ISO 14730:2000
(Main)Ophthalmic optics — Contact lens care products — Antimicrobial preservative efficacy testing and guidance on determining discard date
Ophthalmic optics — Contact lens care products — Antimicrobial preservative efficacy testing and guidance on determining discard date
Optique ophtalmique — Produits d'entretien des lentilles de contact — Essais de l'efficacité de conservation antimicrobienne et lignes directrices pour la détermination de la durée d'utilisation après première ouverture
La présente Norme internationale spécifie une méthode à suivre pour évaluer l'activité de conservation antimicrobienne de tous les produits d'entretien des lentilles de contact conservés en emballages multi-doses et fournit des lignes directrices sur les méthodes à utiliser pour la détermination de la durée d'utilisation après première ouverture, en annexes informatives. Le présent essai est applicable pour une durée d'utilisation après première ouverture allant jusqu'à 28 jours. L'essai ne s'applique pas aux produits stériles emballés en doses unitaires destinées à un usage unique ni aux emballages multi-doses constituant des barrières physiques à la contamination microbienne (exemple : emballages aérosol). NOTE 1: Les principes de l'essai peuvent être utilisés pour étendre la durée d'utilisation au-delà de 28 jours. Voir les annexes B, C, D et E. NOTE 2: L'usage d'inoculums multiples ou mixtes et/ou l'inclusion de lentilles de contact ou d'autres charges organiques peut modifier l'activité antimicrobienne apparente d'un produit particulier. L'évaluation de ces variables, associée à l'essai sur une large gamme de micro-organismes et l'essai d'échantillons provenant de doses utilisées partiellement peuvent être intéressants pour développer un produit d'entretien des lentilles de contact, mais ne font pas partie du domaine d'application de la présente Norme internationale.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14730
First edition
2000-09-15
Ophthalmic optics — Contact lens care
products — Antimicrobial preservative
efficacy testing and guidance on
determining discard date
Optique ophtalmique — Produits d'entretien des lentilles de contact —
Essais de l'efficacité de conservation antimicrobienne et lignes directrices
pour la détermination de la durée d'utilisation après première ouverture
Reference number
ISO 14730:2000(E)
©
ISO 2000
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ISO 14730:2000(E)
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Contents Page
Foreword.iv
Introduction.v
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions .1
4 Principle.1
5 Test methods.2
5.1 Materials and reagents.2
5.2 Test sampling and culture maintenance .3
5.3 Preparation of microbial challenge (Inoculum) .3
5.4 Inoculum challenge test procedure .4
5.5 Controls .5
5.6 Performance criteria.5
5.7 Test report .6
Annex A (informative) Example of a membrane filtration procedure .7
Annex B (informative) Discard date procedure I.9
Annex C (informative) Discard date procedure II.12
Annex D (informative) Discard date procedure III.16
Annex E (informative) Discard date procedure IV.19
Annex F (informative) Test organisms from other culture collections.22
Bibliography.23
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ISO 14730:2000(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 14730 was prepared by Technical Committee ISO/TC 172, Optics and optical
instruments, Subcommittee SC 7, Ophthalmic optics and instruments.
Annexes A to F of this International Standard are for information only.
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Introduction
Contact lens care products (CLCP) are used with contact lenses. These products rinse, clean, disinfect, store, wet,
aid the comfort of, and condition contact lenses. Some products have one function, whilst others are
multifunctional.
Usually products manufactured for use with hydrogel lenses may be used with rigid gas-permeable (RGP) or
poly(methyl methacrylate) (PMMA) lenses, but products specifically used for RGP or PMMA contact lenses are not
usually suitable for hydrogel lenses.
Most CLCPs are manufactured as solutions and are commonly packaged and sold in multidose containers. Dry
products are sold as tablets or granules and must be dissolved in a suitable solvent immediately prior to use.
If the contact lens care product solution does not have any antimicrobial activity itself, an antimicrobial preservative
may be added to the product to inhibit the growth of microorganisms that may be introduced from repeated
dispensing during use and subsequent storage. All antimicrobial agents have the potential for toxicity to the user.
For maximum protection to the user, the concentration of the preservative should be such that it provides adequate
preservative activity with minimum toxicity.
There are differences between ophthalmic preparations and contact lens care products and some of these
differences are significant in relation to preservative efficacy testing. Typically, ophthalmic preparations are
packaged in small-volume containers and are for use for short periods on compromised eyes. Contact lens care
products are distributed in larger volume containers and are used with contact lenses on a long term basis on
healthy eyes. The potential risks for contact lens care products are the solution/lens interaction causing ocular
irritation and the risks of the solution contamination by the repeated (daily) use of the product.
Thus when contact lens care products are formulated, the risk of adverse patient reaction due to the lens and/or
solution interaction has to be weighed against the benefits of safety derived from the maintenance of the
antimicrobial activity of the solution.
This International Standard gives the test procedure and performance criteria for preservative efficacy. It has been
adapted from Pharmacopoeias which give a time limitation in their test procedure of 28 days. The informative
annexes give four examples of preservative efficacy test procedures developed by contact lens care product
manufacturers to show preservative efficacy for products whose discard dates are over 28 days.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 14730:2000(E)
Ophthalmic optics — Contact lens care products — Antimicrobial
preservative efficacy testing and guidance on determining discard
date
1 Scope
This International Standard specifies a procedure to be used in evaluating the antimicrobial preservative activity of
all preserved multidose contact lens care products, and provides guidance on methods to be used for
determination of discard date as informative annexes.
This test is applicable to products for up to a 28-day discard date.
The test is not applicable to sterile products packaged in unit doses for single use or multidose containers designed
with physical barriers to microbial contamination (e.g. aerosol containers).
NOTE 1 Principles of the test may be used to extend discard dating beyond 28 days. See annexes B, C, D and E.
NOTE 2 Use of multiple or mixed microbial challenges and/or inclusion of contact lenses or other organic load can influence
the apparent antimicrobial activity of a particular product. The evaluation of these variables together with testing against a larger
panel of microorganisms and testing of samples from partially used containers may be of value in developing a contact lens
care product, but are excluded from the scope of this International Standard.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
1�
ISO 8320-2:— , Contact lenses and contact lens care products — Vocabulary — Part 2: Contact lens care
products.
ISO 14534:1997, Ophthalmic optics — Contact lenses and contact lens care products — Fundamental
requirements.
3 Terms and definitions
For the purposes of this International Standard, the terms and definitions given in ISO 8320-2 apply.
4Principle
4.1 The test consists of challenging the preparation with a specified inoculum of suitable microorganisms at the
commencement of the test and then rechallenging at day 14. The inoculated preparations are stored at a specified
1�
To be published.
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temperature. Samples are withdrawn from the inoculated preparations at specified time intervals and are cultured
for determination of viable organisms. The capability of the product to prevent re-growth is confirmed by counting of
viable organisms over longer time periods.
4.2 The size of the microbial challenge chosen in this test is not intended to be representative of the likely
challenge in practice, but to provide countable numbers from which estimation of the rate and extent of viability loss
can be determined.
4.3 The antimicrobial preservative properties of the product are adequate if, in the conditions of the test, there is
significant reduction of bacteria and no increase in yeasts and moulds in the inoculated preparation after the times
and at the temperatures specified. The performance criteria are given in 5.6.
4.4 Appropriate measures shall be taken to inactivate or remove residual antimicrobial agents during culturing and
counting of survivors. The effectiveness of these measures shall be validated.
5 Test methods
5.1 Materials and reagents
5.1.1 Test organisms.
The strains listed in Table 1 shall be used.
NOTE Test organisms from other culture collections that may be used are listed in Annex F.
Table 1 — Test organisms
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Escherichia coli ATCC 8739
Candida albicans ATCC 10231
Aspergillus niger ATCC 16404
5.1.2 Culture media and reagents.
5.1.2.1 Tryptone Soya Agar (TSA).
5.1.2.2 Sabouraud Dextrose Agar (SDA).
5.1.2.3 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride (DPBS).
Combine 200 mg/l KCl, 200 mg/l KH PO , 8 000 mg/l NaCl, and 2 160 mg/l Na HPO � 7H O or suitable diluent.
2 4 2 4 2
5.1.2.4 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline plus 0,05 % volumic mass polysorbate 80 (DPBST) or
suitable diluent.
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5.1.2.5 Validated neutralizing agents/media as required, for example, Dey-Engley Neutralizing Broth (DEB)
and Letheen Broth.
5.1.3 Laboratory equipment.
The following common laboratory equipment is required: Sterile pipettes, swabs, tubes, Petri dishes (90 mm to
100 mm � 20 mm), etc. and suitable instruments for spectrophotometric determination of cell density, for colony
counting, and for centrifugation.
5.2 Test sampling and culture maintenance
The product to be tested shall be representative of the product to be marketed. Aliquots should be taken directly
from the final product container immediately prior to testing.
Three lots of product shall be tested. Each lot of product shall be tested with a separate inoculum preparation for
each challenge organism.
Maintain the test cultures as recommended by the curator of the appropriate culture collection.
Cultures should be no greater than five passes removed from the depository stock (ATCC, NCIB, NCTC, NCPF or
other recognized culture depository; see annex F). Each pass is a subculture of the previous pass.
5.3 Preparation of microbial challenge (Inoculum)
Culture each test organism on agar slopes under the conditions given in Table 2.
Table 2 — Media and incubation conditions for growth of challenge organisms
Temperature Incubation
Organism Medium
°C time
P. aeruginosa TSA 30to 35 18hto24h
S. aureus TSA 30to 35 18hto24h
E. coli TSA 30to 35 18hto24h
either 20 to 25 42 h to 48 h
C. albicans SDA
or 30 to 35 18 h to 24 h
A. niger
SDA 20to 25 7dto 10d
Use sterile DPBST or suitable diluent to harvest each culture; wash the surface growth, transfer it to a suitable
vessel and vortex. Filter the spore suspensions through sterile glass wool, cheesecloth or gauze to remove hyphal
fragments.
After harvesting, the cultured organisms may be washed using centrifugation. The bacterial suspensions may be
filtered (e.g. 3µm to 5µm pore size) to produce a single cell dispersion. Then adjust all challenge cell suspensions
7 8
with DPBST or other suitable diluent to a concentration of between 1 � 10 cfu/ml and 1 � 10 cfu/ml. Estimate the
approximate cell concentration of each suspension by measuring the turbidity of the suspension or a dilution of the
suspension using a spectrophotometer. The actual concentration of colony-forming units per millilitre shall be
determined for each suspension, e.g. by the plate-count method, at the time of the test.
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If centrifugation is used, each centrifugation should be conducted at 20 °Cto 25 °C for no longer than the
equivalent of 10 min at 4 000 g or less.
Use bacterial and yeast cell suspensions on the day of preparation.
NOTE 1 Longer centrifugation times may be required at lower speeds.
NOTE 2 Spore suspensions may be used up to seven days following preparation by storage under refrigeration (2 °Cto
8 °C).
5.4 Inoculum challenge test procedure
5.4.1 Prepare one or more tubes (for each lot tested) containing a minimum of 10 ml of test solution per
challenge organism.
NOTE Sample tubes are used rather than lens cases to allow effective technical execution of the test. Since
incompatibilities can exist between solution ingredients and tube materials, tubes of an appropriate material which is compatible
with the ingredients should be considered.
Inoculate the sample tube of the product to be tested with a suspension of test organisms sufficient to provide a
5 6
final count of between 1,0� 10 cfu/ml and 1,0� 10 cfu/ml. Ensure that the volume of inoculum does not exceed
1 % of the sample volume. Ensure complete dispersion of the inoculum by adequate mixing.
5.4.2 Store the inoculated product at 20 °Cto25 °C. The temperature must be monitored using a calibrated
device and the temperature documented.
If the product is sensitive to light, it should be protected during the period of the test.
5.4.3 Take 1,0 ml aliquots of the inoculated product for determination of viable count at 7 d and 14 d.
5.4.4 After taking the 14 d sample, each sample is rechallenged as in 5.4.1 by using an inoculum level of
4 5
1,0� 10 cfu/ml to 1,0� 10 cfu/ml.
5.4.5 Take 1,0 ml aliquots of the inoculated product for determination of the viable count at 21 d and 28 d.
5.4.6 Subject each of the 1,0 ml aliquots, removed at the specified time intervals, to a suitable series of decimal
dilutions in validated neutralizing media. Mix the suspension well by vortexing vigorously and let stand to allow
neutralization to be completed. Neutralization conditions shall be based on recovery-medium control testing (see
5.5.2).
If an antimicrobial agent in the formulation cannot be adequately inactivated or neutralized, eliminate it using a
validated membrane filtration procedure (see annex A).
5.4.7 Determine the viable count of organisms in appropriate dilutions by preparation of triplicate plates (unless
otherwise justified) of a suitable recovery medium (e.g. TSA for bacteria and SDA for mould and yeast).
If membrane filtration has been employed to remove or neutralize antimicrobial agents, culture the membranes on
these media as appropriate.
If the pour-plate method is utilized, keep the agar for pour plates below 50 °C prior to pouring.
NOTE The agar media used for determination of viable counts may also contain antimicrobial inactivators or neutralizers, if
required.
5.4.8 Incubate bacterial recovery plates at 30 °Cto35 °C. Incubate yeast recovery plates at 20 °Cto 25 °Cor
30 °Cto35 °C. Incubate mould recovery plates at 20 °Cto25 °C. Incubation times for optimal recovery of bacteria,
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yeast and moulds shall be determined. Minimum incubation times shall be based on recovery medium control
testing (see 5.5.2). Record the number of cfu observed on countable plates.
Plates should be observed periodically during incubation to prevent the occurrence of uncountable plates due to
overgrowth.
5.4.9 Determine the average number of colony-forming units on countable plates. Calculate the microbial
reduction at the specified time points.
NOTE Countable plates refer to 30 cfu to 300 cfu per plate for bacteria and yeast, and 8 cfu to 80 cfu per plate for moulds,
0 –1
except when colonies are observed only for the 10 or 10 dilution plates.
5.4.10 The absence of microorganisms shall be documented, e.g., by recording a “0” or “NR” (no recovery), when
plates for all dilutions of a sample at a single time point have zero colonies.
5.4.11 The concentration of survivors is calculated at each point of time. The concentration of viable organisms
following the 14 d rechallenge is the sum of the rechallenge inoculum concentration and the 14 d survivor
concentration.
5.5 Controls
5.5.1 Inoculum controls
The initial and rechallenge inoculum concentrations are calculated by dispersing an identical aliquot of the
inoculum into the same volume as used in 5.4.1 of a suitable diluent to achieve a final concentration not less than
5 6 4 5
1,0� 10 cfu/ml to 1,0� 10 cfu/ml for the initial inoculum or 1,0� 10 to 1,0� 10 cfu/ml for the rechallenge. The
volume of inoculum does not exceed 1 % of the sample volume. Ensure dispersion of the inoculum by adequate
mixing. Evaluate this control sample for cfu/ml at the beginning of the test in order to demonstrate the suitability of
the medium used for growth of the test organism and provide an estimate of the initial inoculum concentration.
Plate the appropriate aliquot from each tube onto the recovery agar plates in triplicate (unless otherwise justified).
5.5.2 Recovery medium control
Vortex a 1/10 dilution of the preserved product in the validated neutralizing broth (1 ml into 9 ml). Let it stand to
allow neutralization to be completed. Prepare a second control tube with 10 ml of a suitable diluent (e.g. DPBST).
Inoculate the tubes with sufficient inoculum to result in 10 cfu to 100 cfu of challenge organism per plate. Incubate
for an appropriate period of time at ambient temperature. Plate the appropriate aliquot from each tube onto the
recovery agar plates in triplicate (unless otherwise justified).
Incubate bacterial recovery plates at 30 °Cto35 °C. Incubate yeast recovery plates at 20 °Cto 25 °Cor30 °Cto
35 °C. Incubate mould recovery plates at 20 °Cto25 °C. Determine minimum incubation times for optimal recovery
of bacteria, yeast and moulds.
Check that the recovery from the neutralizer broth is at least 50 % of the recovery in the second control tube.
Perform this control for each challenge organism.
If a dilution of greater than 1/10 is required for neutralization, then membrane filtration should be used.
Validate the neutralization of the product with each challenge organism initially and as appropriate.
5.6 Performance criteria
5.6.1 General
Products shall be capable of meeting these criteria throughout their labelled shelf life and at the discard date.
Meeting the criteria of 5.6.2 and 5.6.3 shall justify a 28 d period of use after opening (discard date).
NOTE Refer to annexes B, C, D and E for suggested methods, if a discard date longer than 28 d is desired.
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5.6.2 Bacteria
The number of each challenge organism recovered per millilitre shall be reduced by a mean value of not less than
3,0 logs at 14 d. After the rechallenge at 14 d, the concentration of each challenge organism shall be reduced
again by at least a mean value of 3,0 logs by 28 d.
5.6.3 Moulds and yeasts
The number of each challenge organism recovered per millilitre shall remain at, or below, the initial concentrations
(within an experimental error of � 0,5 logs) within 14 d. At 28 d, the concentration of each challenge organism shall
remain at, or below, the concentrations (within an experimental error of � 0,5 logs) of each challenge organism
after the rechallenge.
5.7 Test report
The test report shall include:
a) the title of this International Standard;
b) the identification of the product, including name of the product, batch number, expiry date, manufacturer,
storage conditions and active substances(s) and its/their concentration(s) (as available);
c) the name(s) of the operator(s);
d) deviations from the protocol;
e) date and time of incubation;
f) storage time for inoculated product;
g) results obtained, including numbers of organisms recovered at each time point.
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ISO 14730:2000(E)
Annex A
(informative)
Example of a membrane filtration procedure
A.1 Materials and reagents
A.1.1 Culture media and reagents
A.1.1.1 Diluting fluid, with or without neutralizers.
A.1.1.2 Tryptone Soya Agar (TSA).
A.1.1.3 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride (DPBS):
200 mg/l KCl, 200 mg/l KH PO , 8 000 mg/l NaCl, and 2 160 mg/l Na HPO �7H O or suitable diluent.
2 4 2 4 2
A.1.1.4 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline plus 0,05 % polysorbate 80 (DPBST) or suitable diluent.
A.1.1.5 Validated neutralizing agents/media as required, for example, Dey-Engley Neutralizing Broth (DEB)
and Letheen Broth.
A.1.2 Test equipment
Usual laboratory equipment (such as sterile pipettes, Petri dishes, containers) together with the following.
A.1.2.1 Sterile membrane filter.
A.1.2.2 Suitable sterile apparatus for holding the sterile membrane filter and filtrate.
A.1.2.3 Suitable equipment for creating a vacuum or pressure to cause the liquid phase of the inoculated
test solution to pass through the membrane filter aseptically.
The membrane filter should have a nominal pore size of not greater than 0,45µm, a diameter of at least 47 mm
and should be free of chemicals which could be toxic to microbial cells.
A.2 Test method and results
A.2.1 Moisten the sterile membrane filter (A.1.2.1) in a sterile filter assembly (A.1.2.2) with sterile DPBST
(A.1.1.4), or suitable diluent.
A.2.2 Aseptically transfer a measured volume of the inoculated test solution into sterile DPBST (A.1.1.4) or
diluting fluid.
A.2.3 Transfer the diluted solution to the membrane and filter immediately with the aid of vacuum or pressure.
Dilute the sample applied to the filter with 50 ml to 100 ml of dilution fluid and thoroughly mix to ensure uniform
distribution of the sample over the entire area of the filter.
NOTE This will decrease the probability of multiple colony-forming units being placed on the filter at the same location.
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A.2.4 Wash the membrane filter with several volumes of diluting fluid which may contain additional neutralizing
agents as needed. The actual volume should be determined empirically for each formulation for each challenge
organism.
NOTE Three volumes of diluting fluid (100 ml each) are usually sufficient to remove and/or dilute the antimicrobial agent.
A.2.5 Incubate the membrane filter with appropriate media to allow growth of colony-forming units on the surface
of the filter.
NOTE This may be accomplished by aseptic removal of the membrane filter from the filter assembly unit and placement of
the membrane on the surface of a sterile agar plate which does not have obvious liquid on the surface; or the membrane may
be enclosed in an agar sandwich. Alternatively, a sterile membrane filter unit may be used which requires addition of sterile
media to the sealed filter and incubation of the membrane in situ. Media should be used which are appropriate for the type of
challenge organism and the specific formulation under test. Time of the incubation should be established.
A.2.6 Determine the average number of colony-forming units on the countable membrane filters (3 cfu to
100 cfu/47 mm filter for bacteria and yeast and 3 cfu to 10 cfu/47 mm filter for moulds). Calculate and document the
number of colony-forming units per millilitre of inoculated solution.
A.3 Controls
Confirm neutralizer efficacy by transferring an aliquot of the uninoculated test solution into 50 ml to 100 ml of sterile
diluting fluid using the same ratio of volume of test solution to volume of diluting fluid. Apply the entire volume to the
membrane and filter using vacuum or pressure. Wash the filter with several volumes of the diluting fluid using the
same volume as used for the test procedure. Transfer 5 cfu to 100 cfu challenge organisms (one species per filter)
into 100 ml of diluting fluid and apply to the membrane. Incubate the membrane filter in contact with media as
described in the test procedure (see A.2.5).
Repeat the procedure using diluting fluid not exposed to the test solution. Compare counts with those derived by
the same method but using a suitable diluent (e.g. DPBST), instead of the test solution. Confirm the inoculum on a
suitable medium in triplicate (unless otherwise justified). Ensure that the recovery in the neutralizer broth is at least
50 % of the inoculum.
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ISO 14730:2000(E)
Annex B
(informative)
Discard date procedure I
B.1 Principle
6
B.1.1 The test consists of inoculating the test samples with a high level of organism (approximately 10 cfu/ml) on
3
0 d. The test samples are rechallenged with a low organism inoculum level (approximately 10 cfu/ml) in the test
formulation.
B.1.2 Inoculation times are at initial, 2 weeks, 25 %, 50 %, 75 % and 100 % of the proposed discard date.
B.1.3 Sampling times should include 1, 2, 3, 4 weeks, and 25 %, 50 %, 75 % and 100 % of the proposed discard
date, and 14 d after the proposed discard date.
B
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14730
Première édition
2000-09-15
Optique ophtalmique — Produits
d'entretien des lentilles de contact —
Essais de l'efficacité de conservation
antimicrobienne et lignes directrices pour
la détermination de la durée d'utilisation
après première ouverture
Ophthalmic optics — Contact lens care products — Antimicrobial
preservative efficacy testing and guidance on determining discard date
Numéro de référence
ISO 14730:2000(F)
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ISO 2000
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ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
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Sommaire Page
Avant-propos.iv
Introduction.v
1 Domaine d'application.1
2Références normatives .1
3Termesetdéfinitions.2
4 Principe.2
5Méthodes d’essai.2
5.1 Matériaux et réactifs .2
5.2 Échantillons pour essai et maintenance de la culture.3
5.3 Préparation de l'ensemencement microbien (inoculum).3
5.4 Méthode d'essai pour l'ensemencement de l'inoculum.4
5.5 Contrôles .5
5.6 Critères de performance .6
5.7 Rapport d'essai .6
Annexe A (informative) Exempledeméthode de filtration par membrane .7
Annexe B (informative) Méthode I pour la duréed’utilisation aprèspremière ouverture .9
Annexe C (informative) Méthode II pour la duréed’utilisation aprèspremière ouverture .12
Annexe D (informative) Méthode III pour la duréed’utilisation aprèspremière ouverture .16
Annexe E (informative) Méthode IV pour la duréed’utilisation aprèspremière ouverture .20
Annexe F (informative) Organismes d'essai provenant d'autres collections de cultures.23
Bibliographie .24
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiéeaux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude aledroit de fairepartie ducomité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments delaprésente Norme internationale peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 14730 a étéélaboréepar le comité technique ISO/TC 172, Optique et instruments
d'optique, sous-comité SC 7, Optique et instruments ophtalmiques.
Les annexes A àF delaprésente Norme internationale sont données à titre d’information.
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Introduction
Les produits d'entretien des lentilles de contact (PELC) sont utilisés avec des lentilles de contact. Ces produits
permettent de rincer, de nettoyer, de désinfecter, d'entreposer, d'humidifier, d'aider au confort et de conditionner
les lentilles de contact. Certains produits ont une seule fonction, d'autres ont de multiples fonctions.
En règle générale, les produits fabriqués en vue d'une utilisation avec des lentilles souples peuvent être utilisés
avec des lentilles rigides perméables aux gaz (RPG) ou avec des lentilles polyméthylméthacrylates (PMMA), mais
les produits utilisésspécifiquement avec les lentilles RPG ou PMMA ne conviennent généralement pas aux lentilles
souples.
La plupart des PELC sont fabriqués sous forme de solutions et sont en général conditionnés et vendus en
emballages multi-doses. Des produits secs sont vendus sous forme de comprimés oudegranulés et doivent être
dissous dans un solvant approprié immédiatement avant utilisation.
Si la solution de produit d'entretien des lentilles de contact n'a pas en elle-même une activité antimicrobienne, il est
possible d'ajouter un conservateur antimicrobien au produit pour inhiber la prolifération de micro-organismes
pouvant être introduits à l'occasion de versements répétés pendant l'utilisation et le stockage qui suit. Tous les
agents antimicrobiens présententunrisquedetoxicité pour l'utilisateur. En vue d'une protection maximale de
l'utilisateur, il convient que la concentration du conservateur soit telle qu'elle offre une activité de conservation
adéquate pour une toxicité minimale.
Il existe des différences entre les préparations ophtalmiques et les produits d'entretien des lentilles de contact.
Certaines de ces différences sont significatives par rapport à l'essai de l'efficacité de préservation. En règle
générale, les préparations ophtalmiques sont conditionnées dans des emballages de faible volume, et sont
utilisées pour de courtes périodes sur des yeux présentant des troubles fonctionnels. Les produits d'entretien des
lentilles de contact sont distribués en doses plus grandes et sont utilisés sur des yeux sains avec des lentilles de
contact sur une longue période. Les risques potentiels liés à l'entretien des lentilles de contact sont l'interaction
solution/lentilles qui provoque une irritation oculaire et les risques de contamination de solution par l'utilisation
répétée (quotidienne) du produit.
Par conséquent, lorsque les produits d'entretien des lentilles de contact sont formulés, le risque de réaction
nuisible au patient dû aux lentilles et/ou à l'interaction avec la solution doit être pondéré par rapport aux bénéfices
de sécurité dus à la maintenance de l'activité antimicrobienne de la solution.
La présente Norme internationale spécifielaméthode d'essai et les critères de performance applicables à
l'efficacité de la conservation. Elle a été adaptée à partir des Pharmacopées qui donnent une limite de temps de 28
jours dans leur méthode d'essai. Les annexes informatives donnent quatre exemples de méthodes d'essai de
l'efficacité de conservation développées par des fabricants de produits d'entretien des lentilles de contact afin de
présenter l'efficacité de conservation des produits dont les dates d’utilisation aprèspremière ouverture sont
supérieures à 28 jours.
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NORME INTERNATIONALE ISO 14730:2000(F)
Optique ophtalmique — Produits d'entretien des lentilles de
contact — Essais de l'efficacité de conservation antimicrobienne
et lignes directrices pour la détermination de la durée d'utilisation
aprèspremière ouverture
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode à suivre pour évaluer l'activité de conservation
antimicrobienne de tous les produits d'entretien des lentilles de contact conservés en emballages multi-doses et
fournit des lignes directrices sur les méthodes à utiliser pour la détermination de la duréed’utilisation après
première ouverture, en annexes informatives.
Le présent essai est applicable pour une duréed’utilisation aprèspremière ouverture allant jusqu’à 28 jours.
L'essai ne s'applique pas aux produits stériles emballés en doses unitaires destinées à un usage unique ni aux
emballages multi-doses constituant des barrières physiques à la contamination microbienne (exemple : emballages
aérosol).
NOTE 1 Les principes de l’essai peuvent être utiliséspour étendre la duréed’utilisation au-delà de 28 jours. Voir les annexes
B, C, D et E.
NOTE 2 L’usage d’inoculums multiples ou mixtes et/ou l'inclusion de lentilles de contact ou d'autres charges organiques peut
modifier l'activité antimicrobienne apparente d'un produit particulier. L'évaluation de ces variables, associée à l'essai sur une
large gamme de micro-organismes et l'essai d'échantillons provenant de doses utilisées partiellement peuvent être intéressants
pour développer un produit d'entretien des lentilles de contact, mais ne font pas partie du domaine d'application de la présente
Norme internationale.
2Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
1)
ISO 8320-2:— , Lentilles de contact et produits d’entretien des lentilles de contact — Vocabulaire —
Partie 2 : Produits d’entretien.
ISO 14534:1997, Optique ophtalmique — Lentilles de contact et produits d'entretien des lentilles de contact —
Prescriptions fondamentales.
1)
À publier.
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ISO 14730:2000(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions donnés dans l'ISO 8320-2
s'appliquent.
4Principe
4.1 L'essai consiste à contaminer la préparation avec un inoculum microbien défini et convenable au début de
ème
l’essai, puis à nouveau au 14 jour. Les préparations inoculées sont conservées à une température donnée. Des
échantillons des préparations inoculées sont prélevés à intervalles donnés, et sont mis en culture pour déterminer
les organismes viables. L'aptitude du produit à empêcher toute nouvelle prolifération est confirmée par le
dénombrement des organismes viables sur des durées prolongées.
4.2 Le titredel’inoculum microbien retenu pour cet essai n'est pas censéêtre représentatif de la contamination
probable en pratique, mais permet plutôt d'obtenir des informations chiffrées à partir desquelles l'estimation du taux
et de l'importance de la perte de viabilité peut être déterminée.
4.3 Les propriétés de conservation antimicrobienne du produit sont adéquates si, dans les conditions de l'essai,
il existe une réduction significative des bactéries et aucune augmentation des levures et des moisissures dans la
préparation inoculée après le temps indiqué et à la température prescrite. Les critères de performance figurent en
5.6.
4.4 Il convient de prendre des mesures appropriées pour inactiver ou éliminer les agents antimicrobiens pendant
la culture et le dénombrement des micro-organismes survivants. L'efficacité de ces mesures doit être validée.
5Méthodes d’essai
5.1 Matériaux et réactifs
5.1.1 Organisme d'essai.
Les souches énumérées au Tableau 1 doivent être utilisées.
NOTE Les organismes d'essai provenant d'autres collections de cultures pouvant être utilisés figurent à l'annexe F.
Tableau 1 — Organismes d'essai
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Escherichia coli ATCC 8739
Candida albicans
ATCC 10231
Aspergillus niger ATCC 16404
5.1.2 Milieux de culture et réactifs.
5.1.2.1 Gélose tryptone soja (TSA).
5.1.2.2 Gélose Sabouraud (SDA).
5.1.2.3 Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, sans chlorure de calcium ni chlorure de
magnésium (DPBS) : 200 mg/l de KCl, 200 mg/l de KH PO , 8 000 mg/l de NaCl et 2 160 mg/l de Na HPO ,7H O
2 4 2 4 2
ou autre diluant approprié.
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5.1.2.4 Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, plus 0,05 % (en masse volumique) de
polysorbate 80 (DPBST) ou autre diluant approprié.
5.1.2.5 Milieux/agents neutralisants validés,comme spécifié, par exemple bouillon neutralisant Dey-Engley
(DEB) et le bouillon Letheen.
5.1.3 Appareillage d’essai
L'équipement normal de laboratoire suivant est nécessaire: pipettes, compresses, tubes, boîtes de Pétri (90 mm à
100 mm � 20 mm) stériles, etc. et des appareils appropriés pour la détermination spectrophotométrique de la
densité des cellules, pour le dénombrement des colonies et pour la centrifugation.
5.2 Échantillons pour essai et maintenance de la culture
Le produit à soumettre à l'essai doit être représentatif du produit à commercialiser. Il convient de prélever les
parties aliquotes directement dans l'emballage final immédiatement avant l'essai.
Trois lots de produits doivent être soumis à l'essai. Chaque lot de produit doit être soumis à l’essai avec des
contaminants distincts pour chaque organisme à inoculer.
Maintenir les cultures d'essai selon les recommandations du centre de collection dont elles sont issues.
Les cultures ne devraient pas être repiquées plus de 5 fois à partir du stock provenant de la collection (ATCC,
NCIB, NCTC, NCPF ou autres, voir annexe F). Chaque repiquage est une sous-culture du repiquage précédent.
5.3 Préparation de l'ensemencement microbien (inoculum)
Chaque organisme d'essai est mis en culture sur de la gélose dans les conditions énoncées au Tableau 2.
Tableau 2 — Milieux et conditions d'incubation pour la prolifération des organismes d'ensemencement
Température
Organisme Milieu Durée d'incubation
°C
P. aeruginosa TSA 30-35 18-24 h
S. aureus
TSA 30-35 18-24 h
E. coli TSA 30-35 18-24 h
20-25 42-48 h
C. albicans SDA
30-35 18-24 h
A. niger
SDA 20-25 7 jours à 10 jours
Utiliser un DPBST stérile ou un diluant approprié pour collecter chaque culture. Laver le milieu de culture, le
transférer dans un godet adéquat et agiter. Filtrer les suspensions de spores à travers de la laine de verre stérile,
de la mousseline ou de la gaze pour enlever les fragments d'hyphal.
Après la collecte, les organismes mis en culture peuvent être lavés par centrifugation. Les bactéries en suspension
peuvent être filtrées pour produire une unique dispersion de cellules (par exemple granulométrie des pores de
3µm à 5µm). Ajuster ensuite toutes les suspensions de cellules d'ensemencement avec du DPBST ou un autre
7 8
diluant appropriéà une concentration comprise entre 1� 10 ufc/ml et 1� 10 ufc/ml. Estimer la concentration
approximative en cellules de chaque suspension en mesurant la turbidité de la suspension ou de la dilution de la
suspension à l'aide d'un spectrophotomètre. La concentration réelle des unités formant colonie par ml doit être
déterminée pour chaque suspension, par exemple par la méthode du dénombrement de boîtes, au moment de
l'essai.
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En utilisant la centrifugation, il convient de réaliser chaque centrifugation entre 20 °Cet 25 °C pour une duréequi
ne dépasse pas l'équivalent de 10 min à 4 000 g ou moins.
Utiliser les suspensions de cellules de levures et de bactéries le jour de leur préparation.
NOTE 1 Il se peut que des durées de centrifugation supérieures soient nécessaires à des vitesses inférieures.
NOTE 2 Les suspensions de spores peuvent être utilisées jusqu'à sept jours aprèslapréparation, si elles sont conservées
au réfrigérateur (entre 2 °Cet8 °C).
5.4 Méthode d'essai pour l'ensemencement de l'inoculum
5.4.1 Préparer un ou plusieurs tubes (pour chaque lot utilisé) contenant un minimum de 10 ml de solution d'essai
par organisme à inoculer.
NOTE Des tubes échantillons sont utilisésdepréférence à des boîtes à lentilles pour permettre une exécution technique
efficace de l'essai. Du fait d’incompatibilités qui peuvent exister entre la composition de la solution et les matériaux des tubes, il
convient d’utiliser des tubes d’un matériau utilisé, qui soient compatibles avec la composition de la solution d’essai.
Inoculer le tube échantillon de produit soumis à l'essai avec une suspension d'organismes d'essai suffisante pour
5 6
obtenir un dénombrement final compris entre 1,0� 10 ufc/ml et 1,0� 10 ufc/ml. S'assurer que le volume de
l'inoculum ne dépasse pas 1 % du volume échantillon. Réaliser une dispersion complète de l'inoculum par un
mélange approprié.
5.4.2 Entreposer le produit inoculé entre 20 °Cet 25 °C. La température doit être contrôlée à l'aide d'un dispositif
étalonné et être indiquée dans le rapport d'essai.
Si le produit est sensible à la lumière, il convient de le protéger pendant la duréedel'essai.
5.4.3 Prélever des échantillons de 1,0 ml du produit inoculé pour dénombrer les cellules viables à 7 jours et
14 jours.
5.4.4 Aprèsavoir prélevé l'échantillon à 14 jours, chaque produit est réensemencé commeen5.4.1 à l'aide d'un
4 5
inoculum dont la concentration est comprise entre 1,0� 10 ufc/ml et 1,0� 10 ufc/ml.
5.4.5 Prélever des échantillons de 1,0 ml du produit inoculé pour dénombrer les cellules viables à 21 jours et
28 jours.
5.4.6 Diluer les échantillons prélevés (1 ml) aux intervalles spécifiés, en réalisant une série adéquate de dilutions
décimales dans un milieu neutralisant validé.Bien mélanger la suspension en l'agitant vigoureusement et laisser
reposer pour permettre une neutralisation intégrale. Les conditions de la neutralisation doivent être basées sur
l’essai de contrôle du milieu de récupération (voir 5.5.2).
Si un agent antimicrobien de la formulation ne peut pas être inactivé ou neutralisé de manière adéquate, l'éliminer
en utilisant une méthode de filtration par membrane appropriée (voir annexe A).
5.4.7 Procéder au dénombrement des organismes viables dans chacune des dilutions en triple (sauf
spécification contraire) en utilisant des boîtes de milieu de récupération approprié (par exemple TSA pour les
bactéries et SDA pour la moisissure et la levure).
Si une filtration par membrane a été utiliséepour éliminer ou neutraliser les agents antimicrobiens, mettre en
culture les membranes sur ces milieux le cas échéant.
Si la méthode en inclusion est utilisée, conserver la gélose des boîtes à une température inférieure à 50 °C avant
la distribution.
NOTE Les milieux de gélose utiliséspour le dénombrement peuvent également contenir des inactivateurs ou des
neutralisants antimicrobiens, si nécessaire.
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5.4.8 Incuber les boîtes de dénombrement des bactéries entre 30 °Cet 35 °C. Incuber les boîtes de
dénombrement de levures entre 20 °Cet25 °C ou entre 30 °Cet 35 °C. Incuber les boîtes de dénombrement de
moisissures entre 20 °Cet 25 °C. Les durées d'incubation minimales doivent être fondées sur l'essai de contrôle
du milieu de récupération (voir 5.5.2). Noter le nombre d’ufc observées dans les boîtes dénombrables.
Il convient d'examiner périodiquement les boîtes pendant l'incubation afin d'empêcher que les boîtes ne deviennent
incomptables en raison d'une surcroissance.
5.4.9 Déterminer le nombre moyen d’unités formant colonie (ufc) sur les boîtes dénombrables. Calculer la
réduction microbienne aux intervalles spécifiés.
NOTE Ne sont comptables que les boîtes contenant entre 30 et 300 ufc/boîte pour les bactéries et les levures et entre 8 et
0 -1
80 ufc/boîte pour les moisissures, sauf si les colonies ne sont observées que sur les boîtes de dilution 10 ou 10 .
5.4.10 L’absence de micro-organismes doit être documentée, c’est-à-dire en enregistrant «O» ou «NR» (pas de
récupération) pour toutes les dilutions d'un échantillon prélevéà un intervalle de temps donné unique qui ont zéro
colonie.
5.4.11 Le titre des survivants est calculéà chaque intervalle de temps. Le titre des organismes viables aprèsle
ème
réensemencement au 14 jour correspond à la somme du titre de l'inoculum réensemencé et du titre des
ème
survivants au 14 jour.
5.5 Contrôles
5.5.1 Contrôles de l'inoculum
Les titres initiaux de l'inoculum et les titres de l'inoculum réensemencé sont déterminés en diluant un volume
identique de l’échantillon de l'inoculum dans le même volume d'un diluant approprié utilisé en 5.4.1. Le
5 6
dénombrement des colonies doit montrer que l’inoculum contient entre 1,0� 10 ufc/ml et 1,0� 10 ufc/ml pour
4 5
l'inoculum initial ou entre 1,0� 10 ufc/ml et 1,0� 10 ufc/ml pour le réensemencement, le volume de l'inoculum
n’excédant pas 1 % du volume d'échantillon. S'assurer de la dispersion de l'inoculum par un mélange adéquat.
Évaluer cet échantillon de contrôle en ufc/ml au débutdel'essaiafindedémontrer l'adéquation du milieu utiliséà la
croissance de l'organisme d'essai, et d'obtenir une estimation de la concentration initiale de l'inoculum. Placer la
partie aliquote de chaque tube sur les boîtes de gélose de récupération (sauf spécification contraire).
5.5.2 Contrôle du milieu de récupération
Procéder à une dilution à 1:10 du produit conservé dans le bouillon neutralisant validé (1 ml dans 9 ml) et agiter.
Laisser reposer pour terminer la neutralisation. Préparer un second tube de contrôle avec 10 ml d'un diluant adapté
(par exemple le DPBST). Inoculer les tubes pour obtenir un titre en micro-organisme compris entre 10 ufc et
100 ufc par boîte. Incuber pendant une durée appropriée à température ambiante. Distribuer la partie aliquote de
chaque tube sur les boîtes de récupération de gélose en triple exemplaire (sauf spécification contraire).
Incuber les boîtes de dénombrement des bactéries à une température comprise entre 30 °Cet 35 °C. Incuber les
boîtes de dénombrement des levures à une température comprise entre 20 °Cet 25 °Couentre 30 °Cet 35 °C.
Incuber les boîtes de dénombrement des moisissures entre 20 °Cet 25 °C. Déterminer les durées d'incubation
minimales permettant la récupération optimale de bactéries, levures et moisissures.
Vérifier queledénombrement du bouillon neutralisant est égal ou supérieur à 50 % de la récupération dans le
second tube de contrôle. Procéder à ce contrôle pour chaque organisme d'ensemencement.
Si une dilution supérieure à 1:10 est nécessaire pour la neutralisation, il convient d’utiliser la filtration sur
membrane.
Valider la neutralisation du produit avec chaque organisme d'ensemencement initialement, et lorsque nécessaire.
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5.6 Critères de performance
5.6.1 Généralités
Les produits doivent être capables de satisfaire aux critères tout au long de leur durée de conservation indiquée
sur l'emballage et jusqu'à leur date limite d’utilisation aprèsouverture.
La satisfaction aux critères indiqués en 5.6.2 et 5.6.3 doit justifier une période de 28 jours après ouverture (durée
d’utilisation aprèspremière ouverture).
NOTE Se référer aux annexes B, C, D et E pour les méthodes suggérées, si une date de péremption supérieure à 28 jours
est souhaitée.
5.6.2 Bactéries
Le nombre de chaque organisme d'ensemencement récupéré par ml doit être ramenéà une valeur moyenne
supérieure ou égale à 3,0 logs à 14 jours. Aprèsle réensemencement à 14 jours, la concentration de chaque
organisme d'ensemencement doit êtredenouveau ramenée à une valeur moyenne de 3,0 logs à 28 jours au
minimum.
5.6.3 Moisissures et levures
Le nombre de chaque organisme d'ensemencement récupéré par ml doit rester égal ou inférieur aux
concentrations initiales (avec une tolérance d'erreur expérimentale de � 0,5 logs) pendant 14 jours. À 28 jours, la
concentration de chaque organisme d'ensemencement par ml doit rester égale ou inférieure aux concentrations
(avec une tolérance d'erreur expérimentale de � 0,5 logs) de chaque organisme d'ensemencement aprèsle
réensemencement.
5.7 Rapport d'essai
Le rapport d'essai doit comporter les éléments suivants :
a) letitredelaprésente Norme internationale ;
b) l'identification du produit, y compris le nom du produit, le numéro de lot, la date de péremption, le fabricant, les
conditions d'entreposage et la ou les substance(s) active(s) et leur(s) concentration(s) (si disponibles) ;
c) le ou les nom(s) du ou des opérateur(s) ;
d) les écarts par rapport au protocole ;
e) la date et la durée d'incubation ;
f) la durée de stockage du produit inoculé ;
g) les résultats obtenus, incluant le nombre d’organismes récupérés à chaque point.
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Annexe A
(informative)
Exemple de méthode de filtration par membrane
A.1 Matériaux et réactifs
A.1.1 Milieux de culture et réactifs
A.1.1.1 Diluant liquide, avec ou sans neutralisants.
A.1.1.2 Gélose de tryptone soja (TSA).
A.1.1.3 Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, sans chlorure de calcium ni chlorure de
magnésium (DPBS) : 200 mg/l de KCl, 200 mg/l de KH PO , 8 000 mg/l de NaCl et 2 160 mg/l de Na HPO ,7H O
2 4 2 4 2
ou autre diluant approprié.
A.1.1.4 Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, plus 0,05 % (en masse volumique) de
polysorbate 80 (DPBST) ou autre diluant approprié.
A.1.1.5 Milieux/agents neutralisants validés,comme spécifié, par exemple bouillon neutralisant Dey-Engley
(DEB) et le bouillon Letheen.
A.1.2 Appareillage d’essai
Appareillage normal de laboratoire (tel que pipettes stériles, boîtes de Pétri, récipients) ainsi que les appareils
suivants.
A.1.2.1 Filtre à membrane stérile.
A.1.2.2 Appareillage stérile approprié, pour maintenir le filtre à membrane stérile et le filtrat.
A.1.2.3 Appareillage approprié permettant de créer un vide ou une pression, pour passer la phase liquide
de la solution d'essai inoculée à travers le filtre à membrane dans des conditions aseptiques.
Il convient que le filtre à membrane ait des pores d'une granulométrie nominale inférieure ou égale à 0,45µm, un
diamètre supérieur ou égal à 47 mm, et ne contienne aucun produit chimique risquant d'être toxique pour les
cellules microbiennes.
A.2 Méthode d’essai et résultats
A.2.1 Humidifier le filtre à membrane stérile (A.1.2.1) dans un bloc à filtre stérile (A.1.2.2) avec du DPBST stéri
...
Questions, Comments and Discussion
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