ISO 21569:2005/Amd 1:2013
(Amendment)Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods — Amendment 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods — Amendment 1
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques — Amendement 1
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21569
First edition
2005-06-15
AMENDMENT 1
2013-04-01
Foodstuffs — Methods of analysis for
the detection of genetically modified
organisms and derived products —
Qualitative nucleic acid based methods
AMENDMENT 1
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Reference number
ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
©
ISO 2013
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Foreword
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Amendment 1 to ISO 21569:2005was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 16, Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
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Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Qualitative nucleic acid based methods
AMENDMENT 1
No attempt has been made in this amendment to update the footnote numbering to fit in with the scheme
adopted in ISO 21569:2005. The footnote numbers given are for use refer solely within this amendment.
Page v, Introduction, paragraph 1
Delete “— Sampling (ISO 21568)”.
Page 2, Clause 2, ISO 24276
Delete the footnote and update the entry to read:
ISO 24276:2006, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms
and derived products — General requirements and definitions
Page 2, 4.1, paragraph 2
Delete the existing text and insert the following.
A qualitative result shall clearly demonstrate the presence or absence of the genetic element under
study, relative to appropriate controls.
NOTE Detection limits and size of the test portion are critical aspects of a method.
Page 2, 7.3.3.3.3, paragraph 2
Delete “a representative” and insert “an appropriate” so that the text reads as follows.
Primers designed to detect taxon-specific target sequences should be shown to detect these
sequences reliably in an appropriate number of different members of the taxon.
Page 6, 8.1 a) and b)
In both cases, delete “ISO 24276:—”, and insert “ISO 24276:2006.
Page 7, 9.4
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
Delete the existing text and insert the following.
Results within the same test portion shall be consistent. In case of +/− results for the two replicates,
repeat the two PCR for the respective test portion. If the two novel replicates are tested +/− or −/−,
the test portion is considered as negative.
Results from all test portions shall be consistent. When at least one test portion gives a positive
result and at least one gives a negative result, the analysis shall be repeated.
If at least one repetition of the procedure, beginning with the nucleic acid extraction, gives ambiguous
results such as a positive and a negative result, the report should state that the sample is negative
at the limit of detection (LOD).
Page 7, Clause 10, list item 2
Delete the existing text and insert the following.
— the specificity of the analytical method (event specific, construct specific, or screening method);
Page 23, Annex A
Insert A.5 and A.6 after the existing text.
A.5 Target taxon-specific method for the detection of DNAs derived from rice
A.5.1 Purpose, relevance and scientific basis
The GMO Detection Laboratory of Shanghai Jiao Tong University (GMDL-SJTU) organized a collaborative
study for validation of the applicability of a target taxon-specific method using the rice sucrose phosphate
synthase (SPS) gene as an endogenous gene for qualitative analysis of genetically modified (GM) or non-
GM rice. This study involved 12 laboratories from Spain, Korea, Lithuania, Slovenia, Japan, Italy, and China.
The operational procedure of the collaborative study comprised the following modules:
— qualitative PCR for validation of the heterogeneity of the SPS gene among rice cultivars for different
geographic and phylogenetic origins;
— qualitative PCR for validation of the species specificity of SPS gene for rice;
— qualitative PCR for evaluation of the LOD of the established SPS qualitative PCR assay.
The collaborative study was carried out in accordance with Reference [44].
The results of the collaborative study as well as the related protocol are given in A.5.3.
A.5.2 Principle
The method has been optimized for rice seeds and other processed products such as seed powder.
Applicability of the SPS gene was evaluated in this collaborative study using DNA samples extracted
from rice seeds and other plant materials.
The collaborative study organizer provided method-specific reagents (primers, probes, reaction master
mix), and the test DNA samples extracted from rice materials to collaborative study participants.
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A.5.3 Validation status and performance criteria
A.5.3.1 Robustness of the method
Robustness has been tested on the SPS gene qualitative PCR system for three different annealing
temperatures (i.e. 56 °C, 58 °C, and 60 °C), on three different DNA samples containing known amounts
of rice DNA (10 ng, 1 ng, 0,1 ng rice genome DNA samples) and with three repetitions per sample.
The qualitative PCR systems demonstrated the expected robustness and performed well at all three
annealing temperatures and three concentrations of the rice DNA samples.
1)
The SPS gene qualitative PCR system was also tested on different thermal cyclers (PTC-100, MJ
Research and instruments from Bio-Rad and Applied Biosystems), on three different reaction volumes
(25 μl, 30 μl, and 50 μl) and three repetitions per volume. The qualitative PCR systems had the expected
robustness and performed well on different thermal cyclers and with different reaction volumes.
A.5.3.2 Intralaboratory trial
The rice SPS gene has been described as being suitable for use as an endogenous reference gene in rice
identification and quantification (Reference [44]). The detailed technical information was modified
from Reference [44].
For sample preparation in the collaboration study, all the DNA samples were extracted by the GMDL-
SJTU using the CTAB method adopted from ISO 21571:2005, A.3. Spectrophotometric quantification
of DNA extracted was performed using a method adopted from ISO 21571:2005, B.1. After the DNA
quantification, a qualitative PCR using an 18S PCR system (Reference [45]) was carried out to provide
data about possible PCR inhibition.
The SPS gene PCR system was tested using rice genomic DNA by three researchers at the GMDL-SJTU.
The results were satisfactory; in particular, for qualitative PCR, the results show that the SPS gene is
specific for rice, and the LOD is about 0,1 %.
A.5.3.3 Collaborative trial
For the collaborative study, each participant received 12 rice DNA samples for heterogeneity testing; 10
DNA samples from plants other than rice plus one DNA sample from rice for species specificity testing; and
10 serially diluted rice samples for LOD evaluation. A negative and a positive control were also included.
The heterogeneity of the SPS gene among rice cultivars was evaluated using 12 rice cultivars from
different geographic and phylogenetic origins in China, such as Najing14, Taibei309, Shengnong265,
Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9 and Nipponbare.
The results returned from 12 laboratories showed that out of a total of 144 (12 × 12) rice DNA samples,
143 positive results were obtained using the SPS gene PCR system. This means that the false-negative
rate of the SPS gene PCR system for rice is 0,69 % (1/144) (see Table A.14). These data suggest that there
is low heterogeneity of the SPS gene in the target region.
The species specificity of the SPS gene was validated using a rice genome DNA sample (Guangluai4) and
10 other plant DNAs that were evolutionarily related to rice, common crops or model plants, such as
the fruit materials of bamboo (Phyllostachys spp.), green bristlegrass [Setaria viridis (L.) Beauv.], barley
(Hordeum vulgare), wheat (Triticum aestivum), foxtail millet (Setaria italica), rapeseed (Brassica napus),
tomato (Lycopersicon esculentum), potato (Solanum tuberosum), soya bean (Glycine max) and thale cress
(Arabidopsis thaliana). The results returned from 12 laboratories showed that out of a total of 120 (10 ×
12), non-rice plant DNA samples, 118 negative results were obtained using the SPS gene PCR system. This
means that the false-positive rate of the SPS gene PCR system for other 10 plant materials was 1,67 %
(2/120) (see Table A.14). These data suggest that the SPS gene is species specific for detection of rice.
1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of
this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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Table A.14 — The results of heterogeneity and of specificity testing of the qualitative PCR
Parameter (collaborative study of 2007) Value
No. laboratories 12
No. laboratories submitting results 12
No. samples per laboratory 22
No. accepted results 264
No. samples containing rice 144
No. samples not containing rice 120
False-positive results 2 (1,67 %)
False-negative results 1 (0,69 %)
The LOD of the SPS gene PCR system was validated using mixed powder containing maize and various
quantities of rice seed by means of qualitative PCR: all 12 laboratories detected the SPS gene in the DNA
sample extracted from mixed powder containing 0,1 % mass fraction or higher of rice, and two in 12
laboratories detected it from mixed powder containing 0,01 % mass fraction of rice. These data suggest
that the LOD of the SPS gene PCR system is as low as 0,1 % mass fraction (see Table A.15).
Table A.15 — The results of the LOD test of the qualitative PCR
Rice to maize mass fraction, m /m
rice maize
Parameter (collaborative study of
2007)
10 % 1 % 0,1 % 0,05 % 0,01 %
No. laboratories 12 12 12 12 12
No. laboratories submitting results 12 12 12 12 12
No. samples per laboratory 2 2 2 2 2
No. laboratories accepted results 12 12 12 12 12
Positive results 12 (100 %) 12 (100 %) 12 (100 %) 4 (33,33 %) 2 (16,67 %)
A.5.3.4 Molecular selectivity
A.5.3.4.1 General
For qualitative validation of the SPS gene as a specific rice gene, a 279 bp fragment of the conserved
region of the SPS gene was selected and amplified using specific primers.
A.5.3.4.2 Experimental
DNA samples extracted from 11 different plant materials (including rice) were analysed by the SPS gene
PCR system as described (Reference [44]). Among the 11 samples, only rice DNA gave positive results.
The other 10 samples (see A.5.3.3) gave negative results.
The DNA samples extracted from 12 different rice cultivars were analysed by the SPS gene PCR system
reported in Reference [44]. All 12 samples gave positive results.
A.5.3.4.3 Theoretical
The theoretical specificity of the SPS gene primer was assessed through a homology search using the
BLASTN 2.0MP-WashU program (Reference [82], search date: 2010-01-09). The 279 bp sequence used
as query is part of the NCBI accession number U33175 (nucleotides 1055–1333). The results of the basic
local alignment search tool (BLAST) confirmed the complete identity of the query sequence with rice
SPS gene sequence, and no homology with other genes and species.
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A.5.4 Principle and summary
This methodology is a PCR procedure for the applicability of the SPS gene for use as a rice endogenous
gene in qualitative detection of GM or non-GM rice. Heterogeneity, species specificity of the SPS gene and
LOD were evaluated as part of the validation of this method. The 279 bp PCR product was visualized by
agarose gel electrophoresis.
A.5.5 Terms and definitions
[40]
For the purposes of this document, the terms and definitions of ISO 5725-1 and ISO 24276 apply.
A.5.6 Sample type and amounts
In the following, the data from the collaborative study are given as examples for sample types and
sample amounts adequate for this method.
DNA samples extracted from the seeds of 12 rice cultivars, 10 other plant materials (see A.5.3.3) and
the mixed powder containing different mass fractions of rice in maize seed power, were used in this
collaborative study.
The participants received the following samples.
— 12 DNA samples from 12 different rice cultivars that are widely planted in different region of
China (i.e. Najing14, Taibei309, Shengnong265, Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733,
Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9, and Nipponbare), 20 ng/μl, 50 μl each. These DNA samples
were used to validate the heterogeneity of the SPS gene among rice cultivars.
— 11 DNA samples from rice (Guangluai4) and 10 other plant materials which are related to rice
(i.e. bamboo, green bristlegrass, barley, wheat, foxtail millet) or common GM crops (i.e. rapeseed,
tomato, potato and soya bean) or model plants (i.e. thale cress), 20 ng/μl, 50 μl each. These DNA
samples were used to validate the species specific of the SPS gene in rice.
— 10 DNA samples from mixed powders of maize with different mass fractions of rice, 20 ng/μl, 50 μl
each. These DNA samples were double blind replicates of the series of five rice concentrations used
for testing the LOD of the SPS gene PCR system.
— Negative DNA target control (labelled N): salmon sperm DNA (20 ng/µl).
— Positive DNA target control (labelled P): rice (Guangluai4) genomic DNA (20 ng/µl). All the DNA
samples were purified using the CTAB method by the GMDL-SJTU. The negative and positive DNA
target controls were used for each PCR plate.
— Reaction reagents, primers for the SPS gene PCR system as follows:
— primer pair for conventional PCR: SPS-F/SPS-R;
— DNA dilution solution [0,1× tris–EDTA (TE), 1,2 ml].
A.5.7 Limit of detection and range of use
DNA was extracted from five mixed powder samples containing different amounts of rice. These samples
were analysed by the SPS PCR system as described (Reference [44]). Positive results were obtained with
samples containing mass fractions of 10 %, 1 %, and 0,1 % rice. The other two samples (containing mass
fractions of 0,05 % and 0,01 %) gave negative results.
According to the developed method, the relative LOD of the qualitative PCR method is about 0,1 % mass
fraction. The SPS gene PCR system can be used for specific detection and identification of rice materials
in other plant materials.
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A.5.8 Estimation of measurement uncertainty
The reproducibility of the method is given by the results of the collaborative trial (see A.5.3.3).
A.5.9 Interferences
In the studies performed, no additional information about interferences have been observed.
A.5.10 Physical and environmental conditions
See ISO 24276 for details. For example:.
— maintain strictly separated working areas for DNA preparation, PCR set-up, PCR amplification and
electrophoresis;
— any residual DNA should be removed from all equipment prior to its use;
— in order to avoid contamination, use filter pipette tips protected against aerosol;
— use only powder-free gloves and change them frequently.
A.5.11 Apparatus and equipment
A.5.11.1 Microcentrifuge.
A.5.11.2 Freezer operating at −20 °C and refrigerator operating at 4 °C.
A.5.11.3 Micropipettes.
A.5.11.4 Mixer, e.g. vortex mixer.
A.5.11.5 Microcentrifuge tubes, capacities: 0,2 ml, 1,5 ml, and 2,0 ml.
A.5.11.6 Tips and aerosol-resistant tips for micropipettes.
A.5.11.7 Rack for reaction tubes.
A.5.11.8 PVC or latex gloves.
A.5.11.9 DNA amplifying equipment (thermal cycler or equivalent apparatus).
A.5.11.10 Electrophoresis equipment, with power supply.
A.5.11.11 Imaging system for gel analysis.
A.5.11.12 Microwave oven (optional).
A.5.12 Reagents and materials
A.5.12.1 General
Unless otherwise stated, only reagents that conformed to the specifications of ISO 24276 and only
molecular biology grade water or water of equivalent purity were used.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
A.5.12.2 Qualitative PCR
A.5.12.2.1 PCR buffer (without MgCl ) 10×.
2
A.5.12.2.2 MgCl solution 25 mmol/l.
2
A.5.12.2.3 dNTP solution 2,5 mmol/l each.
A.5.12.2.4 Primer (see Table A.16).
A.5.12.2.5 DNA polymerase, thermostable.
A.5.12.3 Electrophoresis
For details see e.g. ISO 21571:2005, B.1.
A.5.12.3.1 Loading buffer (10 g/l sodium dodecyl sulfate, 500 g/l glycerol, 0,5 g/l bromophenol blue), 10×.
A.5.12.3.2 DNA size standard.
A.5.13 Sample collection, transportation, preservation, and storage
DNA solutions may be stored at 4 °C for a maximum of 1 week, or at −20 °C for long-term storage.
A.5.14 Preparation of test sample
Ensure that the test sample is representative of the laboratory sample, e.g. by grinding or homogenization.
Measures and operational steps to be taken into consideration are described in ISO 21571 and ISO 24276.
A.5.15 Instrument calibration
[41]
Instruments, e.g. thermal cyclers and pipettes should be calibrated as per ISO/IEC 17025.
A.5.16 Analysis steps
A.5.16.1 Preparation of the DNA for qualitative PCR
Extract DNA from the samples by using an adequate extraction method, e.g. ISO 21571:2005, A.3, CTAB
extraction method. Thaw, mix gently and centrifuge the DNA samples needed for the PCR run. Keep
thawed reagents at 1 °C to 4 °C on ice.
A.5.16.2 PCR reagents
A.5.16.2.1 Conventional PCR master mix
A conventional PCR reaction mixture containing the following: 1× PCR buffer, 200 µmol/l each of dNTPs,
2+
2,5 mmol/l Mg , 330 nmol/l forward/reverse primer, 1 unit Taq DNA polymerase.
A.5.16.2.2 Primers
See Table A.16.
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Table A.16 — Oligonucleotide primer sequences for qualitative PCR
Name Oligonucleotide DNA sequence (5’ to 3’)
Qualitative PCR primer sequence
SPS primer F TTg CgC CTg AAC ggA TAT
SPS primer R ggA gAA gCA CTg gAC gAgg
A.5.16.3 Procedure
A.5.16.3.1 General
The qualitative PCR for rice SPS gene was developed for a total volume of 30 µl per reaction mixture. The
use of 100 ng of template DNA per reaction well is recommended.
Thaw, mix gently and centrifuge the PCR master mix needed for the run. Keep thawed reagents at 1 °C
to 4 °C on ice.
Distribute 25 µl/tube of the master mixture to 200 µl PCR reaction tubes. Add 5 µl of DNA solution
samples, rice positive control, negative control, and blank control (H O) to the tubes, respectively.
2
Mix the PCR tubes gently, centrifuge in the microcentrifuge at 1 000 × g for 10 s.
Insert the plate into the instrument.
Run the PCR with qualitative PCR cycling conditions.
A.5.16.4 PCR controls
See 7.5 and ISO 24276.
A.5.16.5 Temperature–time programme
1) 1)
The PCR assay has been optimized for use in a PTC-100 (MJ Research) and an ABI 2720 (Applied
Biosystems) thermal cycler PCR machine. Although other PCR machines may be used, the thermal cycling
conditions may need to be verified. The qualitative PCR cycling parameters are indicated in Table A.17.
Table A.17 — Qualitative PCR temperature–time programme
Temperature Time
Step Stage No. cycles
°C s
1 Activation and initial denaturation 94 900 1×
2a Denaturation 94 30
2b Amplification Annealing 58 30 35×
2c Elongation 72 30
3 Final elongation 72 420 1×
A.5.16.6 Detection
After the PCR programme has finished, transfer 3 μl of 10× loading buffer to each reaction tube and mix
with the PCR products.
Load 10 μl of each PCR product on to electrophoresis gel (20 g/l agarose, 0,5 µg/ml ethidium bromide),
respectively.
Run the gel in the electrophoresis equipment under 5 V/cm, 20 min.
Record gel image with an UV gel documentation or similar system.
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A fragment of 279 bp should be the specific product; other bands existing in the agarose electrophoresis
are unexpected products.
A.5.16.7 Accept or reject criteria
Method performance requirements used to evaluate the results from the collaborative study are as follows.
A fragment of 279 bp should be detected in the rice positive control (sample P), and no target fragment
should be detected in negative control (sample N) and blank. The detection of fragments with a size of
279 bp indicates that the sample DNA solution contains amplifiable DNA of SPS, and the result is positive,
otherwise the result is negative.
A.5.17 Sample identification
All samples should be identified unambiguously.
A.5.18 Interpretation and calculations of the results
The expected amplicon length of SPS is 279 bp in size.
A fragment of 279 bp should be detected in the rice positive control (sample P), and no target fragment
should be detected in negative control (sample N) and blank. The detection of fragments with a size of
279 bp indicates that the sample DNA solution contains amplifiable DNA of SPS, and the result is positive,
otherwise the result is negative.
A.6 Target taxon-specific method for the detection of components derived from
tomato
A.6.1 Purpose, relevance and scientific basis
The LAT52 gene encodes a heat-stable, glycosylated, cysteine-rich protein that is necessary for tomato
pollen development. The LAT52 detection system has been demonstrated to be suitable for being used
as species-specific gene in GM tomato identification and quantification (Reference [46]). The GMO
Detection Laboratory of Shanghai Jiao Tong University (GMDL-SJTU) organized the collaborative trial
for validation of the applicability of the tomato LAT52 gene as species-specific gene for qualitative
analysis of genetically modified (GM) or non-GM tomato. The study involved 13 laboratories from the
US, Singapore, Korea, Lithuania, Slovenia, Norway, Italy, and China (Reference [47]). The results are
given in Table A.18 and Table A.19.
The operational procedure of the collaborative study comprised the following modules:
a) qualitative PCR for the validation of the heterogeneity of the LAT52 gene among tomato cultivars for
different geographic and phylogenetic origin;
b) qualitative PCR for the validation of the species-specificity of the LAT52 gene for tomato;
c) qualitative PCR for the evaluation of the LOD of the established LAT52 qualitative PCR assay.
The collaborative study was carried out in accordance with the following internationally accepted guidelines:
[39]
— ISO 5725-2 especially considered in relation to the measure of precision (i.e. repeatability and
reproducibility) and trueness;
— The IUPAC protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies
(Reference [48]).
A.6.2 Principle
This method describes the detection of tomato DNA by using qualitative PCR.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
The method has been optimized for tomato seeds, tomato fruits, tomato ketchup, tomato juice, and
other processed products derived from tomato. The applicability of the LAT52 gene was tested through
collaborative trial using DNA samples extracted from tomato seeds and other plant materials.
A.6.3 Validation status and performance criteria
A.6.3.1 Robustness of the method
The robustness of the LAT52 qualitative PCR system was tested by the method developer using three
different annealing temperatures (i.e. 56 °C, 58 °C, and 60 °C), on three different DNA samples containing
known amounts of tomato seed DNA (10 ng, 1 ng, 0,1 ng tomato genome DNA samples, and three
repetitions per sample). The qualitative PCR systems showed the expected robustness and performed
satisfactorily at all three annealing temperatures and three concentrations of the tomato DNA samples.
The LAT52 qualitative PCR system has also been tested by the method developer on different thermal cyclers
1) 1) 1)
[PTC-100, MJ Research; S1000, Bio-Rad; and ABI 9700, Applied Biosystems] and with three different
reaction volumes (25 μl, 30 μl and 50 μl, and three repetitions per volume). The qualitative PCR system
showed the expected robustness when used at different thermal cyclers and different reaction volumes.
A.6.3.2 Intralaboratory trial
The tomato LAT52 gene has been validated suitable for use as species-specific gene in GM tomato
identification and quantification (Reference [46]). The detailed technical information given here is
modified from Reference [46].
For sample preparation for the validation study, the DNA samples were extracted by the GMDL-SJTU
using the CTAB method adopted from ISO 21571:2005, A.3. Spectrometric quantification of the amount
of total DNA extracted was performed using a method adopted from ISO 21571:2005, B.1. After the DNA
quantification, a qualitative PCR run applying the 18S PCR system was carried out to provide data about
possible PCR inhibition (Reference [49]).
The LAT52 PCR system was tested by three operators by the GMDL-SJTU using tomato genomic DNA
providing satisfactory and consistent results; in particular, in qualitative PCR, the results showed the
LAT52 gene is specific for tomato, and the relative LOD is at least 0,1 % mass fraction.
A.6.3.3 Collaborative trial
The heterogeneity of LAT52 gene among tomato cultivars was evaluated using 12 tomato cultivars from
different geographic and phylogenetic origins in China, such as Shengnong2, Jifan4, Zhongsu5, Yashu6,
Jiafen1, Shenfeng2, Hongza9, R144, Nongyou30, Dongnong704, Lichun, and Zaokui. The results returned
from 13 laboratories showed that from the total of 156 (12 × 13) tomato DNA samples, 155 positive
results were obtained using the LAT52 gene PCR system. Thus, the false-negative rate of the LAT52 PCR
system for tomato is 0,64 % (1/156) (see Table A.18). These data suggest that the LAT52 gene has low
heterogeneity among tomato cultivars from China.
The species specificity of the LAT52 gene was validated using a tomato genome DNA sample (Jiafen1)
and 10 other plant DNAs that were evolutionarily related to tomato or common GM crops or model
plants, such as the fruit materials of aubergine (Solanum melongena), potato (Solanum tuberosum), sweet
pepper (Capsicum annuum); maize (Zea mays), soya bean (Glycine max), rapeseed (Brassica rapa), rice
(Oryza sativa); leaf materials of petunia (Petunia hybrida), tobacco (Nicotiana tabacum), and thale cress
(Arabidopsis thaliana). The results returned from 13 laboratories show that from the total of 130 (10 ×
13, without tomato DNA sample) various plant DNA, 126 negative results were obtained using the LAT52
gene PCR system. Thus the false-positive rate of the LAT52 gene PCR system was 3,08 % (4/130) (see
Table A.18). The false-positive results might come from the contamination of the PCR operation. These
data suggest that the LAT52 gene is species-specific for the detection of tomato.
10 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(E)
Table A.18 — Results of the qualitative PCR
Parameter
Value
(collaborative trial of 2007)
No. laboratories 13
No. laboratories submitting results 13
No. samples per laboratory 22
No. accepted results 286
No. samples containing tomato 156
No. samples not containing tomato 130
False-positive results 4 (3,08 %)
False-negative results 1 (0,64 %)
The LOD of the LAT52 PCR system was validated using mixed powder containing maize and tomato
seeds
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21569
Première édition
2005-06-15
AMENDEMENT 1
2013-04-01
Produits alimentaires — Méthodes
d’analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Méthodes
qualitatives basées sur l’utilisation
des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid
based methods
AMENDMENT 1
Numéro de référence
ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
©
ISO 2013
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
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Publié en Suisse
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’Amendement 1 à l’ISO 21569:2005 a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.
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Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la
détection des organismes génétiquement modifiés et
des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur
l’utilisation des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Dans le présent amendement, la numérotation des notes de bas de page n’a pas fait l’objet d’une mise à jour
permettant de l’adapter à la numérotation adoptée dans l’ISO 21569:2005. Les renvois de note de bas de
page indiqués sont donnés pour utilisation uniquement comme références au sein du présent amendement.
Page v, Introduction, alinéa 1
Supprimer le premier élément de la liste:
«— Échantillonnage (ISO 21568);»
Page 1, Article 2, ISO 24276
Supprimer la note de bas de page et mettre à jour la référence pour lire:
ISO 24276:2006, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
Page 2, 4.1, alinéa 1
Remplacer le texte existant par le texte suivant.
«Un résultat qualitatif doit clairement indiquer la présence ou l’absence de l’élément génétique à
l’étude, recherchée à l’aide de témoins appropriés.
NOTE Les limites de détection et la taille de la prise d’essai sont des aspects critiques d’une méthode.»
Page 5, 7.3.3.3.3, alinéa 2
Supprimer «représentatif» et remplacer par «approprié» de manière à lire le texte qui suit.
«Il convient de démontrer que les amorces conçues pour détecter les séquences cibles spécifiques
au taxon sont capables de détecter de manière fiable ces séquences dans un nombre approprié de
membres différents du taxon.»
Page 5, 8.1 a) et b)
Remplacer «ISO 24276:—» par «ISO 24276:2006».
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
Page 7, 9.4
Remplacer le texte existant par le texte suivant.
«Les résultats obtenus avec la même prise d’essai doivent être cohérents. En cas de résultats +/- pour
les deux répétitions, répéter les deux PCR pour la prise d’essai correspondante. Si les deux nouvelles
répétitions donnent des résultats +/- ou -/-, la prise d’essai est considérée comme négative.
Les résultats obtenus avec toutes les prises d’essai doivent être cohérents. Lorsqu’au moins une
prise d’essai donne un résultat positif et qu’au moins une autre donne un résultat négatif, l’analyse
doit être répétée.
Si au moins une répétition du mode opératoire, commençant par l’extraction des acides nucléiques,
donne des résultats ambigus, tels qu’un résultat positif et un résultat négatif, il convient que le
rapport indique que l’échantillon est négatif à la limite de détection (LOD).»
Page 7, Article 10, deuxième élément de la liste
Remplacer le texte existant par le texte suivant.
«— la spécificité de la méthode analytique (événements spécifiques, construit spécifique ou
méthode de criblage);»
Page 24, Annexe A
Insérer A.5 et A.6 après le texte existant.
A.5 Méthodes spécifiques au taxon pour la détection d’ADN dérivés du riz
A.5.1 Objet, pertinence et base scientifique
Le Laboratoire de détection d’OGM de l’Université Jiao Tong de Shanghai (GMDL-SJTU) a organisé un
essai interlaboratoires pour valider l’applicabilité d’une méthode spécifique au taxon utilisant le gène
codant la saccharose phosphate synthase (SPS) du riz comme gène endogène pour l’analyse qualitative
du riz génétiquement modifié (GM) ou non génétiquement modifié (non-GM). Douze laboratoires situés
en Espagne, en Corée, en Lituanie, en Slovénie, au Japon, en Italie et en Chine ont participé à cet essai.
Le mode opératoire de l’essai interlaboratoires comportait les modules suivants:
— PCR qualitative pour la validation de l’hétérogénéité du gène SPS parmi des cultivars de riz de
différentes origines géographiques et phylogénétiques;
— PCR qualitative pour la validation de la spécificité à l’espèce riz du gène SPS;
— PCR qualitative pour l’évaluation de la LOD du test PCR qualitatif établi pour le SPS.
L’essai interlaboratoires a été réalisé conformément à la Référence [44].
Les résultats de l’essai interlaboratoires ainsi que le protocole associé sont donnés en A.5.3.
A.5.2 Principe
La méthode a été optimisée pour les semences de riz, et d’autres produits transformés comme la poudre
issue de semences. L’applicabilité du gène SPS a été évaluée dans le cadre de cet essai interlaboratoires
en utilisant des échantillons d’ADN extraits de semences de riz et d’autres plantes.
L’organisateur de l’essai interlaboratoires a fourni aux participants les réactifs spécifiques à la méthode
(amorces, sondes, mélange réactionnel maître) et les échantillons d’ADN pour essai extraits de produits
à base de riz.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.3 État de validation et critères de performance
A.5.3.1 Robustesse de la méthode
La robustesse a été évaluée sur un système de PCR qualitative pour le gène SPS pour trois températures
d’hybridation différentes (à savoir 56 °C, 58 °C et 60 °C), sur trois échantillons d’ADN différents
contenant des quantités connues d’ADN de riz (échantillons d’ADN de génome de riz de 10 ng, 1 ng,
0,1 ng) et avec trois répétitions par échantillon. Les systèmes de PCR qualitative ont démontré qu’ils
présentaient la robustesse attendue et ont bien fonctionné aux trois températures d’hybridation et aux
trois concentrations des échantillons d’ADN de riz.
Le système de PCR qualitative pour le gène SPS a également été évalué sur différents thermocycleurs
1)
(PTC-100 , MJ Research et instruments de Bio-Rad et Applied Biosystems), sur trois volumes réactionnels
différents (25 μl, 30 μl et 50 μl) et avec trois répétitions par volume. Les systèmes de PCR qualitative ont
présenté la robustesse attendue et ont bien fonctionné sur différents thermocycleurs et avec différents
volumes réactionnels.
A.5.3.2 Essai intralaboratoire
Le gène SPS du riz a été décrit comme étant adapté à une utilisation en tant que gène endogène de
référence dans l’identification et la quantification du riz (Référence [44]). Les informations techniques
détaillées ont été modifiées par rapport à la Référence [44].
Pour la préparation des échantillons dans le cadre de l’essai interlaboratoires, tous les échantillons
d’ADN ont été extraits au laboratoire GMDL-SJTU par la méthode employant le CTAB décrite dans
l’ISO 21571:2005, A.3. La quantification spectrophotométrique de l’ADN extrait a été réalisée par une
méthode décrite dans l’ISO 21571:2005, B.1. Après la quantification de l’ADN, une PCR qualitative a été
réalisée à l’aide du système de PCR 18S (Référence [45]) pour obtenir des données sur une éventuelle
inhibition de la PCR.
Le système de PCR pour le gène SPS a été soumis à essai en utilisant de l’ADN génomique de riz par
trois chercheurs du laboratoire GMDL-SJTU. Les résultats ont été satisfaisants; en particulier, pour
la PCR qualitative, les résultats ont montré que le gène SPS est spécifique pour le riz et que la LOD est
d’environ 0,1 %.
A.5.3.3 Essai interlaboratoires
Dans le cadre de l’essai interlaboratoires, chaque participant a reçu douze échantillons d’ADN de riz pour
l’essai d’hétérogénéité; dix échantillons d’ADN provenant de plantes autres que le riz plus un échantillon
d’ADN provenant de riz pour les essais de spécificité à l’espèce; et dix échantillons de riz dilués en série
pour l’évaluation de la LOD. Un témoin négatif et un témoin positif étaient également inclus.
L’hétérogénéité du gène SPS parmi des cultivars de riz a été évaluée en utilisant douze cultivars de
riz de différentes origines géographiques et phylogénétiques en Chine, tels que Najing14, Taibei309,
Shengnong265, Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9
et Nipponbare. Les résultats renvoyés par les douze laboratoires ont montré que sur un total de 144
(12 × 12) échantillons d’ADN de riz, 143 résultats positifs ont été obtenus en utilisant le système de PCR
pour le gène SPS. Cela signifie que le taux de faux négatif du système de PCR pour le gène SPS du riz est
de 0,69 % (1/144) (voir Tableau A.14). Ces données suggèrent qu’il existe une faible hétérogénéité du
gène SPS dans la région cible.
1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
Tableau A.14 — Résultats des essais d’hétérogénéité et de spécificité de la PCR qualitative
Paramètre Valeur
(Essai interlaboratoires de 2007)
Nombre de laboratoires 12
Nombre de laboratoires présentant des résultats 12
Nombre d’échantillons par laboratoire 22
Nombre de résultats acceptés 264
Nombre d’échantillons contenant du riz 144
Nombre d’échantillons ne contenant pas de riz 120
Faux positifs 2 (1,67 %)
Faux négatifs 1 (0,69 %)
La spécificité à l’espèce du gène SPS a été validée en utilisant un échantillon d’ADN génomique de riz
(Guangluai4) et dix ADN d’autres plantes liées d’un point de vue évolutif au riz, de plantes cultivées
courantes ou de plantes modèles, tels que les fruits du bambou (Phyllostachys spp.), la sétaire verte
[Setaria viridis (L.) Beauv.], l’orge (Hordeum vulgare), le blé (Triticum aestivum), le millet des oiseaux
(Setaria italica), le colza (Brassica napus), la tomate (Lycopersicon esculentum), la pomme de terre
(Solanum tuberosum), le soja (Glycine max) et l’arabette des dames (Arabidopsis thaliana). Les résultats
renvoyés par les douze laboratoires ont montré que sur un total de 120 (10 × 12) échantillons d’ADN
provenant de plantes autres que le riz, 118 résultats négatifs ont été obtenus en utilisant un système
PCR pour le gène SPS. Cela signifie que le taux de faux positif du système de PCR pour le gène SPS pour
les dix autres plantes est de 1,67 % (2/120) (voir Tableau A.14). Ces données suggèrent que le gène SPS
est spécifique à l’espèce pour la détection du riz.
La LOD du système de PCR pour le gène SPS a été validée en utilisant une poudre mélangée contenant du
maïs et différentes quantités de semences de riz au moyen d’une PCR qualitative: les douze laboratoires
ont détecté le gène SPS dans l’échantillon d’ADN extrait de la poudre mélangée contenant 0,1 % (fraction
massique) ou plus de riz, et deux des douze laboratoires l’ont détecté dans la poudre de riz mélangée
contenant 0,01 % (fraction massique) de riz. Ces données suggèrent que la LOD du système de PCR pour
le gène SPS est aussi faible que 0,1 % (fraction massique) (voir Tableau A.15).
Tableau A.15 — Résultats de l’essai de limite de détection de la PCR qualitative
Paramètre Fraction massique riz sur maïs, m /m
riz maïs
(Essai interlaboratoires de 2007)
10 % 1 % 0,1 % 0,05 % 0,01 %
Nombre de laboratoires 12 12 12 12 12
Nombre de laboratoires présentant des
12 12 12 12 12
résultats
Nombre d’échantillons par laboratoire 2 2 2 2 2
Nombre de résultats acceptés 12 12 12 12 12
Résultats positifs 12 (100 %) 12 (100 %) 12 (100 %) 4 (33,33 %) 2 (16,67 %)
A.5.3.4 Sélectivité moléculaire
A.5.3.4.1 Généralités
Pour la validation qualitative du gène SPS comme gène spécifique du riz, un fragment de 279 bp de la
région conservée du gène SPS a été sélectionné et amplifié en utilisant des amorces spécifiques.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.3.4.2 Aspects expérimentaux
Des échantillons d’ADN extraits de onze plantes différentes (y compris le riz) ont été analysés par le
système de PCR pour le gène SPS comme décrit dans la Référence [44]. Parmi les onze échantillons,
seul l’ADN du riz a donné des résultats positifs. Les dix autres échantillons (voir A.5.3.3) ont donné des
résultats négatifs.
Les échantillons d’ADN extraits de douze cultivars de riz différents ont été analysés par le système de PCR
pour le gène SPS décrit dans la Référence [44]. Les douze échantillons ont donné des résultats positifs.
A.5.3.4.3 Aspects théoriques
La spécificité théorique de l’amorce du gène SPS a été évaluée par une recherche d’homologie à l’aide
du programme BLASTN 2.0MP-WashU (Référence [82], date de la recherche: 2010-01-09). La séquence
de 279 bp utilisée comme requête fait partie du numéro de référence NCBI U33175 (nucléotides
1055-1333). Les résultats de la recherche effectuée avec l’outil d’alignement local (BLAST) ont confirmé
une homologie totale de la séquence avec la séquence du gène SPS du riz, et l’absence d’homologie avec
d’autres gènes et espèces.
A.5.4 Principe et résumé
Cette méthodologie est un mode opératoire de PCR pour l’applicabilité du gène SPS à une utilisation en
tant que gène endogène du riz dans la détection qualitative de riz génétiquement modifié ou de riz non
génétiquement modifié. L’hétérogénéité, la spécificité à l’espèce du gène SPS et la limite de détection ont
été évaluées dans le cadre de la validation de cette méthode. Le produit PCR de 279 bp a été visualisé par
électrophorèse sur gel d’agarose.
A.5.5 Termes et Définitions
[40]
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 5725-1 et
l’ISO 24276 s’appliquent.
A.5.6 Type et quantités d’échantillon
Dans ce qui suit, les données obtenues dans le cadre de l’essai interlaboratoires sont indiquées à titre
d’exemples pour les types et quantités d’échantillon adéquats pour la présente méthode.
Des échantillons d’ADN extraits des semences de douze cultivars de riz, de dix autres plantes (voir A.5.3.3)
et d’une poudre mélangée contenant différentes fractions massiques de riz dans une poudre de semences
de maïs, ont été utilisés dans le cadre de cet essai interlaboratoires.
Les participants ont reçu les échantillons suivants.
— Douze échantillons d’ADN provenant de douze cultivars de riz différents qui sont largement
plantés dans différentes régions de Chine (à savoir Najing14, Taibei309, Shengnong265, Jinyinbao,
Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9 et Nipponbare.),
20 ng/μl, de 50 μl chacun. Ces échantillons d’ADN ont été utilisés pour valider l’hétérogénéité du
gène SPS parmi des cultivars de riz.
— Onze échantillons d’ADN provenant de riz (Guangluai4) et de dix autres plantes qui sont liées au
riz (à savoir bambou, sétaire verte, orge, blé, millet des oiseaux) ou de plantes cultivées courantes
génétiquement modifiées (à savoir colza, tomate, pomme de terre et soja) ou de plantes modèles (à
savoir arabette des dames), 20 ng/μl, de 50 μl chacun. Ces échantillons d’ADN ont été utilisés pour
valider la spécificité à l’espèce riz du gène SPS.
— Dix échantillons d’ADN provenant des poudres de maïs contenant différentes fractions massiques de
riz, 20 ng/μl, de 50 μl chacun. Ces échantillons d’ADN étaient des répétitions en double aveugle de la
série de cinq concentrations de riz utilisée pour évaluer la LOD du système de PCR pour le gène SPS.
— Un témoin négatif d’ADN cible (étiqueté N): ADN de sperme de saumon (20 ng/µl).
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
— Un témoin positif d’ADN cible (étiqueté P): ADN génomique de riz (Guangluai4) (20 ng/µl). Tous les
échantillons d’ADN ont été purifiés en utilisant la méthode CTAB par le laboratoire GMDL-SJTU. Les
témoins négatif et positif d’ADN cible ont été utilisés pour chaque plaque de PCR.
— Réactifs, amorces pour le système de PCR pour le gène SPS comme suit:
— paire d’amorces pour PCR conventionnelle: SPS-F/SPS-R;
— solution de dilution de l’ADN [tris-EDTA (TE) 0,1×, 1,2 ml].
A.5.7 Limite de détection et domaine d’utilisation
L’ADN a été extrait de cinq échantillons de poudre mélangée contenant différentes quantités de riz. Ces
résultats ont été analysés en utilisant le système PCR pour le gène SPS tel que décrit (Référence [44]).
Des résultats positifs ont été obtenus avec les échantillons contenant des fractions massiques de riz
de 10 %, 1 %, et 0,1 %. Les deux autres échantillons (contenant des fractions massiques de 0,05 % et
0,01 %) ont donné des résultats négatifs.
Selon la méthode développée, la LOD relative de la méthode PCR qualitative est d’environ 0,1 % (fraction
massique). Le système de PCR pour le gène SPS peut être utilisé pour la détection et l’identification
spécifiques du riz dans d’autres produits d’origine végétale.
A.5.8 Estimation de l’incertitude de mesure
La reproductibilité de la méthode est donnée par les résultats de l’essai interlaboratoires (voir A.5.3.3).
A.5.9 Interférences
Dans les études menées, aucune information complémentaire n’est donnée concernant des
interférences observées.
A.5.10 Conditions physiques et environnementales
Voir l’ISO 24276 pour des informations détaillées. Par exemple:
— respecter des zones de travail strictement séparées pour la préparation de l’ADN, la réaction PCR,
l’amplification par PCR et l’électrophorèse;
— il convient d’éliminer tout ADN résiduel de tous les équipements avant leur utilisation;
— pour éviter toute contamination, utiliser des embouts de pipette à filtre protégés contre les aérosols;
— utiliser uniquement des gants non poudrés et les changer fréquemment.
A.5.11 Appareillage et matériel
A.5.11.1 Microcentrifugeuse.
A.5.11.2 Congélateur fonctionnant à -20 °C et réfrigérateur fonctionnant à 4 °C.
A.5.11.3 Micropipettes.
A.5.11.4 Agitateur-mélangeur, par exemple agitateur-mélangeur vortex.
A.5.11.5 Microtubes à centrifuger, de capacités 0,2 ml, 1,5 ml et 2,0 ml.
A.5.11.6 Embouts et embouts résistant aux aérosols pour micropipettes.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.11.7 Râtelier pour tubes de réaction.
A.5.11.8 Gants en vinyle ou en latex.
A.5.11.9 Équipement d’amplification d’ADN (thermocycleur ou appareil équivalent).
A.5.11.10 Équipement d’électrophorèse, avec alimentation.
A.5.11.11 Système d’imagerie, pour analyse du gel.
A.5.11.12 Four à micro-ondes (facultatif).
A.5.12 Réactifs et matériaux
A.5.12.1 Généralités
Sauf indication contraire, uniquement des réactifs conformes aux spécifications de l’ISO 24276 et
uniquement de l’eau de qualité pour biologie moléculaire ou de l’eau de pureté équivalente ont été utilisés.
A.5.12.2 PCR qualitative
A.5.12.2.1 Tampon pour PCR (sans MgCl ) 10×.
2
A.5.12.2.2 Solution de MgCl , 25 mmol/l.
2
A.5.12.2.3 Solution de dNTP, 2,5 mmol/l (chaque).
A.5.12.2.4 Amorce (voir Tableau A.16).
A.5.12.2.5 ADN polymérase, thermostable.
A.5.12.3 Électrophorèse
Pour des informations détaillées, se reporter, par exemple, à l’ISO 21571:2005, B.1.
A.5.12.3.1 Tampon de charge (10 g/l de dodécyl sulfate de sodium, 500 g/l de glycérol, 0,5 g/l de bleu
de bromophénol) 10×.
A.5.12.3.2 Étalon de taille d’ADN.
A.5.13 Collecte, transport, conservation et stockage des échantillons
Les solutions d’ADN peuvent être conservées à 4 °C pendant une semaine au maximum ou à -20 °C pour
un stockage à long terme.
A.5.14 Préparation de l’échantillon pour essai
S’assurer que l’échantillon pour essai est représentatif de l’échantillon pour laboratoire, par exemple
par broyage ou homogénéisation. Les mesures et étapes opératoires à prendre en considération sont
décrites dans l’ISO 21571 et l’ISO 24276.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 7
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.15 Étalonnage des instruments
Il convient d’étalonner les instruments, par exemple les thermocycleurs et les pipettes, conformément à
[41]
l’ISO/CEI 17025 .
A.5.16 Étapes de l’analyse
A.5.16.1 Préparation de l’ADN pour une PCR qualitative
Extraire l’ADN des échantillons en utilisant une méthode d’extraction appropriée, par exemple la méthode
d’extraction employant le CTAB décrite dans l’ISO 21571:2005, A.3. Décongeler, mélanger doucement
et centrifuger les échantillons d’ADN nécessaires à l’analyse. Maintenir les réactifs décongelés à une
température de 1 °C à 4 °C sur de la glace.
A.5.16.2 Réactifs PCR
A.5.16.2.1 Mélange maître conventionnel pour PCR
Mélange réactionnel conventionnel pour PCR contenant les éléments suivants: tampon pour PCR 1×,
2+
200 µmol/l de chaque dNTP, 2,5 mmol/l de Mg , 330 nmol/l d’amorce sens/antisens, 1 unité de Taq
polymérase.
A.5.16.2.2 Amorces
Voir Tableau A.16.
Tableau A.16 — Séquences d’amorces oligonucléotidiques pour PCR qualitative
Nom Séquence d’ADN oligonucléotidique (5’ à 3’)
Séquence d’amorce pour PCR qualitative
Amorce SPS F TTg CgC CTg AAC ggA TAT
Amorce SPS R ggA gAA gCA CTg gAC gAgg
A.5.16.3 Mode opératoire
A.5.16.3.1 Généralités
La PCR qualitative pour le gène SPS du riz a été développée pour un volume total de 30 µl par mélange
réactionnel. Il est recommandé d’utiliser 100 ng d’ADN matrice par puits de réaction.
Décongeler, mélanger doucement et centrifuger le mélange maître pour PCR nécessaire à l’analyse.
Maintenir les réactifs décongelés à une température de 1 °C à 4 °C sur de la glace.
Répartir le mélange maître dans des tubes de réaction PCR de 200 µl, à raison de 25 µl/tube. Introduire
respectivement dans les tubes 5 µl des solutions d’ADN échantillons, du témoin de riz positif, du témoin
négatif et du témoin de blanc (eau).
Agiter doucement les tubes PCR, centrifuger dans la microcentrifugeuse à 1 000 × g pendant 10 s.
Installer la plaque dans l’instrument.
Réaliser la PCR dans les conditions de cycles pour PCR qualitative.
A.5.16.4 Témoins de PCR
Voir 7.5 et l’ISO 24276.
8 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.5.16.5 Programme d’amplification
1)
Le test PCR a été optimisé pour une utilisation dans un thermocycleur PTC-100 (MJ Research) et un
1)
thermocycleur ABI 2720 (Applied Biosystems). Bien que d’autres machines PCR puissent être utilisées,
il peut être nécessaire de vérifier les conditions de cycle thermique. Les paramètres de cycle pour PCR
qualitative sont indiqués dans le Tableau A.17.
Tableau A.17 — Programme d’amplification pour PCR qualitative
Température Durée
Nombre de
Étape Phase
cycles
°C s
1 Activation et dénaturation initiale 94 900 1×
2a Dénaturation 94 30
2b Amplification Hybridation 58 30 35×
2c Élongation 72 30
3 Élongation finale 72 420 1×
A.5.16.6 Détection
Une fois le programme PCR terminé, introduire 3 μl de tampon de charge 10× dans chaque tube de
réaction et mélanger avec les produits de PCR.
Charger respectivement 10 μl de chaque produit de PCR sur un gel d’électrophorèse (20 g/l d’agarose,
0,5 μg/ml de bromure d’éthidium).
Placer le gel dans l’équipement d’électrophorèse sous une tension de 5 V/cm pendant 20 min.
Enregistrer l’image du gel à l’aide d’un système de documentation sur les gels UV ou d’un système similaire.
Il convient qu’un fragment de 279 bp soit le produit spécifique; les autres bandes existant dans
l’électrophorèse sur agarose sont des produits inattendus.
A.5.16.7 Critères d’acceptation ou de rejet
Les exigences de performance de la méthode utilisées pour évaluer les résultats de l’essai interlaboratoires
sont les suivantes.
Il convient qu’un fragment de 279 bp soit détecté dans le témoin positif de riz (échantillon P) et qu’aucun
fragment cible ne soit détecté dans le témoin négatif (échantillon N) et le blanc. La détection de fragments
dont la taille est de 279 bp indique que la solution d’ADN échantillon contient de l’ADN amplifiable de
SPS, et le résultat est positif, sinon le résultat est négatif.
A.5.17 Identification de l’échantillon
Il convient d’identifier tous les échantillons sans ambigüité.
A.5.18 Interprétation et calcul des résultats
La longueur attendue de l’amplicon de SPS est de 279 bp.
Il convient qu’un fragment de 279 bp soit détecté dans le témoin positif de riz (échantillon P) et qu’aucun
fragment cible ne soit détecté dans le témoin négatif (échantillon N) et le blanc. La détection de fragments
dont la taille est de 279 bp indique que la solution d’ADN échantillon contient de l’ADN amplifiable de
SPS, et le résultat est positif, sinon le résultat est négatif.
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ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)
A.6 Méthode spécifique au taxon pour la détection de composés dérivés de la tomate
A.6.1 Objet, pertinence et base scientifique
Le gène LAT52 code une protéine glycosilée, riche en cystéine, thermostable, qui est nécessaire au
développement du pollen de la tomate. Le système de détection de LAT52 s’est avéré approprié pour une
utilisation en tant que gène spécifique aux espèces dans l’identification et la quantification des tomates
génétiquement modifiées (Référence [46]). Le Laboratoire de détection d’OGM de l’Université Jiao Tong
de Shanghai (GMDL-SJTU) a organisé un essai interlaboratoires pour valider l’applicabilité du gène
LAT52 de la tomate comme gène endogène spécifique aux espèces pour l’analyse qualitative de la tomate
génétiquement modifiée (GM) ou non génétiquement modifiée (non-GM). Treize laboratoires situés aux
États-Unis, à Singapour, en Corée, en Lituanie, en Slovénie, en Norvège, en Italie et en Chine ont participé
à cet essai (Référence [47]). Les résultats sont indiqués dans le Tableau A.18 et le Tableau A.19.
Le mode opératoire de l’essai interlaboratoires comportait les modules suivants:
a) PCR qualitative pour la validation de l’hétérogénéité du gène LAT52 parmi des cultivars de tomate
de différentes origines géographiques et phylogénétiques;
b) PCR qualitative pour la validation de la spécificité à l’espèce tomate du gène LAT52;
c) PCR qualitative pour l’évaluation de la LOD du test PCR qualitatif établi pour le LAT52.
L’essai interlaboratoires a été réalisé conformément aux lignes directrices suivantes reconnues à
l’échelle internationale:
[39]
— ISO 5725-2 , notamment pour ce qui concerne le mesurage de la fidélité (c’est-à-dire répétabilité
et reproductibilité) et de la justesse;
— le protocole pour la conception, la conduite et l’interprétation des études de performance des
méthodes de l’UICPA (Référence [48]).
A.6.2 Principe
La présente méthode décrit la détection d’ADN de tomate par PCR qualitative.
La méthode a été optimisée pour les semences de tomate, les tomates, le ketchup de tomates, le jus de
tomates et d’autres produits transformés dérivés de la tomate. L’applicabilité du gène LAT52 a été évaluée
dans le cadre d’un essai interlaboratoires en utilisant des échantillons d’ADN extraits de semences de
tomate et d’autres plantes.
A.6.3 État de validation et critères de performance
A.6.3.1 Robustesse de la méthode
La robustesse du système de PCR qualitative pour le gène LAT52 a été évaluée par le d
...
Questions, Comments and Discussion
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