ISO 9936:1997
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherols and tocotrienols contents — Method using high-performance liquid chromatography
Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherols and tocotrienols contents — Method using high-performance liquid chromatography
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des teneurs en tocophérols et en tocotriénols — Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance
La présente Norme internationale prescrit une méthode pour la détermination des teneurs en alpha-, bêta-, gamma- et delta- tocophérols et tocotriénols libres (appelés globalement tocols) des corps gras et des huiles (appelés globalement corps gras) d'origines animale et végétale, par chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP). Les produits contenant des esters de tocophérols ou de tocotriénols doivent subir une saponification préalable. NOTE - Une méthode appropriée incluant un processus de saponification à froid, est décrite pour information, dans l'annexe A.
Živalske in rastlinske maščobe in olja - Določevanje tokoferolov in tokotrienolov - Metoda z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9936
First edition
1997-12-15
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of tocopherols and
tocotrienols contents — Method using high-
performance liquid chromatography
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des teneurs en
tocophérols et en tocotriénols — Méthode par chromatographie en phase
liquide à haute performance
A
Reference number
ISO 9936:1997(E)
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ISO 9936:1997(E)
Contents Page
1 Scope. 1
2 Normative reference. 1
3 Definition. 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Apparatus. 2
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample . 3
9 Procedure. 3
10 Expression of results. 6
11 Precision . 6
.......................................................................................
12 Test report 7
Annex A (informative) Saponification.
8
(informative) .
Annex B Results of interlaboratory tests 10
Annex C (informative) Bibliography.
11
© ISO 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Switzerland
Internet central@iso.ch
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii
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©
ISO ISO 9936:1997(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 9936 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 11, Animal and
vegetable fats and oils.
Annexes A to C of this International Standard are for information only.
iii
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INTERNATIONAL STANDARD ISO ISO 9936:1997(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherols
and tocotrienols contents — Method using high-performance liquid
chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the contents of free α-, β-, γ- and δ-
tocopherols and tocotrienols (referred to jointly as tocols) in animal and vegetable fats and oils (referred to
hereinafter as fats) by high-performance liquid chromatography (HPLC).
For products containing tocopherol or tocotrienol esters, it is necessary to prepare the unsaponifiable matter.
NOTE A suitable method involving a cold saponification procedure is described in annex A for information only.
2 Normative reference
The following standard contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of the publication, the edition indicated was valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on the International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent edition of the standard indicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 661:1989, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample.
3 Definition
For the purposes of this International Standard, the following definition applies.
3.1 tocols contents: Mass fractions of the individual tocols, determined using the method specified in this
International Standard.
NOTE They are expressed in micrograms per gram.
4 Principle
A test portion is dissolved and the individual tocols are separated by high-performance liquid chromatography. The
content of each tocol is calculated using calibration factors determined from calibration solutions.
1
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ISO
ISO 9936:1997(E)
5 Reagents
All reagents shall be of HPLC grade or equivalent.
5.1 α-, β-, γ- and δ-tocopherol and tocotrienol standards
5.1.1 If tocopherol standards are not available, a blend of wheat germ and soya bean oil can be used to obtain
chromatograms which contain β γ and δ-tocopherols.
α-, -, -
5.1.2 If tocotrienol standards are not available, palm oil can be used to identify α- and γ-tocotrienols. The
chromatograms obtained can be used to assist peak identification in test sample chromatograms, in which case the
calibration factors for the corresponding tocotrienols should be used.
NOTE β-, γ- and δ-tocopherol standards can be obtained from Merck; α-tocopherol can be obtained from various suppliers. It
has been reported that the purity of some commercially available tocopherol standards may vary between 85 % and 100 %.
Thus it is important to determine the concentration of prepared calibration solutions by UV spectrometry.
5.2 Methanol.
5.3 Dichloromethane.
5.4 n-Hexane.
5.5 Propan-2-ol.
5.6 HPLC mobile phase, propan-2-ol, 0,5 % (V/V) solution in n-hexane.
6 Apparatus
All glassware shall be of low actinic activity. No apparatus shall give an alkaline reaction. This requirement is not
applicable when solutions are protected by pyrogallol.
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 HPLC system, consisting of a high-pressure pump, a sample injection device, a fluorescence detector with
the excitation wavelength set at 290 nm and emission wavelength at 330 nm, and a chart recorder or recording
integrator.
NOTE An ultraviolet (UV) detector may be used if a fluorescence detector is not available but it is not recommended. However,
if a UV detector is used, the wavelength should be set at 292 nm.
6.2 HPLC analytical column, 250 mm x 4 mm, packed with microparticulate silica having a mean particle size of
about 5 μm.
1)
NOTE 1 Suitable silica column packing materials available commercially are 5 μm LiChrosob SI 60 and Spherisorb S5W .
NOTE 2 The length and the diameter of the column may be varied according to the HPLC technique used.
NOTE 3 Depending on the silica HPLC column status (prehistory, dry or deactivation by traces of water, etc.) a triacylglycerol
peak could overlap the α-tocopherol peak.
If this happens, different results may be obtained from a fluorescence detector (possibility of quenching) and a UV detector
(peak disturbance). This will be most problematic if a calibration is carried out with a calibrant that does not contain fat for the
analysis of fat-containing samples.
1)
This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement
by ISO of these products.
2
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ISO
ISO 9936:1997(E)
6.3 UV spectrometer, capable of absolute measurement of absorbance at precisely defined wavelengths.
6.4 Rotary evaporator.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method is
given in ISO 5555 [2].
8 Preparation of test sample
In the case of liquid laboratory samples, prepare the test sample by homogenization as described in ISO 661,
except that filtration should be avoided.
In the case of solid samples, transfer a representative portion (i.e. not less than 10 % by mass of the laboratory
sample) to a glass beaker and carefully homogenize by melting, with gentle mixing, in a water bath at a temperature
not exceeding 40 °C.
Preparation of the test samples should be carried out, as far as is practicable, in subdued light and in any case out
of direct sunlight.
9 Procedure
NOTE In general, the oxidation of tocols during the analysis may lead to low results. In the presence of oxygen they are
oxidized more quickly in the presence of alkalis, or under the influence of heat or light, and measures should be taken to guard
against these influences.
9.1 Preparation of calibration solutions
9.1.1 Stock calibration solutions
Prepare a stock solution of each tocol by weighing 10 mg ± 1 mg of the standard (5.1) into a 100 ml one-mark
volumetric flask and diluting to the mark with hexane (5.4).
Pipette 10 ml of this solution into an amber glass round-bottomed flask and remove all hexane on a rotary
evaporator (6.4) under vacuum at a temperature not greater than 40 °C. Restore atmospheric pressure with
nitrogen and remove the flask from the evaporator as soon as all the solvent has been removed. Pipette into the
flask 10 ml of methanol (5.2) and swirl to dissolve the residue. Measure the absorbance of this solution at the
appropriate wavelength using the UV spectrometer (6.3). Calculate the concentration (in micrograms per millilitre)
by dividing the absorbance value by the appropriate factor given in table 1.
3
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ISO 9936:1997(E)
Table 1 — Division factors
Wavelength Tocopherol Division factor
nm
292 0,007 6
α-tocopherol
296 0,008 9
β-tocopherol
298 0,009 1
γ-tocopherol
298 0,008 7
δ-tocopherol
NOTE The factors quoted are derived from the E values (1 %/1 cm) of the
tocopherols. For example, the E value (1 %/1 cm) of α-tocopherol is 76 at 292 nm (in
methanol); therefore a 1 μg/ml solution of α-tocopherol will have an absorbance of
0,007 6 at 292 nm.
9.1.2 Working calibration solution
Mix appropriate volumes of the stock calibration solutions (9.1.1) to obtain a mixed tocol working calibration
solution, and dilute with n-hexane to give a solution containing between 1 μg and 5 μg of each standard per millilitre.
The working calibration solution shall be freshly prepared each working day.
Protect all solutions from light and store them at between 0 °C and 4 °C.
NOTE 1 Stock standard solutions can be satisfactorily stored in amber low-actinic glassware for up to 1 week if refrigerated.
Flasks may be wrapped in aluminium foil.
NOTE 2 If a UV detector
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 9936:1998
01-december-1998
äLYDOVNHLQUDVWOLQVNHPDãþREHLQROMD'RORþHYDQMHWRNRIHURORYLQWRNRWULHQRORY
0HWRGD]XSRUDERWHNRþLQVNHNURPDWRJUDILMHYLVRNHORþOMLYRVWL
Animal and vegetable fats and oils -- Determination of tocopherols and tocotrienols
contents -- Method using high-performance liquid chromatography
Corps gras d'origines animale et végétale -- Détermination des teneurs en tocophérols et
en tocotriénols -- Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 9936:1997
ICS:
67.200.10 5DVWOLQVNHLQåLYDOVNH Animal and vegetable fats
PDãþREHLQROMD and oils
SIST ISO 9936:1998 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST ISO 9936:1998
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SIST ISO 9936:1998
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First edition
1997-12-15
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of tocopherols and
tocotrienols contents — Method using high-
performance liquid chromatography
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des teneurs en
tocophérols et en tocotriénols — Méthode par chromatographie en phase
liquide à haute performance
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ISO 9936:1997(E)
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SIST ISO 9936:1998
ISO 9936:1997(E)
Contents Page
1 Scope. 1
2 Normative reference. 1
3 Definition. 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Apparatus. 2
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample . 3
9 Procedure. 3
10 Expression of results. 6
11 Precision . 6
.......................................................................................
12 Test report 7
Annex A (informative) Saponification.
8
(informative) .
Annex B Results of interlaboratory tests 10
Annex C (informative) Bibliography.
11
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All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
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ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 9936 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 11, Animal and
vegetable fats and oils.
Annexes A to C of this International Standard are for information only.
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Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherols
and tocotrienols contents — Method using high-performance liquid
chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the contents of free α-, β-, γ- and δ-
tocopherols and tocotrienols (referred to jointly as tocols) in animal and vegetable fats and oils (referred to
hereinafter as fats) by high-performance liquid chromatography (HPLC).
For products containing tocopherol or tocotrienol esters, it is necessary to prepare the unsaponifiable matter.
NOTE A suitable method involving a cold saponification procedure is described in annex A for information only.
2 Normative reference
The following standard contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of the publication, the edition indicated was valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on the International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent edition of the standard indicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 661:1989, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample.
3 Definition
For the purposes of this International Standard, the following definition applies.
3.1 tocols contents: Mass fractions of the individual tocols, determined using the method specified in this
International Standard.
NOTE They are expressed in micrograms per gram.
4 Principle
A test portion is dissolved and the individual tocols are separated by high-performance liquid chromatography. The
content of each tocol is calculated using calibration factors determined from calibration solutions.
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ISO 9936:1997(E)
5 Reagents
All reagents shall be of HPLC grade or equivalent.
5.1 α-, β-, γ- and δ-tocopherol and tocotrienol standards
5.1.1 If tocopherol standards are not available, a blend of wheat germ and soya bean oil can be used to obtain
chromatograms which contain β γ and δ-tocopherols.
α-, -, -
5.1.2 If tocotrienol standards are not available, palm oil can be used to identify α- and γ-tocotrienols. The
chromatograms obtained can be used to assist peak identification in test sample chromatograms, in which case the
calibration factors for the corresponding tocotrienols should be used.
NOTE β-, γ- and δ-tocopherol standards can be obtained from Merck; α-tocopherol can be obtained from various suppliers. It
has been reported that the purity of some commercially available tocopherol standards may vary between 85 % and 100 %.
Thus it is important to determine the concentration of prepared calibration solutions by UV spectrometry.
5.2 Methanol.
5.3 Dichloromethane.
5.4 n-Hexane.
5.5 Propan-2-ol.
5.6 HPLC mobile phase, propan-2-ol, 0,5 % (V/V) solution in n-hexane.
6 Apparatus
All glassware shall be of low actinic activity. No apparatus shall give an alkaline reaction. This requirement is not
applicable when solutions are protected by pyrogallol.
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 HPLC system, consisting of a high-pressure pump, a sample injection device, a fluorescence detector with
the excitation wavelength set at 290 nm and emission wavelength at 330 nm, and a chart recorder or recording
integrator.
NOTE An ultraviolet (UV) detector may be used if a fluorescence detector is not available but it is not recommended. However,
if a UV detector is used, the wavelength should be set at 292 nm.
6.2 HPLC analytical column, 250 mm x 4 mm, packed with microparticulate silica having a mean particle size of
about 5 μm.
1)
NOTE 1 Suitable silica column packing materials available commercially are 5 μm LiChrosob SI 60 and Spherisorb S5W .
NOTE 2 The length and the diameter of the column may be varied according to the HPLC technique used.
NOTE 3 Depending on the silica HPLC column status (prehistory, dry or deactivation by traces of water, etc.) a triacylglycerol
peak could overlap the α-tocopherol peak.
If this happens, different results may be obtained from a fluorescence detector (possibility of quenching) and a UV detector
(peak disturbance). This will be most problematic if a calibration is carried out with a calibrant that does not contain fat for the
analysis of fat-containing samples.
1)
This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement
by ISO of these products.
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6.3 UV spectrometer, capable of absolute measurement of absorbance at precisely defined wavelengths.
6.4 Rotary evaporator.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method is
given in ISO 5555 [2].
8 Preparation of test sample
In the case of liquid laboratory samples, prepare the test sample by homogenization as described in ISO 661,
except that filtration should be avoided.
In the case of solid samples, transfer a representative portion (i.e. not less than 10 % by mass of the laboratory
sample) to a glass beaker and carefully homogenize by melting, with gentle mixing, in a water bath at a temperature
not exceeding 40 °C.
Preparation of the test samples should be carried out, as far as is practicable, in subdued light and in any case out
of direct sunlight.
9 Procedure
NOTE In general, the oxidation of tocols during the analysis may lead to low results. In the presence of oxygen they are
oxidized more quickly in the presence of alkalis, or under the influence of heat or light, and measures should be taken to guard
against these influences.
9.1 Preparation of calibration solutions
9.1.1 Stock calibration solutions
Prepare a stock solution of each tocol by weighing 10 mg ± 1 mg of the standard (5.1) into a 100 ml one-mark
volumetric flask and diluting to the mark with hexane (5.4).
Pipette 10 ml of this solution into an amber glass round-bottomed flask and remove all hexane on a rotary
evaporator (6.4) under vacuum at a temperature not greater than 40 °C. Restore atmospheric pressure with
nitrogen and remove the flask from the evaporator as soon as all the solvent has been removed. Pipette into the
flask 10 ml of methanol (5.2) and swirl to dissolve the residue. Measure the absorbance of this solution at the
appropriate wavelength using the UV spectrometer (6.3). Calculate the concentration (in micrograms per millilitre)
by dividing the absorbance value by the appropriate factor given in table 1.
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SIST ISO 9936:1998
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ISO 9936:1997(E)
Table 1 — Division factors
Wavelength Tocopherol Division factor
nm
292 0,007 6
α-tocopherol
296 0,008 9
β-tocopherol
298 0,009 1
γ-tocopherol
298 0,008 7
δ-tocopherol
NOTE The factors quoted are derived from the E values (1 %/1 cm) of the
tocopherols. For example, the E value (1 %/1 cm) of α-tocopherol is 76 at 292 nm (in
methanol); therefore a 1 μg/ml solut
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 9936
Première édition
1997-12-15
Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination des teneurs en
tocophérols et en tocotriénols — Méthode
par chromatographie en phase liquide à
haute performance
Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherols and
tocotrienols contents — Method using high-performance liquid
chromatography
A
Numéro de référence
ISO 9936:1997(F)
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ISO 9936:1997(F)
Sommaire Page
1 Domaine d'application. 1
2 Référence normative . 1
3 Définition. 1
4 Principe. 1
Réactifs.
5 2
6 Appareillage. 2
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 3
9 Mode opératoire. 3
10 Expression des résultats . 6
11 Fidélité . 6
12 Rapport d'essai. 7
Annexe A (informative) Saponification . 8
Annexe B (informative) Résultats des essais interlaboratoires. 10
Annexe C (informative) Bibliographie . 11
© ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet central@iso.ch
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
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ISO ISO 9936:1997(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 9936 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 11, Corps
gras d'origines animale et végétale.
Les annexes A à C de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d'information.
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NORME INTERNATIONALE ISO ISO 9936:1997(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination
des teneurs en tocophérols et en tocotriénols — Méthode par
chromatographie en phase liquide à haute performance
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale prescrit une méthode pour la détermination des teneurs en a-, b-, g- et d-
tocophérols et tocotriénols libres (appelés globalement tocols) des corps gras et des huiles (appelés globalement
corps gras) d'origines animale et végétale, par chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP).
Les produits contenant des esters de tocophérols ou de tocotriénols doivent subir une saponification préalable.
NOTE — Une méthode appropriée incluant un processus de saponification à froid, est décrite pour information, dans
l'annexe A.
2 Référence normative
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, l'édition indiquée était en
vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente Norme
internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l'édition la plus récente de la norme indiquée ci-
après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur à un
moment donné.
ISO 661:1989, Corps gras d'origines animale et végétal — Préparation de l'échantillon pour essai.
3 Définition
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la définition suivante s'applique.
3.1 teneurs en tocols: Fractions massiques des différents tocols, déterminées suivant la méthode prescrite dans
la présente Norme internationale.
NOTE — Ces teneurs sont exprimées en microgrammes par gramme.
4 Principe
Dissolution d'une prise d'essai et séparation des différents tocols par chromatographie en phase liquide à haute
performance. Calcul des teneurs en tocols à l'aide de facteurs d'étalonnage déterminés à partir de solutions
étalons.
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ISO
ISO 9936:1997(F)
5 Réactifs
Tous les réactifs doivent être de qualité CLHP ou équivalente.
5.1 Étalons a-, b-, g- et d -tocophérol et d'a-, b-, g- et d-tocotriénol.
5.1.1 Si l'on ne dispose pas d'étalons pour les tocophérols, il est possible d'obtenir des chromatogrammes contenant
des pics d'a-, b-, g- et d -tocophérols à partir d'un mélange d'huile de germes de blé et de graines de soja.
5.1.2 Si l'on ne dispose pas d'étalons pour les tocotriénols, on peut utiliser de l'huile pour identifier les a- et
g-tocotriénols. Les chromatogrammes obtenus peuvent aider à l'identification des pics sur les chromatogrammes
obtenus à partir des échantillons pour essai, auquel cas les facteurs d'étalonnage correspondant aux différents
tocotriénols seront utilisés.
NOTE — On peut se procurer les étalons b-, g- et d -tocophérol auprès de la société Merck et ceux d'a-tocophérol auprès de
différents fournisseurs. Une certaine variabilité de la pureté des étalons du commerce, qui peut aller de 85 % à 100 %, a été
signalée dans plusieurs cas. Ceci confirme l'importance de la détermination, par spectrométrie UV, de la concentration des
solutions d'étalonnages préparées.
5.2 Méthanol.
5.3 Dichlorométhane.
5.4 n-Hexane.
5.5 Propanol-2.
5.6 Phase mobile pour colonne CLHP, solution à 0,5 % (V/V) de propanol-2 dans le n-hexane.
6 Appareillage
Toute la verrerie de laboratoire utilisée doit avoir une activité actinique faible et l'appareillage ne doit pas induire de
réaction basique (sauf si les solutions sont protégées par addition de pyrogallol).
Matériel courant de laboratoire, et en particulier, ce qui suit:
6.1 Système CLHP, comprenant une pompe haute-pression, un dispositif d'injection de l'échantillon, un
spectromètre à fluorescence dont la longueur d'onde d'excitation est réglée sur 290 nm et la longueur d'onde
d'émission sur 330 nm, et un enregistreur graphique ou un intégrateur enregistreur.
NOTE — Si l'on ne dispose pas d'un spectromètre à fluorescence, il est admis, mais non recommandé, d'utiliser un
spectromètre ultraviolet (UV). La longueur d'onde du spectromètre UV doit être réglée sur 292 nm.
6.2 Colonne analytique pour CLHP, 250 mm · 4 mm, remplie de microparticules de silice d'un diamètre moyen
d'environ 5 mm.
NOTES
1)
1 Le LiChrosob SI 60 et le Sperisorb S5W (diamètre 5 mm), disponibles dans le commerce conviennent pour le remplissage
de la colonne.
2 On peut adapter la longueur et le diamètre de la colonne, en fonction de la technique CLHP employée.
3 L'état de la colonne (antécédents, sécheresse ou présence d'eau entraînant la désactivation, etc.) peut parfois induire
l'apparition d'un pic de triacylglycérol se superposant au pic d'a-tocophérol.
Dans ce cas, l'utilisation d'un spectromètre à fluorescence (possibilité d'annulation) ou d'un spectromètre UV (perturbation du
pic) peut conduire à des résultats différents. Ce problème lié au choix du spectromètre sera d'autant plus sensible si, en outre,
l'instrument est étalonné avec une solution ne contenant pas de corps gras, alors que l'analyse porte sur des échantillons
contenant des corps gras.
__________
1) Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif de ces produits.
2
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ISO
ISO 9936:1997(F)
6.3 Spectromètre UV, permettant le mesurage absolu de l'absorbance à des longueurs d'onde précisément
définies.
6.4 Évaporateur rotatif.
7 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une méthode
d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 5555 [2].
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l'entreposage.
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Dans le cas d'échantillons pour laboratoire liquides, l'échantillon pour essai doit être préparé par homogénéisation,
comme décrit dans l'ISO 661, en omettant toutefois la filtration.
Dans le cas d'échantillons solides, placer une portion représentative de l'échantillon pour laboratoire (c'est-à-dire au
moins égale à 10 % en masse de l'échantillon pour laboratoire) dans un bécher en verre et homogénéiser
o
soigneusement en laissant fondre, dans un bain d'eau réglé à une température inférieure à 40 C, tout en
mélangeant doucement.
Dans la mesure du possible, préparer l'échantillon en lumière atténuée, mais en aucun cas, à la lumière du jour
directe.
9 Mode opératoire
NOTE — L'oxydation des tocols au cours de l'analyse conduit en général à l'obtention de résultats anormalement faibles.
L'oxydation par l'oxygène pouvant être accélérée par la présence de substances basiques, la chaleur ou l'exposition à la
lumière, il convient de prendre les mesures nécessaires pour empêcher l'action de ces facteurs.
9.1 Préparation des solutions d'étalonnage
9.1.1 Solutions étalons mères
Préparer une solution étalon mère de chacun des tocols: peser 10 mg – 1 mg de l'étalon (5.1) et les placer dans
une fiole jaugée de 100 ml, puis compléter jusqu'au trait avec de l'hexane (5.4).
Transférer à la pipette 10 ml de cette solution dans un ballon à fond rond en verre ambré et éliminer totalement
o
l'hexane dans un évaporateur rotatif (6.4), sous vide et à température inférieure ou égale à 40 C. Rétablir la
pression atmosphérique avec de l'azote et sortir le ballon de l'évaporateur dès élimination complète du solvant.
Introduire à la pipette 10 ml de méthanol (5.2) dans le ballon et remuer pour dissoudre le résidu. Mesurer
l'absorbance de cette solution à la longueur d'onde convenable, dans le spectromètre (6.3), et calculer la
concentration (en microgrammes par millilitre) en divisant la valeur de l'absorbance par le facteur convenable donné
dans le tableau 1.
3
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ISO 9936:1997(F)
Tableau 1 — Facteurs de division
Longueur d'onde Tocophérol Facteur de division
nm
292 a-tocophérol 0,007 6
296 b-tocophérol 0,008 9
298 g-tocophérol 0,009 1
298 d-tocophérol 0,008 7
NOTE — Ces facteurs sont calculés à partir de la valeur E (1 %/1 cm) des tocols.
La valeur E (1 %/1 cm) de l'a-tocophérol , par exemple, est égale à 76 à 292 nm
(dans le méthanol). Une solution à 1 g/ml d' tocophérol aura donc une
μ a-
absorbance de 0,007 6 à 292 nm.
9.1.2 Solutions étalons de travail
Mélanger des volumes convenables des solutions étalons mères (9.1.1) pour préparer une solution étalon de travail
contenant un mélange de tocols, et diluer avec du n-hexane de façon que la concentration de chacun des
constituants étalons de cette solution soit comprise entre 1 μg/ml et 5 μg/ml.
Il faut préparer chaque jour une nouvelle solution étalon de travail.
o o
Protéger les étalons de toute exposition à la lumière et les stocker à température comprise entre 0 C et 4 C.
NOTES
1 Les solutions étalons mères se conservent convenablement pendant 1 semaine si elles sont réfrigérées et stockées dans
des fioles en verre ambré à faible activité actinique. Les fioles peuvent être enveloppées dans des feuilles d'aluminium.
2 Si l'on u
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