ISO 21115:2019

Water quality — Determination of acute toxicity of water samples and chemicals to a fish gill cell line (RTgill-W1)

This document specifies a method for the determination of fish acute toxicity using the permanent cell line from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) gill, RTgill-W1. Cells in confluent monolayers in 24-well tissue culture plates are exposed to water samples, such as surface waters or different kinds of effluents, or to chemicals for 24 h and, thereafter, cell viability is assessed based on fluorescent cell viability indicator dyes (see 4.1). Data are then expressed as a percentage of unexposed control and toxicity quantified based on the percentage of cell viability versus the percentage of effluent or the chemical concentration in response curves (see Clause 9).

Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë d'échantillons d'eau et de produits chimiques vis-à-vis de la lignée cellulaire de branchies de poissons (RTgill-W1)

Le présent document spécifie une méthode de détermination de la toxicité aiguë sur les poissons à l'aide de la lignée cellulaire permanente établie à partir de branchies de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), RTgill-W1. Les cellules en monocouche confluente cultivées dans des plaques de culture tissulaire de 24 puits sont exposées à des échantillons d'eau, tels que des eaux de surface ou différents types d'effluents, ou à des produits chimiques pendant 24 h. Ensuite, la viabilité cellulaire est évaluée à l'aide d'indicateurs colorés fluorescents de la viabilité cellulaire (voir 4.1). Les données sont ensuite exprimées sous forme du pourcentage d'un témoin non exposé et la toxicité est quantifiée d'après la courbe concentration-effet du pourcentage de viabilité cellulaire en fonction du pourcentage de concentration en effluent ou en produit chimique (voir l'Article 9).

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 31-Mar-2019
• ICS: 13.060.70 - Examination of biological properties of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Current Stage: 9060 - Close of review
• Start Date: 02-Dec-2029

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21115
First edition
2019-04
Water quality — Determination
of acute toxicity of water samples
and chemicals to a fish gill cell line
(RTgill-W1)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë d'échantillons
d'eau et de produits chimiques vis-à-vis de la lignée cellulaire de
branchies de poissons (RTgill-W1)
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 Cell viability assay . 2
4.2 Key differences in water sample and chemical testing procedure . 3
5 Interferences . 3
5.1 Matrix effects by effluent samples . 3
5.2 Interferences of water constituents or chemicals with fluorescent dye assays . 4
6 Reagents . 4
6.1 General . 4
6.2 Ready-for-use purchased reagents . 4
6.3 Freshly prepared solutions . 6
7 Apparatus and material . 8
7.1 General equipment . 8
7.2 Whole-water sample/ex preparation . 9
7.3 Cell seeding and plate dosing . 9
7.4 Preparation/dosing of stock solutions . 9
7.5 Sampling for chemical analysis .10
7.6 Detection of cytotoxicity .10
8 Procedure.10
8.1 Cell line used .10
8.2 Seeding cells into 24-well plates .10
8.2.1 General.10
8.2.2 Preparation of working materials and solutions for cell seeding .10
8.2.3 Seeding cells: step-by-step performance .11
8.3 Cell exposure.12
8.3.1 General.12
8.3.2 Exposure of cells to water samples .13
8.3.3 Exposure of cells to chemicals .18
8.4 Determination of cytotoxicity .21
8.4.1 General.21
8.4.2 Visual control of cell damage .22
8.4.3 Preparation of working materials and solutions for cytotoxicity measurement .23
8.4.4 Measuring cytotoxicity — Step-by-step performance .23
8.4.5 Parameters for the fluorescence measurement .24
8.4.6 Chemical analyses of the test samples .24
9 Preparation and expression of results .24
10 Validity criteria of the test .25
10.1 No cells-control wells .25
10.2 Positive control in L-15/ex .25
10.3 Positive control in w-ws/ex .26
10.4 Solvent control .26
Annex A (informative) Routine cell culture of RTgill-W1 .27
Annex B (informative) Performance of the RTgill-W1 cell line assay .32
Bibliography .38
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved

Introduction
Millions of fish are used annually to test the acute toxicity of water samples, such as effluents or
chemicals. Using an alternative model of testing would not only reduce the need for animals, but would
have added benefits, such as much faster testing, using smaller volumes and creating less waste. Using
embryos of zebrafish prior to independent feeding has partly filled this need for alternative fish acute
toxicity testing.
This document describes a procedure that assesses fish acute toxicity using a permanent fish cell line.
Comparative work with both the zebrafish embryo and the cell line has shown that they are expected to
yield similar results, i.e. within approximately a 10-fold range based on measured concentrations. They
also have a common limitation, i.e. a limited ability to detect neurotoxic compounds. Resource needs,
however, differ. For example, while the use of the cell line omits any need for fish and the time from
exposure to obtaining the test results is reduced, it does require sterile culture techniques. Thus, the
choice of the assay may be guided by the available resources and needs.
[1]
The fish cell line in the procedure described in this document is the RTgill-W1 cell line established
1)
from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) gill. It is commercially available as ATCC® CRL-2523™ . Two
similarly structured procedures are described: one for water samples, such as effluents, and one for
chemical testing.
[2] [3]
The standards ISO 15088 and OECD 236 are also related to prediction of waste water or chemical
fish acute toxicity, relying on zebrafish embryos.
1) ATCC® CRL-2523™ is the trademark of a product supplied by ATCC, US. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21115:2019(E)
Water quality — Determination of acute toxicity of water
samples and chemicals to a fish gill cell line (RTgill-W1)
WARNING — Working with chemicals or water samples requires precautionary safety measures
for handling. This document does not purport to address the safety problems associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate health and safety practice
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21115
Première édition
2019-04
Qualité de l'eau — Détermination de
la toxicité aiguë d'échantillons d'eau
et de produits chimiques vis-à-vis de
la lignée cellulaire de branchies de
poissons (RTgill-W1)
Water quality — Determination of acute toxicity of water samples
and chemicals to a fish gill cell line (RTgill-W1)
Numéro de référence
©
ISO 2019
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Tél.: [phone]
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
4.1 Essai de viabilité cellulaire . 2
4.2 Principales différences du mode opératoire de l’essai sur échantillons d’eau et sur
produits chimiques . 3
5 Interférences . 4
5.1 Effets de matrice dus aux échantillons d’effluent . 4
5.2 Interférences des constituants de l’eau ou des produits chimiques avec les essais
utilisant un indicateur coloré fluorescent . 4
6 Réactifs . 5
6.1 Généralités . 5
6.2 Réactifs prêts à l’emploi . 5
6.3 Solutions préparées extemporanément . 6
7 Appareillage et matériel . 8
7.1 Équipement général . 8
7.2 Préparation de l’échantillon d’eau complet/ex. 9
7.3 Ensemencement des cellules sur plaque . 9
7.4 Préparation/distribution des solutions mères .10
7.5 Échantillonnage pour l’analyse chimique .10
7.6 Détection de la cytotoxicité .10
8 Mode opératoire.10
8.1 Lignée cellulaire utilisée .10
8.2 Ensemencement des cellules dans des plaques de 24 puits .11
8.2.1 Généralités .11
8.2.2 Préparation du matériel et des solutions d’ensemencement des cellules .11
8.2.3 Ensemencement des cellules: déroulement étape par étape .11
8.3 Exposition des cellules .13
8.3.1 Généralités .13
8.3.2 Exposition des cellules aux échantillons d’eau .13
8.3.3 Exposition des cellules à des produits chimiques .18
8.4 Détermination de la cytotoxicité .22
8.4.1 Généralités .22
8.4.2 Contrôle visuel des dommages cellulaires .22
8.4.3 Préparation du matériel et des solutions de mesure de la cytotoxicité .23
8.4.4 Mesurage de la cytotoxicité: déroulement étape par étape .23
8.4.5 Paramètres applicables au mesurage de la fluorescence.24
8.4.6 Analyses chimiques des échantillons pour essai .24
9 Préparation et expression des résultats .24
10 Critères de validité de l’essai .25
10.1 Puits «témoins sans cellules» .25
10.2 Témoin positif dans le L-15/ex .26
10.3 Témoin positif dans w-ws/ex: .26
10.4 Témoin solvant .26
Annexe A (informative) Culture cellulaire de routine de RTgill-W1 .27
Annexe B (informative) Performance de l’essai sur la lignée cellulaire RTgill-W1 .33
Bibliographie .40
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, de la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de
l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les
obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
Introduction
Des millions de poissons sont utilisés chaque année pour évaluer la toxicité d’échantillons d’eau, tels
que les effluents, ou de produits chimiques. Utiliser un autre modèle d’essai réduirait non seulement
les besoins en animaux, mais permettrait également d’accélérer les essais tout en réduisant les volumes
utilisés et la production de déchets. L’utilisation d’embryons de poisson-zèbre avant l’alimentation
autonome comble partiellement le besoin d’essais alternatifs de toxicité aiguë sur les poissons.
Le présent document décrit un mode opératoire qui évalue la toxicité aiguë sur les poissons à l’aide d’une
lignée cellulaire permanente de poisson. Les travaux comparatifs utilisant les embryons de poisson-
zèbre et la ligne cellulaire ont montré qu’ils sont censés produire des résultats similaires, c’est-à-dire
dans une gamme d’environ un facteur 10 reposant sur les concentrations mesurées. Ils ont également
un inconvénient commun: une capacité limitée à détecter les composés neurotoxiques. Cependant, les
besoins en ressources diffèrent. Par exemple, bien que l’utilisation de la lignée cellulaire permette de
ne pas utiliser de poissons du tout et de réduire la durée entre l’exposition et l’obtention des résultats
d’essai, elle exige des techniques de culture en milieu stérile. Ainsi, le choix de l’essai peut être guidé par
les ressources disponibles et les besoins.
Dans le mode opératoire décrit dans le présent document, la lignée cellulaire de poisson est la lignée
[1]
cellulaire RTgill-W1 établie à partir de branchies de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Elle est
1)
disponible dans le commerce auprès de l’ATCC® CRL-2523™ . Deux modes opératoires de structure
similaire sont décrits: un pour les échantillons d’eau, tels que les effluents, et un pour les essais sur
produits chimiques.
[2] [3]
La norme ISO 15088 et la ligne directrice de l’OCDE 236 concernent également la prédiction de
...