General requirements and definitions
Page 2, 4.1, paragraph 2
Delete the existing text and insert the following.

A qualitative result shall clearly demonstrate the presence or absence of the genetic element under

study, relative to appropriate controls.

NOTE Detection limits and size of the test portion are critical aspects of a method.

Page 2, 7.3.3.3.3, paragraph 2

Delete “a representative” and insert “an appropriate” so that the text reads as follows.

Primers designed to detect taxon-specific target sequences should be shown to detect these

sequences reliably in an appropriate number of different members of the taxon.
Page 6, 8.1 a) and b)
In both cases, delete “ISO 24276:—”, and insert “ISO 24276:2006.
Page 7, 9.4
© ISO 2013 – All rights reserved 1
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
Delete the existing text and insert the following.

Results within the same test portion shall be consistent. In case of +/− results for the two replicates,

repeat the two PCR for the respective test portion. If the two novel replicates are tested +/− or −/−,

the test portion is considered as negative.

Results from all test portions shall be consistent. When at least one test portion gives a positive

result and at least one gives a negative result, the analysis shall be repeated.

If at least one repetition of the procedure, beginning with the nucleic acid extraction, gives ambiguous

results such as a positive and a negative result, the report should state that the sample is negative

at the limit of detection (LOD).
Page 7, Clause 10, list item 2
Delete the existing text and insert the following.

— the specificity of the analytical method (event specific, construct specific, or screening method);

Page 23, Annex A
Insert A.5 and A.6 after the existing text.
A.5 Target taxon-specific method for the detection of DNAs derived from rice
A.5.1 Purpose, relevance and scientific basis

The GMO Detection Laboratory of Shanghai Jiao Tong University (GMDL-SJTU) organized a collaborative

study for validation of the applicability of a target taxon-specific method using the rice sucrose phosphate

synthase (SPS) gene as an endogenous gene for qualitative analysis of genetically modified (GM) or non-

GM rice. This study involved 12 laboratories from Spain, Korea, Lithuania, Slovenia, Japan, Italy, and China.

The operational procedure of the collaborative study comprised the following modules:

— qualitative PCR for validation of the heterogeneity of the SPS gene among rice cultivars for different

geographic and phylogenetic origins;

— qualitative PCR for validation of the species specificity of SPS gene for rice;

— qualitative PCR for evaluation of the LOD of the established SPS qualitative PCR assay.

The collaborative study was carried out in accordance with Reference [44].

The results of the collaborative study as well as the related protocol are given in A.5.3.

A.5.2 Principle

The method has been optimized for rice seeds and other processed products such as seed powder.

Applicability of the SPS gene was evaluated in this collaborative study using DNA samples extracted

from rice seeds and other plant materials.

The collaborative study organizer provided method-specific reagents (primers, probes, reaction master

mix), and the test DNA samples extracted from rice materials to collaborative study participants.

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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
A.5.3 Validation status and performance criteria
A.5.3.1 Robustness of the method

Robustness has been tested on the SPS gene qualitative PCR system for three different annealing

temperatures (i.e. 56 °C, 58 °C, and 60 °C), on three different DNA samples containing known amounts

of rice DNA (10 ng, 1 ng, 0,1 ng rice genome DNA samples) and with three repetitions per sample.

The qualitative PCR systems demonstrated the expected robustness and performed well at all three

annealing temperatures and three concentrations of the rice DNA samples.

The SPS gene qualitative PCR system was also tested on different thermal cyclers (PTC-100, MJ

Research and instruments from Bio-Rad and Applied Biosystems), on three different reaction volumes

(25 μl, 30 μl, and 50 μl) and three repetitions per volume. The qualitative PCR systems had the expected

robustness and performed well on different thermal cyclers and with different reaction volumes.

A.5.3.2 Intralaboratory trial

The rice SPS gene has been described as being suitable for use as an endogenous reference gene in rice

identification and quantification (Reference [44]). The detailed technical information was modified

from Reference [44].

For sample preparation in the collaboration study, all the DNA samples were extracted by the GMDL-

SJTU using the CTAB method adopted from ISO 21571:2005, A.3. Spectrophotometric quantification

of DNA extracted was performed using a method adopted from ISO 21571:2005, B.1. After the DNA

quantification, a qualitative PCR using an 18S PCR system (Reference [45]) was carried out to provide

data about possible PCR inhibition.

The SPS gene PCR system was tested using rice genomic DNA by three researchers at the GMDL-SJTU.

The results were satisfactory; in particular, for qualitative PCR, the results show that the SPS gene is

specific for rice, and the LOD is about 0,1 %.
A.5.3.3 Collaborative trial

For the collaborative study, each participant received 12 rice DNA samples for heterogeneity testing; 10

DNA samples from plants other than rice plus one DNA sample from rice for species specificity testing; and

10 serially diluted rice samples for LOD evaluation. A negative and a positive control were also included.

The heterogeneity of the SPS gene among rice cultivars was evaluated using 12 rice cultivars from

different geographic and phylogenetic origins in China, such as Najing14, Taibei309, Shengnong265,

Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9 and Nipponbare.

The results returned from 12 laboratories showed that out of a total of 144 (12 × 12) rice DNA samples,

143 positive results were obtained using the SPS gene PCR system. This means that the false-negative

rate of the SPS gene PCR system for rice is 0,69 % (1/144) (see Table A.14). These data suggest that there

is low heterogeneity of the SPS gene in the target region.

The species specificity of the SPS gene was validated using a rice genome DNA sample (Guangluai4) and

10 other plant DNAs that were evolutionarily related to rice, common crops or model plants, such as

the fruit materials of bamboo (Phyllostachys spp.), green bristlegrass [Setaria viridis (L.) Beauv.], barley

(Hordeum vulgare), wheat (Triticum aestivum), foxtail millet (Setaria italica), rapeseed (Brassica napus),

tomato (Lycopersicon esculentum), potato (Solanum tuberosum), soya bean (Glycine max) and thale cress

(Arabidopsis thaliana). The results returned from 12 laboratories showed that out of a total of 120 (10 ×

12), non-rice plant DNA samples, 118 negative results were obtained using the SPS gene PCR system. This

means that the false-positive rate of the SPS gene PCR system for other 10 plant materials was 1,67 %

(2/120) (see Table A.14). These data suggest that the SPS gene is species specific for detection of rice.

1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of

this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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Table A.14 — The results of heterogeneity and of specificity testing of the qualitative PCR

Parameter (collaborative study of 2007) Value
No. laboratories 12
No. laboratories submitting results 12
No. samples per laboratory 22
No. accepted results 264
No. samples containing rice 144
No. samples not containing rice 120
False-positive results 2 (1,67 %)
False-negative results 1 (0,69 %)

The LOD of the SPS gene PCR system was validated using mixed powder containing maize and various

quantities of rice seed by means of qualitative PCR: all 12 laboratories detected the SPS gene in the DNA

sample extracted from mixed powder containing 0,1 % mass fraction or higher of rice, and two in 12

laboratories detected it from mixed powder containing 0,01 % mass fraction of rice. These data suggest

that the LOD of the SPS gene PCR system is as low as 0,1 % mass fraction (see Table A.15).

Table A.15 — The results of the LOD test of the qualitative PCR
Rice to maize mass fraction, m /m
rice maize
Parameter (collaborative study of
2007)
10 % 1 % 0,1 % 0,05 % 0,01 %
No. laboratories 12 12 12 12 12
No. laboratories submitting results 12 12 12 12 12
No. samples per laboratory 2 2 2 2 2
No. laboratories accepted results 12 12 12 12 12
Positive results 12 (100 %) 12 (100 %) 12 (100 %) 4 (33,33 %) 2 (16,67 %)
A.5.3.4 Molecular selectivity
A.5.3.4.1 General

For qualitative validation of the SPS gene as a specific rice gene, a 279 bp fragment of the conserved

region of the SPS gene was selected and amplified using specific primers.
A.5.3.4.2 Experimental

DNA samples extracted from 11 different plant materials (including rice) were analysed by the SPS gene

PCR system as described (Reference [44]). Among the 11 samples, only rice DNA gave positive results.

The other 10 samples (see A.5.3.3) gave negative results.

The DNA samples extracted from 12 different rice cultivars were analysed by the SPS gene PCR system

reported in Reference [44]. All 12 samples gave positive results.
A.5.3.4.3 Theoretical

The theoretical specificity of the SPS gene primer was assessed through a homology search using the

BLASTN 2.0MP-WashU program (Reference [82], search date: 2010-01-09). The 279 bp sequence used

as query is part of the NCBI accession number U33175 (nucleotides 1055–1333). The results of the basic

local alignment search tool (BLAST) confirmed the complete identity of the query sequence with rice

SPS gene sequence, and no homology with other genes and species.
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A.5.4 Principle and summary

This methodology is a PCR procedure for the applicability of the SPS gene for use as a rice endogenous

gene in qualitative detection of GM or non-GM rice. Heterogeneity, species specificity of the SPS gene and

LOD were evaluated as part of the validation of this method. The 279 bp PCR product was visualized by

agarose gel electrophoresis.
A.5.5 Terms and definitions
[40]

For the purposes of this document, the terms and definitions of ISO 5725-1 and ISO 24276 apply.

A.5.6 Sample type and amounts

In the following, the data from the collaborative study are given as examples for sample types and

sample amounts adequate for this method.

DNA samples extracted from the seeds of 12 rice cultivars, 10 other plant materials (see A.5.3.3) and

the mixed powder containing different mass fractions of rice in maize seed power, were used in this

collaborative study.
The participants received the following samples.

— 12 DNA samples from 12 different rice cultivars that are widely planted in different region of

China (i.e. Najing14, Taibei309, Shengnong265, Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733,

Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9, and Nipponbare), 20 ng/μl, 50 μl each. These DNA samples

were used to validate the heterogeneity of the SPS gene among rice cultivars.

— 11 DNA samples from rice (Guangluai4) and 10 other plant materials which are related to rice

(i.e. bamboo, green bristlegrass, barley, wheat, foxtail millet) or common GM crops (i.e. rapeseed,

tomato, potato and soya bean) or model plants (i.e. thale cress), 20 ng/μl, 50 μl each. These DNA

samples were used to validate the species specific of the SPS gene in rice.

— 10 DNA samples from mixed powders of maize with different mass fractions of rice, 20 ng/μl, 50 μl

each. These DNA samples were double blind replicates of the series of five rice concentrations used

for testing the LOD of the SPS gene PCR system.
— Negative DNA target control (labelled N): salmon sperm DNA (20 ng/µl).

— Positive DNA target control (labelled P): rice (Guangluai4) genomic DNA (20 ng/µl). All the DNA

samples were purified using the CTAB method by the GMDL-SJTU. The negative and positive DNA

target controls were used for each PCR plate.
— Reaction reagents, primers for the SPS gene PCR system as follows:
— primer pair for conventional PCR: SPS-F/SPS-R;
— DNA dilution solution [0,1× tris–EDTA (TE), 1,2 ml].
A.5.7 Limit of detection and range of use

DNA was extracted from five mixed powder samples containing different amounts of rice. These samples

were analysed by the SPS PCR system as described (Reference [44]). Positive results were obtained with

samples containing mass fractions of 10 %, 1 %, and 0,1 % rice. The other two samples (containing mass

fractions of 0,05 % and 0,01 %) gave negative results.

According to the developed method, the relative LOD of the qualitative PCR method is about 0,1 % mass

fraction. The SPS gene PCR system can be used for specific detection and identification of rice materials

in other plant materials.
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A.5.8 Estimation of measurement uncertainty

The reproducibility of the method is given by the results of the collaborative trial (see A.5.3.3).

A.5.9 Interferences

In the studies performed, no additional information about interferences have been observed.

A.5.10 Physical and environmental conditions
See ISO 24276 for details. For example:.

— maintain strictly separated working areas for DNA preparation, PCR set-up, PCR amplification and

electrophoresis;
— any residual DNA should be removed from all equipment prior to its use;

— in order to avoid contamination, use filter pipette tips protected against aerosol;

— use only powder-free gloves and change them frequently.
A.5.11 Apparatus and equipment
A.5.11.1 Microcentrifuge.
A.5.11.2 Freezer operating at −20 °C and refrigerator operating at 4 °C.
A.5.11.3 Micropipettes.
A.5.11.4 Mixer, e.g. vortex mixer.
A.5.11.5 Microcentrifuge tubes, capacities: 0,2 ml, 1,5 ml, and 2,0 ml.
A.5.11.6 Tips and aerosol-resistant tips for micropipettes.
A.5.11.7 Rack for reaction tubes.
A.5.11.8 PVC or latex gloves.
A.5.11.9 DNA amplifying equipment (thermal cycler or equivalent apparatus).
A.5.11.10 Electrophoresis equipment, with power supply.
A.5.11.11 Imaging system for gel analysis.
A.5.11.12 Microwave oven (optional).
A.5.12 Reagents and materials
A.5.12.1 General

Unless otherwise stated, only reagents that conformed to the specifications of ISO 24276 and only

molecular biology grade water or water of equivalent purity were used.
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A.5.12.2 Qualitative PCR
A.5.12.2.1 PCR buffer (without MgCl ) 10×.
A.5.12.2.2 MgCl solution 25 mmol/l.
A.5.12.2.3 dNTP solution 2,5 mmol/l each.
A.5.12.2.4 Primer (see Table A.16).
A.5.12.2.5 DNA polymerase, thermostable.
A.5.12.3 Electrophoresis
For details see e.g. ISO 21571:2005, B.1.

A.5.12.3.1 Loading buffer (10 g/l sodium dodecyl sulfate, 500 g/l glycerol, 0,5 g/l bromophenol blue), 10×.

A.5.12.3.2 DNA size standard.
A.5.13 Sample collection, transportation, preservation, and storage

DNA solutions may be stored at 4 °C for a maximum of 1 week, or at −20 °C for long-term storage.

A.5.14 Preparation of test sample

Ensure that the test sample is representative of the laboratory sample, e.g. by grinding or homogenization.

Measures and operational steps to be taken into consideration are described in ISO 21571 and ISO 24276.

A.5.15 Instrument calibration
[41]

Instruments, e.g. thermal cyclers and pipettes should be calibrated as per ISO/IEC 17025.

A.5.16 Analysis steps
A.5.16.1 Preparation of the DNA for qualitative PCR

Extract DNA from the samples by using an adequate extraction method, e.g. ISO 21571:2005, A.3, CTAB

extraction method. Thaw, mix gently and centrifuge the DNA samples needed for the PCR run. Keep

thawed reagents at 1 °C to 4 °C on ice.
A.5.16.2 PCR reagents
A.5.16.2.1 Conventional PCR master mix

A conventional PCR reaction mixture containing the following: 1× PCR buffer, 200 µmol/l each of dNTPs,

2,5 mmol/l Mg , 330 nmol/l forward/reverse primer, 1 unit Taq DNA polymerase.
A.5.16.2.2 Primers
See Table A.16.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
Table A.16 — Oligonucleotide primer sequences for qualitative PCR
Name Oligonucleotide DNA sequence (5’ to 3’)
Qualitative PCR primer sequence
SPS primer F TTg CgC CTg AAC ggA TAT
SPS primer R ggA gAA gCA CTg gAC gAgg
A.5.16.3 Procedure
A.5.16.3.1 General

The qualitative PCR for rice SPS gene was developed for a total volume of 30 µl per reaction mixture. The

use of 100 ng of template DNA per reaction well is recommended.

Thaw, mix gently and centrifuge the PCR master mix needed for the run. Keep thawed reagents at 1 °C

to 4 °C on ice.

Distribute 25 µl/tube of the master mixture to 200 µl PCR reaction tubes. Add 5 µl of DNA solution

samples, rice positive control, negative control, and blank control (H O) to the tubes, respectively.

Mix the PCR tubes gently, centrifuge in the microcentrifuge at 1 000 × g for 10 s.

Insert the plate into the instrument.
Run the PCR with qualitative PCR cycling conditions.
A.5.16.4 PCR controls
See 7.5 and ISO 24276.
A.5.16.5 Temperature–time programme
1) 1)

The PCR assay has been optimized for use in a PTC-100 (MJ Research) and an ABI 2720 (Applied

Biosystems) thermal cycler PCR machine. Although other PCR machines may be used, the thermal cycling

conditions may need to be verified. The qualitative PCR cycling parameters are indicated in Table A.17.

Table A.17 — Qualitative PCR temperature–time programme
Temperature Time
Step Stage No. cycles
°C s
1 Activation and initial denaturation 94 900 1×
2a Denaturation 94 30
2b Amplification Annealing 58 30 35×
2c Elongation 72 30
3 Final elongation 72 420 1×
A.5.16.6 Detection

After the PCR programme has finished, transfer 3 μl of 10× loading buffer to each reaction tube and mix

with the PCR products.

Load 10 μl of each PCR product on to electrophoresis gel (20 g/l agarose, 0,5 µg/ml ethidium bromide),

respectively.
Run the gel in the electrophoresis equipment under 5 V/cm, 20 min.
Record gel image with an UV gel documentation or similar system.
8 © ISO 2013 – All rights reserved
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A fragment of 279 bp should be the specific product; other bands existing in the agarose electrophoresis

are unexpected products.
A.5.16.7 Accept or reject criteria

Method performance requirements used to evaluate the results from the collaborative study are as follows.

A fragment of 279 bp should be detected in the rice positive control (sample P), and no target fragment

should be detected in negative control (sample N) and blank. The detection of fragments with a size of

279 bp indicates that the sample DNA solution contains amplifiable DNA of SPS, and the result is positive,

otherwise the result is negative.
A.5.17 Sample identification
All samples should be identified unambiguously.
A.5.18 Interpretation and calculations of the results
The expected amplicon length of SPS is 279 bp in size.

A fragment of 279 bp should be detected in the rice positive control (sample P), and no target fragment

should be detected in negative control (sample N) and blank. The detection of fragments with a size of

279 bp indicates that the sample DNA solution contains amplifiable DNA of SPS, and the result is positive,

otherwise the result is negative.
A.6 Target taxon-specific method for the detection of components derived from
tomato
A.6.1 Purpose, relevance and scientific basis

The LAT52 gene encodes a heat-stable, glycosylated, cysteine-rich protein that is necessary for tomato

pollen development. The LAT52 detection system has been demonstrated to be suitable for being used

as species-specific gene in GM tomato identification and quantification (Reference [46]). The GMO

Detection Laboratory of Shanghai Jiao Tong University (GMDL-SJTU) organized the collaborative trial

for validation of the applicability of the tomato LAT52 gene as species-specific gene for qualitative

analysis of genetically modified (GM) or non-GM tomato. The study involved 13 laboratories from the

US, Singapore, Korea, Lithuania, Slovenia, Norway, Italy, and China (Reference [47]). The results are

given in Table A.18 and Table A.19.

The operational procedure of the collaborative study comprised the following modules:

a) qualitative PCR for the validation of the heterogeneity of the LAT52 gene among tomato cultivars for

different geographic and phylogenetic origin;

b) qualitative PCR for the validation of the species-specificity of the LAT52 gene for tomato;

c) qualitative PCR for the evaluation of the LOD of the established LAT52 qualitative PCR assay.

The collaborative study was carried out in accordance with the following internationally accepted guidelines:

[39]

— ISO 5725-2 especially considered in relation to the measure of precision (i.e. repeatability and

reproducibility) and trueness;

— The IUPAC protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies

(Reference [48]).
A.6.2 Principle
This method describes the detection of tomato DNA by using qualitative PCR.
© ISO 2013 – All rights reserved 9
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The method has been optimized for tomato seeds, tomato fruits, tomato ketchup, tomato juice, and

other processed products derived from tomato. The applicability of the LAT52 gene was tested through

collaborative trial using DNA samples extracted from tomato seeds and other plant materials.

A.6.3 Validation status and performance criteria
A.6.3.1 Robustness of the method

The robustness of the LAT52 qualitative PCR system was tested by the method developer using three

different annealing temperatures (i.e. 56 °C, 58 °C, and 60 °C), on three different DNA samples containing

known amounts of tomato seed DNA (10 ng, 1 ng, 0,1 ng tomato genome DNA samples, and three

repetitions per sample). The qualitative PCR systems showed the expected robustness and performed

satisfactorily at all three annealing temperatures and three concentrations of the tomato DNA samples.

The LAT52 qualitative PCR system has also been tested by the method developer on different thermal cyclers

1) 1) 1)

[PTC-100, MJ Research; S1000, Bio-Rad; and ABI 9700, Applied Biosystems] and with three different

reaction volumes (25 μl, 30 μl and 50 μl, and three repetitions per volume). The qualitative PCR system

showed the expected robustness when used at different thermal cyclers and different reaction volumes.

A.6.3.2 Intralaboratory trial

The tomato LAT52 gene has been validated suitable for use as species-specific gene in GM tomato

identification and quantification (Reference [46]). The detailed technical information given here is

modified from Reference [46].

For sample preparation for the validation study, the DNA samples were extracted by the GMDL-SJTU

using the CTAB method adopted from ISO 21571:2005, A.3. Spectrometric quantification of the amount

of total DNA extracted was performed using a method adopted from ISO 21571:2005, B.1. After the DNA

quantification, a qualitative PCR run applying the 18S PCR system was carried out to provide data about

possible PCR inhibition (Reference [49]).

The LAT52 PCR system was tested by three operators by the GMDL-SJTU using tomato genomic DNA

providing satisfactory and consistent results; in particular, in qualitative PCR, the results showed the

LAT52 gene is specific for tomato, and the relative LOD is at least 0,1 % mass fraction.

A.6.3.3 Collaborative trial

The heterogeneity of LAT52 gene among tomato cultivars was evaluated using 12 tomato cultivars from

different geographic and phylogenetic origins in China, such as Shengnong2, Jifan4, Zhongsu5, Yashu6,

Jiafen1, Shenfeng2, Hongza9, R144, Nongyou30, Dongnong704, Lichun, and Zaokui. The results returned

from 13 laboratories showed that from the total of 156 (12 × 13) tomato DNA samples, 155 positive

results were obtained using the LAT52 gene PCR system. Thus, the false-negative rate of the LAT52 PCR

system for tomato is 0,64 % (1/156) (see Table A.18). These data suggest that the LAT52 gene has low

heterogeneity among tomato cultivars from China.

The species specificity of the LAT52 gene was validated using a tomato genome DNA sample (Jiafen1)

and 10 other plant DNAs that were evolutionarily related to tomato or common GM crops or model

plants, such as the fruit materials of aubergine (Solanum melongena), potato (Solanum tuberosum), sweet

pepper (Capsicum annuum); maize (Zea mays), soya bean (Glycine max), rapeseed (Brassica rapa), rice

(Oryza sativa); leaf materials of petunia (Petunia hybrida), tobacco (Nicotiana tabacum), and thale cress

(Arabidopsis thaliana). The results returned from 13 laboratories show that from the total of 130 (10 ×

13, without tomato DNA sample) various plant DNA, 126 negative results were obtained using the LAT52

gene PCR system. Thus the false-positive rate of the LAT52 gene PCR system was 3,08 % (4/130) (see

Table A.18). The false-positive results might come from the contamination of the PCR operation. These

data suggest that the LAT52 gene is species-specific for the detection of tomato.

10 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
Table A.18 — Results of the qualitative PCR
Parameter
Value
(collaborative trial of 2007)
No. laboratories 13
No. laboratories submitting results 13
No. samples per laboratory 22
No. accepted results 286
No. samples containing tomato 156
No. samples not containing tomato 130
False-positive results 4 (3,08 %)
False-negative results 1 (0,64 %)

The LOD of the LAT52 PCR system was validated using mixed powder containing maize and tomato

seeds
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21569
Première édition
2005-06-15
AMENDEMENT 1
2013-04-01
Produits alimentaires — Méthodes
d’analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Méthodes
qualitatives basées sur l’utilisation
des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid
based methods
AMENDMENT 1
Numéro de référence
ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
ISO 2013
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DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives

ISO/CEI, Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de

Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.

Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités

membres votants.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de

ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L’Amendement 1 à l’ISO 21569:2005 a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,

sous-comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la
détection des organismes génétiquement modifiés et
des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur
l’utilisation des acides nucléiques
AMENDEMENT 1

Dans le présent amendement, la numérotation des notes de bas de page n’a pas fait l’objet d’une mise à jour

permettant de l’adapter à la numérotation adoptée dans l’ISO 21569:2005. Les renvois de note de bas de

page indiqués sont donnés pour utilisation uniquement comme références au sein du présent amendement.

Page v, Introduction, alinéa 1
Supprimer le premier élément de la liste:
«— Échantillonnage (ISO 21568);»
Page 1, Article 2, ISO 24276
Supprimer la note de bas de page et mettre à jour la référence pour lire:

ISO 24276:2006, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes

génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions

Page 2, 4.1, alinéa 1
Remplacer le texte existant par le texte suivant.

«Un résultat qualitatif doit clairement indiquer la présence ou l’absence de l’élément génétique à

l’étude, recherchée à l’aide de témoins appropriés.

NOTE Les limites de détection et la taille de la prise d’essai sont des aspects critiques d’une méthode.»

Page 5, 7.3.3.3.3, alinéa 2

Supprimer «représentatif» et remplacer par «approprié» de manière à lire le texte qui suit.

«Il convient de démontrer que les amorces conçues pour détecter les séquences cibles spécifiques

au taxon sont capables de détecter de manière fiable ces séquences dans un nombre approprié de

membres différents du taxon.»
Page 5, 8.1 a) et b)
Remplacer «ISO 24276:—» par «ISO 24276:2006».
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
Page 7, 9.4
Remplacer le texte existant par le texte suivant.

«Les résultats obtenus avec la même prise d’essai doivent être cohérents. En cas de résultats +/- pour

les deux répétitions, répéter les deux PCR pour la prise d’essai correspondante. Si les deux nouvelles

répétitions donnent des résultats +/- ou -/-, la prise d’essai est considérée comme négative.

Les résultats obtenus avec toutes les prises d’essai doivent être cohérents. Lorsqu’au moins une

prise d’essai donne un résultat positif et qu’au moins une autre donne un résultat négatif, l’analyse

doit être répétée.

Si au moins une répétition du mode opératoire, commençant par l’extraction des acides nucléiques,

donne des résultats ambigus, tels qu’un résultat positif et un résultat négatif, il convient que le

rapport indique que l’échantillon est négatif à la limite de détection (LOD).»
Page 7, Article 10, deuxième élément de la liste
Remplacer le texte existant par le texte suivant.

«— la spécificité de la méthode analytique (événements spécifiques, construit spécifique ou

méthode de criblage);»
Page 24, Annexe A
Insérer A.5 et A.6 après le texte existant.
A.5 Méthodes spécifiques au taxon pour la détection d’ADN dérivés du riz
A.5.1 Objet, pertinence et base scientifique

Le Laboratoire de détection d’OGM de l’Université Jiao Tong de Shanghai (GMDL-SJTU) a organisé un

essai interlaboratoires pour valider l’applicabilité d’une méthode spécifique au taxon utilisant le gène

codant la saccharose phosphate synthase (SPS) du riz comme gène endogène pour l’analyse qualitative

du riz génétiquement modifié (GM) ou non génétiquement modifié (non-GM). Douze laboratoires situés

en Espagne, en Corée, en Lituanie, en Slovénie, au Japon, en Italie et en Chine ont participé à cet essai.

Le mode opératoire de l’essai interlaboratoires comportait les modules suivants:

— PCR qualitative pour la validation de l’hétérogénéité du gène SPS parmi des cultivars de riz de

différentes origines géographiques et phylogénétiques;

— PCR qualitative pour la validation de la spécificité à l’espèce riz du gène SPS;

— PCR qualitative pour l’évaluation de la LOD du test PCR qualitatif établi pour le SPS.

L’essai interlaboratoires a été réalisé conformément à la Référence [44].

Les résultats de l’essai interlaboratoires ainsi que le protocole associé sont donnés en A.5.3.

A.5.2 Principe

La méthode a été optimisée pour les semences de riz, et d’autres produits transformés comme la poudre

issue de semences. L’applicabilité du gène SPS a été évaluée dans le cadre de cet essai interlaboratoires

en utilisant des échantillons d’ADN extraits de semences de riz et d’autres plantes.

L’organisateur de l’essai interlaboratoires a fourni aux participants les réactifs spécifiques à la méthode

(amorces, sondes, mélange réactionnel maître) et les échantillons d’ADN pour essai extraits de produits

à base de riz.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.3 État de validation et critères de performance
A.5.3.1 Robustesse de la méthode

La robustesse a été évaluée sur un système de PCR qualitative pour le gène SPS pour trois températures

d’hybridation différentes (à savoir 56 °C, 58 °C et 60 °C), sur trois échantillons d’ADN différents

contenant des quantités connues d’ADN de riz (échantillons d’ADN de génome de riz de 10 ng, 1 ng,

0,1 ng) et avec trois répétitions par échantillon. Les systèmes de PCR qualitative ont démontré qu’ils

présentaient la robustesse attendue et ont bien fonctionné aux trois températures d’hybridation et aux

trois concentrations des échantillons d’ADN de riz.

Le système de PCR qualitative pour le gène SPS a également été évalué sur différents thermocycleurs

(PTC-100 , MJ Research et instruments de Bio-Rad et Applied Biosystems), sur trois volumes réactionnels

différents (25 μl, 30 μl et 50 μl) et avec trois répétitions par volume. Les systèmes de PCR qualitative ont

présenté la robustesse attendue et ont bien fonctionné sur différents thermocycleurs et avec différents

volumes réactionnels.
A.5.3.2 Essai intralaboratoire

Le gène SPS du riz a été décrit comme étant adapté à une utilisation en tant que gène endogène de

référence dans l’identification et la quantification du riz (Référence [44]). Les informations techniques

détaillées ont été modifiées par rapport à la Référence [44].

Pour la préparation des échantillons dans le cadre de l’essai interlaboratoires, tous les échantillons

d’ADN ont été extraits au laboratoire GMDL-SJTU par la méthode employant le CTAB décrite dans

l’ISO 21571:2005, A.3. La quantification spectrophotométrique de l’ADN extrait a été réalisée par une

méthode décrite dans l’ISO 21571:2005, B.1. Après la quantification de l’ADN, une PCR qualitative a été

réalisée à l’aide du système de PCR 18S (Référence [45]) pour obtenir des données sur une éventuelle

inhibition de la PCR.

Le système de PCR pour le gène SPS a été soumis à essai en utilisant de l’ADN génomique de riz par

trois chercheurs du laboratoire GMDL-SJTU. Les résultats ont été satisfaisants; en particulier, pour

la PCR qualitative, les résultats ont montré que le gène SPS est spécifique pour le riz et que la LOD est

d’environ 0,1 %.
A.5.3.3 Essai interlaboratoires

Dans le cadre de l’essai interlaboratoires, chaque participant a reçu douze échantillons d’ADN de riz pour

l’essai d’hétérogénéité; dix échantillons d’ADN provenant de plantes autres que le riz plus un échantillon

d’ADN provenant de riz pour les essais de spécificité à l’espèce; et dix échantillons de riz dilués en série

pour l’évaluation de la LOD. Un témoin négatif et un témoin positif étaient également inclus.

L’hétérogénéité du gène SPS parmi des cultivars de riz a été évaluée en utilisant douze cultivars de

riz de différentes origines géographiques et phylogénétiques en Chine, tels que Najing14, Taibei309,

Shengnong265, Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9

et Nipponbare. Les résultats renvoyés par les douze laboratoires ont montré que sur un total de 144

(12 × 12) échantillons d’ADN de riz, 143 résultats positifs ont été obtenus en utilisant le système de PCR

pour le gène SPS. Cela signifie que le taux de faux négatif du système de PCR pour le gène SPS du riz est

de 0,69 % (1/144) (voir Tableau A.14). Ces données suggèrent qu’il existe une faible hétérogénéité du

gène SPS dans la région cible.

1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des

utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du

produit ainsi désigné.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)

Tableau A.14 — Résultats des essais d’hétérogénéité et de spécificité de la PCR qualitative

Paramètre Valeur
(Essai interlaboratoires de 2007)
Nombre de laboratoires 12
Nombre de laboratoires présentant des résultats 12
Nombre d’échantillons par laboratoire 22
Nombre de résultats acceptés 264
Nombre d’échantillons contenant du riz 144
Nombre d’échantillons ne contenant pas de riz 120
Faux positifs 2 (1,67 %)
Faux négatifs 1 (0,69 %)

La spécificité à l’espèce du gène SPS a été validée en utilisant un échantillon d’ADN génomique de riz

(Guangluai4) et dix ADN d’autres plantes liées d’un point de vue évolutif au riz, de plantes cultivées

courantes ou de plantes modèles, tels que les fruits du bambou (Phyllostachys spp.), la sétaire verte

[Setaria viridis (L.) Beauv.], l’orge (Hordeum vulgare), le blé (Triticum aestivum), le millet des oiseaux

(Setaria italica), le colza (Brassica napus), la tomate (Lycopersicon esculentum), la pomme de terre

(Solanum tuberosum), le soja (Glycine max) et l’arabette des dames (Arabidopsis thaliana). Les résultats

renvoyés par les douze laboratoires ont montré que sur un total de 120 (10 × 12) échantillons d’ADN

provenant de plantes autres que le riz, 118 résultats négatifs ont été obtenus en utilisant un système

PCR pour le gène SPS. Cela signifie que le taux de faux positif du système de PCR pour le gène SPS pour

les dix autres plantes est de 1,67 % (2/120) (voir Tableau A.14). Ces données suggèrent que le gène SPS

est spécifique à l’espèce pour la détection du riz.

La LOD du système de PCR pour le gène SPS a été validée en utilisant une poudre mélangée contenant du

maïs et différentes quantités de semences de riz au moyen d’une PCR qualitative: les douze laboratoires

ont détecté le gène SPS dans l’échantillon d’ADN extrait de la poudre mélangée contenant 0,1 % (fraction

massique) ou plus de riz, et deux des douze laboratoires l’ont détecté dans la poudre de riz mélangée

contenant 0,01 % (fraction massique) de riz. Ces données suggèrent que la LOD du système de PCR pour

le gène SPS est aussi faible que 0,1 % (fraction massique) (voir Tableau A.15).
Tableau A.15 — Résultats de l’essai de limite de détection de la PCR qualitative
Paramètre Fraction massique riz sur maïs, m /m
riz maïs
(Essai interlaboratoires de 2007)
10 % 1 % 0,1 % 0,05 % 0,01 %
Nombre de laboratoires 12 12 12 12 12
Nombre de laboratoires présentant des
12 12 12 12 12
résultats
Nombre d’échantillons par laboratoire 2 2 2 2 2
Nombre de résultats acceptés 12 12 12 12 12
Résultats positifs 12 (100 %) 12 (100 %) 12 (100 %) 4 (33,33 %) 2 (16,67 %)
A.5.3.4 Sélectivité moléculaire
A.5.3.4.1 Généralités

Pour la validation qualitative du gène SPS comme gène spécifique du riz, un fragment de 279 bp de la

région conservée du gène SPS a été sélectionné et amplifié en utilisant des amorces spécifiques.

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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.3.4.2 Aspects expérimentaux

Des échantillons d’ADN extraits de onze plantes différentes (y compris le riz) ont été analysés par le

système de PCR pour le gène SPS comme décrit dans la Référence [44]. Parmi les onze échantillons,

seul l’ADN du riz a donné des résultats positifs. Les dix autres échantillons (voir A.5.3.3) ont donné des

résultats négatifs.

Les échantillons d’ADN extraits de douze cultivars de riz différents ont été analysés par le système de PCR

pour le gène SPS décrit dans la Référence [44]. Les douze échantillons ont donné des résultats positifs.

A.5.3.4.3 Aspects théoriques

La spécificité théorique de l’amorce du gène SPS a été évaluée par une recherche d’homologie à l’aide

du programme BLASTN 2.0MP-WashU (Référence [82], date de la recherche: 2010-01-09). La séquence

de 279 bp utilisée comme requête fait partie du numéro de référence NCBI U33175 (nucléotides

1055-1333). Les résultats de la recherche effectuée avec l’outil d’alignement local (BLAST) ont confirmé

une homologie totale de la séquence avec la séquence du gène SPS du riz, et l’absence d’homologie avec

d’autres gènes et espèces.
A.5.4 Principe et résumé

Cette méthodologie est un mode opératoire de PCR pour l’applicabilité du gène SPS à une utilisation en

tant que gène endogène du riz dans la détection qualitative de riz génétiquement modifié ou de riz non

génétiquement modifié. L’hétérogénéité, la spécificité à l’espèce du gène SPS et la limite de détection ont

été évaluées dans le cadre de la validation de cette méthode. Le produit PCR de 279 bp a été visualisé par

électrophorèse sur gel d’agarose.
A.5.5 Termes et Définitions
[40]

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 5725-1 et

l’ISO 24276 s’appliquent.
A.5.6 Type et quantités d’échantillon

Dans ce qui suit, les données obtenues dans le cadre de l’essai interlaboratoires sont indiquées à titre

d’exemples pour les types et quantités d’échantillon adéquats pour la présente méthode.

Des échantillons d’ADN extraits des semences de douze cultivars de riz, de dix autres plantes (voir A.5.3.3)

et d’une poudre mélangée contenant différentes fractions massiques de riz dans une poudre de semences

de maïs, ont été utilisés dans le cadre de cet essai interlaboratoires.
Les participants ont reçu les échantillons suivants.

— Douze échantillons d’ADN provenant de douze cultivars de riz différents qui sont largement

plantés dans différentes régions de Chine (à savoir Najing14, Taibei309, Shengnong265, Jinyinbao,

Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9 et Nipponbare.),

20 ng/μl, de 50 μl chacun. Ces échantillons d’ADN ont été utilisés pour valider l’hétérogénéité du

gène SPS parmi des cultivars de riz.

— Onze échantillons d’ADN provenant de riz (Guangluai4) et de dix autres plantes qui sont liées au

riz (à savoir bambou, sétaire verte, orge, blé, millet des oiseaux) ou de plantes cultivées courantes

génétiquement modifiées (à savoir colza, tomate, pomme de terre et soja) ou de plantes modèles (à

savoir arabette des dames), 20 ng/μl, de 50 μl chacun. Ces échantillons d’ADN ont été utilisés pour

valider la spécificité à l’espèce riz du gène SPS.

— Dix échantillons d’ADN provenant des poudres de maïs contenant différentes fractions massiques de

riz, 20 ng/μl, de 50 μl chacun. Ces échantillons d’ADN étaient des répétitions en double aveugle de la

série de cinq concentrations de riz utilisée pour évaluer la LOD du système de PCR pour le gène SPS.

— Un témoin négatif d’ADN cible (étiqueté N): ADN de sperme de saumon (20 ng/µl).

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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)

— Un témoin positif d’ADN cible (étiqueté P): ADN génomique de riz (Guangluai4) (20 ng/µl). Tous les

échantillons d’ADN ont été purifiés en utilisant la méthode CTAB par le laboratoire GMDL-SJTU. Les

témoins négatif et positif d’ADN cible ont été utilisés pour chaque plaque de PCR.

— Réactifs, amorces pour le système de PCR pour le gène SPS comme suit:
— paire d’amorces pour PCR conventionnelle: SPS-F/SPS-R;
— solution de dilution de l’ADN [tris-EDTA (TE) 0,1×, 1,2 ml].
A.5.7 Limite de détection et domaine d’utilisation

L’ADN a été extrait de cinq échantillons de poudre mélangée contenant différentes quantités de riz. Ces

résultats ont été analysés en utilisant le système PCR pour le gène SPS tel que décrit (Référence [44]).

Des résultats positifs ont été obtenus avec les échantillons contenant des fractions massiques de riz

de 10 %, 1 %, et 0,1 %. Les deux autres échantillons (contenant des fractions massiques de 0,05 % et

0,01 %) ont donné des résultats négatifs.

Selon la méthode développée, la LOD relative de la méthode PCR qualitative est d’environ 0,1 % (fraction

massique). Le système de PCR pour le gène SPS peut être utilisé pour la détection et l’identification

spécifiques du riz dans d’autres produits d’origine végétale.
A.5.8 Estimation de l’incertitude de mesure

La reproductibilité de la méthode est donnée par les résultats de l’essai interlaboratoires (voir A.5.3.3).

A.5.9 Interférences

Dans les études menées, aucune information complémentaire n’est donnée concernant des

interférences observées.
A.5.10 Conditions physiques et environnementales
Voir l’ISO 24276 pour des informations détaillées. Par exemple:

— respecter des zones de travail strictement séparées pour la préparation de l’ADN, la réaction PCR,

l’amplification par PCR et l’électrophorèse;

— il convient d’éliminer tout ADN résiduel de tous les équipements avant leur utilisation;

— pour éviter toute contamination, utiliser des embouts de pipette à filtre protégés contre les aérosols;

— utiliser uniquement des gants non poudrés et les changer fréquemment.
A.5.11 Appareillage et matériel
A.5.11.1 Microcentrifugeuse.
A.5.11.2 Congélateur fonctionnant à -20 °C et réfrigérateur fonctionnant à 4 °C.
A.5.11.3 Micropipettes.
A.5.11.4 Agitateur-mélangeur, par exemple agitateur-mélangeur vortex.
A.5.11.5 Microtubes à centrifuger, de capacités 0,2 ml, 1,5 ml et 2,0 ml.
A.5.11.6 Embouts et embouts résistant aux aérosols pour micropipettes.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.11.7 Râtelier pour tubes de réaction.
A.5.11.8 Gants en vinyle ou en latex.

A.5.11.9 Équipement d’amplification d’ADN (thermocycleur ou appareil équivalent).

A.5.11.10 Équipement d’électrophorèse, avec alimentation.
A.5.11.11 Système d’imagerie, pour analyse du gel.
A.5.11.12 Four à micro-ondes (facultatif).
A.5.12 Réactifs et matériaux
A.5.12.1 Généralités

Sauf indication contraire, uniquement des réactifs conformes aux spécifications de l’ISO 24276 et

uniquement de l’eau de qualité pour biologie moléculaire ou de l’eau de pureté équivalente ont été utilisés.

A.5.12.2 PCR qualitative
A.5.12.2.1 Tampon pour PCR (sans MgCl ) 10×.
A.5.12.2.2 Solution de MgCl , 25 mmol/l.
A.5.12.2.3 Solution de dNTP, 2,5 mmol/l (chaque).
A.5.12.2.4 Amorce (voir Tableau A.16).
A.5.12.2.5 ADN polymérase, thermostable.
A.5.12.3 Électrophorèse

Pour des informations détaillées, se reporter, par exemple, à l’ISO 21571:2005, B.1.

A.5.12.3.1 Tampon de charge (10 g/l de dodécyl sulfate de sodium, 500 g/l de glycérol, 0,5 g/l de bleu

de bromophénol) 10×.
A.5.12.3.2 Étalon de taille d’ADN.
A.5.13 Collecte, transport, conservation et stockage des échantillons

Les solutions d’ADN peuvent être conservées à 4 °C pendant une semaine au maximum ou à -20 °C pour

un stockage à long terme.
A.5.14 Préparation de l’échantillon pour essai

S’assurer que l’échantillon pour essai est représentatif de l’échantillon pour laboratoire, par exemple

par broyage ou homogénéisation. Les mesures et étapes opératoires à prendre en considération sont

décrites dans l’ISO 21571 et l’ISO 24276.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 7
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.15 Étalonnage des instruments

Il convient d’étalonner les instruments, par exemple les thermocycleurs et les pipettes, conformément à

[41]
l’ISO/CEI 17025 .
A.5.16 Étapes de l’analyse
A.5.16.1 Préparation de l’ADN pour une PCR qualitative

Extraire l’ADN des échantillons en utilisant une méthode d’extraction appropriée, par exemple la méthode

d’extraction employant le CTAB décrite dans l’ISO 21571:2005, A.3. Décongeler, mélanger doucement

et centrifuger les échantillons d’ADN nécessaires à l’analyse. Maintenir les réactifs décongelés à une

température de 1 °C à 4 °C sur de la glace.
A.5.16.2 Réactifs PCR
A.5.16.2.1 Mélange maître conventionnel pour PCR

Mélange réactionnel conventionnel pour PCR contenant les éléments suivants: tampon pour PCR 1×,

200 µmol/l de chaque dNTP, 2,5 mmol/l de Mg , 330 nmol/l d’amorce sens/antisens, 1 unité de Taq

polymérase.
A.5.16.2.2 Amorces
Voir Tableau A.16.
Tableau A.16 — Séquences d’amorces oligonucléotidiques pour PCR qualitative
Nom Séquence d’ADN oligonucléotidique (5’ à 3’)
Séquence d’amorce pour PCR qualitative
Amorce SPS F TTg CgC CTg AAC ggA TAT
Amorce SPS R ggA gAA gCA CTg gAC gAgg
A.5.16.3 Mode opératoire
A.5.16.3.1 Généralités

La PCR qualitative pour le gène SPS du riz a été développée pour un volume total de 30 µl par mélange

réactionnel. Il est recommandé d’utiliser 100 ng d’ADN matrice par puits de réaction.

Décongeler, mélanger doucement et centrifuger le mélange maître pour PCR nécessaire à l’analyse.

Maintenir les réactifs décongelés à une température de 1 °C à 4 °C sur de la glace.

Répartir le mélange maître dans des tubes de réaction PCR de 200 µl, à raison de 25 µl/tube. Introduire

respectivement dans les tubes 5 µl des solutions d’ADN échantillons, du témoin de riz positif, du témoin

négatif et du témoin de blanc (eau).

Agiter doucement les tubes PCR, centrifuger dans la microcentrifugeuse à 1 000 × g pendant 10 s.

Installer la plaque dans l’instrument.
Réaliser la PCR dans les conditions de cycles pour PCR qualitative.
A.5.16.4 Témoins de PCR
Voir 7.5 et l’ISO 24276.
8 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.16.5 Programme d’amplification

Le test PCR a été optimisé pour une utilisation dans un thermocycleur PTC-100 (MJ Research) et un

thermocycleur ABI 2720 (Applied Biosystems). Bien que d’autres machines PCR puissent être utilisées,

il peut être nécessaire de vérifier les conditions de cycle thermique. Les paramètres de cycle pour PCR

qualitative sont indiqués dans le Tableau A.17.
Tableau A.17 — Programme d’amplification pour PCR qualitative
Température Durée
Nombre de
Étape Phase
cycles
°C s
1 Activation et dénaturation initiale 94 900 1×
2a Dénaturation 94 30
2b Amplification Hybridation 58 30 35×
2c Élongation 72 30
3 Élongation finale 72 420 1×
A.5.16.6 Détection

Une fois le programme PCR terminé, introduire 3 μl de tampon de charge 10× dans chaque tube de

réaction et mélanger avec les produits de PCR.

Charger respectivement 10 μl de chaque produit de PCR sur un gel d’électrophorèse (20 g/l d’agarose,

0,5 μg/ml de bromure d’éthidium).

Placer le gel dans l’équipement d’électrophorèse sous une tension de 5 V/cm pendant 20 min.

Enregistrer l’image du gel à l’aide d’un système de documentation sur les gels UV ou d’un système similaire.

Il convient qu’un fragment de 279 bp soit le produit spécifique; les autres bandes existant dans

l’électrophorèse sur agarose sont des produits inattendus.
A.5.16.7 Critères d’acceptation ou de rejet

Les exigences de performance de la méthode utilisées pour évaluer les résultats de l’essai interlaboratoires

sont les suivantes.

Il convient qu’un fragment de 279 bp soit détecté dans le témoin positif de riz (échantillon P) et qu’aucun

fragment cible ne soit détecté dans le témoin négatif (échantillon N) et le blanc. La détection de fragments

dont la taille est de 279 bp indique que la solution d’ADN échantillon contient de l’ADN amplifiable de

SPS, et le résultat est positif, sinon le résultat est négatif.
A.5.17 Identification de l’échantillon
Il convient d’identifier tous les échantillons sans ambigüité.
A.5.18 Interprétation et calcul des résultats
La longueur attendue de l’amplicon de SPS est de 279 bp.

Il convient qu’un fragment de 279 bp soit détecté dans le témoin positif de riz (échantillon P) et qu’aucun

fragment cible ne soit détecté dans le témoin négatif (échantillon N) et le blanc. La détection de fragments

dont la taille est de 279 bp indique que la solution d’ADN échantillon contient de l’ADN amplifiable de

SPS, et le résultat est positif, sinon le résultat est négatif.
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A.6 Méthode spécifique au taxon pour la détection de composés dérivés de la tomate

A.6.1 Objet, pertinence et base scientifique

Le gène LAT52 code une protéine glycosilée, riche en cystéine, thermostable, qui est nécessaire au

développement du pollen de la tomate. Le système de détection de LAT52 s’est avéré approprié pour une

utilisation en tant que gène spécifique aux espèces dans l’identification et la quantification des tomates

génétiquement modifiées (Référence [46]). Le Laboratoire de détection d’OGM de l’Université Jiao Tong

de Shanghai (GMDL-SJTU) a organisé un essai interlaboratoires pour valider l’applicabilité du gène

LAT52 de la tomate comme gène endogène spécifique aux espèces pour l’analyse qualitative de la tomate

génétiquement modifiée (GM) ou non génétiquement modifiée (non-GM). Treize laboratoires situés aux

États-Unis, à Singapour, en Corée, en Lituanie, en Slovénie, en Norvège, en Italie et en Chine ont participé

à cet essai (Référence [47]). Les résultats sont indiqués dans le Tableau A.18 et le Tableau A.19.

Le mode opératoire de l’essai interlaboratoires comportait les modules suivants:

a) PCR qualitative pour la validation de l’hétérogénéité du gène LAT52 parmi des cultivars de tomate

de différentes origines géographiques et phylogénétiques;

b) PCR qualitative pour la validation de la spécificité à l’espèce tomate du gène LAT52;

c) PCR qualitative pour l’évaluation de la LOD du test PCR qualitatif établi pour le LAT52.

L’essai interlaboratoires a été réalisé conformément aux lignes directrices suivantes reconnues à

l’échelle internationale:
[39]

— ISO 5725-2 , notamment pour ce qui concerne le mesurage de la fidélité (c’est-à-dire répétabilité

et reproductibilité) et de la justesse;

— le protocole pour la conception, la conduite et l’interprétation des études de performance des

méthodes de l’UICPA (Référence [48]).
A.6.2 Principe
La présente méthode décrit la détection d’ADN de tomate par PCR qualitative.

La méthode a été optimisée pour les semences de tomate, les tomates, le ketchup de tomates, le jus de

tomates et d’autres produits transformés dérivés de la tomate. L’applicabilité du gène LAT52 a été évaluée

dans le cadre d’un essai interlaboratoires en utilisant des échantillons d’ADN extraits de semences de

tomate et d’autres plantes.
A.6.3 État de validation et critères de performance
A.6.3.1 Robustesse de la méthode

La robustesse du système de PCR qualitative pour le gène LAT52 a été évaluée par le d

...

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