ISO 15753:2006
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons
Animal and vegetable fats and oils — Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons
ISO 15753:2006 describes two methods for the determination of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in animal and vegetable fats and oils: a general method, and a method specific for coconut oil and short-chain vegetable oils. These methods are not quantitative for the very volatile compounds such as naphthalene, acenaphthene and fluorene. Due to interferences provided by the matrix itself, palm oil and olive pomace oil cannot be analysed using this method.
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des hydrocarbures aromatiques polycycliques
L'ISO 15753:2006 décrit deux méthodes pour la détermination de 15 hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans les corps gras d'origines animale et végétale: une méthode générale et une méthode spécifique pour l'huile de coprah et les huiles végétales avec acides gras à chaînes courtes. Ces méthodes ne sont pas quantitatives pour les composés très volatils tels que le naphtalène, l'acénaphtène et le fluorène. En raison des interférences causées par la matrice elle-même, l'huile de palme et l'huile de grignons d'olive ne peuvent pas être analysées par cette méthode.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 15753
Первое издание
2006-09-01
Жиры и масла животные и
растительные. Определение
содержания полициклических
ароматических углеводородов
Animal and vegetable fats and oils - Determination of polycyclic
aromatic hydrocarbons
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 15753:2006(R)
©
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или вывести на экран, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на загрузку интегрированных шрифтов в компьютер, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЁН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2006
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO или IDF по соответствующему адресу, указанному ниже.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2006 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .1
4 Принцип.2
5 Реагенты и материалы .2
6 Аппаратура.3
7 Отбор проб.5
8 Приготовление образцов.5
9 Процедура для определения содержания PAHs в жирах и маслах: Общий метод.5
9.1 Предварительные замечания .5
9.2 Холостое испытание.5
9.3 Определение значений восстановления (без матрицы) .6
9.4 Экстракция (жидкостно-жидкостная экстракция).6
9.5 Очистка на картридже со связанной фазой C18 (твердо-жидкостная экстракция).6
9.6 Очистка на картридже со связанной фазой флоризила (твердо-жидкостная
экстракция) .7
10 Процедура для определения PAHs в жирах и маслах: Метод, специально
предназначенный для кокосового масла.7
10.1 Первая экстракция (жидкостно-жидкостная экстракция).7
10.2 Вторая экстракция (жидкостно-жидкостная экстракция) .8
10.3 Очистка на картридже со связанной фазой С18 (твердо-жидкостная экстракция).8
10.4 Очистка на картридже со связанной фазой флоризила (твердо-жидкостная
экстракция) .9
11 Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) .9
11.1 Рабочие условия .9
11.2 Параметры детектирования .10
11.3 Анализ образцов и стандартных растворов.11
11.4 Подтверждение присутствия PAHs.12
12 Выражение результатов .12
13 Прецизионность.12
13.1 Межлабораторное испытание.12
13.2 Повторяемость .13
13.3 Воспроизводимость .13
14 Протокол испытания.13
Приложение А (информативное) Значения восстановления, блок-схемы, хроматограммы и
последовательности инжекций .14
Приложение В (информативное) Результаты межлабораторного испытания .19
Библиография.22
© ISO 2006 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, ISO
работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC,
Часть 2.
Главная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Обращается внимание на возможность патентования некоторых элементов данного международного
стандарта. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо или всех таких патентных
прав.
Международный стандарт ISO 15753 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые
продукты, Подкомитетом SC 11, Жиры и масла животные и растительные.
iv © ISO 2006 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 15753:2006(R)
Жиры и масла животные и растительные. Определение
содержания полициклических ароматических
углеводородов
1 Область применения
Настоящий международный стандарт описывает два метода для определения 15 полициклических
ароматических углеводородов (PAHs) в животных и растительных жирах и маслах:
⎯ общий метод и
⎯ метод, специально предназначенный для кокосового масла и растительного масла с
короткоцепочечными жирными кислотами.
Эти методы не являются количественными для очень летучих веществ, таких как нафталин,
аценафтен и флуорен. Из-за интерференций, обусловленных самой матрицей, пальмовое масло и
масло из оливкового жмыха нельзя анализировать этим методом.
Количественный предел составляет 0,2 мкг/кг почти для всех анализируемых веществ, кроме
fфлуорантена and бензо(g,h,i)перилена, для которых количественный предел 0,3 мкг/кг, и
индено(1,2,3-c,d)пирена, для которого количественный предел 1 мкг/кг.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы являются обязательными при применении данного
документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание документа. Для плавающих
ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного ссылочного документа
(включая любые изменения).
ISO 661, Жиры и масла животные и растительные. Приготовление испытательного образца
3 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются следующие термины и определения.
3.1
полициклический ароматический углеводород
polycyclic aromatic hydrocarbon
PAH
соединение, которое состоит из двух или более конденсированных (сращенных) ароматических
углеводородных колец и содержание которого можно определить согласно методу, установленному в
этом международном стандарте
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Содержание дается в микрограммах на килограмм.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 В общем PAHs делятся на легкие PAHs с ароматическими кольцами от двух до четырех и на
тяжелые PAHs с пятью или более ароматическими кольцами.
© ISO 2006 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
ПРИМЕРЫ
Легкие PAHs включают:
нафталин (CAS RN [91-20-3]), аценафтен (CAS RN [83-32-9]), аценафтилен (CAS RN [208-96-8]), флуорен
(CAS RN [86-73-7]), антрацен (CAS RN [120-12-7]), фенантрен (CAS RN [85-01-8]), флуорантен (CAS RN [206-44-0]),
хризен (CAS RN [218-01-9]), бенз(a)антрацен (CAS RN [56-55-3]), пирен (CAS RN [129-00-0]).
Тяжелые PAHs включают:
бензо(a)пирен (CAS RN [50-32-8]), бензо(b)флуорантен (CAS RN [205-99-2]), бензо(k)флуорантен
(CAS RN [207-08-9]), бензо(g,h,i)перилен (CAS RN [191-24-2]), дибенз(a,h)антрацен (CAS RN [53-70-3]),
индено(1,2,3-c,d)пирен (CAS RN [193-39-5]).
4 Принцип
Полициклические ароматические углеводороды экстрагируют посредством смеси
ацетонитрила/ацетона с последующей очисткой на картридже с обращенной фазой C18 и затем на
картридже со связанной фазой флоризила. Определение содержания отдельных полициклических
ароматических углеводородов после разделения выполняется методом жидкостной хроматографии
под высоким давлением (HPLC) и путем измерения флуоресценции при различных длинах волн
возбуждения и испускания.
5 Реагенты и материалы
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ – Обращается внимание на правила обращения с опасными веществами.
Должны соблюдаться технические, организационные и личные меры безопасности.
Используются только реагенты признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний.
Проверяют качество растворителей перед использованием, концентрируя растворитель примерно в
1 000 раз путем выпаривания и анализируя концентрат методом HPLC (300 мл до 300 мкл).
Хроматограмма не будет иметь пиков в элюентной области PAHs.
1)
5.1 Метанол, высшего класса чистоты для анализа .
1)
5.2 Гексан, класс HPLC .
1
)
5.3 Ацетонитрил, класс HPLC .
1
)
5.4 Ацетон, класс HPLC .
1
)
5.5 Дихлорметан, класс HPLC .
1
)
5.6 Толуол, класс HPLC .
1
)
5.7 Вода, класс HPLC .
1
)
5.8 Тетрагидрофуран, класс HPLC .
5.9 Смесь растворителей 1: ацетонитрил/ацетон (объемная доля 60 % / 40 %).
Количество, приходящееся на образец: 41 мл для общего метода, 36 мл для метода, специально
предназначенного для кокосового масла.
1) Эти продукты могут быть получены, например, от фирмы, Baker.
Эта информация дается только для удобства пользователей настоящего международного стандарта и не
является рекомендацией ISO для этих продуктов. Можно использовать аналогичные продукты, если показано, что
они дают такие же результаты.
2 © ISO 2006 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
5.10 Смесь растворителей 2: ацетонитрил/ацетон (объемная доля 80 % / 20 %).
Количество, приходящееся на образец: 2 × 11 мл для метода, специально предназначенного для
кокосового масла.
5.11 Смесь растворителей 3: гексан/дихлорметан (объемная доля 75 % / 25 %).
Количество, приходящееся на образец: 7 мл для общего метода, 2 × 7 мл для метода, специально
предназначенного для кокосового масла.
5.12 Смесь тетрагидрофурана/метанола (объемная доля 50 % / 50 %).
5.13 Стандартный раствор с 16 сертифицированными ЕРА (Агентство по защите окружающей
2)
среды) приоритетными РАНs в толуоле , с концентрацией 100 мкг/мл (100 мг/л): нафталин,
аценафтилен, аценафтен, флуорен, фенантрен, антрацен, флуорантен, пирен, бенз(a)антрацен,
кризен, бензо(b)флуорантен, бензо(k)флуорантен, бензо(a)пирен, дибенз(a,h)антрацен,
бензо(g,h,i)пирилен, индено(1,2,3-c,d)пирен. Должен храниться при −20 °C.
Перед использованием раствору дают согреться до температуры окружающей среды как минимум в
течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ Аценафтилен не является флуоресцентным и поэтому не может быть определен этими
методами.
5.14 Исходный стандартный раствор, 200 нг/мл (200 мкг/л).
Add 100 µl of standard solution (5.13) with a 250 µl syringe (6.11) to a 50 ml volumetric flask (6.20) and dilute
to the mark with acetonitrile.
5.15 Рабочий стандартный раствор, 50 ng/ml (50 µg/l).
Добавляют 100 мкл стандартного раствора (5.13) 250-мкл шприцем (6.11) в 50-мл мерную колбу (6.20)
и разбавляют до метки ацетонитрилом.
3)
5.16 Картриджи со связанной фазой C18 , фаза 2 г, емкость 12 мл.
3)
5.17 Картриджи со связанной фазой флоризила , фаза 500 мг, емкость 3 мл.
5.18 Струя азота, регулируемое давление при 34,5 кПа (5 фунтов на кв. дюйм, около 1,5 л/мин).
6 Аппаратура
Обычная лабораторная аппаратура и, в частности, следующая.
Использование одноразовых стеклянных пробирок приемлемо. Общепринятым должно быть
использование стекла, так как пластмасса может содержать PAHs.
−1
6.1 Центрифуга, со скоростью как минимум 4 000 мин , подходящая для пробирок емкостью 100 мл
и 10 мл.
2) Этот продукт может быть получен, например, от фирмы, Promochem.
3) Этот продукт может быть получен, например, от фирмы, Varian.
Эта информация дается только для удобства пользователей настоящего международного стандарта и не
является рекомендацией ISO для этих продуктов. Можно использовать аналогичные продукты, если показано, что
они дают такие же результаты.
© ISO 2006 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
6.2 Система HPLC с бинарным градиентным элюированием, с резервуаром для растворителя
емкостью 1 л, фильтром с прокладкой для подвижной фазы, насосом, автосамплером, регулированием
температуры колонки при 25 °C, флуоресцентным детектором, программируемым со временем на
различные длины волн возбуждения и испускания, и автоматизированным сбором и обработкой
данных.
4)
6.3 Колонка с обращенной фазой C18 , длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, частицами
размером 5 мкм, подходящая для анализа PAH.
6.4 Вихревая мешалка.
5)
6.5 Автоматический выпарной аппарат , для 10-мл пробирки (необязательной) или водяная баня (6.6).
Рекомендованные рабочие условия:
⎯ температура водяной бани 35 °C;
⎯ давление азота 34,5 кПа.
6.6 Водяная баня, регулируемая при 35 °C.
6.7 Весы, возможность считывания до 0,1 мг.
6.8 Центрифужные пробирки, емкостью 100 мл (одна на образец).
6.9 Конические центрифужные пробирки, емкостью 11 мл (три на образец), с мембранами из
политетрафторэтилена (PTFE) и закрытые сверху завинчивающимися крышками (одна на образец).
6.10 Мерные цилиндры.
6.11 Микрошприц, 250 мкл.
6.12 Шприц, 1 000 мкл.
6.13 Мерная пипетка, 5 мл.
6.14 Шприц, 5 мл, оснащенный адаптерной крышкой для картриджей для твердофазной экстракции
(SPE).
6.15 Ампулы для автосамплера.
6.16 Микроампулы, емкостью 250 мкл, приспособленные для системы HPLC.
6.17 Ультразвуковая ванна, с температурой воды не выше 40 °C.
6.18 Пипетки Пастера, с ватой в верхней части для предотвращения загрязнения.
6)
6.19 Устройство, состоящее из штатива и пинцетов , для удерживания картриджев для SPE или,
если имеется, автоматизированное рабочее место для SPE.
ПРИМЕЧАНИЕ В зависимости от используемого рабочего места для SPE, для предлагаемых методов
экстракции могут потребоваться незначительные адаптации (время, давление, объемы).
6.20 Мерная колба, емкостью 50 мл.
4) Этот продукт может быть получен, например. от фирмы Vydac, ref. 201TP54.
5) Этот продукт может быть получен, например, от фирмы Zymark, испаритель Zymark TurboVap LV.
6) Этот продукт может быть получен, например, от фирмы Zymark, Zymark Rapid Trace.
Эта информация дается только для удобства пользователей настоящего международного стандарта и не
является рекомендацией ISO для этих продуктов. Можно использовать аналогичные продукты, если показано, что
они дают такие же результаты.
4 © ISO 2006 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
7 Отбор проб
В лабораторию должна быть отправлена представительная проба. Ее следует оберегать от
повреждений или изменений во время транспортировки или хранения.
Отбор проб не является частью метода, установленного в этом международном стандарте.
Рекомендованный метод отбора проб дан в ISO 5555.
8 Приготовление образцов
Образцы для испытаний приготовляют согласно методу, данному в ISO 661. Перед приготовлением
образцов жидкие пробы должны быть при комнатной температуре и их гомогенизируют путем
магнитного перемешивания.
Образцы из твердой матрицы приготовляют путем расплавления всей пробы или путем расплавления
и гомогенизации нескольких кернов.
9 Процедура для определения содержания PAHs в жирах и маслах: Общий
метод
9.1 Предварительные замечания
Для того чтобы получить повторяемые результаты, температура окружающей среды в лаборатории
должна регулироваться (u 20 °C). Это является очень важным условием для экстракции PAHs из
кокосового масла (или растительных масел, содержащих короткоцепочечные жирные кислоты). Эти
масла содержат жирные кислоты с короткими и длинными цепочками; когда температура окружающей
среды выше 20 °C, растворимость короткоцепочечных жирных кислот увеличивается.
Перед использованием весь сосуд промывают три раза гексаном (5.2).
Каждая последовательность образцов должна включать холостой раствор (9.2) и стандартный раствор,
экстрагированные при тех же условиях, что и образец, для того чтобы вычислить значения
восстановления экстракции (9.3). Значения восстановления должны быть в пределах от 70 % до 110 %.
Средние значения восстановления приведены в Таблице A.1.
Для количественного анализа два испытуемых образца экстрагируют и анализируют отдельно, и
окончательный результат является средним значением результатов для этих двух образцов.
Невозможно провести полный анализ за один день. Экстракты образцов должны храниться ночью в
условиях глубокого охлаждения как минимум при −18 °C:
-й
⎯ 1 день: шаг 1, шаг 2 и шаг 3, вплоть до очистки на картридже C18 (см. Рисунок A.1).
-й
⎯ 2 день: шаг 3, очистка на картридже с флоризилом и подготовка системы HPLC для анализа
образцов (см. Рисунок A.1).
⎯ следующие ночи и день(дни): анализ образцов (см. Таблицу A.2).
9.2 Холостое испытание
Чтобы обеспечить отсутствие загрязнения растворителей и картриджей, процедуру очистки (согласно
9.5, 9.6 и Разделу 11) сначала проводят на холостом образце (образец со смесью растворителей, но
без масла). Полученная хроматограмма должна быть свободна от рассматриваемых соединений. Если
хроматограмма содержит интерференции, источник интерференций должен быть определен и
исключен. Значения для холостого раствора нельзя использовать для корректировки значений для
образца, так как значения для холостого раствора обычно неоднородны (повторяемость).
© ISO 2006 – Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
9.3 Определение значений восстановления (без матрицы)
Для того чтобы проверить экстракционную эффективность картриджей, проводят испытание со
стандартным раствором. Инжектируют в 1 750 мкл смеси растворителей 1 (5.9) 250 мкл рабочего
стандартного раствора (5.15) 250-мкл шприцем (6.11). Переводят в картридж C18 и обрабатывают, как
описано в 9.5, 9.6 и Разделе 11).
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — При удалении растворителей под струей азота (см. 9.5.6) следует не
выпаривать досуха, но оставлять около 50 мкл в ампуле, иначе летучие PAHs будут потеряны.
9.4 Экстракция (жидкостно-жидкостная экстракция)
9.4.1 Блок-схема процедуры разделения дана на Рисунке A.1.
9.4.2 Отвешивают, с точностью до 1 мг, около 2,5 г образца в 100-мл центробежную пробирку (6.8).
Добавляют 10 мл смеси растворителей 1 (5.9).
9.4.3 Встряхивают центробежную пробирку в течение 30 с помощью вихревой мешалки (средняя
скорость) и затем помещают эту пробирку в ультразвуковую ванну (6.17) на 5 мин.
−1
9.4.4 Центрифугируют 5 мин со скоростью 4 000 мин .
9.4.5 Тщательно удаляют верхний слой пипеткой Пастера (6.18) и помещают его во взвешенную
коническую пробирку (6.9).
9.4.6 Выпаривают растворитель из конической пробирки в течение от 30 мин до 40 мин под струей
азота (5.18), используя или водяную баню при 35 °C (6.6) или автоматический выпарной аппарат (6.5).
9.4.7 Повторяют экстракцию дважды со следующей 10-мл смесью растворителей 1 (5.9).
Концентрируют экстракты в одной и той же конической пробирке под струей азота (5.18), используя
водяную баню при 35 °C (6.6) или автоматический выпарной аппарат (6.5). Остаток жира должен быть
от 200 мг до 800 мг.
Если масса жирового остатка выше 800 мг, тогда общий метод (пункт 9) не годится и нужно
использовать метод, специально предназначенный для кокосового масла (Раздел 10).
9.5 Очистка на картридже со связанной фазой C18 (твердо-жидкостная экстракция)
9.5.1 Кондиционирование картриджа: Помещают картридж (5.16) на штатив (6.19). Промывают
картридж 2 объемами по 12 мл метанола (5.1), затем 2 объемами по 12 мл ацетонитрила (5.3). Дают
растворителю течь при атмосферном давлении.
9.5.2 Помещают взвешенную коническую пробирку (6.9) под картридж (5.16).
9.5.3 Шприцем (6.12) или мерной пипеткой (6.13) вводят 2 мл смеси растворителей 1 (5.9) в
коническую пробирку, содержащую остаточный жировой материал (9.4.6). Встряхивают пробирку с
помощью вихревой мешалки (6.4) в течение 15 с. Центрифугируют 30 с. Переносят верхний слой в
картридж (5.16) пипеткой Пастера (6.18). Повторяют операцию дважды (2 мл of смеси растворителей 1,
смешивание, центрифугирование и перенос на картридж). Собирают растворитель, элюирующий из
картриджа, вместе с применяемым элюентом.
9.5.4 Добавляют 5 мл смеси растворителей 1 (5.9) в верхнюю часть картриджа (5.16) и дают
элюированию продолжаться при атмосферном давлении.
9.5.5 Используя шприц (6.14), вводят воздух в картридж, чтобы элюировать оставшийся
растворитель и любые PAHs, которые могли остаться в этой фазе.
6 © ISO 2006 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
9.5.6 Удаляют растворители под струей азота (5.18), используя водяную баню, установленную на
35 °C, (6.6) или автоматический выпарной аппарат (6.5). Жировой остаток не должен превышать 50 мг.
9.5.7 Остаток разбавляют в 1 мл гексана (5.2), отмеряемого шприцем (6.12). Герметично закрывают
коническую пробирку и хранят при −18 °C до дальнейшего использования.
9.6 Очистка на картридже со связанной фазой флоризила (твердо-жидкостная
экстракция)
9.6.1 Дают экстракту (9.5.7) нагреться до температуры окружающей среды в течение 1 ч.
9.6.2 Кондиционирование картриджа: Помещают картридж (5.17) на штатив (6.19). Промывают
картридж 5 объемами дихлорметана (5.5) по 3 мл каждый, затем 4 объемами гексана (5.2) по 3 мл
каждый.
9.6.3 Помещают взвешенную коническую пробирку (6.9) под картридж (5.17).
9.6.4 Переносят экстракт (9.5.7) в картридж (5.17) пипеткой Пастера (6.18).
9.6.5 Вводят 1 мл смеси растворителей 3 (5.11) с помощью шприца (6.12) или мерной пипетки (6.13),
в коническую пробирку, содержащую экстракт. Встряхивают ее в течение 15 с помощью вихревой
мешалки и переносят на картридж (5.17). Промывают пробирку смесью растворителей 3 с отношением
растворителей 2 х 2 мл (5.11) и переносят ее на картридж. Собирают растворитель, элюирующий из
картриджа, вместе с применяемым элюентом.
Нужно внимательно следить, чтобы избежать контакта между пипеткой и конической пробиркой для
предотвращения поперечного загрязнения.
9.6.6 Элюируют 4 мл смеси растворителей 3 (5.11) через картридж (5.17). Шприцем (6.14),
инжектируют воздух в картридж для элюирования оставшегося растворителя.
9.6.7 9.6.7 Концентрируют раствор под струей азота (5.18), используя водяную баню, установленную
на 35 °C (6.6), или автоматический выпарной аппарат (6.5), приблизительно до 1 мл (от 10 мин до
15 мин). Добавляют около 0,5 мл толуола (5.6) (противоокислитель) и продолжают выпаривание, пока
не останется около 50 мкл.
Растворитель не следует удалять полностью.
9.6.8 Точный объем определяют путем взвешивания конической пробирки и вычисления с
использованием плотности толуола. Добавляют необходимый объем растворителя [MeOH/THF (5.12),
или ацетонитрила (5.3)], V , для получения 250 мкл:
add
m
V =−250
add
d
где
m масса образца, в миллиграммах;
3
d плотность толуола (0,866 9 кг/м ).
9.6.9 Переносят образец в микроампулу (6.16), помещенную в ампулу (6.15).
10 Процедура для определения PAHs в жирах и маслах: Метод, специально
предназначенный для кокосового масла
10.1 Первая экстракция (жидкостно-жидкостная экстракция)
10.1.1 Блок-схема процедуры разделения дана на Рисунке A.2.
© ISO 2006 – Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 15753:2006(R)
10.1.2 Отвешивают, с точностью до 1 мг, около 2 г образца в 100-мл центробежную пробирку (6.8).
Добавляют 10 мл смеси растворителей 1 (5.9).
10.1.3 Встряхивают центробежную пробирку в течение 30 с помощью вихревой мешалки (средняя
скорость) и затем помещают эту пробирку в ультразвуковую ванну (6.17) на 5 мин.
−1
10.1.4 Центрифугируют 5 мин со скоростью 4 000 мин .
10.1.5 Тщательно удаляют верхний слой пипеткой Пастера (6.18) и помещают его во взвешенную
коническую пробирку (6.9).
10.1.6 Выпаривают растворитель из конической пробирки в течение от 30 мин до 40 мин под струей
азота (5.18), используя или водяную баню при 35 °C (6.6) или автоматический выпарной аппарат (6.5).
10.1.7 Повторяют экстракцию дважды, со следующей 10-мл смесью растворителей 1 (5.9).
Концентрируют экстракты в одной и той же конической пробирке под струей азота (5.18), используя
водяную баню при 35 °C (6.6) или автоматический выпарной аппарат (6.5).
10.2 Вторая экстракция (жидкостно-жидкостная экстракция)
10.2.1 Шприцем (6.12) или мерной пипеткой (6.13) вводят 2 мл смеси растворителей 1 (5.9) в
коническую пробирку, содержащую остаточный жировой материал (10.1.7). Встряхивают пробирку с
помощью вихревой мешалки в течение 15 с. Центрифугируют 30 с. Делят экстракт на две равные части
в две взвешенные конические пробирки (6.9).
Нужно стараться избегать контакта между пипеткой и конической пробиркой для предотвращения
поперечного загрязнения.
10.2.2 Повторяют дважды процедуру, описанную в 10.2.1, используя одни и те же конические
пробирки.
10.2.3 Концентрируют два экстракта под струей азота (5.18), используя водяную баню при 35 °C (6.6)
или автоматический выпарной аппарат (6.5). Каждый остаток жира должен быть около 250 мг.
10.3 Очистка на картридже со связанной фазой С18 (твердо-жидкостная экстракция)
10.3.1 Кондиционирование картриджа: Помещают два картриджа (5.16) на штатив (6.19). Промывают
картриджи 2 объемами по 12 мл метанола (5.1), затем 2 объемами по 12 мл ацетонитрила (5.3). Дают
растворителю течь при атмосферном давлении.
10.3.2 Помещают взвешенную коническую пробирку (6.9) под каждый картридж (5.16).
10.3.3 Шприцем (6.12) или мерной пипеткой (6.13) вводят 2 мл смеси растворителей 2 (5.10) в две
конические пробирки, содержащие
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15753
First edition
2006-09-01
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of polycyclic aromatic
hydrocarbons
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des
hydrocarbures aromatiques polycycliques
Reference number
ISO 15753:2006(E)
©
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2006
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Reagents and materials . 2
6 Apparatus. 3
7 Sampling. 4
8 Sample preparation. 5
9 Procedure for determination of PAHs from fats and oils: General method . 5
9.1 Preliminary remarks. 5
9.2 Blank. 5
9.3 Determination of recovery values (without matrix) . 5
9.4 Extraction (liquid/liquid extraction) . 6
9.5 Purification on C18-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction). 6
9.6 Purification on Florisil-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction). 6
10 Procedure for determination of PAHs from fats and oils: Method specific for coconut oil . 7
10.1 First extraction (liquid/liquid extraction). 7
10.2 Second extraction (liquid/liquid extraction). 8
10.3 Purification on C18-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction). 8
10.4 Purification on Florisil-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction). 8
11 High-performance liquid chromatography (HPLC) . 9
11.1 Operating conditions. 9
11.2 Detection parameters . 10
11.3 Analysis of samples and standards. 11
11.4 Confirmation of the presence of PAHs. 12
12 Expression of results. 12
13 Precision. 12
13.1 Interlaboratory test . 12
13.2 Repeatability. 13
13.3 Reproducibility. 13
14 Test report. 13
Annex A (informative) Recovery values, flow charts, chromatograms and injection sequences . 14
Annex B (informative) Results of the interlaboratory test . 19
Bibliography . 22
© ISO 2006 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 15753 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
iv © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 15753:2006(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
polycyclic aromatic hydrocarbons
1 Scope
This International Standard describes two methods for the determination of 15 polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAHs) in animal and vegetable fats and oils:
⎯ a general method, and
⎯ a method specific for coconut oil and vegetable oils with short-chain fatty acids.
These methods are not quantitative for the very volatile compounds such as naphthalene, acenaphthene and
fluorene. Due to interferences provided by the matrix itself, palm oil and olive pomace oil cannot be analysed
using this method.
The quantification limit is 0,2 µg/kg for almost all compounds analysed, except for fluoranthene and
benzo(g,h,i)perylene where the quantification limit is 0,3 µg/kg, and indeno(1,2,3-c,d)pyrene where the
quantification limit is 1 µg/kg.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
polycyclic aromatic hydrocarbon
PAH
compound that contains two or more condensed (fused) aromatic hydrocarbon rings and the content of which
can be determined according to the method specified in this International Standard
NOTE 1 The content is given in micrograms per kilogram.
NOTE 2 In general PAHs are divided into light PAHs with two to four aromatic rings, and heavy PAHs with five or more
aromatic rings.
EXAMPLES
Light PAHs include:
naphthalene (CAS RN [91-20-3]), acenaphthene (CAS RN [83-32-9]), acenaphthylene (CAS RN [208-96-8]), fluorene
(CAS RN [86-73-7]), anthracene (CAS RN [120-12-7]), phenanthrene (CAS RN [85-01-8]), fluoranthene (CAS RN [206-44-0]),
chrysene (CAS RN [218-01-9]), benz(a)anthracene (CAS RN [56-55-3]), pyrene (CAS RN [129-00-0]).
© ISO 2006 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
Heavy PAHs include:
benzo(a)pyrene (CAS RN [50-32-8]), benzo(b)fluoranthene (CAS RN [205-99-2]), benzo(k)fluoranthene
(CAS RN [207-08-9]), benzo(g,h,i)perylene (CAS RN [191-24-2]), dibenz(a,h)anthracene (CAS RN [53-70-3]),
indeno(1,2,3-c,d)pyrene (CAS RN [193-39-5]).
4 Principle
The polycyclic aromatic hydrocarbons are extracted with an acetonitrile/acetone mixture followed by
purification on C18 reversed-phase and then Florisil bonded-phase cartridges. Determination of the content of
the individual polycyclic aromatic hydrocarbons after separation is achieved by means of high-pressure liquid
chromatography (HPLC) and by measuring the fluorescence at various excitation and emission wavelengths.
5 Reagents and materials
WARNING — Attention is drawn to the regulations governing the handling of dangerous matter.
Technical, organizational and personal safety measures must be followed.
Use only reagents of recognized analytical grade unless otherwise stated.
Check the quality of solvents before use by concentrating the solvent about 1 000 times by evaporation and
analysing the concentrate by HPLC (300 ml to 300 µl). The chromatogram shall be free from peaks in the
elution area of PAHs.
1)
5.1 Methanol, ‘ultra resi-analysed’ grade .
1)
5.2 Hexane, HPLC grade .
1)
5.3 Acetonitrile, HPLC grade .
1)
5.4 Acetone, HPLC grade .
1)
5.5 Dichloromethane, HPLC grade .
1)
5.6 Toluene, HPLC grade .
1)
5.7 Water, HPLC grade .
1)
5.8 Tetrahydrofuran, HPLC grade .
5.9 Solvent mixture 1: acetonitrile/acetone (volume fraction 60 % / 40 %).
Quantity used per sample: 41 ml for general method, 36 ml for method specific for coconut oil.
5.10 Solvent mixture 2: acetonitrile/acetone (volume fraction 80 % / 20 %).
Quantity used per sample: 2 × 11 ml for method specific for coconut oil.
5.11 Solvent mixture 3: hexane/dichloromethane (volume fraction 75 % / 25 %).
Quantity used per sample: 7 ml for general method, 2 × 7 ml for method specific for coconut oil.
1) These can be obtained from, for example, Baker.
This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an
endorsement by ISO of these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
2 © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
5.12 Mixture of tetrahydrofuran/methanol (volume fraction 50 % / 50 %).
2)
5.13 Standard solution with 16 certified EPA Priority PAHs in toluene , at a concentration of 100 µg/ml
(100 mg/l): naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, fluorene, phenanthrene, anthracene, fluoranthene,
pyrene, benz(a)anthracene, chrysene, benzo(b)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene, benzo(a)pyrene,
dibenz(a,h)anthracene, benzo(g,h,i)perylene, indeno(1,2,3-c,d)pyrene. To be stored at −20 °C.
Before use, allow the solution to warm up to ambient temperature for at least 1 h.
NOTE Acenaphthylene is not fluorescent and, thus, it cannot be determined by these methods.
5.14 Stock standard solution, 200 ng/ml (200 µg/l).
Add 100 µl of standard solution (5.13) with a 250 µl syringe (6.11) to a 50 ml volumetric flask (6.20) and dilute
to the mark with acetonitrile.
5.15 Working standard solution, 50 ng/ml (50 µg/l).
Add 250 µl of stock standard solution (5.14) with a 250 µl syringe (6.11) to 750 µl of THF/methanol mixture
(5.12) or acetonitrile (5.3).
3)
5.16 C18 bonded-phase cartridges , 2 g phase, 12 ml capacity.
3)
5.17 Florisil bonded-phase cartridges , 500 mg phase, 3 ml capacity.
5.18 Stream of nitrogen, pressure regulated at 34,5 kPa (5 psi, about 1,5 l/min).
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
The use of disposable glass tubes is acceptable. The general use of glass is necessary as plastics can
contain PAHs.
−1
6.1 Centrifuge, capable of attaining at least 4 000 min , suitable for 100 ml and 10 ml tubes.
6.2 HPLC system with binary gradient elution, with solvent reservoir of 1 l capacity, a mobile phase liner
filter, pump, autosampler, column temperature regulation set at 25 °C, fluorescence detector programmable
over time for various excitation and emission wavelengths, and computer-assisted acquisition and data
treatment.
4)
6.3 C18 reversed-phase column , 250 mm in length, 4,6 mm internal diameter, 5 µm particles, suitable
for PAH analysis.
6.4 Vortex mixer.
5)
6.5 Automatic evaporator , for 10 ml tube (optional), or water bath (6.6).
2) This can be obtained from, for example, Promochem.
3) This can be obtained from, for example, Varian.
This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an
endorsement by ISO of these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
4) This can be obtained from, for example, Vydac, ref. 201TP54.
5) This can be obtained from, for example, Zymark, Zymark TurboVap LV evaporator.
© ISO 2006 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
Recommended operating conditions:
⎯ temperature of water bath 35 °C;
⎯ nitrogen pressure 34,5 kPa.
6.6 Water bath, regulated at 35 °C.
6.7 Balance, with readability of 0,1 mg.
6.8 Centrifuge tubes, of 100 ml capacity (one per sample).
6.9 Conical centrifuge tubes, of 11 ml capacity (three per sample), with PTFE septa and closed top screw
caps (one per sample).
6.10 Graduated cylinders.
6.11 Microsyringe, 250 µl.
6.12 Syringe, 1 000 µl.
6.13 Graduated pipette, 5 ml.
6.14 Syringe, 5 ml, equipped with an adapter cap for SPE cartridges.
6.15 Vials for autosampler.
6.16 Microvials, of 250 µl capacity, adapted for HPLC system.
6.17 Ultrasonic bath, with water temperature not higher than 40 °C.
6.18 Pasteur pipettes, with cotton wool in the top part to prevent contamination.
6)
6.19 Device composed of stand and pincers , to hold SPE cartridges or, if available, an automatic SPE
work station.
NOTE Depending on the SPE sample processing station used, the proposed extraction methods may require slight
adaptations (times, pressure, volumes).
6.20 Volumetric flask, of capacity 50 ml.
7 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
is given in ISO 5555.
6) This can be obtained from, for example, Zymark, Zymark Rapid Trace.
This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an
endorsement by ISO of these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
4 © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
8 Sample preparation
Prepare the test sample in accordance with the method given in ISO 661. Before sampling, the liquid samples
shall be at room temperature and homogenized by magnetic agitation.
Sample the solid matrix by melting the entire sample or by melting and homogenizing several core samples.
9 Procedure for determination of PAHs from fats and oils: General method
9.1 Preliminary remarks
In order to obtain repeatable results, the ambient temperature of the laboratory shall be regulated (u 20 °C).
This is a very important condition for the extraction of PAHs from coconut oil (or vegetable oils containing
short-chain fatty acids). These oils contain fatty acids with short and long chains; when the ambient
temperature is higher than 20 °C, the solubility of short-chain fatty acids increases.
Before use, rinse the whole vessel three times with hexane (5.2).
Each sequence of samples shall include a blank (9.2), and a standard solution extracted under the same
conditions as the sample in order to calculate the recovery values of the extraction (9.3). The recovery values
shall be within the range 70 % to 110 %. The mean recovery values are given in Table A.1.
For a quantitative analysis, two test portions shall be extracted and analysed separately, the final result being
the mean value of the results of these two subsamples.
It is not possible to complete the entire analysis within a single day. Sample extracts shall be stored overnight
under deep-freeze conditions of at least −18 °C:
st
⎯ 1 day: step 1, step 2 and step 3, up to purification on C18 cartridge (see Figure A.1).
nd
⎯ 2 day: step 3, purification on Florisil cartridge and preparation of HPLC system for sample analysis (see
Figure A.1).
⎯ following night and day(s): analysis of the samples (see Table A.2).
9.2 Blank
To ensure the absence of contamination of solvents and cartridges, the purification procedure (according to
9.5, 9.6 and Clause 11) shall first be carried out on a blank sample (sample with solvent mixture but with the
oil omitted). The chromatogram obtained shall be free from the compounds of interest. If the chromatogram
contains interferences, the source of interferences shall be determined and eliminated. Blank values cannot
be used to correct sample values as blank values are generally not homogenous (repeatability).
9.3 Determination of recovery values (without matrix)
In order to verify the extraction efficiency of cartridges, carry out a test with a standard solution. Spike 1 750 µl
of solvent mixture 1 (5.9) with 250 µl of working standard solution (5.15) with a 250 µl syringe (6.11). Transfer
to a C18 cartridge and treat as described in 9.5, 9.6 and Clause 11).
WARNING — When removing solvents under a stream of nitrogen (see 9.5.6), do not evaporate to
dryness but leave about 50 µl in the vial, otherwise volatile PAHs will be lost.
© ISO 2006 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
9.4 Extraction (liquid/liquid extraction)
9.4.1 The flow chart of the isolation procedure is given in Figure A.1.
9.4.2 Weigh, to the nearest 1 mg, about 2,5 g of the sample into a 100 ml centrifuge tube (6.8). Add 10 ml
of solvent mixture 1 (5.9).
9.4.3 Agitate the centrifuge tube for 30 s with the vortex mixer (half speed), and then put the tube in an
ultrasonic bath (6.17) for 5 min.
−1
9.4.4 Centrifuge for 5 min at 4 000 min .
9.4.5 Carefully remove the top layer with a Pasteur pipette (6.18) and transfer it to a weighed conical tube
(6.9).
9.4.6 Evaporate the solvent from the conical tube for 30 min to 40 min, under a stream of nitrogen (5.18),
using either a water bath at 35 °C (6.6) or an automatic evaporator (6.5).
9.4.7 Repeat the extraction twice with a further 10 ml of solvent mixture 1 (5.9). Concentrate the extracts in
the same conical tube under a stream of nitrogen (5.18) using water bath set at 35 °C (6.6) or using an
automatic evaporator (6.5). The fat residue should be about 200 mg to 800 mg.
If the fat residue mass is higher than 800 mg, then the general method (Clause 9) is not suitable and the
method specific for coconut oil should be used (Clause 10).
9.5 Purification on C18-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction)
9.5.1 Cartridge conditioning: Put the cartridge (5.16) on a stand (6.19). Rinse the cartridge with 2 volumes
of 12 ml of methanol (5.1) then 2 volumes of 12 ml of acetonitrile (5.3). Allow the solvent to flow through under
atmospheric pressure.
9.5.2 Put a weighed conical tube (6.9) under the cartridge (5.16).
9.5.3 With a syringe (6.12) or a graduated pipette (6.13), introduce 2 ml of solvent mixture 1 (5.9) into the
conical tube containing residual fat material (9.4.6). Agitate the tube with the vortex mixer (6.4) for 15 s.
Centrifuge for 30 s. Transfer the top layer to the cartridge (5.16) with a Pasteur pipette (6.18). Repeat the
operation twice (2 ml of solvent mixture 1, mixing, centrifuging and transferring onto the cartridge). Collect the
solvent eluting from the cartridge together with the elution solvent.
9.5.4 Add 5 ml of solvent mixture 1 (5.9) to the top of the cartridge (5.16) and allow the elution to proceed
under atmospheric pressure.
9.5.5 Using a syringe (6.14), inject air into the cartridge in order to elute the remaining solvent and any
PAHs which could be retained in the phase.
9.5.6 Remove solvents under a stream of nitrogen (5.18) using a water bath set at 35 °C (6.6) or an
automatic evaporator (6.5). The fat residue should be not more than 50 mg.
9.5.7 Dilute the residue in 1 ml of hexane (5.2), measured with a syringe (6.12). Close the conical tube
hermetically and store at −18 °C until further use.
9.6 Purification on Florisil-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction)
9.6.1 Allow the extract (9.5.7) to warm up to ambient temperature for at least 1 h.
9.6.2 Cartridge conditioning: Put the cartridge (5.17) on a stand (6.19). Rinse the cartridge with 5 volumes
of 3 ml of dichloromethane (5.5) then 4 volumes of 3 ml of hexane (5.2).
6 © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
9.6.3 Put a weighed conical tube (6.9) under the cartridge (5.17).
9.6.4 Transfer the extract (9.5.7) to the cartridge (5.17) with a Pasteur pipette (6.18).
9.6.5 Introduce 1 ml of solvent mixture 3 (5.11), using a syringe (6.12) or a graduated pipette (6.13), to the
conical tube containing the extract. Agitate it for 15 s with the vortex mixer and transfer it to the
cartridge (5.17). Rinse the tube with 2 × 2 ml of solvent mixture 3 (5.11) and transfer it onto the cartridge.
Collect the solvent eluting from the cartridge together with the elution solvent.
Pay careful attention to avoid contact between the pipette and the conical tube in order to prevent cross
contamination.
9.6.6 Elute 4 ml of solvent mixture 3 (5.11) through the cartridge (5.17). Using a syringe (6.14), inject air
into the cartridge in order to elute the remaining solvent.
9.6.7 Concentrate the solution under a stream of nitrogen (5.18), using a water bath set at 35 °C (6.6) or an
automatic evaporator (6.5), to about 1 ml (takes 10 min to 15 min). Add about 0,5 ml of toluene (5.6) (keeper)
and continue to evaporate until about 50 µl remain.
The solvent should not be removed completely.
9.6.8 The exact volume is determined by weighing the conical tube, and calculating using the density of
toluene. Add the necessary volume of solvent [MeOH/THF (5.12), or acetonitrile (5.3)], V , to make up to
add
250 µl:
m
V =−250
add
d
where
m is the sample mass, in milligrams;
3
d is the density of toluene (0,866 9 kg/m ).
9.6.9 Transfer the sample to a microvial (6.16) placed in a vial (6.15).
10 Procedure for determination of PAHs from fats and oils: Method specific for
coconut oil
10.1 First extraction (liquid/liquid extraction)
10.1.1 The flow chart of the isolation procedure is given in Figure A.2.
10.1.2 Weigh, to the nearest 1 mg, about 2 g of the sample into a 100 ml centrifuge tube (6.8). Add 10 ml of
solvent mixture 1 (5.9).
10.1.3 Agitate the centrifuge tube for 30 s with the vortex mixer (half speed), and then put the tube in an
ultrasonic bath (6.17) for 5 min.
−1
10.1.4 Centrifuge for 5 min at 4 000 min .
10.1.5 Carefully remove the top layer with a Pasteur pipette (6.18) and introduce it into a conical tube (6.9).
10.1.6 Evaporate the solvent from the conical tube for 30 min to 40 min under a stream of nitrogen (5.18)
using the water bath set at 35 °C (6.6) or an automatic evaporator (6.5).
© ISO 2006 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 15753:2006(E)
10.1.7 Repeat the extraction twice, with a further 10 ml of solvent mixture 1 (5.9). Concentrate the extracts in
the same conical tube under a stream of nitrogen (5.18) using water bath set at 35 °C (6.6) or an automatic
evaporator (6.5).
10.2 Second extraction (liquid/liquid extraction)
10.2.1 With a syringe (6.12) or a graduated pipette (6.13), introduce 2 ml of solvent mixture 1 (5.9) to the
conical tube containing residual fat material (10.1.7). Agitate the tube with the vortex mixer for 15 s. Centrifuge
for 30 s. Divide the extract into two equal parts in two weighed conical tubes (6.9).
Pay careful attention to avoid contact between the pipette and the conical tube in order to prevent cross
contamination.
10.2.2 Repeat twice the procedure detailed in 10.2.1 using the same conical tubes.
10.2.3 Concentrate the two extracts under a stream of nitrogen (5.18) using the water bath set at 35 °C (6.6)
or an automatic evaporator (6.5). Each fat residue should be about 250 mg.
10.3 Purification on C18-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction)
10.3.1 Cartridge conditioning: Put two cartridges (5.16) on a stand (6.19). Rinse the cartridges with
2 volumes of 12 ml of methanol (5.1) then 2 volumes of 12 ml of acetonitrile (5.3). Allow the solvent to flow
under atmospheric pressure.
10.3.2 Put a weighed conical tube (6.9) under each cartridge (5.16).
10.3.3 With a syringe (6.12) or a graduated pipette (6.13), introduce 2 ml of solvent mixture 2 (5.10) to the
two conical tubes containing the residual fat material (10.2.3). Agitate the tubes with the vortex mixer for 15 s.
Transfer the whole extract of each conical tube to each cartridge (5.16) with a Pasteur pipette (6.18). Rinse
the tube with 2 × 2 ml of solvent mixture 2 (5.10) and transfer it onto the cartridge. Collect the solvent eluting
from the cartridge together with the elution solvent.
10.3.4 Elute 5 ml of solvent mixture 2 (5.10) through the cartridges (do not inject air on the cartridges).
10.3.5 Remove solvents under a stream of nitrogen (5.18) using the water bath set at 35 °C (6.6) or an
automatic evaporator (6.5). The fat residue should be about 50 mg to 100 mg.
10.3.6 Dilute the residues in 1 ml of hexane (5.2), measured with a syringe (6.12). Close the conical tube
hermetically and store at −18 °C until the following day.
10.4 Purification on Florisil-bonded phase cartridge (solid/liquid extraction)
10.4.1 Allow the extracts (10.3.6) to warm up to ambient temperature for at least 1 h.
10.4.2 Cartridge conditioning: Put two cartridges (5.17) on a stand (6.19). Rinse the cartridges with
5 volumes of 3 ml of dichloromethane (5.5) then 4 volumes of 3 ml of hexane (5.2).
10.4.3 Put a weighed conical tube (6.9) under each cartridge (5.17).
10.4.4 Transfer each extract (10.3.6) to each cartridge (5.17) with a Pasteur pipette (6.18).
10.4.5 Introduce 1 ml of solvent mixture 3 (5.11), using a syringe (6.12) or graduated pipette (6.13), to each
extract tube. Agitate it for 15 s with the vortex mixer and transfer to the cartridge (5.17). Rinse the tube with
2 × 2 ml of solvent mixture 3 (5.11) and transfer it onto the cartridge. Collect the solvent eluting from the
cartridge together with the elution solvent.
10.4.6 Elute 4 ml of s
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15753
Première édition
2006-09-01
Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination des
hydrocarbures aromatiques
polycycliques
Animal and vegetable fats and oils — Determination of polycyclic
aromatic hydrocarbons
Numéro de référence
ISO 15753:2006(F)
©
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
© ISO 2006
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 2
5 Réactifs et matériaux. 2
6 Appareillage. 3
7 Échantillonnage . 5
8 Préparation de l'échantillon. 5
9 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras: Méthode
générale . 5
9.1 Remarques préliminaires. 5
9.2 Essai à blanc . 5
9.3 Détermination des valeurs des taux de récupération (sans matrice). 6
9.4 Extraction (extraction liquide/liquide) . 6
9.5 Purification sur des cartouches de phase greffée en C18 (extraction solide/liquide) . 6
9.6 Purification sur des cartouches de phase greffée de Florisil (extraction solide/liquide) . 7
10 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras: Méthode
spécifique pour l'huile de coprah. 7
10.1 Première extraction (extraction liquide/liquide) . 7
10.2 Deuxième extraction (extraction liquide/liquide). 8
10.3 Purification sur des cartouches de phase greffée en C18 (extraction solide/liquide) . 8
10.4 Purification sur des cartouches de phase greffée de Florisil (extraction solide/liquide) . 9
11 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP) . 9
11.1 Conditions de fonctionnement. 9
11.2 Paramètres de détection . 10
11.3 Analyse des échantillons et des étalons. 12
11.4 Confirmation de la présence des HAP. 13
12 Expression des résultats. 13
13 Fidélité. 13
13.1 Essai interlaboratoires. 13
13.2 Répétabilité. 14
13.3 Reproductibilité. 14
14 Rapport d'essai . 14
Annexe A (informative) Valeurs des taux de récupération, schémas fonctionnels,
chromatogrammes et séquences d'injection. 15
Annexe B (informative) Résultats de l'essai interlaboratoires . 20
Bibliographie . 23
© ISO 2006 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 15753 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,
Corps gras d'origines animale et végétale.
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 15753:2006(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des
hydrocarbures aromatiques polycycliques
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit deux méthodes pour la détermination de 15 hydrocarbures
aromatiques polycycliques (HAP) dans les corps gras d'origines animale et végétale:
⎯ une méthode générale, et
⎯ une méthode spécifique pour l'huile de coprah et les huiles végétales avec acides gras à chaînes courtes.
Ces méthodes ne sont pas quantitatives pour les composés très volatils tels que le naphtalène, l'acénaphtène
et le fluorène. En raison des interférences causées par la matrice elle-même, l'huile de palme et l'huile de
grignons d'olive ne peuvent pas être analysées par cette méthode.
La limite de quantification est de 0,2 µg/kg pour la majorité des composés analysés, à l'exception du
fluoranthène et du benzo(g,h,i)pérylène dont la limite de quantification est de 0,3 µg/kg et de l'indéno(1,2,3-
c,d)pyrène dont la limite de quantification est de 1 µg/kg.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 661, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
hydrocarbures aromatiques polycycliques
HAP
composés contenant au moins deux noyaux d’hydrocarbures aromatiques condensés (accolés) et dont la
teneur peut être déterminée à l'aide de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
NOTE 1 La teneur est indiquée en microgrammes par kilogramme.
NOTE 2 On divise, en général, les HAP en HAP légers, avec deux à quatre noyaux aromatiques, et HAP lourds avec
au moins cinq noyaux aromatiques.
EXEMPLE
Les HAP légers incluent: le naphtalène (CAS RN [91-20-3]), l'acénaphtène (CAS RN [83-32-9]), l'acénaphthylène
(CAS RN [208-96-8]), le fluorène (CAS RN [86-73-7]), l'anthracène (CAS RN [120-12-7]), le phénanthrène
(CAS RN [85-01-8]), le fluoranthène (CAS RN [206-44-0]), le chrysène (CAS RN [218-01-9]), le benzo(a)anthracène
(CAS RN [56-55-3]), le pyrène (CAS RN [129-00-0]).
© ISO 2006 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
Les HAP lourds incluent: le benzo(a)pyrène (CAS RN [50-32-8]), le benzo(b)fluoranthène (CAS RN [205-99-2]), le
benzo(k)fluoranthène (CAS RN [207-08-9]), le benzo(g,h,i)pérylène (CAS RN [191-24-2]), le dibenzo(a,h)anthracène
(CAS RN [53-70-3]), l'indéno(1,2,3-c,d)pyrène (CAS RN [193-39-5]).
4 Principe
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont extraits avec un mélange acétonitrile/acétone, puis purifiés
sur des cartouches de phase inversée C18 et, ensuite, sur des cartouches de Florisil. La détermination de la
teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques individuels après séparation est réalisée par le biais de la
chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en mesurant la fluorescence à des longueurs d'onde
d'excitation et d'émission différentes.
5 Réactifs et matériaux
AVERTISSEMENT — L'attention est appelée sur la réglementation régissant la manipulation de
matières dangereuses. Des mesures de sécurité sur le plan technique, organisationnel et personnel
doivent être respectées.
Lors de l'analyse, sauf spécification contraire, utiliser exclusivement des réactifs de qualité analytique
reconnue.
Vérifier la qualité des solvants avant utilisation en concentrant le solvant environ 1 000 fois par évaporation,
puis analyser le concentré par CLHP (300 ml à 300 µl). Le chromatogramme doit être exempt de pics dans la
zone d'élution des HAP.
1)
5.1 Méthanol, qualité «ultra resi-analysed» .
1)
5.2 Hexane, qualité CLHP .
1)
5.3 Acétonitrile, qualité CLHP .
1)
5.4 Acétone, qualité CLHP .
1)
5.5 Dichlorométhane, qualité CLHP .
1)
5.6 Toluène, qualité CLHP .
1)
5.7 Eau, qualité CLHP .
1)
5.8 Tétrahydrofuranne, qualité CLHP .
5.9 Mélange de solvants 1: acétonitrile/acétone (fraction volumique 60 % / 40 %).
Quantité utilisée par échantillon: 41 ml pour la méthode générale, 36 ml pour la méthode spécifique pour
l'huile de coprah.
5.10 Mélange de solvants 2: acétonitrile/acétone (fraction volumique 80 % / 20 %).
Quantité utilisée par échantillon: 2 × 11 ml pour la méthode spécifique pour l'huile de coprah.
1) Ces produits peuvent, par exemple, être obtenus auprès de Baker.
Cette information est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et
ne saurait constituer un engagement de l'ISO à l'égard de ces produits. Il est possible d'utiliser des produits équivalents, à
condition qu'il soit établi qu'ils donnent les mêmes résultats.
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
5.11 Mélange de solvants 3: hexane/dichlorométhane (fraction volumique 75 % / 25 %).
Quantité utilisée par échantillon: 7 ml pour la méthode générale, 2 × 7 ml pour la méthode spécifique pour
l'huile de coprah.
5.12 Mélange de tétrahydrofuranne (THF)/méthanol (MeOH) (fraction volumique 50 % / 50 %).
5.13 Solution étalon avec 16 HAP certifiés prioritaires par l'EPA (Agence de protection de l'environ-
2)
nement) dans le toluène à une concentration de 100 µg/ml (100 mg/l): le naphtalène, l'acénaphthylène,
l'acénaphtène, le fluorène, le phénanthrène, l'anthracène, le fluoranthène, le pyrène, le benzo(a)anthracène,
le chrysène, le benzo(b)fluoranthène, le benzo(k)fluoranthène, le benzo(a)pyrène, le dibenzo(a,h)anthracène,
le benzo(g,h,i)pérylène, l'indéno(1,2,3-c,d)pyrène. À conserver à −20 °C.
Avant emploi, laisser la solution se réchauffer à température ambiante pendant au minimum 1 h.
NOTE L'acénaphthylène n'est pas fluorescent et ne peut donc par être déterminé par ces méthodes.
5.14 Solution mère étalon, à 200 ng/ml (200 µg/l).
Ajouter 100 µl de solution étalon (5.13) avec une seringue de 250 µl (6.11) dans une fiole jaugée de 50 ml
(6.20) et diluer au volume avec de l'acétonitrile.
5.15 Solution étalon de travail, à 50 ng/ml (50 µg/l).
Ajouter 250 µl de solution mère étalon (5.14) avec une seringue de 250 µl (6.11) à 750 µl de mélange
THF/méthanol (5.12) ou d'acétonitrile (5.3).
3)
5.16 Cartouches de phase greffée en C18 : phase 2 g, capacité de 12 ml.
3)
5.17 Cartouches de phase Florisil : phase 500 mg, capacité de 3 ml.
5.18 Flux d'azote: pression contrôlée à 34,5 kPa (5 psi, environ 1,5 l/min).
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, notamment, les éléments suivants.
L'utilisation de tubes jetables en verre est acceptable. L’utilisation généralisée du verre est nécessaire parce
que les plastiques peuvent contenir des HAP.
−1
6.1 Centrifugeuse, tournant au moins à 4 000 min , convenant aux tubes de 100 ml et 10 ml.
6.2 Système de CLHP avec élution de gradient binaire, avec réservoir de solvant d'une capacité de 1 l,
filtre à membrane pour phase mobile, pompe, passeur d'échantillons, régulation de température de colonne
réglée à 25 °C, détecteur fluorimétrique programmable dans le temps pour des longueurs d'onde d'excitation
et d'émission différentes et un système d'acquisition et de traitement des données assisté par ordinateur.
4)
6.3 Colonne de phase inversée C18 , 250 mm de longueur, 4,6 mm de diamètre intérieur, 5 µm de
particules, convenant à l'analyse des HAP.
2) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Promochem.
3) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Varian.
4) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Vydac, réf. 201TP54.
Ces informations sont données par souci de commodité à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale
et ne sauraient constituer un engagement de l'ISO à l'égard de ces produits. Il est possible d'utiliser des produits
équivalents, à condition qu'il soit établi qu'ils donnent les mêmes résultats.
© ISO 2006 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
6.4 Agitateur vortex.
5)
6.5 Évaporateur automatique , pour un tube de 10 ml (facultatif) ou bain-marie (6.6).
Conditions de fonctionnement recommandées:
⎯ température du bain-marie 35 °C;
⎯ pression d'azote 34,5 kPa.
6.6 Bain-marie, régulé à 35 °C.
6.7 Balance, lisibilité 0,1 mg.
6.8 Tubes à centrifuger, capacité de 100 ml (un par échantillon).
6.9 Tubes à centrifuger coniques, capacité de 11 ml (trois par échantillon) avec capuchons vissés munis
de joints en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (un par échantillon).
6.10 Éprouvettes graduées.
6.11 Microseringue, de 250 µl.
6.12 Seringue, de 1 000 µl.
6.13 Pipette graduée, de 5 ml.
6.14 Seringue, de 5 ml munie d'un bouchon adaptateur pour les cartouches SPE.
6.15 Flacons pour passeur d'échantillons.
6.16 Microflacons, capacité de 250 µl, adaptées au système CLHP.
6.17 Bain à ultrasons, température de l'eau ne dépassant pas 40 °C.
6.18 Pipettes Pasteur, munies de coton dans la partie supérieure pour éviter toute contamination.
6)
6.19 Appareil disposant d'un support et de pinces pour maintenir les cartouches SPE ou, si possible,
une station de travail SPE automatique.
NOTE Selon la station de traitement d'échantillons SPE utilisée, les méthodes d'extraction proposées peuvent
nécessiter de légères adaptations (temps, pression, volumes).
6.20 Fiole jaugée, de capacité 50 ml.
5) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Zymark, turbo-évaporateur Zymark TurboVap LV.
6) Ce produit peut, par exemple, être obtenu auprès de Zymark, Zymark Rapid Trace.
Ces informations sont données par souci de commodité à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale
et ne sauraient constituer un engagement de l'ISO à l'égard de ces produits. Il est possible d'utiliser des produits
équivalents, à condition qu'il soit établi qu'ils donnent les mêmes résultats.
4 © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
7 Échantillonnage
Il convient que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, qui n'a été ni endommagé ni modifié
pendant le transport ou le stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d'échantillonnage recommandée est fournie dans l'ISO 5555.
8 Préparation de l'échantillon
Préparer l'échantillon pour essai conformément à la méthode spécifiée dans l'ISO 661. Avant
l'échantillonnage, les échantillons liquides doivent être à température ambiante et être homogénéisés par
agitation magnétique.
Échantillonner la matrice solide en fondant la totalité de l'échantillon ou en fondant, puis en homogénéisant
plusieurs carottes d'échantillons.
9 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras: Méthode
générale
9.1 Remarques préliminaires
Pour obtenir des résultats répétables, la température ambiante du laboratoire doit être régulée (u 20 °C). Ce
paramètre est très important pour l'extraction des HAP à partir de l'huile de coprah (ou des huiles végétales
contenant des acides gras à chaînes courtes). L'huile de coprah contient des acides gras à chaînes courtes et
longues: si la température ambiante dépasse 20 °C, la solubilité des acides gras à chaîne courte augmente.
Avant emploi, rincer la totalité de la verrerie trois fois avec de l'hexane (5.2).
Chaque séquence d'échantillons doit inclure un essai à blanc (9.2) et une solution étalon extraite dans les
mêmes conditions que l'échantillon afin de calculer les taux de récupération de l'extraction (9.3). Les valeurs
des taux de récupération doivent être comprises entre 70 % et 110 %. Les valeurs des taux de récupération
moyens sont donnés au Tableau A.1.
Pour une analyse quantitative, deux prises d'essai doivent être extraites et analysées séparément, le résultat
final étant la valeur moyenne des résultats des deux sous-échantillons.
Il n'est pas possible d'effectuer la totalité de l'analyse en une journée. Les extraits des échantillons doivent
être conservés jusqu'au lendemain dans des conditions de surgélation à −18 °C:
er
⎯ 1 jour: étape 1, étape 2 et étape 3 jusqu'à la purification sur cartouche C18 (voir Figure A.1).
e
⎯ 2 jour: étape 3, purification sur cartouche Florisil et préparation du système CLHP pour l'analyse
d'échantillon (voir Figure A.1).
⎯ nuit et jour(s) suivants: analyse des échantillons (voir Tableau A.2).
9.2 Essai à blanc
Pour garantir l'absence de contamination des solvants et cartouches, l'opération de purification
(conformément à 9.5, à 9.6 et à l'Article 11) doit d'abord être effectuée sur un échantillon à blanc (échantillon
avec un mélange de solvants mais sans l'huile). Le chromatogramme obtenu doit être exempt de composés
d'intérêt. Si le chromatogramme contient des interférences, l'origine de ces interférences doit être déterminée
et éliminée. Les valeurs des essais à blanc ne peuvent pas être utilisées pour corriger les valeurs des
échantillons puisque les valeurs des essais à blanc ne sont généralement pas homogènes (répétabilité).
© ISO 2006 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
9.3 Détermination des valeurs des taux de récupération (sans matrice)
Afin de vérifier l'efficacité d'extraction des cartouches, effectuer un essai avec une solution étalon.
Complémenter 1 750 µl de mélange de solvants 1 (5.9) avec 250 µl de solution étalon de travail (5.15) à l'aide
d'une seringue de 250 µl (6.11). Déposer sur une cartouche C18, puis suivre le mode opératoire décrit en 9.5,
en 9.6 et à l'Article 11.
AVERTISSEMENT — Lors de l'élimination du solvant sous un flux d'azote (voir 9.5.6), ne pas évaporer
à siccité mais conserver environ 50 µl dans le tube conique afin de ne pas perdre les HAP volatils.
9.4 Extraction (extraction liquide/liquide)
9.4.1 Le schéma fonctionnel du mode opératoire d'isolement est fourni à la Figure A.1.
9.4.2 Peser, à 1 mg près, environ 2,5 g de l'échantillon dans un tube à centrifuger de 100 ml (6.8). Ajouter
10 ml de mélange de solvants 1 (5.9).
9.4.3 Agiter le tube à centrifuger pendant 30 s dans l'agitateur vortex (demi-vitesse). Puis, placer le tube
dans un bain à ultrasons (6.17) pendant 5 min.
−1
9.4.4 Centrifuger pendant 5 min à 4 000 min .
9.4.5 Prélever avec précaution la phase supérieure à l'aide d'une pipette Pasteur (6.18), puis la transférer
dans un tube conique taré (6.9).
9.4.6 Évaporer le solvant du tube conique pendant 30 min à 40 min sous un flux d'azote (5.18) en utilisant
un bain-marie à 35 °C (6.6) ou un évaporateur automatique (6.5).
9.4.7 Répéter l'extraction deux fois avec 10 ml supplémentaires de mélange de solvants 1 (5.9). Concentrer
les extraits dans le même tube conique sous un flux d'azote (5.18) en utilisant un bain-marie à 35 °C (6.6) ou
un évaporateur automatique (6.5). Il convient que le résidu de corps gras soit d'environ 200 mg à 800 mg.
Si le poids du résidu de corps gras est supérieur à 800 mg, la méthode générale (Article 9) n'est pas
appropriée; il convient, dans ce cas, d'utiliser la méthode spécifique pour l'huile de coprah (Article 10).
9.5 Purification sur des cartouches de phase greffée en C18 (extraction solide/liquide)
9.5.1 Conditionnement des cartouches: placer la cartouche (5.16) sur un support (6.19), rincer la cartouche
avec 2 volumes de 12 ml de méthanol (5.1), puis avec 2 volumes de 12 ml d'acétonitrile (5.3). Laisser le
solvant s'écouler à la pression atmosphérique.
9.5.2 Placer un tube conique taré (6.9) sous la cartouche (5.16).
9.5.3 À l'aide d'une seringue (6.12) ou d'une pipette graduée (6.13), introduire 2 ml de mélange de
solvants 1 (5.9) dans le tube conique contenant le résidu de corps gras (9.4.7). Agiter le tube avec l'agitateur
vortex (6.4) pendant 15 s. Centrifuger 30 s. Transférer la phase supérieure en tête de la cartouche (5.16) à
l'aide d'une pipette Pasteur (6.18). Répéter l'opération deux fois (2 ml de mélange de solvants 1, mélanger,
centrifuger et transférer sur la cartouche). Recueillir le solvant éluant de la cartouche avec le solvant d'élution.
9.5.4 Ajouter 5 ml de mélange de solvants 1 (5.9) en tête de la cartouche (5.16), puis laisser l'élution se
développer à la pression atmosphérique.
9.5.5 À l'aide d'une seringue (6.14), injecter de l'air dans la cartouche dans le but d'éluer le solvant restant
et les HAP pouvant être retenus dans la phase solide.
9.5.6 Évaporer les solvants sous un flux d'azote (5.18) à l'aide d'un bain-marie à 35 °C (6.6) ou d'un
évaporateur automatique (6.5). Il convient que le résidu de corps gras ne dépasse pas 50 mg.
6 © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
9.5.7 Diluer le résidu dans 1 ml d'hexane (5.2), mesuré avec une seringue (6.12), fermer hermétiquement le
tube conique et conserver à − 18 °C jusqu'à la prochaine utilisation.
9.6 Purification sur des cartouches de phase greffée de Florisil (extraction solide/liquide)
9.6.1 Laisser l'extrait (9.5.7) se réchauffer à température ambiante pendant au moins 1 h.
9.6.2 Conditionnement des cartouches: placer la cartouche (5.17) sur un support (6.19), rincer la cartouche
avec 5 volumes de 3 ml de dichlorométhane (5.5), puis avec 4 volumes de 3 ml d'hexane (5.2).
9.6.3 Placer un tube conique taré (6.9) sous la cartouche (5.17).
9.6.4 Transférer l'extrait (9.5.7) en tête de la cartouche (5.17) à l'aide d'une pipette Pasteur (6.18).
9.6.5 Introduire 1 ml de mélange de solvants 3 (5.11) à l'aide d'une seringue (6.12) ou d'une pipette
graduée (6.13) dans le tube conique contenant l'extrait. Agiter le tube pendant 15 s avec l'agitateur vortex,
puis transférer le mélange en tête de la cartouche (5.17). Rincer le tube avec 2 × 2 ml de mélange de
solvants 3 (5.11), puis le transférer sur la cartouche. Recueillir le solvant éluant de la cartouche avec le
solvant d'élution.
Éviter tout contact entre la pipette et le tube conique afin d'empêcher une contamination croisée.
9.6.6 Éluer 4 ml de mélange de solvants 3 (5.11) dans la cartouche (5.17). À l'aide d'une seringue (6.14),
injecter de l'air dans la cartouche afin d'éluer le solvant restant.
9.6.7 Concentrer la solution sous un flux d'azote (5.18), à l'aide d'un bain-marie à 35 °C (6.6) ou d'un
évaporateur automatique (6.5), à environ 1 ml (l'opération prend 10 min à 15 min). Ajouter environ 0,5 ml de
toluène (5.6) (rétenteur), puis poursuivre l'évaporation jusqu'à ce qu'il reste environ 50 µl.
Il convient de ne pas évaporer entièrement le solvant.
9.6.8 Le volume exact est déterminé par la pesée du tube conique et calculé à l'aide de la densité de
toluène. Ajouter le volume de solvant requis [MeOH/THF (5.12), ou acétonitrile (5.3)], V , pour obtenir
ajouté
250 µl.
m
V =−250
ajouté
d
où
m est la masse d'échantillon, en milligrammes;
3
d est la masse volumique du toluène (0,866 9 kg/m ).
9.6.9 Transférer l'échantillon dans un microflacon (6.16), placé dans un flacon (6.15).
10 Mode opératoire pour la détermination des HAP à partir des corps gras: Méthode
spécifique pour l'huile de coprah
10.1 Première extraction (extraction liquide/liquide)
10.1.1 Le schéma fonctionnel du mode opératoire d'isolement est fourni à la Figure A.2.
10.1.2 Peser, à 1 mg près, environ 2 g de l'échantillon dans un tube à centrifuger de 100 ml (6.8). Ajouter
10 ml de mélange de solvants 1 (5.9).
© ISO 2006 – Tous droits réservés 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 15753:2006(F)
10.1.3 Agiter le tube à centrifuger pendant 30 s dans l'agitateur vortex (demi-vitesse). Puis, placer le tube
dans un bain à ultrasons (6.17) pendant 5 min.
−1
10.1.4 Centrifuger pendant 5 min à 4 000 min .
10.1.5 Prélever avec précaution la phase supérieure à l'aide d'une pipette Pasteur (6.18), puis la transférer
dans un tube conique (6.9).
10.1.6 Évaporer le solvant du tube conique pendant 30 min à 40 min, sous un flux d'azote (5.18), en utilisant
un bain-marie à 35 °C (6.6) ou un évaporateur automatique (6.5).
10.1.7 Répéter l'extraction deux fois avec 10 ml supplémentaires de mélange de solvants 1 (5.9). Concentrer
les extraits dans le même tube conique, sous un
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.