ISO 15302:1998

Animal and vegetable fats and oils — Determination of benzo[a]pyrene content — Reverse-phase high-performance liquid chromatography method

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la teneur en benzo[a]pyrène — Méthode par chromatographie liquide à haute performance à polarité de phase inversée

La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination du benzo[a]pyrène dans les corps gras comestibles bruts ou raffinés par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à polarité de phase inversée par détection fluorimétrique, dans la gamme de 0,1 µg/kg à 10 µg/kg.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 17-Jun-1998
• Withdrawal Date: 17-Jun-1998
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 10-Dec-2007

Relations

• Revised: ISO 15302:2007 - Animal and vegetable fats and oils — Determination of benzo[a]pyrene — Reverse-phase high performance liquid chromatography method
• Effective Date: 15-Apr-2008
• Consolidated By: ISO 2419:2006 - Leather — Physical and mechanical tests — Sample preparation and conditioning
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15302
First edition
1998-07-01
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of benzo[a]pyrene content —
Reverse-phase high-performance liquid
chromatography method
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la teneur en
benzo[a]pyrène — Méthode par chromatographie liquide à haute
performance à polarité de phase inversée
Reference number
A
ISO 15302:1998(E)

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15302:1998(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 15302 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 11, Animal and
vegetable fats and oils.
Annexes A and B of this International Standard are for information only.
©  ISO 1998
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Switzerland
Internet [e-mail]
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii

---------------------- Page: 2 ----------------------
©
INTERNATIONAL STANDARD  ISO ISO 15302:1998(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
benzo[a]pyrene content — Reverse-phase high-performance liquid
chromatography method
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of benzo[a]pyrene in crude or refined edible
oils and fats by reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) using fluorimetric detection in the
range from 0,1 μg/kg to 10 μg/kg.
2 Normative reference
The following standard contains provisions, which through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication the edition indicated was valid. All standards are subject to revision
and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the possibility of
applying the most recent edition of the standard indicated below. Members of IEC and ISO maintain registers of
currently valid International Standards.
ISO 661:1989, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Principle
Adsorption of a suitable amount of sample on an alumina column, followed by elution with light petroleum of any
benzo[a]pyrene present, and subsequent analysis of the eluate by HPLC using a fluorimetric detector.
4 Reagents
All reagents shall be of recognized analytical grade. Where analytical grade solvents other than the recommended
ones are used, a full blank analysis shall be carried out and the results of this blank analysis reported.
4.1  Water, double distilled, filtered through a membrane filter of 0,45 μm pore size; deionized water obtained by
purifying demineralized water systems may also be used.
4.2  Light petroleum (boiling point range between 40 °C and 60 °C), or hexane, redistilled over potassium
hydroxide pellets (4 g/l).
4.3  Acetonitrile, suitable for HPLC.
4.4  Tetrahydrofuran, suitable for HPLC.
4.5  Toluene, suitable for HPLC.
4.6  Sodium sulfate, granular, anhydrous.
1

---------------------- Page: 3 ----------------------
©
ISO
ISO 15302:1998(E)
4.7  Alumina, activity grade 4, prepared from neutral aluminium oxide, activity grade super 1, deactivated by the
addition of 10 ml distilled water to 90 g of alumina.
CAUTION — THE REACTION IS EXOTHERMIC AND PRESSURE MAY BUILD UP.
Shake the container for about 15 min and allow the contents to equilibriate for 24 h. Store the alumina in a closed
vessel at ambient temperature.
4.8  Benzo[a]pyrene, 99,0 % purity.
CAUTION — BENZO[a]PYRENE IS A KNOWN CARCINOGEN. CARRY OUT ALL WORK WITH IT IN A FUME
HOOD, WEARING GLOVES TO MINIMIZE EXPOSURE.
1)
4.9  Benzo[a]pyrene solutions
4.9.1  Stock solution
Weigh, to the nearest 0,1 mg, about 12,5 mg of benzo[a]pyrene in a 25 ml graduated flask. Dissolve it in toluene
(4.5) and fill to the mark.
This solution contains about 0,5 mg/ml benzo[a]pyrene and should be stored in the dark at 4 °C when it is stable for
6 months at least.
4.9.2  Standard solutions
Prepare two standard solutions containing approximately 0,2 μg/ml and 0,01 μg/ml of benzo[a]pyrene respectively
by diluting aliquots of the stock solution (4.9.1) with acetonitrile (4.3).
5 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
5.1  Glass column for chromatography, 300 mm long, 15 mm internal diameter, fitted with sintered glass discs,
and polytetrafluoroethylene (PTFE) tap.
5.2  Water baths (two), maintained at 35 °C – 1°C and 65 °C – 1°C.
5.3  Flash evaporator
A rotary evaporator with vacuum and a water bath set at 40 °C may be used. Care should be taken to prevent cross
contamination. Clean the system thoroughly between determinations.
5.4  High-performance liquid chromatograph, consisting of an HPLC pump, injection valve with 10 μl sample
loop, reverse-phase column, electronic integrator and chart recorder.
NOTE If an autosampler is used, the sample loop should be flushed with acetonitrile between subsequent injections.
___________
1)  A suitable reference material is available from the Commission of the European Community Bureau of Reference (BCR),
rue de la Loi 200, B-1049, Brussels, Belgium.
2

---------------------- Page: 4 ----------------------
©
ISO
ISO 15302:1998(E)
5.5  Columns for HPLC analysis
5.5.1  Reverse-phase guard column, capable of resolving benzo[a]pyrene from co-extractives, together with
appropriate precolumn [e.g. stainless-steel precolumn 75 mm long, 4,6 mm internal diameter, packed with
2)
Lichrosorb RP-18 (5 μm particle size).
5.5.2  HPLC reverse-phase column, 250 mm long, of 4,6 mm internal diameter (stainless steel), for polycyclic
3)
aromatic hydrocarbons (PAHs) (e.g. Chromspher 5 PAH or Vydac 201 TP5).
5.6  Fluorescence detector, with emission wavelength at 406 nm (slit 10 nm) and excitation wavelength at 384 nm
(slit 10 nm). The detector shall be capable of the required performance to carry out the analysis.
5.7  Crimp-top minivials, of about 1 ml volume, with Teflon-layered septa and aluminium caps.
5.8  Hand crimper, for crimping the caps onto the vials.
5.9  Disposable pipettes
6 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method is
given in ISO 5555.
It is important the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or changed
during transport or storage.
7 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 661.
8 Procedure
8.1 Clean up of sample
8.1.1  Weigh, to the nearest 0,001 g, about 2 g of the oil sample into a 10 ml graduated flask. Dissolve in light
petroleum (4.2) and dilute to the mark.
8.1.2  Fill the chromatography column (5.1) to half its height with light petroleum (4.2). Rapidly weigh 22 g of
alumina (4.7) into a small beaker and transfer the alumina immediately to the column, promoting settling of the
alumina by gently tapping the column.
8.1.3  Add anhydrous sodium sulfate (4.6) to the top of the column to form a layer about 30 mm deep.
8.1.4  Open the tap and allow the light petroleum to fall to the level of the top of the sodium sulfate layer.
8.1.5  Place a 20 ml graduated flask under the column.
8.1.6  Pipette 2,00 ml of the oil solution (8.1.1) onto the column. Rinse the column with minimal amounts of light
petroleum, allowing the solvent layer to run into th
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 15302
Première édition
1998-07-01
Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination de la teneur en
benzo[a]pyrène — Méthode par
chromatographie liquide à haute
performance à polarité de phase inversée
Animal and vegetable fats and oils — Determination of benzo[a]pyrene
content — Reverse-phase high-performance liquid chromatography method
A
Numéro de référence
ISO 15302:1998(F)

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15302:1998(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 15302 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 11, Corps
gras d'origines animale et végétale.
Les annexes A et B de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d'information.
©  ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet [e-mail]
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii

---------------------- Page: 2 ----------------------
©
NORME INTERNATIONALE  ISO ISO 15302:1998(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la
teneur en benzo[a]pyrène — Méthode par chromatographie liquide
à haute performance à polarité de phase inversée
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination du benzo[a]pyrène dans les corps gras
comestibles bruts ou raffinés par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à polarité de phase
inversée par détection fluorimétrique, dans la gamme de 0,1 μg/kg à 10 μg/kg.
2 Référence normative
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, l'édition indiquée était en
vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente Norme
internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l'édition la plus récente de la norme indiquée
ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur à un
moment donné.
ISO 661:1989, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai.
3 Principe
Adsorption d'une quantité appropriée d'échantillon sur une colonne d'alumine, puis élution à l'éther de pétrole de
tout benzo[a]pyrène présent et analyse consécutive de l'éluat par CLHP à l'aide d'un détecteur fluorimétrique.
4 Réactifs
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue. Lors de l'utilisation de solvants ayant une qualité
analytique autre que celle recommandée, effectuer un essai à blanc et consigner les résultats de cet essai.
4.1 Eau, ayant fait l'objet d'une double distillation, filtrée à travers un microfiltre moléculaire ayant des pores de
0,45 μm; de l'eau déionisée, obtenue à partir de systèmes de déminéralisation d'eau, peut également être utilisée.
4.2 Éther de pétrole (point d'ébullition se situant dans une plage comprise entre 40 °C et 60 °C) ou hexane
redistillé sur des pastilles d'hydroxyde de potassium (4 g/l).
4.3 Acétonitrile, pour CLHP.
4.4 Tétrahydrofurane, pour CLHP.
4.5 Toluène, pour CLHP.
4.6 Sulfate de sodium, anhydre, en grains.
1

---------------------- Page: 3 ----------------------
©
ISO 15302:1998(F) ISO
4.7 , activité 4, préparée à partir d'oxyde d'aluminium neutre, activité supérieure à 1, désactivée par
Alumine
addition de 10 ml d'eau distillée à 90 g d'alumine.
AVERTISSEMENT — LA RÉACTION EST EXOTHERMIQUE ET IL PEUT Y AVOIR ACCUMULATION DE
PRESSION.
Agiter le conteneur pendant 15 min environ et laisser le contenu parvenir à l'équilibre pendant 24 h. Conserver
l'alumine dans un récipient fermé à température ambiante.
4.8 Benzo[a]pyrène, pur à 99,0 %.
AVERTISSEMENT — LE BENZO[a]PYRÈNE EST UN CARCINOGÈNE BIEN CONNU. IL CONVIENT DE
L'UTILISER SOUS HOTTE POUR TOUS LES TRAVAUX, EN PORTANT DES GANTS AFIN DE RÉDUIRE
L'EXPOSITION AU MINIMUM.
1)
4.9 Solutions de benzo[a]pyrène
4.9.1  Solution mère
Peser, à 0,1 mg près, environ 12,5 mg de benzo[a]pyrène dans une fiole jaugée de 25 ml, les dissoudre dans le
toluène (4.5) et remplir jusqu'au trait.
Cette solution contient environ 0,5 mg/ml de benzo[a]pyrène. Elle se conserve pendant au moins six mois dans
l'obscurité à 4 °C.
4.9.2  Solutions étalons
Préparer deux solutions étalons contenant respectivement à peu près 0,2 μg/ml et 0,01 μg/ml de benzo[a]pyrène en
diluant les parties aliquotes de la solution mère (4.9.1) avec de l'acétonitrile (4.3).
5 Appareillage
Appareillage courant de laboratoire et notamment:
5.1 Colonne de chromatographie en verre, de 300 mm de longueur, 15 mm de diamètre intérieur, munie de
disques en verre fritté et d'un robinet en polytétrafluoroéthylène (PTFE).
5.2 Bains d'eau (deux), maintenus à 35 °C ± 1 °C et 65 °C ± 1 °C.
5.3 Évaporateur rotatif
Il est permis d'utiliser un évaporateur rotatif sous vide et un bain d'eau à 40 °C. Il convient de veiller à empêcher
toute contamination croisée. Nettoyer soigneusement le système entre les déterminations.
5.4 Chromatographe liquide à haute performance, comprenant une pompe CLHP, une vanne d'injection avec
boucle d'échantillonnage de 10 μl, une colonne à polarité de phase inversée, un intégrateur électronique et un
enregistreur de diagramme.
NOTE  En cas d'utilisation d'un autoéchantillonneur, il convient de rincer la boucle d'échantillonnage à l'acétonitrile entre les
injections consécutives.

1)  Un matériau de référence approprié est disponible au Bureau de Référence de la Commission des Communautés
Européennes (BCR), rue de la Loi 200, B-1049 Bruxelles, Belgique.
2

---------------------- Page: 4 ----------------------
©
ISO ISO 15302:1998(F)
5.5 Colonnes d'analyse CLHP
5.5.1  Colonne de garde à polarité de phase inversée, pouvant séparer le benzo[a]pyrène des coextraits, ainsi
que précolonne appropriée [par exemple en acier inoxydable, de 75 mm de longueur, 4,6 mm de diamètre intérieur,
2)
garnie de Lichrosorb RP-18 (granulométrie de 5 μm)].
5.5.2  Colonne CLHP à polarité de phase inversée, de 250 mm de longueur, 4,6 mm de diamètre intérieur (acier
inoxydable), pour hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) (par exemple Chromspher 5 PAH ou Vydac 201
3)
TP5) .
5.6 Détecteur fluorimétrique, avec une longueur d'onde d'émission à 406 nm (fente de 10 nm) et une longueur
d'onde d'excitation à 384 nm (fente de 10 nm). Le détecteur doit présenter les performances requises pour réaliser
l'analyse.
5.7 Miniflacons à bord serti, d'un volume d'environ 1 ml, munis de septums recouverts d'une couche de Teflon et
de bouchons en aluminium.
5.8 Sertisseuse manuelle, permettant de sertir les bouchons sur les flacons.
5.9 Pipettes jetables.
6 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une méthode
d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 5555.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l'entreposage.
7 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à l'ISO 661.
8 Mode opératoire
8.1 Récupération de l'échantillon
8.1.1  Peser environ 2 g d'échantillon de corps gras, à 0,001 g près, et les verser dans une fiole jaugée de 10 ml.
Dissoudre dans l'éther de pétrole (4.2) et diluer jusqu'au trait.
8.1.2  Remplir la colonne de chromatographie (5.1) jusqu'à mi-hauteur d'éther de pétrole (4.2). Peser rapidement
22 g d'alumine (4.7), les verser dans un petit bécher et transvaser immédiatement l'alumine dans la colonne, en
accélérant la décantation de l'alumine en tapotant doucement la colonne.
8.1.3  Ajouter le sulfate de sodium anhydre (4.6) jusqu'en haut de la colonne afin de constituer une couche
d'environ 30 mm d'épaisseur.

2)  Le Lichrosorb RP-18 est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée à
l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande
l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
3)  Chromspher 5 PAH et Vydac 201 TP5 sont des exemples de produits
...