ISO 20418-3:2020
(Main)Textiles — Qualitative and quantitative proteomic analysis of some animal hair fibres — Part 3: Peptide detection using LC-MS without protein reduction
Textiles — Qualitative and quantitative proteomic analysis of some animal hair fibres — Part 3: Peptide detection using LC-MS without protein reduction
This document specifies a qualitative and quantitative procedure to determine the composition of animal hair fibre blends (made of wool, cashmere, yak, alpaca, camel or angora) by LC-MS without protein reduction. NOTE 1 The composition of non-animal hair fibres can be measured by ISO 1833 (all parts). Both results are combined to determine the total fibre composition. The method is based on a preliminary identification, by light microscopy, of all fibres in the blend on the basis of their morphology, according to ISO/TR 11827[4]. It is not applicable if fibres of the same animal species (such as blends of cashmere and mohair) are present. NOTE 2 In this case, the quantitative analysis is performed using microscopical analysis [for example, ISO 17751 (all parts)].
Textiles — Analyse protéomique qualitative et quantitative de certaines fibres animales — Partie 3: Détection des peptides par LC-MS sans réduction protéique
Le présent document spécifie une méthode qualitative et quantitative pour déterminer la composition des mélanges de fibres animales ? poils - (composés de laine, de cachemire, de yack, d'alpaga, de chameau ou d'angora) par LC-MS sans réduction protéique. NOTE 1 La composition des fibres autres que les poils animaux peut être mesurée conformément à l'ISO 1833 (toutes les parties). Les résultats de ces deux méthodes sont ensuite combinés pour déterminer la composition globale des fibres. La méthode repose sur une identification préliminaire, par microscopie optique, de toutes les fibres présentes dans le mélange sur la base de leur morphologie, conformément à l'ISO/TR 11827[4]. Elle n'est pas applicable si des fibres de la même espèce animale (telles que des mélanges de cachemire et de mohair) sont présentes. NOTE 2 Dans ce cas, l'analyse quantitative est réalisée par microscopie [tel que décrit dans l'ISO 17751 (toutes les parties), par exemple].
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20418-3
First edition
2020-06
Textiles — Qualitative and
quantitative proteomic analysis of
some animal hair fibres —
Part 3:
Peptide detection using LC-MS without
protein reduction
Textiles — Analyse protéomique qualitative et quantitative de
certaines fibres animales —
Partie 3: Détection des peptides par LC-MS sans réduction protéique
Reference number
ISO 20418-3:2020(E)
©
ISO 2020
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ISO 20418-3:2020(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
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Published in Switzerland
ii © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 20418-3:2020(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Symbols and abbreviated terms . 2
5 Principle . 2
6 Reagents . 3
7 Apparatus . 3
8 Test method . 4
8.1 Sampling . 4
8.2 Preliminary identification . 4
8.3 Wash for degreasing . 4
8.4 Powderization of fibres . 4
8.5 Trypsin digestion . 4
8.6 Marker peptides . 5
8.7 LC-MS analysis . 5
8.8 Evaluation of the validity of observed data . 5
8.9 Calculation of correction factor . 5
8.9.1 Correction factor . 5
8.9.2 Correction factor for Cas1 against She1 and Yak1 (kc). 6
8.9.3 Correction factor for Yak2 against She2, She3 and Cas2 (ky) . 6
8.9.4 Correction factor for alpaca and camel (ka) . 6
8.9.5 Correction factor for angora (kr) . 6
8.10 Calculation of blending ratio . 6
8.10.1 Calculation of blending ratio of cashmere, sheep wool and yak . 6
8.10.2 Calculation by She1, Cas1, Yak1 and kc . 7
8.10.3 Calculation by She2, She3, Cas2, Yak2 and ky . 7
8.10.4 Calculation by She1, She2, She3, Cas2, Yak1 . 7
8.10.5 Calculation of blending ratio of camel, alpaca and angora . 8
9 Test report . 9
Annex A (informative) Marker peptides of cashmere, sheep wool and yak fibres .10
Annex B (informative) Example of LC-MS analysis conditions .13
Annex C (informative) Analysis of camel, alpaca and angora fibres .16
Annex D (informative) Example of marker peptide mass chromatograms .19
Annex E (informative) Results of interlaboratory study .23
Bibliography .24
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ISO 20418-3:2020(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 38, Textiles, in collaboration with the
European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 248, Textiles and textile
products, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna
Agreement).
A list of all parts in the ISO 20418 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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ISO 20418-3:2020(E)
Introduction
Cashmere is a long slender fibre obtained from cashmere goats and is expensive because of its high
quality and rarity. Mislabelling or adulteration of cashmere products blended with other cheaper
animal fibres such as sheep wool and yak have been repeatedly reported worldwide.
Current official methods to identify specific animal fibres are based on microscopic observations.
However, the microscopy-based identification is becoming increasingly difficult due to a wider use
of chemical or physical treatments in the manufacturing process. Given these issues, several other
methods have also been studied either to distinguish fibre structures by the use of near-infrared
spectroscopy or terahertz spectroscopy, or to distinguish DNA sequences by the use of polymerase
chain reaction. Nevertheless, each method has shown some complications when applied. Therefore, it is
required to develop novel identification methods.
Animal fibres consist mainly of proteins called keratins and some associated proteins. Therefore, the
most promising methods to identify fibres are based on the analysis of proteins contained in textiles.
Commonly, proteins are analysed by being subjected to digestion by trypsin, resulting in smaller
molecules, i.e. peptides, which will be later characterized through mass spectrometry. Accordingly,
identification methods using either matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass
spectrometer or liquid chromatography/mass spectrometer (LC-MS) have been studied. When
comparing these options, the latter type of instrument is less expensive and more readily available in
testing laboratories as a versatile analytical instrument than the former. Moreover, LC-MS has a high
quantitative capability, and is therefore preferable to calculate the blending ratio of animal fibres.
Keratins are highly insoluble due to the disulphide bonds they tend to form, both at an intramolecular
as well as at an intermolecular level. Thus, keratins are generally extracted in the presence of reducing
agents. However, this reducing step is considered as time-consuming and arduous. In this document,
an alternative method in which cysteine-free peptides are selected for identification markers is used,
thereby eliminating the need of the reducing step and enabling rapid preparation of LC-MS samples.
Both ISO 20418-1 and this document describe procedures using LC-MS, but they differ regarding the
method utilized to extract the peptides. In ISO 20418-1, proteins are first extracted from fibres with
a thiourea/urea/dithiothreitol (DTT) solution, and then digested by trypsin to obtain peptides. In the
process described here, peptides are directly extracted by trypsin digestion of mechanically powdered
fibres. The method has been shown to be useful even for highly processed samples and is applicable to
various types of animal hairs such as goat (cashmere or mohair), wool and yak.
© ISO 2020 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20418-3:2020(E)
Textiles — Qualitative and quantitative proteomic analysis
of some animal hair fibres —
Part 3:
Peptide detection using LC-MS without protein reduction
1 Scope
This document specifies a qualitative and quantitative procedure to determine the composition of
animal hair fibre blends (made of wool, cashmere, yak, alpaca, camel or angora) by LC-MS without
protein reduction.
NOTE 1 The composition of non-animal hair fibres can be measured by ISO 1833 (all parts). Both results are
combined to determine the total fibre composition.
The method is based on a preliminary identification, by light microscopy, of all fibres in the blend on the
[4]
basis of their morphology, according to ISO/TR 11827 . It is not applicable if fibres of the same animal
species (such as blends of cashmere and mohair) are present.
NOTE 2 In this case, the quantitative analysis is performed using microscopical analysis [for example,
ISO 17751 (all parts)].
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 1833-1, Textiles — Quantitative chemical analysis — Part 1: General principles of testing
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 17751 (all parts), Textiles — Quantitative analysis of cashmere, wool, other specialty animal fibers and
their blends
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
animal hair fibre
type of keratin fibre for textile use, such as wool, cashmere, yak, alpaca, camel or angora
3.2
Bovidae
biological family of cloven-hoofed, ruminant mammals including cashmere goat, sheep and yak
© ISO 2020 – All rights reserved 1
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ISO 20418-3:2020(E)
3.3
Camelidae
biological family of even-toed ungulate mammals including camel and alpaca
3.4
protein
polymer of amino acids that play many critical roles in the body
3.5
peptide
small protein (3.4) consisting of approximately less than 50 amino acids
3.6
marker peptide
portion of a protein (3.4) used for its identification, recovery and purification
3.7
mass chromatogram
chromatogram for a specific mass-to-charge ratio
3.8
total ion chromatogram
TIC
chromatogram with each data point created by summing up intensities of all mass spectral peaks
belonging to the same scan
3.9
selected ion monitoring
SIM
mass spectrometry scanning mode in which only a limited m/z range is transmitted/detected by the
instrument
4 Symbols and abbreviated terms
A peak area
W blending ratio
Br Bovidae rate
Cr Camelidae rate
ka correction factor for alpaca and camel
kc correction factor for cashmere
kr correction factor for angora
ky correction factor for yak
m/z mass to charge ratio, where m is the mass, expressed in atomic mass unit, and z is the charge
number of ions
5 Principle
The mechanically powdered fibres are directly subjected to trypsin digestion without prior reduction.
The analysis of the digested peptides is performed with LC-MS. The percent composition is calculated
from the peak areas of the species-specific marker peptides.
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ISO 20418-3:2020(E)
6 Reagents
The following analytical grade reagents shall be used.
6.1 Acetone, with purity greater than or equal to 99,5 %.
6.2 Water, grade 3 quality specified in ISO 3696.
6.3 Ammonium hydrogen carbonate (NH HCO ) solution (25 mmol/l)
4 3
— 197,5 mg of NH HCO , with purity greater than or equal to 96,0 %.
4 3
— Make up 100 ml by adding water (6.2).
6.4 Trypsin, sequencing-grade porcine trypsin modified by reductive methylation.
6.5 Acetonitrile, with purity greater than or equal to 99,8 %.
6.6 Formic acid, with purity greater than or equal to 98 %.
6.7 Trypsin solution
— Trypsin (6.4) 20 μg.
— 0,1 % formic acid (6.6) 200 μl.
7 Apparatus
The usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
7.1 Heating mantle, capable of operating at a temperature range of 50 °C to 150 °C.
7.2 Mill, beads mill, cryogenic grinder or an equivalent, capable of crushing materials into an extremely
fine powder.
7.3 Membrane filter, for aqueous solutions, with a pore size of 0,45 µm.
7.4 Heat block, capable of heating microtubes at 37 °C.
7.5 Tube mixer, capable of vortex microtubes and LC vials for about 30 min.
7.6 Centrifugal evaporator, capable to deliver 5 000 g.
7.7 LC-MS, liquid chromatography–mass spectrometer, capable of detecting m/z (u) range from
200 m/z (u) to 1 500 m/z (u).
NOTE (u) is for unified atomic mass unit, SI unit.
7.8 LC vial, shall be glass or polymethylpentane.
7.9 LC column, octadecyl (C-18)-silica reversed phase column.
7.10 Balance, with a resolution of at least 0,001 g.
© ISO 2020 – All rights reserved 3
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ISO 20418-3:2020(E)
7.11 Recovery flask (eggplant flask or round-bottom flask).
8 Test method
8.1 Sampling
The general requirement is that the test specimen shall be representative for the lot of material from
which it is taken. The method to obtain a fibre test specimen differs depending on the sample form. The
terms relating to sampling for the various types of samples shall be in accordance with ISO 1833-1.
8.2 Preliminary identification
The preliminary qualitative analysis of the animal hair fibre shall be carried out based on their
morphology, which is determined using light microscopy, according to ISO 17751 (all parts), after
removal of non-animal fibre.
8.3 Wash for degreasing
8.3.1 Reflux 1 g of the fibres in a recovery flask (7.11) on a heating mantle (7.1) with 200 ml of acetone
(6.1) for 30 min. This washing step may be omitted in the case of clean samples. Quantity of the fibres
can be changed.
8.3.2 Take the degreased fibres out of the recovery flask and dry them in the air. Alternatively, the
[5]
sample preparation method of ISO 20418-1 can be used.
8.4 Powderization of fibres
Crush the dried fibre sample (8.3.2) using a mill (7.2) to get a fine powder with an average length of
100 µm or less by checking under the microscope and mix thoroughly for securing representative
sampling of the fibres.
8.5 Trypsin digestion
8.5.1 Weigh about 10 mg of the crushed sample and place it into a microtube. If more than 10 mg of
the sample is used, increase the volumes of the NH HCO solution in 8.5.2 and Trypsin solution in 8.5.3
4 3
proportionally.
8.5.2 Add 300 µl of the NH HCO solution (6.3) and vortex for 10 min to 30 min.
4 3
8.5.3 Add 10 µl of the Trypsin solution (6.7) to the sample and incubate at 37 °C for 20 h to 24 h.
8.5.4 Centrifuge the tryptic solution for 3 min using the centrifugal evaporator (7.6). Filter the
supernatant through a membrane filter (7.3) to remove residual fibres.
NOTE Centrifugal filter, syringe filter or other means of filtration can be used.
8.5.5 Transfer the solution to an LC vial, then dry it using the centrifugal evaporator (7.6). If the LC vial
does not fit in the dryer, the solution can be dried in other types of container such as a microtube. The
sample is transferred to an LC vial after dissolution. Alternatively, a freeze dryer or nitrogen flux can be
used as the drying method, instead of the centrifugal evaporator.
8.5.6 Add 40 µl of water containing 0,1 % formic acid and 5 % acetonitrile and vortex for 30 min, for
subsequent LC-MS measurements. Sonication shall not be a substitute for vortex when LC-MS sample is
dissolved.
4 © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 20418-3:2020(E)
8.6 Marker peptides
8.6.1 Select the peptides which are used as markers for differential identification of fibres, as specified
in Annex A and Annex C. The result of the preliminary identification by microscopy (8.2) and Table 1 can
be used as references for this selection.
Table 1 — Correlation of marker peptides and identifiable
...
FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 20418-3
ISO/TC 38
Textiles — Qualitative and
Secretariat: JISC
quantitative proteomic analysis of
Voting begins on:
2020-03-11 some animal hair fibres —
Voting terminates on:
Part 3:
2020-05-06
Peptide detection using LC-MS without
protein reduction
Textiles — Analyse protéomique qualitative et quantitative de
certaines fibres animales —
Partie 3: Détection des peptides par LC-MS sans réduction protéique
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO-
ISO/FDIS 20418-3:2020(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN-
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
©
NATIONAL REGULATIONS. ISO 2020
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/FDIS 20418-3:2020(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2020
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
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Phone: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
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ISO/FDIS 20418-3:2020(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Symbols and abbreviated terms . 2
5 Principle . 2
6 Reagents . 3
7 Apparatus . 3
8 Test method . 4
8.1 Sampling . 4
8.2 Preliminary identification . 4
8.3 Wash for degreasing . 4
8.4 Powderization of fibres . 4
8.5 Trypsin digestion . 4
8.6 Marker peptides . 5
8.7 LC-MS analysis . 5
8.8 Evaluation of the validity of observed data . 5
8.9 Calculation of correction factor . 5
8.9.1 Correction factor . 5
8.9.2 Correction factor for Cas1 against She1 and Yak1 (kc). 6
8.9.3 Correction factor for Yak2 against She2, She3 and Cas2 (ky) . 6
8.9.4 Correction factor for alpaca and camel (ka) . 6
8.9.5 Correction factor for angora (kr) . 6
8.10 Calculation of blending ratio . 6
8.10.1 Calculation of blending ratio of cashmere, sheep wool and yak . 6
8.10.2 Calculation by She1, Cas1, Yak1 and kc . 7
8.10.3 Calculation by She2, She3, Cas2, Yak2 and ky . 7
8.10.4 Calculation by She1, She2, She3, Cas2, Yak1 . 7
8.10.5 Calculation of blending ratio of camel, alpaca and angora . 8
9 Test report . 9
Annex A (informative) Marker peptides of cashmere, sheep wool and yak fibres .10
Annex B (informative) Example of LC-MS analysis conditions .13
Annex C (informative) Analysis of camel, alpaca and angora fibres .16
Annex D (informative) Example of marker peptide mass chromatograms .19
Annex E (informative) Results of interlaboratory study .23
Bibliography .24
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ISO/FDIS 20418-3:2020(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 38, Textiles, in collaboration with
the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 248, Textiles, in
accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
A list of all parts in the ISO 20418 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/FDIS 20418-3:2020(E)
Introduction
Cashmere is a long slender fibre obtained from cashmere goats and is expensive because of its high
quality and rarity. Mislabelling or adulteration of cashmere products blended with other cheaper
animal fibres such as sheep wool and yak have been repeatedly reported worldwide.
Current official methods to identify specific animal fibres are based on microscopic observations.
However, the microscopy-based identification is becoming increasingly difficult due to a wider use
of chemical or physical treatments in the manufacturing process. Given these issues, several other
methods have also been studied either to distinguish fibre structures by the use of near-infrared
spectroscopy or terahertz spectroscopy, or to distinguish DNA sequences by the use of polymerase
chain reaction. Nevertheless, each method has shown some complications when applied. Therefore, it is
required to develop novel identification methods.
Animal fibres consist mainly of proteins called keratins and some associated proteins. Therefore, the
most promising methods to identify fibres are based on the analysis of proteins contained in textiles.
Commonly, proteins are analysed by being subjected to digestion by trypsin, resulting in smaller
molecules, i.e. peptides, which will be later characterized through mass spectrometry. Accordingly,
identification methods using either matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass
spectrometer or liquid chromatography/mass spectrometer (LC-MS) have been studied. When
comparing these options, the latter type of instrument is less expensive and more readily available in
testing laboratories as a versatile analytical instrument than the former. Moreover, LC-MS has a high
quantitative capability, and is therefore preferable to calculate the blending ratio of animal fibres.
Keratins are highly insoluble due to the disulphide bonds they tend to form, both at an intramolecular
as well as at an intermolecular level. Thus, keratins are generally extracted in the presence of reducing
agents. However, this reducing step is considered as time-consuming and arduous. In this document,
an alternative method in which cysteine-free peptides are selected for identification markers is used,
thereby eliminating the need of the reducing step and enabling rapid preparation of LC-MS samples.
Both ISO 20418-1 and this document describe procedures using LC-MS, but they differ regarding the
method utilized to extract the peptides. In ISO 20418-1, proteins are first extracted from fibres with
a thiourea/urea/dithiothreitol (DTT) solution, and then digested by trypsin to obtain peptides. In the
process described here, peptides are directly extracted by trypsin digestion of mechanically powdered
fibres. The method has been shown to be useful even for highly processed samples and is applicable to
various types of animal hairs such as goat (cashmere or mohair), wool and yak.
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FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 20418-3:2020(E)
Textiles — Qualitative and quantitative proteomic analysis
of some animal hair fibres —
Part 3:
Peptide detection using LC-MS without protein reduction
1 Scope
This document specifies a qualitative and quantitative procedure to determine the composition of
animal hair fibre blends (made of wool, cashmere, yak, alpaca, camel or angora) by LC-MS without
protein reduction.
NOTE 1 The composition of non-animal hair fibres can be measured by ISO 1833 (all parts). Both results are
combined to determine the total fibre composition.
The method is based on a preliminary identification, by light microscopy, of all fibres in the blend on the
[4]
basis of their morphology, according to ISO/TR 11827 . It is not applicable if fibres of the same animal
species (such as blends of cashmere and mohair) are present.
NOTE 2 In this case, the quantitative analysis is performed using microscopical analysis [for example,
ISO 17751 (all parts)].
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 1833-1, Textiles — Quantitative chemical analysis — Part 1: General principles of testing
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 17751 (all parts), Textiles — Quantitative analysis of cashmere, wool, other specialty animal fibers and
their blends
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
animal hair fibre
type of keratin fibre for textile use, such as wool, cashmere, yak, alpaca, camel or angora
3.2
Bovidae
biological family of cloven-hoofed, ruminant mammals including cashmere goat, sheep and yak
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3.3
Camelidae
biological family of even-toed ungulate mammals including camel and alpaca
3.4
protein
polymer of amino acids that play many critical roles in the body
3.5
peptide
small protein (3.4) consisting of approximately less than 50 amino acids
3.6
marker peptide
portion of a protein (3.4) used for its identification, recovery and purification
3.7
mass chromatogram
chromatogram for a specific mass-to-charge ratio
3.8
total ion chromatogram
TIC
chromatogram with each data point created by summing up intensities of all mass spectral peaks
belonging to the same scan
3.9
selected ion monitoring
SIM
mass spectrometry scanning mode in which only a limited m/z range is transmitted/detected by the
instrument
4 Symbols and abbreviated terms
A peak area
W blending ratio
Br Bovidae rate
Cr Camelidae rate
ka correction factor for alpaca and camel
kc correction factor for cashmere
kr correction factor for angora
ky correction factor for yak
m/z mass to charge ratio, where m is the mass, expressed in atomic mass unit, and z is the charge
number of ions
5 Principle
The mechanically powdered fibres are directly subjected to trypsin digestion without prior reduction.
The analysis of the digested peptides is performed with LC-MS. The percent composition is calculated
from the peak areas of the species-specific marker peptides.
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6 Reagents
The following analytical grade reagents shall be used.
6.1 Acetone, with purity greater than or equal to 99,5 %.
6.2 Water, grade 3 quality specified in ISO 3696.
6.3 Ammonium hydrogen carbonate (NH HCO ) solution (25 mmol/l)
4 3
— NH HCO , with purity greater than or equal to 96,0 % 197,5 mg.
4 3
— Make up 100 ml by adding water (6.2).
6.4 Trypsin, sequencing-grade porcine trypsin modified by reductive methylation.
6.5 Acetonitrile, with purity greater than or equal to 99,8 % .
6.6 Formic acid, with purity greater than or equal to 98 % .
6.7 Trypsin solution
— Trypsin (6.4) 20 μg.
— 0,1 % formic acid (6.6) 200 μl.
7 Apparatus
The usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
7.1 Heating mantle, capable of operating at a temperature range of 50 °C to 150 °C.
7.2 Mill, beads mill, cryogenic grinder or an equivalent, capable of crushing materials into an extremely
fine powder.
7.3 Membrane filter, for aqueous solutions, with a pore size of 0,45 µm.
7.4 Heat block, capable of heating microtubes at 37 °C.
7.5 Tube mixer, capable of vortex microtubes and LC vials for about 30 min.
7.6 Centrifugal evaporator, capable to deliver 5 000 g.
7.7 LC-MS, liquid chromatography–mass spectrometer, capable of detecting m/z (u) range from
200 m/z (u) to 1 500 m/z (u).
NOTE (u) is for unified atomic mass unit, SI unit.
7.8 LC vial, shall be glass or polymethylpentane.
7.9 LC column, octadecyl (C-18)-silica reversed phase column.
7.10 Balance, with a resolution of at least 0,001 g.
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7.11 Recovery flask (eggplant flask or round-bottom flask).
8 Test method
8.1 Sampling
The general requirement is that the test specimen shall be representative for the lot of material from
which it is taken. The method to obtain a fibre test specimen differs depending on the sample form. The
terms relating to sampling for the various types of samples shall be in accordance with ISO 1833-1.
8.2 Preliminary identification
The preliminary qualitative analysis of the animal hair fibre shall be carried out based on their
morphology, which is determined using light microscopy, according to ISO 17751 (all parts), after
removal of non-animal fibre.
8.3 Wash for degreasing
8.3.1 Reflux 1 g of the fibres in a recovery flask (7.11) on a heating mantle (7.1) with 200 ml of acetone
(6.1) for 30 min. This washing step may be omitted in the case of clean samples. Quantity of the fibres
can be changed.
8.3.2 Take the degreased fibres out of the recovery flask and dry them in the air. Alternatively, the
[5]
sample preparation method of ISO 20418-1 can be used.
8.4 Powderization of fibres
Crush the dried fibre sample (8.3.2) using a mill (7.2) to get a fine powder with an average length of
100 µm or less by checking under the microscope and mix thoroughly for securing representative
sampling of the fibres.
8.5 Trypsin digestion
8.5.1 Weigh about 10 mg of the crushed sample and place it into a microtube. If more than 10 mg of
the sample is used, increase the volumes of the NH HCO solution in 8.5.2 and Trypsin solution in 8.5.3
4 3
proportionally.
8.5.2 Add 300 µl of the NH HCO solution (6.3) and vortex for 10 min to 30 min.
4 3
8.5.3 Add 10 µl of the Trypsin solution (6.7) to the sample and incubate at 37 °C for 20 h to 24 h.
8.5.4 Centrifuge the tryptic solution for 3 min using the centrifugal evaporator (7.6). Filter the
supernatant through a membrane filter (7.3) to remove residual fibres.
NOTE Centrifugal filter, syringe filter or other means of filtration can be used.
8.5.5 Transfer the solution to an LC vial, then dry it using the centrifugal evaporator (7.6). If the LC vial
does not fit in the dryer, the solution can be dried in other types of container such as a microtube. The
sample is transferred to an LC vial after dissolution. Alternatively, a freeze dryer or nitrogen flux can be
used as the drying method, instead of the centrifugal evaporator.
8.5.6 Add 40 µl of water containing 0,1 % formic acid and 5 % acetonitrile and vortex for 30 min, for
subsequent LC-MS measurements. Sonication shall not be a substitute for vortex when LC-MS sample is
dissolved.
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8.6 Marker peptides
8.6.1 Select the peptides which are used as markers for differential identification of fibres, as specified
in Annex A and Annex C. The result of the preliminary identification by microscopy (8.2) and Table 1 can
be used as references for this selection.
Table 1 — Correlation of marker peptides and identifiable animal taxa
Species Family Class
Fibre
a
Name Marker Name Marker Name Marker
She1,
Sheep wool Ovis aries (She2,
She3)
Cashmere/ Cas1, Bovidae Fbv1
Capra hircus
mohair (Cas2)
Yak1,
Yak Bos grunniens
(Yak2)
Mammalia Cmm1
Alp1,
Alpaca Vicugna pacos
(Alp2)
Camelidae Fcm1
Cam1,
Camel Camelus ferus
(Cam2)
Oryctolgus Ang1,
Angora rabbit Leporidae —
cuniculus (Ang2)
a
Marker peptides with suffix 1 are preferable when conducting quantitative analysis.
8.6.2 Optimize LC-MS parameters and confirm retention times of target peaks by using either
synthesized peptides (with amino acid sequences shown in Annex A and Annex C) or peptides extracted
from pure animal hair fibre samples.
8.7 LC-MS analysis
8.7.1 Inject 5 µl of the sample onto an LC column (7.9). Use water containing 0,1 % formic acid and
acetonitrile containing 0,1 % formic acid to form a gradient with increasing concentration of acetonitrile
for chromatography. The initial concentration of acetonitrile is 5 %. An example of LC parameters is
indicated in Annex B.
8.7.2 Operate mass spectrometer in SIM mode. The selected markers (preferably those with suffix
1), which are described in Annex A and Annex C, shall be monitored. An example of MS parameters is
indicated in Annex B.
8.7.3 Integrate the peak area of each marker peptide. The peaks of additional marker peptides (those
with suffix 2 and 3), which are also described in Annex A and Annex C, can be used when it is difficult to
use the target peak.
8.8 Evaluation of the validity of observed data
See Annex C.
8.9 Calculation of correction factor
8.9.1 Correction factor
Peak areas of marker peptides are not expected to be proportional to the amounts of corresponding
animal fibres in the following combinations of marker peptides, for reasons such as the difference in
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the protein species from which each marker peptide is derived (see 8.9.2). In these cases, a correction
factor for a peptide against other peptides should be experimentally obtained for the quantification of
their blending ratio. Moreover, the correction factor should be updated when analysis conditions are
modified.
8.9.2 Correction factor for Cas1 against She1 and Yak1 (kc)
8.9.2.1 Analyse blend samples with 50 % cashmere and 50 % sheep wool in mass ratio at least
three times.
8.9.2.2 Calculate the value of A /A from the peak area of She1 (A ) and the peak area of Cas1
she1 cas1 she1
(A ) for each analysis.
cas1
8.9.2.3 Correction factor for cashmere (kc) shall be calculated as the average of each A /A .
she1 cas1
8.9.3 Correction factor for Yak2 against She2, She3 and Cas2 (ky)
8.9.3.1 Analyse blend samples with 50 % cashmere and 50 % yak in mass ratio at least three times.
8.9.3.2 Calculate the value of A /A from the peak area of Cas2 (A ) and the peak area of Yak2
cas2 yak2 cas2
(A ) for each analysis.
yak2
8.9.3.3 Correction factor for yak (ky) shall be calculated as the average of each A /A .
cas2 yak2
8.9.4 Correction factor for alpaca and camel (ka)
8.9.4.1 Analyse blend samples with 50 % alpaca and 50 % sheep wool in mass ratio at least three times.
8.9.4.2 Calculate the value of A /A from the peak area of Fbv1 (A ) and the peak area of F
fbv1 fcm1 fbv1 cm1
(A ) for each analysis.
fcm1
8.9.4.3 Correction factor for alpaca and camel (ka) shall be calculated as the average of each A /A .
fbv1 fcm1
EXAMPLE See Annex C.
8.9.5 Correction factor for angora (kr)
8.9.5.1 Analyse blend samples with 50 % angora and 50 % sheep wool in mass ratio at least three times.
8.9.5.2 Calculate the value of A /A from the peak area of Fbv1 (A ) and the peak area of Ang1
fbv1 ang1 fbv1
(A ) for each analysis.
ang1
8.9.5.3 Correction factor for angora (kr) shall be calculated as the average of each A /A .
fbv1 ang1
EXAMPLE See Annex C.
8.10 Calculation of blending ratio
8.10.1 Calculation of blending ratio of cashmere, sheep wool and yak
Calculate the blending ratios from one of 8.10.2, 8.10.3 or 8.10.4. Use 8.10.2 first and consider 8.10.3
or 8.10.4 as an alternative in case of unstable peak positions (8.9.2, 8.9.3, 8.9.4 or 8.9.5). The results of
interlaboratory study carried out to validate the test method are given in Annex E.
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8.10.2 Calculation by She1, Cas1, Yak1 and kc
Calculate the blending ratios using Formulae (1) to (3).
W = A / (A + kc × A + A ) × 100 (1)
sheep wool she1 she1 cas1 yak1
W = kc × A / (A + kc × A + A ) × 100 (2)
cashmere cas1 she1 cas1 yak1
W = A / (A + kc × A + A ) × 100 (3)
yak yak1 she1 cas1 yak1
where
W is the blending ratio (%) of sheep wool;
sheep wool
W is the blending ratio (%) of cashmere;
cashmere
W is the blending ratio (%) of yak;
yak
A is the peak area of She1;
she1
A is the peak area of Cas1;
cas1
A is the peak area of Yak1.
yak1
8.10.3 Calculation by She2, She3, Cas2, Yak2 and ky
Calculate the blending ratios using Formulae (4) to (6).
W = (A + A ) / (A + A + A + ky × A ) × 100 (4)
sheep wool she2 she3 she2 she3 cas2 yak2
W = A / (A + A + A + ky × A ) × 100 (5)
cashmere cas2 she2 she3 cas2 yak2
W = ky × A / (A + A + A + ky × A ) × 100 (6)
yak yak2 she2 she3 cas2 yak2
where
W is the blending ratio (%) of sheep wool;
sheep wool
W is the blending ratio (%) of cashmere;
cashmere
W is the blending ratio (%) of yak;
yak
A is the peak area of She2;
she2
A is the peak area of She3;
she3
A is the peak area of Cas2;
cas2
A is the peak area of Yak2.
yak2
8.10.4 Calculation by She1, She2, She3, Cas2, Yak1
Calculate the blending ratios using Formulae (7) to (10) when A is not 0.
she1
A = A + A (7)
she2+3 she2 she3
W = 1 / (1 + A / A + A / A ) × 100 (8)
sheep wool cas2 she2+3 yak1 she1
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W = (A / A ) / (1 + A / A + A / A ) × 100 (9)
cashmere cas2 she2+3 cas2 she2+3 yak1 she1
W = (A / A ) / (1 + A / A + A / A ) × 100 (10)
yak yak1 she1 cas2 she2+3 yak1 she1
where
W is the blending ratio (%) of sheep wool;
sheep wool
W is the blending ratio (%) of cashmere;
cashmere
W is the blending ratio (%) of yak;
yak
A is the peak area of She1;
she1
A is the peak area of She2;
she2
A is the peak area of She3;
she3
A is the peak area of Cas2;
cas2
A is the peak area of Yak1.
yak1
8.10.5 Calculation of blending ratio of camel, alpaca and angora
Calculate blending ratio using Formulae (11) to (18). Marker peptides of camel, alpaca and angora
with suffix 1 can be replaced by those with suffix 2. Use A in combination with A and A in
alp1 cam1 alp2
combination with A .
cam2
Br = A / (A + ka × A + kr × A) (11)
fbv1 fbv1 fcm1 ang1
Cr = (ka × A ) / (A + ka × A + kr × A) (12)
fcm1 fbv1 fcm1 ang1
W = (kr × A ) / (A + ka × A + kr × A ) × 100 (13)
angora ang1 fbv1 fcm1 ang1
W = Br ×W (see 8.10.1) (14)
sheep wool sheep wool
W = Br ×W (see 8.10.1) (15)
cashmere cashmere
W = Br ×W (se
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20418-3
Première édition
2020-06
Textiles — Analyse protéomique
qualitative et quantitative de certaines
fibres animales —
Partie 3:
Détection des peptides par LC-MS sans
réduction protéique
Textiles — Qualitative and quantitative proteomic analysis of some
animal hair fibres —
Part 3: Peptide detection using LC-MS without protein reduction
Numéro de référence
ISO 20418-3:2020(F)
©
ISO 2020
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Publié en Suisse
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ISO 20418-3:2020(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Symboles et abréviations . 2
5 Principe . 3
6 Réactifs . 3
7 Appareillage . 3
8 Méthode d’essai . 4
8.1 Échantillonnage . 4
8.2 Identification préliminaire . 4
8.3 Lavage pour dégraissage . 4
8.4 Réduction en poudre des fibres . 4
8.5 Digestion à la trypsine . 4
8.6 Marqueurs peptidiques . 5
8.7 Analyse LC-MS . 5
8.8 Évaluation de la validité des données observées . 6
8.9 Calcul du facteur de correction . 6
8.9.1 Facteur de correction . 6
8.9.2 Facteur de correction de Cac1 vis-à-vis de Mou1 et de Yac1 (kc) . 6
8.9.3 Facteur de correction de Yac2 vis-à-vis de Mou2, Mou3 et de Cac2 (ky) . 6
8.9.4 Facteur de correction de l’alpaga et du chameau (ka) . 6
8.9.5 Facteur de correction de l’angora (kr) . 7
8.10 Calcul des proportions de mélange . 7
8.10.1 Calcul des proportions de mélange du cachemire, de la laine de mouton et
du yack . 7
8.10.2 Calcul avec Mou1, Cac1, Yac1 et kc . 7
8.10.3 Calcul avec Mou2, Mou3, Cac2, Yac2 et ky . 7
8.10.4 Calcul avec Mou1, Mou2, Mou3, Cac2, Yac1 . 8
8.10.5 Calcul des proportions de mélange de chameau, d’alpaga et d’angora . 8
9 Rapport d’essai . 9
Annexe A (informative) Marqueurs peptidiques de fibres de cachemire, de laine de mouton
et de yack .11
Annexe B (informative) Exemple de conditions d’analyse LC-MS .14
Annexe C (informative) Analyse de fibres de chameau, d’alpaga et d’angora .17
Annexe D (informative) Exemple de chromatogrammes de masse de marqueurs peptidiques .20
Annexe E (informative) Résultats de l’étude interlaboratoires .24
Bibliographie .26
© ISO 2020 – Tous droits réservés iii
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ISO 20418-3:2020(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le Comité technique ISO/TC 38, Textiles, en collaboration avec le
Comité technique CEN/TC 248, Textiles et produits textiles, du Comité européen de normalisation (CEN)
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20418 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO 20418-3:2020(F)
Introduction
Le cachemire est une fibre fine et longue obtenue à partir des poils des chèvres cachemire, qui est
coûteuse du fait de sa haute qualité et de sa rareté. Des cas de non-conformité de l’étiquetage ou
d’adultération d’articles en cachemire qui intègrent d’autres fibres animales moins onéreuses telles que
la laine de mouton et le yack ont été régulièrement signalés dans le monde entier.
Des méthodes officielles actuelles permettant d’identifier les différentes fibres animales s’appuient sur
une observation au microscope. Toutefois, l’identification au microscope est devenue de plus en plus
difficile du fait d’un emploi plus large de traitements chimiques ou physiques au cours du procédé de
fabrication. Au vu de ces problèmes, plusieurs autres méthodes ont également été étudiées visant soit à
différencier les structures des fibres par spectroscopie dans le proche infrarouge ou par spectroscopie
térahertz, soit à différencier des séquences ADN par réaction en chaîne par polymérase. Néanmoins,
chaque méthode présente des limitations sur le plan de l’application pratique. Par conséquent, il est
nécessaire de mettre au point de nouvelles méthodes d’identification.
Les fibres animales se composent principalement de protéines appelées kératines ainsi que de
certaines protéines associées. De ce fait, les méthodes d’identification les plus prometteuses reposent
sur l’analyse des protéines contenues dans les textiles. Habituellement, les protéines sont analysées
en étant soumises à une digestion par la trypsine afin de les transformer en molécules plus petites,
c’est-à-dire en peptides, qui sont ensuite caractérisés par spectrométrie de masse. Par conséquent, les
méthodes d’identification au moyen d’un spectromètre de masse à désorption/ionisation laser assistée
par matrice avec analyseur à temps de vol ou d’un système de chromatographie en phase liquide
couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS, acronyme issu de l'anglais «liquid chromatography–mass
spectrometry») ont été étudiées. Ce dernier type d’appareillage, par comparaison au premier type
d’appareillage, est moins onéreux et les laboratoires d’essai en sont plus fréquemment équipés du fait de
la polyvalence de cet instrument analytique. De plus, la LC-MS permet d’analyser de grandes quantités
et est donc préférable pour calculer les proportions de mélange de fibres animales.
Les kératines sont hautement insolubles du fait des liaisons disulfure qu’elles tendent à former, tant
sur le plan intramoléculaire que sur le plan intermoléculaire. C’est la raison pour laquelle les kératines
sont généralement extraites en présence d’agents réducteurs. Toutefois, cette étape de réduction est
chronophage et complexe. Le présent document spécifie une méthode alternative reposant sur la
sélection de peptides exempts de cystéine à titre de marqueurs d’identification, éliminant de ce fait la
nécessité d’avoir recours à l’étape de réduction et permettant une préparation rapide des échantillons
de LC-MS.
L’ISO 20418-1 et le présent document traitent tous deux de l’analyse par LC-MS, mais diffèrent quant
à la méthode d’extraction des peptides. Dans l’ISO 20418-1, les protéines sont dans un premier temps
extraites des fibres à l’aide d’une solution de thiourée/urée/dithiothréitol (DTT), puis sont coupées
par digestion à la trypsine afin d’obtenir des peptides. Dans le procédé décrit ici, les peptides sont
directement extraits par digestion à la trypsine des fibres réduites en poudre de manière mécanique.
Cette méthode s’est avérée très utile même pour analyser des échantillons hautement transformés
et peut être appliquée à différents types de poils animaux, tels que les poils de chèvre (cachemire ou
mohair), la laine ou le yack.
© ISO 2020 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 20418-3:2020(F)
Textiles — Analyse protéomique qualitative et quantitative
de certaines fibres animales —
Partie 3:
Détection des peptides par LC-MS sans réduction protéique
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode qualitative et quantitative pour déterminer la composition
des mélanges de fibres animales – poils - (composés de laine, de cachemire, de yack, d’alpaga, de
chameau ou d’angora) par LC-MS sans réduction protéique.
NOTE 1 La composition des fibres autres que les poils animaux peut être mesurée conformément à l’ISO 1833
(toutes les parties). Les résultats de ces deux méthodes sont ensuite combinés pour déterminer la composition
globale des fibres.
La méthode repose sur une identification préliminaire, par microscopie optique, de toutes les fibres
[4]
présentes dans le mélange sur la base de leur morphologie, conformément à l’ISO/TR 11827 . Elle n’est
pas applicable si des fibres de la même espèce animale (telles que des mélanges de cachemire et de
mohair) sont présentes.
NOTE 2 Dans ce cas, l’analyse quantitative est réalisée par microscopie [tel que décrit dans l’ISO 17751 (toutes
les parties), par exemple].
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements)
ISO 1833-1, Textiles — Analyse chimique quantitative — Partie 1: Principes généraux des essais
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 17751 (toutes les parties), Textiles — Analyse quantitative du cachemire, de la laine, d’autres fibres
animales spéciales et leurs mélanges
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse http:// www .electropedia .org/ .
3.1
fibre animale (poil)
type de fibre de kératine destiné à un usage textile, tel que la laine, le cachemire, le yack, l’alpaga, le
chameau ou l’angora
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ISO 20418-3:2020(F)
3.2
Bovidae
famille biologique regroupant les mammifères ruminants biongulés, incluant la chèvre cachemire, le
mouton et le yack
3.3
Camelidae
famille biologique regroupant les mammifères ongulés à nombre de doigts pair, incluant le chameau et
l’alpaga
3.4
protéine
polymère d’acides aminés qui joue de nombreux rôles essentiels dans le corps
3.5
peptide
petite protéine (3.4) composée de moins de 50 acides aminés environ
3.6
marqueur peptidique
partie d’une protéine (3.4) utilisée pour son identification, sa récupération et sa purification
3.7
chromatogramme de masse
chromatogramme pour un rapport masse sur charge donné
3.8
chromatogramme correspondant aux ions totaux
TIC
chromatogramme dont chaque point de donnée est créé en additionnant les intensités de tous les pics
de spectres de masse appartenant au même balayage
3.9
détection d’ions sélectionnés
mode SIM
mode de balayage de spectrométrie de masse dans lequel le spectromètre ne reçoit/ne détecte qu’une
plage limitée de rapport m/z
4 Symboles et abréviations
A surface d’un pic
W proportion de mélange
Br proportion de Bovidae
Cr proportion de Camelidae
ka facteur de correction de l’alpaga et du chameau
kc facteur de correction du cachemire
kr facteur de correction de l’angora
ky facteur de correction du yack
m/z rapport masse sur charge, où m est la masse, exprimée en unité de masse atomique, et z est le
nombre de charges des ions
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5 Principe
Les fibres réduites en poudre de manière mécanique sont directement soumises à une digestion à la
trypsine sans réduction préalable. L’analyse des peptides résultant de la digestion est réalisée par
LC-MS. La composition en pourcentage est calculée à partir des surfaces des pics des marqueurs
peptidiques propres aux espèces.
6 Réactifs
Les réactifs de qualité analytique suivants doivent être utilisés.
6.1 Acétone, d’une pureté supérieure ou égale à 99,5 %.
6.2 Eau, de qualité 3 tel que spécifié dans l’ISO 3696.
6.3 Solution de bicarbonate d’ammonium (NH HCO ) (25 mmol/l)
4 3
— 197,5 mg de NH HCO , d’une pureté supérieure ou égale à 96,0 %.
4 3
— Compléter à 100 ml en ajoutant de l’eau (6.2).
6.4 Trypsine, trypsine porcine de qualité pour séquençage, modifiée par méthylation réductive.
6.5 Acétonitrile, d’une pureté supérieure ou égale à 99,8 %.
6.6 Acide formique, d’une pureté supérieure ou égale à 98 %.
6.7 Solution de trypsine
— 20 μg de trypsine (6.4).
— 200 μl d’acide formique à 0,1 % (6.6).
7 Appareillage
Appareillage de laboratoire habituel et, en particulier, ce qui suit.
7.1 Chauffe-ballon, pouvant fonctionner dans une plage de température de 50 °C à 150 °C.
7.2 Broyeur, broyeur à billes, broyeur cryogénique ou dispositif équivalent, capable de broyer des
matières en une poudre extrêmement fine.
7.3 Membrane filtrante, pour solutions aqueuses, présentant une taille de pores de 0,45 µm.
7.4 Bloc chauffant, permettant de chauffer des microtubes à 37 °C.
7.5 Agitateur de type vortex pour tube, permettant d’agiter au vortex le contenu de microtubes et de
flacons pour LC pendant environ 30 min.
7.6 Évaporateur centrifuge, capable de fournir 5 000 g.
7.7 LC-MS, système de chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse, capable
de détecter des m/z (u) compris entre 200 et 1 500.
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NOTE (u) désigne l’unité de masse atomique unifiée, unité SI.
7.8 Flacon pour LC, qui doit être constitué de verre ou de polyméthylpentane.
7.9 Colonne de LC, colonne de chromatographie en phase inverse, composée de silice greffée par des
chaînes octadécyle (C-18).
7.10 Balance, d’une résolution d’au moins 0,001 g.
7.11 Ballon de récupération (ballon poire ou ballon à fond rond).
8 Méthode d’essai
8.1 Échantillonnage
L’exigence générale est que la prise d’essai doit être représentative du lot de matière dont elle est issue.
La méthode d’obtention d’une prise d’essai de fibres dépend de la forme de l’échantillon. Les termes
relatifs à l’échantillonnage pour les divers types d’échantillons doivent être conformes à l’ISO 1833-1.
8.2 Identification préliminaire
L’analyse qualitative préliminaire de la fibre animale (poil) doit être réalisée d’après sa morphologie
déterminée par microscopie optique, conformément à l’ISO 17751 (toutes les parties), après élimination
de toute fibre non animale.
8.3 Lavage pour dégraissage
8.3.1 Chauffer à reflux 1 g des fibres dans 200 ml d’acétone (6.1) dans un ballon de récupération (7.11)
placé dans un chauffe-ballon (7.1) pendant 30 min. Cette étape de lavage peut être omise pour des
échantillons propres. La quantité des fibres peut être modifiée.
8.3.2 Extraire les fibres dégraissées du ballon de récupération et les laisser sécher à l’air. La méthode
[5]
de préparation des échantillons de l’ISO 20418-1 peut être utilisée à la place.
8.4 Réduction en poudre des fibres
Broyer l’échantillon de fibres séché (8.3.2) à l’aide d’un broyeur (7.2) jusqu’à obtention d’une poudre
fine avec une longueur moyenne de fibre de 100 µm ou moins, la longueur étant vérifiée au microscope,
et homogénéiser avec soin pour garantir un échantillonnage représentatif des fibres.
8.5 Digestion à la trypsine
8.5.1 Peser environ 10 mg de l’échantillon broyé et l’introduire dans un microtube. Pour une prise
d’essai dépassant 10 mg, augmenter de manière proportionnelle les volumes de solution de NH HCO
4 3
en 8.5.2 et de solution de trypsine en 8.5.3.
8.5.2 Ajouter 300 µl de la solution de NH HCO (6.3) et agiter au vortex de 10 min à 30 min.
4 3
8.5.3 Ajouter 10 µl de la solution de trypsine (6.7) à l’échantillon et incuber à 37 °C de 20 h à 24 h.
8.5.4 Centrifuger la solution tryptique pendant 3 min dans l’évaporateur centrifuge (7.6). Filtrer le
surnageant sur une membrane filtrante (7.3) pour éliminer les fibres résiduelles.
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NOTE Un filtre à centrifuger, un filtre seringue ou un autre dispositif de filtration peuvent être utilisés.
8.5.5 Transférer la solution dans un flacon pour LC, puis la sécher dans un évaporateur centrifuge (7.6).
Si le flacon pour LC ne s’insère pas dans l’évaporateur, il est possible d’évaporer la solution dans d’autres
types de contenants, par exemple dans un microtube. L’échantillon est transféré dans un flacon pour LC
après dissolution. À titre d’alternative à l’évaporateur centrifuge, un lyophilisateur ou un flux d’azote
peuvent être utilisés comme méthode de séchage.
8.5.6 Ajouter 40 µl d’eau contenant de l’acide formique à 0,1 % et de l’acétonitrile à 5 % et agiter au
vortex pendant 30 min en vue des mesurages ultérieurs par LC-MS. L’agitation au vortex ne doit pas être
remplacée par une sonication lorsque l’échantillon pour LC-MS est dissous.
8.6 Marqueurs peptidiques
8.6.1 Sélectionner les peptides à utiliser comme marqueurs pour une identification différentielle
de fibres, comme spécifié à l’Annexe A et à l’Annexe C. Le résultat de l’identification préliminaire par
microscopie (8.2) et le Tableau 1 peuvent servir de références pour cette sélection.
Tableau 1 — Corrélation entre marqueurs peptidiques et taxons d’animaux identifiables
Espèce Famille Classe
Fibre
a
Nom Marqueur Nom Marqueur Nom Marqueur
Mou1,
Laine de mouton Ovis aries
(Mou2, Mou3)
Cachemire/ Bovidae Fbv1
Capra hircus Cac1, (Cac2)
mohair
Yack Bos grunniens Yac1, (Yac2)
Mammalia Cmm1
Alpaga Vicugna pacos Alp1, (Alp2)
Camelidae Fcm1
Chameau Camelus ferus Cha1, (Cha2)
Oryctolagus cuni-
Lapin angora Ang1, (Ang2) Leporidae —
culus
a
Les marqueurs peptidiques portant le suffixe 1 sont préférables pour une analyse quantitative.
8.6.2 Optimiser les paramètres de LC-MS et confirmer les temps de rétention des pics cibles soit à
l’aide de peptides synthétisés (présentant les séquences d’acides aminés spécifiées dans l’Annexe A et
dans l’Annexe C), soit à l’aide de peptides extraits d’échantillons de fibres animales pures.
8.7 Analyse LC-MS
8.7.1 Injecter 5 µl d’échantillon dans une colonne de LC (7.9). Utiliser de l’eau contenant de l’acide
formique à 0,1 % et de l’acétonitrile contenant de l’acide formique à 0,1 % de sorte à former un
gradient de concentration croissante en acétonitrile pour la chromatographie. La concentration initiale
d’acétonitrile est de 5 %. Un exemple de paramètres de LC est donné dans l’Annexe B.
8.7.2 Faire fonctionner le spectromètre de masse en mode SIM. Les marqueurs sélectionnés
(de préférence ceux portant le suffixe 1) qui sont décrits dans l’Annexe A et dans l’Annexe C doivent être
recherchés. Un exemple de paramètres de MS est donné dans l’Annexe B.
8.7.3 Intégrer la surface du pic de chaque marqueur peptidique. Les pics des marqueurs peptidiques
complémentaires (ceux portant les suffixes 2 et 3), qui sont également décrits dans l’Annexe A et dans
l’Annexe C, peuvent être utilisés lorsqu’il est difficile d’intégrer le pic cible.
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8.8 Évaluation de la validité des données observées
Voir Annexe C.
8.9 Calcul du facteur de correction
8.9.1 Facteur de correction
Il n’est pas escompté que les surfaces des pics des marqueurs peptidiques soient proportionnelles
aux quantités de fibres animales correspondantes dans les combinaisons suivantes de marqueurs
peptidiques, pour plusieurs raisons telles que la différence des espèces protéiques desquelles chaque
marqueur peptidique est issu (voir 8.9.2). En pareils cas, il convient de définir expérimentalement un
facteur de correction pour un peptide vis-à-vis des autres peptides en vue de la quantification de leurs
proportions de mélange. En outre, il convient de redéfinir le facteur de correction en cas de modification
des conditions d’analyse.
8.9.2 Facteur de correction de Cac1 vis-à-vis de Mou1 et de Yac1 (kc)
8.9.2.1 Analyser des échantillons de mélange composés, en rapport massique, de 50 % de cachemire et
de 50 % de laine de mouton au moins trois fois.
8.9.2.2 Calculer la valeur de A /A à partir de la surface du pic de Mou1 (A ) et de la surface
mou1 cac1 mou1
du pic de Cac1 (A ) pour chaque analyse.
cac1
8.9.2.3 Le facteur de correction du cachemire (kc) doit être établi en calculant la moyenne de tous
les A /A .
mou1 cac1
8.9.3 Facteur de correction de Yac2 vis-à-vis de Mou2, Mou3 et de Cac2 (ky)
8.9.3.1 Analyser des échantillons de mélange composés, en rapport massique, de 50 % de cachemire et
de 50 % de laine de mouton au moins trois fois.
8.9.3.2 Calculer la valeur de A /A à partir de la surface du pic de Cac2 (A ) et de la surface du
cac2 yac2 cac2
pic de Yac2 (A ) pour chaque analyse.
yac2
8.9.3.3 Le facteur de correction du yack (ky) doit être établi en calculant la moyenne de tous
les A /A .
cac2 yac2
8.9.4 Facteur de correction de l’alpaga et du chameau (ka)
8.9.4.1 Analyser des échantillons de mélange composés, en rapport massique, de 50 % d’alpaga et
de 50 % de laine de mouton au moins trois fois.
8.9.4.2 Calculer la valeur de A /A à partir de la surface du pic de Fbv1 (A ) et de la surface du
fbv1 fcm1 fbv1
pic de F (A ) pour chaque analyse.
cm1 fcm1
8.9.4.3 Le facteur de correction de l’alpaga et du chameau (ka) doit être établi en calculant la moyenne
de tous les A /A .
fbv1 fcm1
EXEMPLE Voir Annexe C.
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8.9.5 Facteur de correction de l’angora (kr)
8.9.5.1 Analyser des échantillons de mélange composés, en rapport massique, de 50 % d’angora et
de 50 % de laine de mouton au moins trois fois.
8.9.5.2 Calculer la valeur de A /A à partir de la surface du pic de Fbv1 (A ) et de la surface du
fbv1 ang1 fbv1
pic de Ang1 (A ) pour chaque analyse.
ang1
8.9.5.3 Le facteur de correction de l’angora (kr) doit être établi en calculant la moyenne de tous
les A /A .
fbv1 ang1
EXEMPLE Voir Annexe C.
8.10 Calcul
...
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