ISO 10706:2000
(Main)Water quality — Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
Water quality — Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
This International Standard describes a method for the determination of the long term sublethal toxicity to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) of: a) chemical substances, which are soluble under the conditions of the test, or can be maintained as stable suspensions or dispersions under the conditions of the test, b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, after decanting, filtration, or centrifugation, c) surface or ground waters. NOTE This International Standard is adapted from OECD Guideline 211[1].
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité à long terme de substances vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
La présente Norme internationale décrit une méthode pour la détermination de la toxicité sublétale à long terme vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) des substances suivantes: a) substances chimiques solubles dans les conditions de l'essai ou pouvant être maintenues en suspension ou en dispersion stable dans les conditions de l'essai; b) effluents industriels ou urbains, épurés ou non, s'il y a lieu après décantation, filtration ou centrifugation; c) eaux de surface ou eaux souterraines. NOTE La présente Norme internationale est adaptée de la Ligne directrice 211 de l'OCDE [1].
Kakovost vode - Določevanje dolgotrajne strupenosti snovi z Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
Ta mednarodni standard opisuje metodo določevanja dolgotrajne subletalne strupnosti snovi z Daphnia magnaStraus (Cladocera, Crustacea) za:
a) kemične substance, ki so topne pod pogoji preskusa oziroma se lahko ohranjajo kot stabilne suspenzije ali disperzije pod pogoji preskusa,
b) industrijske ali komunalne odplake, obdelane ali neobdelane, po pretočitvi, filtraciji ali centrifugiranju,
c) površinske in podtalne vode.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10706
First edition
2000-04-01
Water quality — Determination of long term
toxicity of substances to Daphnia magna
Straus (Cladocera, Crustacea)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité à long terme de substances
vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
Reference number
ISO 10706:2000(E)
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ISO 2000
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ISO 10706:2000(E)
Contents Page
Foreword.iv
Introduction.v
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Principle.1
4 Test environment.1
5 Reagents and materials .2
6 Apparatus .3
7 Treatment and preparation of samples .3
7.1 Special precautions for sampling and transportation of water or effluent samples.3
7.2 Preparation of solutions of substances to be tested.3
8 Procedure .4
8.1 Controls .4
8.2 Selection of exposure concentrations .4
8.3 Renewal of exposure solutions.5
8.4 Introduction of animals into the test system .5
8.5 Feeding of organisms .5
8.6 Observations and measurements.5
8.7 Validity of the test.6
9 Data analysis and expression of results .6
10 Test report .7
Annex A (informative) OECD M4 and M7 media — Preparation and acclimation of Elendt M4 and M7
media.9
Annex B (informative) ASTM reconstituted hard fresh water.12
Annex C (informative) Data collection sheet .13
Annex D (informative) Calculation of time-weighted mean concentration.15
Bibliography.17
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ISO 10706:2000(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 10706 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 5, Biological methods.
Annexes A, B, C and D of this International Standard are for information only.
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ISO 10706:2000(E)
Introduction
This International Standard defines a procedure for the determination of the long term sublethal toxicity of
chemicals, waters and waste waters to the water-flea Daphnia magna Straus. The methodology is adapted from a
guideline produced by the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD Guideline 211, see
reference [1] in the Bibliography).
© ISO 2000 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10706:2000(E)
Water quality — Determination of long term toxicity of substances
to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
WARNING — Activated sludge and sewage contain potentially pathogenic organisms. Therefore,
appropriate precautions should be taken when handling them. Toxic test compounds and those whose
properties are unknown should be handled with care.
1 Scope
This International Standard describes a method for the determination of the long term sublethal toxicity to Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea)of:
a) chemical substances, which are soluble under the conditions of the test, or can be maintained as stable
suspensions or dispersions under the conditions of the test,
b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, after decanting, filtration, or centrifugation,
c) surface or ground waters.
[1]
NOTE This International Standard is adapted from OECD Guideline 211 .
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 5667-2, Water quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples.
3Principle
Daphnia magna females, less than 24 h old, are exposed for a period of 21 days to a test substance, industrial or
sewage effluent or surface/ground water added to dilution water in a range of concentrations in a semi-static or
flow-through system. The survival of parents is recorded together with the number of live offspring produced per
live parent at the end of the test.
The survival is reported and the reproductive output of exposed parents living at the end of the test (expressed in a
number of terms) is compared to those of the control parents.
4 Test environment
The test atmosphere shall be free from vapours or dusts which may be toxic to Daphnia magna Straus.
© ISO 2000 – All rights reserved 1
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ISO 10706:2000(E)
The exposure solutions shall not be aerated.
The dissolved oxygen concentration in the exposure solutions shall be above 3 mg/l and the pH shall be within the
range of pH 6 to pH 9 and not change by more than 1,5 pH units for the duration of the test. Hardness shall be
above 140 mg/l (as CaCO ), which has been demonstrated to be necessary to promote reproductive performance
3
that shall meet the validity criteria (see 8.7).
The photoperiod of the test shall be 16 h of light and 8 h of darkness. The intensity shall be in the range 600 lux to
800 lux but not exceeding 1 200 lux.
The temperature of the test exposures shall be maintained within the range of 18 °C to 22 °C and the temperature
for the test shall not vary by more than 2 °C (for instance 18 °C to 20 °C, 19 °C to 21 °C or 20 °C to 22 °C)
throughout the test.
5 Reagents and materials
5.1 Test organism: Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea), hereafter referred to as D. magna, obtained
by acyclical parthenogenesis for at least three generations under specified culture conditions.
The age and the source (including clone, if possible) of the D. magna culture shall be indicated in the test report,
since the sensitivity of D. magna to toxicants can be affected by the source of the culture.
The animals used for the test shall be less than 24 h old and be from the second to fifth brood. The D. magna shall
be from a healthy stock showing no signs of stress such as mortality � 20 %, presence of males, ephippia, or
discoloured animals and there shall be no delay in the production of the first brood.
The stock animals shall be maintained in culture conditions (light, temperature, medium, feeding and animals per
unit volume) similar to those in the test. If the culture conditions differ from test conditions, it is recommended that
one generation be acclimated under the test conditions for about three weeks so as to avoid stressing the parent
animals.
5.2 Dilution water, synthetic as described in 5.3 or uncontaminated natural waters with comparable pH and
hardness characteristics to these dilution waters for culturing and testing.
5.3 Synthetic dilution water, prepared using one of the following methods:
a) OECD M4 and M7 media (see informative annex A);
b) ASTM reconstituted hard freshwater (see informative annex B).
The dilution water shall be aerated until the dissolved oxygen concentration has reached 95 % saturation and the
pH has stabilized. If necessary, adjust the pH to 8,0� 0,5 by adding sodium hydroxide (NaOH) solution or
hydrochloric acid (HCl) solution. The dilution water prepared in this way shall not be further aerated before use.
It is recommended that the TOC levels be� 5 mg/l before the addition of algae. The use of dilution water containing
EDTA (for instance M4 and M7) is not recommended when testing compounds containing metals because
chelation may reduce the toxicity of the compound.
If the test has to be performed for purposes necessitating the use of a dilution water with characteristics differing
from those described above, mention is necessary in the test report of the main characteristics (for instance pH,
hardness, TOC, COD) of the synthetic dilution water used.
2 © ISO 2000 – All rights reserved
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ISO 10706:2000(E)
6 Apparatus
Ordinary laboratory apparatus and in particular the following.
6.1 Environmental controls, for controlling temperature, photoperiod and light intensity.
6.2 Measuring apparatus and/or instruments, for measuring dissolved oxygen, pH, hardness, total organic
carbon, chemical oxygen demand, light intensity and temperature.
6.3 Test containers, of chemically inert material and of sufficient capacity for the tests (for example 50 ml or
100 ml glass test tubes or beakers) and which are clean and uncontaminated.
7 Treatment and preparation of samples
7.1 Special precautions for sampling and transportation of water or effluent samples
Sampling of water or effluent shall be carried out in accordance with the general procedure specified in ISO 5667-2.
Bottles shall be completely filled to exclude air.
The preservation and storage of water or effluent samples shall be carried out in accordance with ISO 5667-16; the
following is only a summary. Carry out the toxicity test as soon as possible, ideally within 12 h of collection. If this
time interval cannot be observed, cool the sample (0 °C to 4 °C) and test the sample within 24 h. If testing cannot
be carried out within 48 h, the sample may be frozen (below�18 °C) for testing within 2 months of collection.
All portions (subsamples) shall be pretreated identically (i.e. if freezing of unstable water is necessary all portions,
including those needed for the first day, shall be frozen prior to testing; see ISO 5667-16).
Because of the duration of this test (21 days) and the periodic renewal of solutions, a sufficient number of portions
of the sample must be frozen to renew test solutions and to repeat the test, if needed (reserve samples). The
minimum volume of the frozen portions is dependent upon the toxicity of the sample to be tested. The volume of
sample needed for a semi-static test with ten daphnids exposed individually in 100 ml of undiluted sample is 9 l;
additional sample will be required for diluted exposures.
If the test is conducted on site or close to the sampling site, fresh samples may be used to replace the test
solutions. In this case the variations at the sampling site are incorporated into the test design.
7.2 Preparation of solutions of substances to be tested
7.2.1 Preparation of stock solutions
A stock solution of the substance(s) to be tested shall be prepared by dissolving a known quantity of the
substance(s) in a specified volume of dilution water, deionized water or distilled water in a glass container. The
stock solution shall be prepared immediately before preparing the exposure solutions unless the substance(s)
is/are known to be stable in defined storage conditions, in which case the stock solution may be prepared in
advance of testing and stored in these conditions.
Stock solutions or suspensions of substance(s) which are poorly soluble in water can be solubilized or dispersed
directly in the medium with ultrasonic dispersion, and/or stirring or with solvents or dispersants of low toxicity to
D. magna as discussed in ISO 5667-16. If a solvent is used, the concentration of the solvent in the stock solution
shall be such that the concentration in the highest exposure solution does not exceed 0,1 ml/l.
The use of organic solvents should be avoided. If they are required organic solvents such as acetone, ethanol,
methanol, dimethylformamide, triethylene glycol or dispersants such as Cremophor RH40, methylcellulose 0,1 %,
and HCO-40 may be used to produce a suitably concentrated stock solution. They are not toxic to D. magna at
0,1 ml/l concentrations. No single procedure for the preparation of stock solutions of poorly soluble substances can
be recommended due to the differing nature of chemicals.
© ISO 2000 – All rights reserved 3
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ISO 10706:2000(E)
7.2.2 Preparation of exposure solutions
The exposure solutions shall be prepared (8.2) by adding the stock solutions (7.2.1) or effluent samples (7.1) to the
dilution water (5.2) in specified quantities (see 8.2).
If the stock solutions are prepared in deionized or distilled water, no more than 100 ml of stock solution shall be
added to each litre of dilution water.
The chosen concentrations can also be prepared separately by the direct addition of the test substance to dilution
water where the amounts to be added can be accurately weighed out or pipetted for liquids.
If the sample pH is not between 6 and 9, the test shall be carried out after adjusting the pH to the value of the
nearest limit (6 or 9) using solutions of hydrochloric acid or sodium hydroxide.
NOTE Testing water samples at concentrations above 100 ml/l may reduce the reproduction and survival of D. magna
because of deficiency in the medium (for instance hardness). Identifying effects of such deficiencies may require the addition of
the same salts to the sample as in the dilution water.
8 Procedure
8.1 Controls
Every test shall include a control containing no test substance.
Two controls are required when a solvent or dispersant is used. One control shall contain no solvent or dispersant.
The second control shall contain a concentration of solvent or dispersant equal to that in the highest exposure
concentration.
8.2 Selection of exposure concentrations
There shall be at least five exposure concentrations arranged in a geometric series with a separation factor not
exceeding 3,2.
In setting the range of concentrations, the following shall be borne in mind:
a) if the objective is to obtain the NOEC (no observed effect concentration), the range of concentrations shall
include at least one concentration producing a significant effect compared to the control (LOEC: lowest
observed effect concentration), preceded by a NOEC.
If this is not the case, the test shall be repeated with a reduced lowest concentration. See footnote 1 to
clause 9.
b) If the objective is to obtain the EC (effect concentration producing a percentage response; typically this is
p
20 % and/or 50 %) for the effect on reproduction and survival, it is advisable that two exposure concentrations
be higher than this EC concentration (p is the percentage response selected). Otherwise, although it will still
p
be possible to estimate the EC , the confidence interval for the EC will be very wide and it may not be
p 50
possible to assess satisfactorily the adequacy of the fitted model.
NOTE Prior knowledge of the toxicity of the test substance from an acute test and/or from range-finding studies (ISO 6341)
is helpful in selecting appropriate exposure concentrations.
Where a solvent or dispersant is used to aid preparation of stock solutions, the concentration of solvent or
dispersant in the highest concentration shall not be greater than 0,1 ml/l. The concentration of solvent or dispersant
shall, as far as possible, be the same in all vessels.
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ISO 10706:2000(E)
8.3 Renewal of exposure solutions
The exposure solutions shall be renewed at least three times per week. If preliminary stability tests indicate that the
test substance concentration falls below 80 % of the initial measured concentration before day three, consideration
shall be given to either increasing the frequency of exposure solution renewal or using a flow-through test.
Changes in the frequency of solution replacement or the rate of continuous flow shall be reported.
When semi-static tests are conducted, minimize the volume of medium transferred with the D. magna.
8.4 Introduction of animals into the test system
Transfer young animals (� 24 h old) from the culture system to the test system at the beginning of the test. Place
each individual in a single vessel containing 50 ml to 100 ml of exposure solution.
Larger volumes of exposure solution may be required for chemical analysis of exposure concentrations.
Alternatively, replicates can be pooled for chemical analysis.
Semi-static testing shall require at least ten animals exposed individually to each exposure concentration and
control. Furthermore, a second series of test vessels shall be prepared at the time of solution renewal and the
parent animals are transferred to them by means of a glass pipette of suitable bore diameter.
Organisms shall be exposed for a total of 21 days.
If a continuous flow test is being conducted, this International Standard should be used f
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 10706:2010
01-september-2010
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHGROJRWUDMQHVWUXSHQRVWLVQRYL]'DSKQLDPDJQD
6WUDXV &ODGRFHUD&UXVWDFHD
Water quality - Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna
Straus (Cladocera, Crustacea)
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité à long terme de substances vis-à-vis de
Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 10706:2000
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 10706:2010 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST ISO 10706:2010
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SIST ISO 10706:2010
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10706
First edition
2000-04-01
Water quality — Determination of long term
toxicity of substances to Daphnia magna
Straus (Cladocera, Crustacea)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité à long terme de substances
vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
Reference number
ISO 10706:2000(E)
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ISO 10706:2000(E)
Contents Page
Foreword.iv
Introduction.v
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Principle.1
4 Test environment.1
5 Reagents and materials .2
6 Apparatus .3
7 Treatment and preparation of samples .3
7.1 Special precautions for sampling and transportation of water or effluent samples.3
7.2 Preparation of solutions of substances to be tested.3
8 Procedure .4
8.1 Controls .4
8.2 Selection of exposure concentrations .4
8.3 Renewal of exposure solutions.5
8.4 Introduction of animals into the test system .5
8.5 Feeding of organisms .5
8.6 Observations and measurements.5
8.7 Validity of the test.6
9 Data analysis and expression of results .6
10 Test report .7
Annex A (informative) OECD M4 and M7 media — Preparation and acclimation of Elendt M4 and M7
media.9
Annex B (informative) ASTM reconstituted hard fresh water.12
Annex C (informative) Data collection sheet .13
Annex D (informative) Calculation of time-weighted mean concentration.15
Bibliography.17
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ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
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liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
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International Standard ISO 10706 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 5, Biological methods.
Annexes A, B, C and D of this International Standard are for information only.
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This International Standard defines a procedure for the determination of the long term sublethal toxicity of
chemicals, waters and waste waters to the water-flea Daphnia magna Straus. The methodology is adapted from a
guideline produced by the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD Guideline 211, see
reference [1] in the Bibliography).
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Water quality — Determination of long term toxicity of substances
to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
WARNING — Activated sludge and sewage contain potentially pathogenic organisms. Therefore,
appropriate precautions should be taken when handling them. Toxic test compounds and those whose
properties are unknown should be handled with care.
1 Scope
This International Standard describes a method for the determination of the long term sublethal toxicity to Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea)of:
a) chemical substances, which are soluble under the conditions of the test, or can be maintained as stable
suspensions or dispersions under the conditions of the test,
b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, after decanting, filtration, or centrifugation,
c) surface or ground waters.
[1]
NOTE This International Standard is adapted from OECD Guideline 211 .
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 5667-2, Water quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples.
3Principle
Daphnia magna females, less than 24 h old, are exposed for a period of 21 days to a test substance, industrial or
sewage effluent or surface/ground water added to dilution water in a range of concentrations in a semi-static or
flow-through system. The survival of parents is recorded together with the number of live offspring produced per
live parent at the end of the test.
The survival is reported and the reproductive output of exposed parents living at the end of the test (expressed in a
number of terms) is compared to those of the control parents.
4 Test environment
The test atmosphere shall be free from vapours or dusts which may be toxic to Daphnia magna Straus.
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SIST ISO 10706:2010
ISO 10706:2000(E)
The exposure solutions shall not be aerated.
The dissolved oxygen concentration in the exposure solutions shall be above 3 mg/l and the pH shall be within the
range of pH 6 to pH 9 and not change by more than 1,5 pH units for the duration of the test. Hardness shall be
above 140 mg/l (as CaCO ), which has been demonstrated to be necessary to promote reproductive performance
3
that shall meet the validity criteria (see 8.7).
The photoperiod of the test shall be 16 h of light and 8 h of darkness. The intensity shall be in the range 600 lux to
800 lux but not exceeding 1 200 lux.
The temperature of the test exposures shall be maintained within the range of 18 °C to 22 °C and the temperature
for the test shall not vary by more than 2 °C (for instance 18 °C to 20 °C, 19 °C to 21 °C or 20 °C to 22 °C)
throughout the test.
5 Reagents and materials
5.1 Test organism: Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea), hereafter referred to as D. magna, obtained
by acyclical parthenogenesis for at least three generations under specified culture conditions.
The age and the source (including clone, if possible) of the D. magna culture shall be indicated in the test report,
since the sensitivity of D. magna to toxicants can be affected by the source of the culture.
The animals used for the test shall be less than 24 h old and be from the second to fifth brood. The D. magna shall
be from a healthy stock showing no signs of stress such as mortality � 20 %, presence of males, ephippia, or
discoloured animals and there shall be no delay in the production of the first brood.
The stock animals shall be maintained in culture conditions (light, temperature, medium, feeding and animals per
unit volume) similar to those in the test. If the culture conditions differ from test conditions, it is recommended that
one generation be acclimated under the test conditions for about three weeks so as to avoid stressing the parent
animals.
5.2 Dilution water, synthetic as described in 5.3 or uncontaminated natural waters with comparable pH and
hardness characteristics to these dilution waters for culturing and testing.
5.3 Synthetic dilution water, prepared using one of the following methods:
a) OECD M4 and M7 media (see informative annex A);
b) ASTM reconstituted hard freshwater (see informative annex B).
The dilution water shall be aerated until the dissolved oxygen concentration has reached 95 % saturation and the
pH has stabilized. If necessary, adjust the pH to 8,0� 0,5 by adding sodium hydroxide (NaOH) solution or
hydrochloric acid (HCl) solution. The dilution water prepared in this way shall not be further aerated before use.
It is recommended that the TOC levels be� 5 mg/l before the addition of algae. The use of dilution water containing
EDTA (for instance M4 and M7) is not recommended when testing compounds containing metals because
chelation may reduce the toxicity of the compound.
If the test has to be performed for purposes necessitating the use of a dilution water with characteristics differing
from those described above, mention is necessary in the test report of the main characteristics (for instance pH,
hardness, TOC, COD) of the synthetic dilution water used.
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SIST ISO 10706:2010
ISO 10706:2000(E)
6 Apparatus
Ordinary laboratory apparatus and in particular the following.
6.1 Environmental controls, for controlling temperature, photoperiod and light intensity.
6.2 Measuring apparatus and/or instruments, for measuring dissolved oxygen, pH, hardness, total organic
carbon, chemical oxygen demand, light intensity and temperature.
6.3 Test containers, of chemically inert material and of sufficient capacity for the tests (for example 50 ml or
100 ml glass test tubes or beakers) and which are clean and uncontaminated.
7 Treatment and preparation of samples
7.1 Special precautions for sampling and transportation of water or effluent samples
Sampling of water or effluent shall be carried out in accordance with the general procedure specified in ISO 5667-2.
Bottles shall be completely filled to exclude air.
The preservation and storage of water or effluent samples shall be carried out in accordance with ISO 5667-16; the
following is only a summary. Carry out the toxicity test as soon as possible, ideally within 12 h of collection. If this
time interval cannot be observed, cool the sample (0 °C to 4 °C) and test the sample within 24 h. If testing cannot
be carried out within 48 h, the sample may be frozen (below�18 °C) for testing within 2 months of collection.
All portions (subsamples) shall be pretreated identically (i.e. if freezing of unstable water is necessary all portions,
including those needed for the first day, shall be frozen prior to testing; see ISO 5667-16).
Because of the duration of this test (21 days) and the periodic renewal of solutions, a sufficient number of portions
of the sample must be frozen to renew test solutions and to repeat the test, if needed (reserve samples). The
minimum volume of the frozen portions is dependent upon the toxicity of the sample to be tested. The volume of
sample needed for a semi-static test with ten daphnids exposed individually in 100 ml of undiluted sample is 9 l;
additional sample will be required for diluted exposures.
If the test is conducted on site or close to the sampling site, fresh samples may be used to replace the test
solutions. In this case the variations at the sampling site are incorporated into the test design.
7.2 Preparation of solutions of substances to be tested
7.2.1 Preparation of stock solutions
A stock solution of the substance(s) to be tested shall be prepared by dissolving a known quantity of the
substance(s) in a specified volume of dilution water, deionized water or distilled water in a glass container. The
stock solution shall be prepared immediately before preparing the exposure solutions unless the substance(s)
is/are known to be stable in defined storage conditions, in which case the stock solution may be prepared in
advance of testing and stored in these conditions.
Stock solutions or suspensions of substance(s) which are poorly soluble in water can be solubilized or dispersed
directly in the medium with ultrasonic dispersion, and/or stirring or with solvents or dispersants of low toxicity to
D. magna as discussed in ISO 5667-16. If a solvent is used, the concentration of the solvent in the stock solution
shall be such that the concentration in the highest exposure solution does not exceed 0,1 ml/l.
The use of organic solvents should be avoided. If they are required organic solvents such as acetone, ethanol,
methanol, dimethylformamide, triethylene glycol or dispersants such as Cremophor RH40, methylcellulose 0,1 %,
and HCO-40 may be used to produce a suitably concentrated stock solution. They are not toxic to D. magna at
0,1 ml/l concentrations. No single procedure for the preparation of stock solutions of poorly soluble substances can
be recommended due to the differing nature of chemicals.
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SIST ISO 10706:2010
ISO 10706:2000(E)
7.2.2 Preparation of exposure solutions
The exposure solutions shall be prepared (8.2) by adding the stock solutions (7.2.1) or effluent samples (7.1) to the
dilution water (5.2) in specified quantities (see 8.2).
If the stock solutions are prepared in deionized or distilled water, no more than 100 ml of stock solution shall be
added to each litre of dilution water.
The chosen concentrations can also be prepared separately by the direct addition of the test substance to dilution
water where the amounts to be added can be accurately weighed out or pipetted for liquids.
If the sample pH is not between 6 and 9, the test shall be carried out after adjusting the pH to the value of the
nearest limit (6 or 9) using solutions of hydrochloric acid or sodium hydroxide.
NOTE Testing water samples at concentrations above 100 ml/l may reduce the reproduction and survival of D. magna
because of deficiency in the medium (for instance hardness). Identifying effects of such deficiencies may require the addition of
the same salts to the sample as in the dilution water.
8 Procedure
8.1 Controls
Every test shall include a control containing no test substance.
Two controls are required when a solvent or dispersant is used. One control shall contain no solvent or dispersant.
The second control shall contain a concentration of solvent or dispersant equal to that in the highest exposure
concentration.
8.2 Selection of exposure concentrations
There shall be at least five exposure concentrations arranged in a geometric series with a separation factor not
exceeding 3,2.
In setting the range of concentrations, the following shall be borne in mind:
a) if the objective is to obtain the NOEC (no observed effect concentration), the range of concentrations shall
include at least one concentration producing a significant effect compared to the control (LOEC: lowest
observed effect concentration), preceded by a NOEC.
If this is not the case, the test shall be repeated with a reduced lowest concentration. See footnote 1 to
clause 9.
b) If the objective is to obtain the EC (effect concentration producing a percentage response; typically this is
p
20 % and/or 50 %) for the effect on reproduction and survival, it is advisable that two exposure concentrations
be higher than this EC concentration (p is the percentage response selected). Otherwise, although it will still
p
be possible to estimate the EC , the confidence interval for the EC will be very wide and it may not be
p 50
possible to assess satisfactorily the adequacy of the fitted model.
NOTE Prior knowledge of the toxicity of the test substance from an acute test and/or from range-finding studies (ISO 6341)
is helpful in selecting appropriate exposure concentrations.
Where a solvent or dispersant is used to aid preparation of stock solutions, the concentration of solvent or
dispersant in the highest concentration shall not be greater than 0,1 ml/l. The concentration of solvent or dispersant
shall, as far as possible, be the same in all vessels.
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SIST ISO 10706:2010
ISO 10706:2000(E)
8.3 Renewal of exposure solutions
The exposure solutions shall be renewed at least three times per week. If preliminary stability tests indicate that the
test substance concentration falls below 80 % of the initial measured concentration before day three, consideration
shall be given to either increasing the frequency of exposure solution renewal or using a flow-through test.
Changes in the frequency of solution replacement or the rate of continuous flow shall be reported.
When semi-static tests are conducted, minimize the volume of medium transferred with the D. magna.
8.4 Introduction of animals into the test system
Transfer young animals (� 24 h old) from the culture system to the test system at the beginning of the test. Place
each individual in a single vessel containing 50 ml to 100 ml of exposure solution.
Larger volumes of exposure solution may be required for chemical analysis of exposure concentrations.
Alternatively, replicates can be pooled for chemical analysis.
Semi-static testing shall require at least ten animals exposed individually to each exposure concentration and
control. Furthermore, a second series of test vessels shall be prepared at the time of solution renewal and the
parent animals are transferred to them by means of a glass pipette of suitable bore diameter.
Organisms shall be exposed for a total of 21 days.
If a continuous flow test is being conducted, this International Standard should be used for guidance.
8.5 Feeding of organisms
The diet of the parent animals shall be living algal cells of one of the following species: Chlorella spp,
Pseudokirchneriella subcapitata (formally known as Selenastrum capricornutum)or Scenedesmus subspicatus.It is
preferable to feed the animals daily but as a minimum when solutions are being replaced. The organisms shall be
fed at a rate of 0,1 mg to 0,2 mg of carbon per animal per day. The ration shall be supplied either at a constant rate
throughout the test period or at a gradually increasing rate consistent with the growth of the parent animals. When
volumes greater than 100 ml are used in the test, the ration given shall be increased proportionately.
NOTE Supplementing the algal food with other sources of particulate carbon has proved valuable, to avoid nutritional
deficiencies in pure, monospecific, cultured algae provided that the total carbon does not exceed the limits above.
Where a surrogate measure of carbon is used, such as algal cell number or light absorbance, the testing laboratory
shall generate a nomograph relating the surrogate measure to carbon content. Nomographs shall be confirmed at
least annually or when algal culture conditions are changed.
A concentrated algal suspension produced by centrifugation or decanting, followed by re-suspension in culture
medium shall be transferred to the animals to minimize the volume of algal culture medium transferred to the test
vessels.
8.6 Observations and measurements
Record all observations on a data sheet. An example of a suitable format is presented for information in annex C;
other formats are acceptable.
The light intensity at the surface of the test solution shall be reported.
Measure and record the dissolved oxygen, temperature, water hardness, and the pH of the control(s) and the
highest exposure concentration weekly, at the beginning and end of one of the renewal periods.
Live offspring produced by each parent shall be counted and removed at least three times per week when
changing solutions. Record the presence of dead parents, offspring, males or ephippia eggs.
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SIST ISO 10706:2010
ISO 10706:2000(E)
If relevant to the objectives of the analysis, measure and record the length and dry mass of parent animals at the
end of the test.
In the case where chemical substances are being tested, exposure concentrations shall be confirmed by
measurement at the beginning and the end of the test and more frequently depending on the stability of the
substance or the method of exposure (for instance semi-static or flow-through).
In semi-static tests, where the concentration of test substance is expected to remain within � 20 % (i.e. within the
range of 80 % to 120 %) of the nominal concentration, the highest and lowest concentrations shall be analysed
when freshly prepared and at the time of renewal on one occasion during each of the three weeks.
In semi-static tests, where the concentration of test substance is not expected to remain within � 20 % of the
nominal concentration, the concentration of all the exposure solutions shall be analysed at least weekly. If
concentrations are demonstrated to be within 20 % of initial measured concentrations, then analyses shall be
conducted on only the highest and lowest exposure concentrations. If the concentrations are not within 20 % of the
initial measured concentrations, see clause 9.
An analysis regime similar to that for the semi-static tests shall be used for flow-through tests except that the
frequency of analysis shall be increased during the first week to demonstrate the stability of the dosing system and
test substance stock solution.
8.7 Validity of the test
Consider the test valid when the following criteria shall have been met:
a) the total number of control replicates exhibiting adult mortality and male development isu 20 % at the end of
the test;
b) the mean number of living offspring per living parent in the controls isW 60;
c) the coefficient of variation for control fecundity, based on the number of offspring per parent per day, does not
exceed 20 % in the controls.
The control animals shall be sexually mature and have produced their first brood within 11 days of the start of the
test otherwise criterion b) may not be met.
9 Data analysis and expression of results
If the exposure concentration of the test substance is within 20 % of the nominal or initial concentration, then the
results shall be expressed in terms of the nominal or initial concentration.
If the deviation of the exposure concentration of the test substance is greater than � 20 % of the nominal or initial
concentration, it is recommended that they be expressed in terms of the time-weighted mean concentration (see
annex D for calculation).
If any parent is identified as a male, then exclude the replicate from the data analysis for reproduction.
Count the total number of offspring produced by each parent and calculate the mean number of live offspring
(to the nearest single decimal place) produced by each live parent per exposure concentration.
The reproductive output shall be expressed as the total number of living offspring per live parent (for each replicate)
at the end of the test. If parent animals are exposed individually, the reproductive output can only be expressed as
the mean number of live offspring per live parent at the end of the test. When more than one organism has been
exposed per vessel, reproductive output shall be expressed as "the total number of living offspring produced per
live parent".
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SIST ISO 10706:2010
ISO 10706:2000(E)
Compare the mean number of live offspring produced per parent in each exposure concentration to the control
mean by Dunnett’s or Williams’ tests providing the variance among exposure concentrations is shown to be
homogeneous by ANOVA (analysis of variance). If variances are not homogeneous, transform and re-evaluate the
data.
The lowest exposure concentration that produces a response statistically different from the control response is the
LOEC (lowest observed effect concentration). The highest exposure concentration below the LOEC that produces
1)
a response statistically similar to the control response is the NOEC (no observed effect concentration).
Estimation
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10706
Première édition
2000-04-01
Qualité de l'eau — Détermination de la
toxicité à long terme de substances
vis-à-vis de Daphnia magna Straus
(Cladocera, Crustacea)
Water quality — Determination of long term toxicity of substances to
Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
Numéro de référence
ISO 10706:2000(F)
©
ISO 2000
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ISO 10706:2000(F)
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ISO 10706:2000(F)
Sommaire Page
Avant-propos.iv
Introduction.v
1 Domaine d'application.1
2Références normatives .1
3 Principe.1
4 Environnement de l'essai.2
5Réactifs et produits .2
6 Appareillage .3
7 Traitement et préparation des échantillons .3
7.1 Précautions particulières concernant le prélèvement et le transport des échantillons d'eaux ou
d'effluents.3
7.2 Préparation des solutions des substances à expérimenter.3
8 Mode opératoire.4
8.1 Témoins .4
8.2 Sélection des concentrations d'essai.4
8.3 Renouvellement des concentrations d'essai.5
8.4 Introduction des animaux dans le système d'essai.5
8.5 Alimentation des organismes.5
8.6 Observations et mesures.6
8.7 Validité des résultats.6
9 Analyse des données et expression des résultats .7
10 Rapport d'essai .8
Annexe A (informative) Milieux M4 et M7 de l'OCDE — Préparation et acclimatation des milieux M4
Elendt et M7.10
Annexe B (informative) Eau dure reconstituée ASTM.13
Annexe C (informative) Fiche de collecte de données.14
Annexe D (informative) Calcul de la concentration moyenne pondérée dans le temps.16
Bibliographie .18
© ISO 2000 – Tous droits réservés iii
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ISO 10706:2000(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiéeaux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude aledroit de fairepartie ducomité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments delaprésente Norme internationale peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 10706 a étéélaboréepar le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau,
sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.
Les annexes A, B, C et D de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
iv © ISO 2000 – Tous droits réservés
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ISO 10706:2000(F)
Introduction
La présente Norme internationale définit une méthode pour la détermination de la toxicité sublétale à long terme
des substances chimiques, des eaux et des effluents vis-à-vis de la puce d’eau Daphnia magna Straus. La
méthodologie est adaptéed’une ligne directrice élaborée par l’Organisation de coopération et de développement
économiques (Ligne directrice 211 de l’OCDE, voir référence [1] de la Bibliographie).
© ISO 2000 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 10706:2000(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicitéà long terme de
substances vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera,
Crustacea)
AVERTISSEMENT — Les boues activées et les eaux usées peuvent contenir des organismes
potentiellement pathogènes. Il est par conséquent recommandé de prendre les précautions d'usage lors de
leur manipulation. Il convient de manipuler avec soin les composés d'essai toxiques et ceux dont les
propriétés sont inconnues.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit une méthodepour ladétermination de la toxicité sublétale à long terme
vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) des substances suivantes:
a) substances chimiques solubles dans les conditions de l'essai ou pouvant être maintenues en suspension ou
en dispersion stable dans les conditions de l'essai;
b) effluents industriels ou urbains, épurés ou non, s'il y a lieu aprèsdécantation, filtration ou centrifugation;
c) eaux de surface ou eaux souterraines.
NOTE La présente Norme internationale est adaptéedelaLigne directrice 211del'OCDE[1].
2Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 5667-2, Qualité de l’eau —Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques d’échantillonnage.
ISO 5667-16, Qualité de l’eau —Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons.
3Principe
Exposition pendant 21 jours de Daphnia magna femelles âgées de moins de 24 heures à une substance d'essai, à
des effluents industriels ou urbains ou à des eaux de surface/souterraines ajoutés à de l'eau de dilution, dans une
gamme de concentrations d'un système semi-statique ou à renouvellement continu. Le nombre de parents
survivants ainsi que le nombre de descendants vivants issus de parents vivants à lafindel'essaisontconsignés.
La survie est notée et la capacité reproductrice des parents mis en expérimentation, vivants en fin d’essai
(exprimée en nombre d'individus) est comparée à celle des parents témoins.
© ISO 2000 – Tous droits réservés 1
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ISO 10706:2000(F)
4 Environnement de l'essai
L'enceinte d'essai doit être exempte de vapeurs ou de poussièrestoxiquesvis-à-vis de Daphnia magna Straus.
Les solutions d'essai ne doivent pas être aérées.
La concentration en oxygène dissous dans les solutions d'essai doit être supérieure à 3 mg/l et le pH doit se situer
dans la gamme comprise entre 6 et 9 et ne doit pas varier de plus de 1,5 unités au cours de l'essai. La dureté doit
avoir une valeur supérieure à 140 mg/l (expriméeenCaCO)ayant démontré qu'elle favorise la capacité
3
reproductrice pour êtreconformeaux critères de validité (voir 8.7).
Le cycle d'essai doit être de 16 h de lumière et de 8 h d’obscurité.L’intensité doit de préférence être comprise
entre 600 lux et 800 lux mais ne doit pas excéder 1 200 lux.
La température des solutions d'essai doit être maintenue dans une gamme comprise entre 18 °Cet 22 °Cet ne
pas varier de plus de 2 °C (par exemple 18 °C à 20 °C, 19 °C à 21 °Cou20 °C à 22 °C) pendant toute la duréede
l'essai.
5Réactifs et produits
5.1 Organismes pour essai: Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea), notée D. magna dans la suite du
texte, de troisième génération au moins, obtenue par parthénogenèse acyclique dans des conditions d'élevage
définies.
La sensibilité de D. magna aux toxiques étant fonction de l'origine de l'élevage, l'âge et la provenance (y compris
les clones, si possible) de l'élevage de D. magna doivent être mentionnés dans le rapport d'essai.
Les animaux utilisés pour l'essai doivent être âgés de moins de 24 h et provenir de la seconde à la cinquième
portée. Les D. magna doivent provenir d’un lot sain ne présentant aucun signe de stress tel que mortalité >20%,
présencedemâles, ephippia ou animaux décolorés, et doivent produire sans retard la première génération.
Le lot d’animaux doit être maintenu dans des conditions d'élevage (lumière, température, milieu, alimentation et
nombre par unité de volume) similaires à celles de l'essai. Si les conditions d'élevage diffèrent de celles de l'essai,
il est recommandé d'acclimater une génération aux conditions d'essai pendant environ trois semaines afin d'éviter
toute source de stress aux animaux parents.
5.2 Eau de dilution: eau synthétique comme décrit en 5.3 ou des eaux naturelles non contaminées ayant un pH
et des caractéristiques de dureté similaires aux eaux de dilution utilisées pour l'élevage et les essais.
5.3 Eau de dilution synthétique,préparée au moyen de l'une des méthodes suivantes:
a) milieux M4 et M7 de l’OCDE (voir annexe A);
b) eau de source dure reconstituée ASTM (voir annexe B).
L'eau de dilution doit être aérée jusqu'à ce que la concentration en oxygène dissous ait atteint la valeur de
saturation de 95 % et jusqu'à stabilisation du pH. Si nécessaire, ajuster le pH à 8,0� 0,5 par ajout d'une solution
d'hydroxyde de sodium (NaOH) ou d'acide chlorhydrique (HCI). L'eau de dilution ainsi préparéenedoit plus être
aérée avant emploi.
Il est recommandé que les niveaux de COT (carbone organique total) soient < 5 mg/l avant l'ajout d'algues. Il n'est
pas recommandé d'utiliser de l'eau de dilution contenant de l'EDTA (par exemple M7 et M4) pour analyser des
composés contenant des métaux dans la mesure où la chélation peut réduire la toxicité du composé.
Si l'essai doit être conduit en vue de besoins qui impliquent l'utilisation d'une eau de dilution dont les
caractéristiques diffèrent de celles décrites ci-dessus, il convient de mentionner dans le rapport d'essai les
principales caractéristiques (par exemple, pH, dureté, COT, DCO) de l'eau de dilution synthétique utilisée.
2 © ISO 2000 – Tous droits réservés
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ISO 10706:2000(F)
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareils de contrôle de l'environnement, pour le contrôle de la température, du cycle jour/nuit et de
l'intensité de la lumière.
6.2 Appareil et/ou instruments de mesurage, pour le mesurage de l'oxygène dissous, du pH, de la dureté,du
carbone organique total, de la demande chimique en oxygène, de l'intensité de la lumière et de la température.
6.3 Récipients d’essai,enmatériau chimiquement inerte et de capacité suffisante pour les essais (par exemple
tubes à essais ou béchers en verre de 50 ml ou 100 ml), propres et non contaminés.
7 Traitement et préparation des échantillons
7.1 Précautions particulières concernant le prélèvement et le transport des échantillons d'eaux
ou d'effluents
Les échantillons d'eaux ou d'effluents doivent être prélevés conformément à la procédure générale définie dans
l'ISO 5667-2. Les flacons doivent être complètement remplis pour ne plus contenir d'air.
Les échantillons d'eaux ou d'effluents doivent être conservés conformément à l'ISO 5667-16; ce qui suit n’en
constitue qu’un résumé.Réaliser l’essai de toxicité le plus rapidement possible, idéalement dans les 12 h qui
suivent le prélèvement. Si cette durée ne peut pas être respectée, refroidir l’échantillon (0 °C à 4 °C) et l’analyser
dans les 24 h. Si l’essai ne peut être réalisé dans les 48 h, l’échantillon peut être congelé (au-dessous de –18 °C)
pour être analysé dans les deux mois suivant le prélèvement.
Toutes les portions (sous-échantillons) doivent être prétraitées de la même manière (c'est-à-dire que lorsqu'il est
nécessaire de congeler de l'eau instable, toutes les portions, y compris celles utilisées le premier jour, doivent être
congelées avant les essais; voir l’ISO 5667-16).
En raison de la durée de cet essai (21 jours) et de la nécessité de renouveler périodiquement les solutions, un
nombre suffisant de portions d'échantillon doit être congelé afin de renouveler les solutions d'essai et de répéter
l'essai si nécessaire (échantillons de réserve). Le volume minimal de portions congelées dépend de la toxicité de
l'échantillon à analyser. Le volume d'échantillon nécessaire pour un essai semi-statique avec mise en
expérimentation individuelle de dix daphnies dans 100 ml d'échantillon non dilué est de 9 litres; des prélèvements
supplémentaires seront nécessaires pour des échantillons dilués.
Lorsque l'essai est réalisé sur le site ou à proximité du lieu de prélèvement, il est admis d'utiliser des échantillons
frais pour remplacer les solutions d'essai. Dans ce cas, les variations existantes sur le lieu de prélèvement sont
intégrées dans la méthode d'essai.
7.2 Préparation des solutions des substances à expérimenter
7.2.1 Préparation des solutions mères
La solution mère de la ou des substances à expérimenter doit être préparée par dissolution d'une quantité connue
de la ou des substances dans un volume défini d'eau de dilution, d'eau déionisée ou d'eau distilléedansun
récipient en verre. La solution mère doit être préparée juste avant la préparation des solutions d'essai à moins que
la (les) substance(s) soit (soient) réputée(s) stable(s) dans des conditions de conservation définies, auquel cas la
solution mère peut être préparée avant l'essai et conservée dans ces conditions.
Les solutions mères ou les suspensions de substance(s) de faible solubilité aqueuse peuvent être solubilisées ou
dispersées directement dans le milieu par des dispositifs à ultrasons, et/ou des agitateurs ou des solvants ou des
dispersants de faible toxicité vis-à-vis de D. magna comme traité dans l'ISO 5667-16. Si un solvant est utilisé,la
concentration du solvant dans la solution mère doit être telle que la concentration dans la plus forte solution d'essai
ne dépasse pas 0,1 ml/l.
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Il convient d’éviter l’utilisation de solvants organiques. Si ceux-ci sont nécessaires, des solvants organiques tels
que acétone, éthanol, méthanol, diméthylformamide, triéthylèneglycol ou des dispersants tels que Cremophor
RH40, méthylcellulose 0,1 %, et HCO-40 peuvent être utilisés pour obtenir une solution mère convenablement
concentrée. Ils ne sont pas toxiques vis-à-vis de D. magna à des concentrations de 0,1 ml/l. En raison des
différences de nature des substances chimiques, aucune procédure unique ne peut être conseillée pour la
préparation des solutions mères de substances de faible solubilité aqueuse.
7.2.2 Préparation des solutions d'essai
Les solutions d'essai doivent être préparées (8.2) par ajout des solutions mères (7.2.1) ou des échantillons
d'effluents (7.1) à l'eau de dilution (5.2) en quantitésdéfinies (voir 8.2).
Lorsque les solutions mères sont préparées dans de l'eau déionisée ou distillée, il ne faut pas ajouter plus de
100 ml de solution mère par litre d'eau de dilution.
Les concentrations choisies peuvent également être préparées séparément par ajout direct de la substance d'essai
à l'eau de dilution lorsque les quantités à ajouter peuvent être pesées ou introduites à l’aide d’une pipette dans le
cas des liquides, de manière précise.
Si le pH de l’échantillon n’est pas compris entre 6 et 9, l’essai doit être effectué après ajustement du pH à la valeur
la plus proche (6 ou 9) à l’aide de solutions d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium.
NOTE L'analyse d'échantillons d'eau à des concentrations supérieures à 100 ml/l peut réduire la reproduction et la survie
des D. magna en raison d'insuffisances dans le milieu (par exemple, la dureté). Il peut s'avérer nécessaire pour déterminer les
effets de ces insuffisances d'ajouter à l'échantillon les mêmes sels que ceux de l'eau de dilution.
8 Mode opératoire
8.1 Témoins
Chaque essai doit comporter un témoin ne contenant aucune substance d'essai.
Lorsqu'un solvant ou un dispersant est utilisé, deux témoins sont nécessaires: l'un ne doit contenir aucun solvant
ou dispersant, l'autre doit contenir un solvant ou un dispersant à une concentration égale à celledela plusforte
concentration d'essai.
8.2 Sélection des concentrations d'essai
Utiliser au moins cinq concentrations d'essai disposées en une série géométrique avec un facteur de séparation ne
dépassant pas 3,2.
Lors de l'établissement de la gamme des concentrations, les points suivants doivent être pris en compte:
a) Si l’objectif est d’obtenir la NOEC (concentration sans effet observé), la gamme de concentration doit inclure
au moins une concentration produisant un effet significatif par rapport au témoin (LOEC: concentration la plus
faible avec effet observé), précédéed’une NOEC.
Si ce n’est pas le cas, l’essai doit être répété avec une concentration plus faible. Voir la note de bas de page 1
de l’article 9.
b) Si l’objectif est d’obtenir la CE (concentration produisant une réponse en pourcentage, généralement 20 %
p
et/ou 50 %) relative à l'effet sur la reproduction et la survie, il est souhaitable que deux concentrations d’essai
soient supérieures à cette concentration CE (p est le pourcentage de réponse choisi). Dans le cas contraire,
p
bien qu'il soit possible d'estimer la CE , l'intervalle de confiance pour CE sera très large et il peut s'avérer
p 50
impossible d'évaluer de manière satisfaisante l'adéquation du modèle établi.
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NOTE La connaissance préalable de la toxicité de la substance d’essai par un essai de toxicité aiguë et/ou préliminaire
(ISO 6341) est utile pour sélectionner les concentrations d'essai appropriées.
Lorsque les solutions mères sont préparées avec un solvant ou un dispersant, la concentration en solvant ou en
dispersant dans la plus forte concentration ne doit pas être supérieure à 0,1 ml/l et doit, dans toute la mesure du
possible, être identique dans tous les récipients.
8.3 Renouvellement des concentrations d'essai
Les concentrations d'essai doivent être renouvelées au moins trois fois par semaine. Lorsque les essais
préliminaires de stabilité indiquent une chute de la concentration de la substance d'essai à plus de 80 % de la
concentration initiale mesurée avant le troisième jour, il est nécessaire de procéder à une augmentation de la
fréquence de renouvellement de la solution d'essai ou d'utiliser un essai à renouvellement continu. La fréquence de
renouvellement de la solution ou la vitesse du débit de renouvellement continu doit être consignée.
Dans le cas d'essais semi-statiques, réduire le volume du milieu transféré avec les D. magna.
8.4 Introduction des animaux dans le système d'essai
Au début de l'essai, transférer les jeunes animaux (âgées de moins de 24 h) du système d'élevage dans le
système d'essai. Placer chacun d'entre eux dans un seul récipient contenant 50 ml à 100 ml de solution d'essai.
Pour l'analyse chimique des concentrations d'essai, il peut être nécessaire d'utiliser des volumes plus importants
de solution d'essai; des répliques peuvent également être regroupées.
Pour ce qui concerne les essais semi-statiques, au moins dix animaux doivent être expérimentés individuellement
pour chaque concentration considérée et chaque témoin. De plus, préparer une seconde sériederécipients d'essai
au moment du renouvellement des solutions, et transférer les animaux parents dans les solutions au moyen d'une
pipette en verre de diamètre approprié.
La duréed’exposition des organismes doit être de21jours.
Si un essai à renouvellement continu est effectué,il convientd’utiliser la présente Norme internationale en tant que
ligne directrice.
8.5 Alimentation des organismes
Les animaux parents doivent être nourris avec des cellules d’algues vivantes de l'une des espèces suivantes:
Chlorella spp, Pseudokirchneriella subcapitata (officiellement appelée Selenastrum capricornutum)ou
Scenedesmus subspicatus.Il est préférable de nourrir les animaux chaque jour mais au minimum chaque fois que
les solutions sont renouvelées. La ration de nourriture doit être comprise entre 0,1 mg et 0,2 mg de carbone par
animal et par jour. La ration doit être distribuéesoit demanière régulière tout au long de l'essai ou de manière
progressive en fonction de la croissance des animaux parents. Lorsque l'essai utilise des volumes supérieurs à
100 ml, la ration de nourriture doit être augmentée en conséquence.
NOTE L'ajout d'autres aliments à base de carbone particulaire à la nourriture d’algues s'est avéré efficace pour éviter toute
carence nutritionnelle susceptible de survenir avec les algues monospécifiques et pures mises en culture, sous réserve que le
carbone total ne dépasse pas les limites indiquées ci-dessus.
Lorsqu'on utilise une autre mesure du carbone, telle que le dénombrement de cellules d’algues ou l'absorbance
lumineuse, le laboratoire d'essai doit produire un nomogramme analysant le rapport de la mesure de substitution à
la teneur en carbone. Les nomogrammes doivent être confirmés au moins tous les ans ou en cas de modifications
apportées aux conditions de mise en culture des algues.
Une suspension d'algues concentrée obtenue par centrifugation ou décantation, suivie d'une remise en suspension
dans le milieu de culture doit être utilisée pour les animaux afin de réduire le volume du milieu de culture d'algues
transféré dans les récipients d'essai.
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8.6 Observations et mesures
Consigner toutes les observations sur une fiche technique. Un exemple de modèle approprié est présenté pour
information à l'annexe C; il est cependant admis d'utiliser d'autres formats.
L'intensité lumineuse à lasurfacedelasolutiond'essaidoit être consignée.
Mesurer et consigner, au début et à la fin de chaque période de renouvellement, l'oxygène dissous, la température,
la dureté de l'eau et le pH du ou des témoins et de la plus forte concentration d'essai toutes les semaines.
Les descendants vivants issus de chaque parent doivent être dénombréset retirés au moins trois fois par semaine
au moment du renouvellement des solutions. Consigner le nombre de parents, descendants, mâles ou œufs
d'ephippia morts.
Mesurer et consigner la taille et la masse sèche des animaux parents à la fin de l'essai si ces données s'avèrent
nécessaires aux fins de l'analyse.
Dans le cas d'essais de produits chimiques, les concentrations d'essai doivent être confirmées au moyen de
mesures réalisées au début et à la fin de l'essai, voire plus fréquemment selon la stabilité de la substance ou la
méthode d'essai (par exemple semi-statique ou à renouvellement continu).
Pour les essais semi-statiques, lorsque la concentration de la substance d'essai est supposée se maintenir à
� 20 % (par exemple entre 80 % et 120 %) de la concentration nominale, la concentration la plus forte et la
concentration la plus faible doivent être analysées immédiatement aprèsleur préparation et lors du renouvellement
une fois au cours de chacune des trois semaines.
Pour les essais semi-statiques, lorsque la concentration de la substance d'essai n'est pas supposée se maintenir à
� 20 % de la concentration nominale, la concentration de la solution d'essai doit être analysée au moins toutes les
semaines. Lorsque les concentrations s'avèrent stables à 20 % des concentrations initiales mesurées, l'analyse ne
doit porter que sur la concentration la plus forte et la concentration la plus faible d'essai. Si les concentrations
diffèrent de plus de 20 % des concentrations initiales mesurées, voir l'article 9.
Les essais à renouvellement continu doivent utiliser le même schéma d'analyse que celui appliqué pour les essais
semi-statiques, à l'exception de la fréquence qui doit être augmentéeaucours de la première semaine afin de
vérifier la stabilité du système de dosage et de la solution mère de la substance d'essai.
8.7 Validité des résultats
Considérer les résultats comme valables si les conditions suivantes sont satisfaites:
a) le nombre total d’adultes morts et de mâlesdansles récipients témoins estu 20 % à lafindel’essai;
b) le nombre moyen de descendants vivants par parent vivant dans les récipients témoins estW 60.
c) il convient que le coefficient de variation du contrôle de fécondité, basé sur le nombre de descendants par
parent par jour, ne soit pas supérieur à 20 % dans les récipients témoins.
Les animaux témoins doivent avoir atteint leur maturité sexuelle et avoir produit leur première couvée dans les
11 jours à partir du début de l'essai, faute de quoi le critère b) risque de ne pas être satisfait.
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9 Analyse des données et expression des résultats
Lorsque la concentration d'essai de la substanc
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.