ISO 12228:1999

Animal and vegetable fats and oils — Determination of individual and total sterols contents — Gas chromatographic method

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la teneur en stérols individuels et totaux — Méthode par chromatographie en phase gazeuse

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 03-Mar-1999
• Withdrawal Date: 03-Mar-1999
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 24-Sep-2014

Relations

• Revised: ISO 12228-1:2014 - Determination of individual and total sterols contents — Gas chromatographic method — Part 1: Animal and vegetable fats and oils
• Effective Date: 06-Aug-2011
• Revised: ISO 12228-2:2014 - Determination of individual and total sterols contents — Gas chromatographic method — Part 2: Olive oils and olive pomace oils
• Effective Date: 06-Aug-2011

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 12228
First edition
1999-03-01
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of individual and total sterols
contents — Gas chromatographic method
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la teneur en
stérols individuels et totaux — Méthode par chromatographie en phase
gazeuse
A
Reference number
ISO/FDIS 12228:1999(E)

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ISO 12228:1999(E)
Contents
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Definitions .1
4 Principle.1
5 Reagents.2
6 Apparatus .2
7 Sampling.3
8 Preparation of test sample.3
9 Procedure .3
10 Expression of results .4
11 Precision.6
12 Test report .6
Annex A (informative) Interlaboratory test .9
Annex B (informative) Bibliography .16
©  ISO 1999
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
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Printed in Switzerland
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© ISO
ISO 12228:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 12228 was prepared by ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils.
Annexes A and B of this International Standard are for information only.
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INTERNATIONAL STANDARD  © ISO ISO 12228:1999(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of individual
and total sterols contents — Gas chromatographic method
1 Scope
This International Standard specifies a method for the gas chromatographic determination of the contents and
compositions of sterols in animal and vegetable fats and oils.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 661:1989, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test samples.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods.
3 Definitions
For the purposes of this International Standard, the following definitions apply.
3.1
composition of sterols
composition of individual sterols in the sample, beginning with cholesterol and ending with Δ7-avenasterol (see
table 1) under the conditions specified in this International Standard
NOTE The composition is expressed as peak area, in percent, and normalized to 100 %.
3.2
total sterol content
mass of the sum of all individual sterols, as determined in accordance with the method specified in this International
Standard, beginning with cholesterol and ending with Δ7-avenasterol (see table 1), divided by the mass of the test
portion
NOTE The content is expressed in milligrams per 100 g.
4 Principle
A test portion is saponified by boiling under reflux with an ethanolic potassium hydroxide solution. The
unsaponifiable matter is isolated by solid-phase extraction on an aluminium oxide column. The aluminium oxide
column is used to retain the fatty acid anions; sterols pass through the column. The sterol fraction from the
unsaponifiable matter is separated by thin-layer chromatography. The qualitative and quantitative compositions of
the sterol fraction are determined by gas chromatography using betulin as an internal standard.
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5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise stated, and water complying with grade 3 of
ISO 3696.
5.1  Potassium hydroxide, ethanolic solution, c(KOH) ≈ 0,5 mol/l.
Dissolve 3 g of potassium hydroxide in 5 ml of water and dilute to 100 ml with ethanol (5.3). The solution should be
colourless or straw-coloured.
5.2  Internal standard solution, betulin, 1,0 mg/ml solution in acetone (see note to 5.10).
NOTE In the case of olive pomace oils which may contain betulin, the use of 5α-cholestan-3β-ol (peak 2 in table 1) as
internal standard is recommended.
5.3  Ethanol, of minimum purity 95 % (V/V).
5.4  Aluminium oxide, neutral, 0,063 mm to 0,200 mm, activity step I.
5.5  Diethyl ether, freshly distilled, free from peroxides and residue.
WARNING: Diethyl ether is highly flammable and can form explosive peroxides. Explosive limits in air are
1,7 % (V/V) to 48 % (V/V). Take special precautions when using it.
5.6  Silica gel thin-layer chromatography (TLC) plates, commercially available, dimensions 20 cm x 20 cm,
thickness of layer 0,25 mm.
5.7  Developing solvent, hexane/diethyl ether [1/1 (V/V)].
5.8  Standard solution for thin-layer chromatography, 1,0 mg/ml cholesterol and 5,0 mg/ml betulin in acetone.
, methanol.
5.9 Spraying reagent
5.10  Silylating reagent, prepared by adding 50 μl of 1-methyl imidazole to 1 ml of N-methyl-N-(trimethylsilyl)-
hepta-fluorobutyramide (MSHFBA).
NOTE Other silylating reagents should normally not be used unless special precautions are taken to ensure that both
hydroxyl groups of betulin are silylated. If not, betulin may show two peaks in the GLC.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1  Round-bottomed flasks, of 25 ml and 50 ml capacity, with ground neck.
, with ground joint to fit a flask (6.1).
6.2 Reflux condenser
6.3  Glass column, with PTFE stopper, sintered glass frit and reservoir for 100 ml, length 25 cm, internal diameter
1,5 cm.
6.4  Rotary evaporator, attached to a vacuum pump and water bath maintained at 40 °C.
6.5  Developing tank, made of glass, with a ground glass lid, suitable for use with plates of dimensions 20 cm x
20 cm.
6.6  Microsyringe or micropipette, to deliver 100 μl.
6.7  Oven, maintained at 105 °C ± 3 °C.
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6.8  Desiccator, containing an efficient desiccant, for storing the plates.
6.9  Reaction vials, of 0,3 ml capacity, with screw caps and PTFE-lined seals, for preparation of sterol derivatives.
6.10  Gas chromatograph, for capillary columns, with split injector, flame ionization detector and suitable recorder.
6.11  Capillary column, made of fused silica or glass, length 25 m to 60 m, internal diameter 0,2 mm to 0,25 mm,
stationary phase SE-54 (or equivalent non-polar phase with a temperature limit of at least 280 °C to 300 °C); film
thickness about 0,1 μm.
6.12  Microsyringe for gas chromatography, for injecting volumes of 1 μl.
6.13  Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,001 g and displaying 0,0001 g.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method is
given in ISO 5555 [1].
8 Preparation of test sample
Prepare the test samples in accordance with ISO 661.
9 Procedure
9.1 Test portion
Weigh, to the nearest 1 mg, about 250 mg of the test sample into a 25 ml flask (6.1).
For fats and oils with a sterol content of less than 100 mg per 100 g, proceed using a three-fold amount of the test
sample. Adjust reagents and apparatus accordingly.
9.2 Determination
9.2.1 Preparation of the aluminium oxide column
Suspend 10 g of aluminium oxide (5.4) in 20 ml of ethanol (5.3) and pour the slurry into the glass column (6.3).
Allow the aluminium oxide to settle and let the solvent run out of the column until the level of the solvent reaches the
top level of the aluminium oxide layer.
9.2.2 Extraction of the unsaponifiable matter
Add exactly 1,00 ml of internal standard solution (5.2) to the test portion (9.1).
Add 5 ml of ethanolic potassium hydroxide solution (5.1) and a few anti-bumping granules. Attach the reflux
condenser (6.2) to the flask and keep the contents gently boiling for 15 min. Stop heating. Immediately dilute the
contents of the flask while still hot with 5 ml of ethanol (5.3) and swirl or shake to homogenize.
Pipette 5 ml of this solution onto the prepared aluminium oxide column (9.2.1). Collect the eluate in a 50 ml round-
bottom flask (6.1) and allow the column to run off until the solvent level has reached the top level of the aluminium
oxide layer. Elute the unsaponifiable matter first with 5 ml of ethanol (5.3) and then with 30 ml of diethyl ether (5.5),
with a flowrate of about 2 ml/min. Remove the solvents from the flask by means of the rotary evaporator (6.4).
WARNING: The aluminium oxide column is essential for this procedure. It shall not be replaced by silica or
other columns or by solvent extraction.
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9.2.3 Thin-layer chromatography
Dissolve the unsaponifiable matter obtained in 9.2.2 in a small amount of diethyl ether (5.5). Apply the solution as a
line at a distance of 2 cm from the lower edge onto a TLC plate (5.6) using the microsyringe (6.6). Leave a gap of at
least 3 cm from each side edge of the plate. Apply a spot of 5 μl of the TLC standard solution (5.8) at 1,5 cm from
the edge. Fill the developing tank (6.5) with about 100 ml of developing solvent (5.7). Place the plate into the tank
and develop it until the solvent reaches the upper edge. Remove the plate from the tank and allow the solvent to
evaporate in a fume cupboard.
NOTE Quantitative transfer of the material (9.2.2) to the TLC plate is not necessary in this step. Automatic apparatus for
applying streaks may be used. No saturation chamber is used.
9.2.4 Isolation of the sterols
Spray the plates with methanol (5.9) until the sterol and betulin zones appear white on a translucent (darker)
background. The betulin zone appears slightly below the sterol zone. Mark the zones at the height of the standard
spots 2 mm above and 4 mm below the visible zones (see figure 1). Scratch off this part of the layer completely
using a spatula and quantitatively collect the silica in a small beaker.
NOTE The wider margin at the lower edge of the visible zones (4 mm vs. 2 mm at the upper edge) is a precaution to avoid
partial loss of betulin in this step. Sunflowerseed oil may show three bands (Δ5-sterols, Δ7-sterols and betulin).
Add 0,5 ml of ethanol to the collected silica gel. Digest the silica gel in the beaker three times with 5 ml of diethyl
ether (5.5) and filter into a flask (6.1). Reduce the combined ether extracts to about 1 ml in the rotary evaporator
(6.4) and transfer the remaining solution into the reaction vial (6.9). Blow off the solvent in the reaction vial with a
stream of nitrogen.
9.2.5 Preparation of sterol trimethylsilyl ethers
Add 100 μl of the silylation reagent (5.10) to the reaction vial (6.9) containing the isolated sterols. Seal and heat the
vial for 15 min in the oven set at 105°C. Allow the reaction vial to cool to room temperature and inject the solution
directly into the gas chromatograph (6.10).
9.2.6 Gas chromatography
Optimize the temperature programme and the carrier gas flowrate so that chromatograms similar to figure 2 are
obtained. Test the separation with silylated sterol fractions obtained from known oils, as shown in figure 2.
NOTE 1 The following parameters were tested and found useful: GC column: SE-54, 50 m length, 0,25 mm internal
diameter, 0,10 μm film thickness; carrier gas H , carrier gas flowrate 36 cm/s, split 1:20, detector/injector 320° C, temperature
2
programme 240 °C to 255 °C at 4 °C/min, injection volume 1 μl. Capillary columns of equivalent quality can be used.
NOTE 2 A standard solution containing cholesterol, campesterol, stigmasterol and sitosterol may be used to check the
retention times. Use a blank run to test for possible contamination (e.g. cholesterol) from solvents, glass walls, filter,
fingerprints, etc.
10 Expression of results
10.1 Identification of sterols
To identify the sterols present in the test sample, determine the relative retention times (RRT) by dividing the
retention time (RT) of the sterol in question by the RT of cholesterol and/or betulin. Table 1 shows the RRT of the
various sterols corresponding to cholesterol (RRTC) and betulin (RRTB), with SE-54 stationary phase.
NOTE The RRT in table 1 (determined under the conditions of note 1 in 9.2.6) are mentioned as an aid for the identification
of the individual sterols only, and to illustrate the elution sequence (cf. also figure. 2). The actual RRT found may deviate
slightly from the RRT given in table 1 because the RRT depends on the experimental conditions (type and length of GLC
column, temperature programme, and quality of stationary phase).
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© ISO
ISO 12228:1999(E)
10.2 Compositio
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 12228
Première édition
1999-03-01
Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination de la teneur en
stérols individuels et totaux — Méthode par
chromatographie en phase gazeuse
Animal and vegetable fats and oils — Determination of individual and total
sterols contents — Gas chromatographic method
A
Numéro de référence
ISO 12228:1999(F)

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ISO 12228:1999(F)
Sommaire
1 Domaine d’application .1
2 Références normatives .1
3 Définitions .1
4 Principe.1
5 Réactifs.2
6 Appareillage .2
7 Échantillonnage .3
8 Préparation de l'échantillon pour essai.3
9 Mode opératoire.3
10 Expression des résultats .5
11 Fidélité .7
12 Rapport d'essai .7
Annexe A (informative) Résultats de l'essai interlaboratoires.10
Annexe B (informative) Bibliographie .17
©  ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet [e-mail]
Imprimé en Suisse
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© ISO
ISO 12228:1999(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 12228 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Les annexes A et B de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
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NORME INTERNATIONALE  © ISO ISO 12228:1999(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la
teneur en stérols individuels et totaux — Méthode par
chromatographie en phase gazeuse
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination, par chromatographie en phase gazeuse,
de la teneur et de la composition des stérols contenus dans les corps gras d'origines animale et végétale.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 661:1989, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai.
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions suivantes s'appliquent.
3.1
composition des stérols
composition des stérols individuels contenus dans l'échantillon, en commençant par le cholestérol et en terminant
par le D7-avénastérol (voir tableau 1), dans les conditions spécifiées par la présente Norme internationale
NOTE La composition est exprimée en pourcentage d'aire de pic, ramenée à 100 %.
3.2
teneur en stérol total
masse de la somme de tous les stérols individuels, déterminée selon la méthode spécifiée dans la présente Norme
internationale, en commençant par le cholestérol et en terminant par le D7-avénastérol (voir tableau 1), divisée par
la masse de la prise d'essai
NOTE La teneur est exprimée en milligrammes pour 100 g.
4 Principe
Saponification d'une prise d'essai par une solution éthanolique d'hydroxyde de potassium à ébullition sous reflux.
Isolement de l'insaponifiable par extraction en phase solide sur une colonne d'oxyde d'aluminium. Cette colonne est
utilisée pour retenir les savons tandis que les stérols traversent la colonne. Séparation de la fraction stérolique de
l'insaponifiable par chromatographie sur couche mince, puis détermination de la composition qualitative et
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ISO 12228:1999(F)
quantitative de la fraction stérolique par chromatographie en phase gazeuse, en utilisant de la bétuline comme
étalon interne.
5 Réactifs
Sauf indication différente, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et de l'eau de qualité 3,
conforméement à l'ISO 3696.
5.1  Hydroxyde de potassium, solution éthanolique, c(KOH) ≈ 0,5 mol/l.
Dissoudre 3 g d'hydroxyde de potassium dans 5 ml d'eau et diluer à 100 ml avec de l'éthanol (5.3). Il convient que
la solution soit incolore ou de couleur paille.
5.2  Solution étalon interne, bétuline, 1,0 mg/ml en solution dans de l'acétone (voir note en 5.10).
NOTE Dans le cas de l'huile de grignons d'olive, qui est susceptible de contenir de la bétuline, il est recommandé d'utiliser
comme étalon interne du 5α-cholestan-3β-ol (voir tableau 1, pic 2).
5.3  Éthanol, d’une pureté minimale de 95 % (V/V).
5.4  Oxyde d'aluminium, neutre, de granulométrie comprise entre 0,063 mm et 0,200 mm, d'activité I.
5.5  Éther diéthylique, fraîchement distillé, exempt de peroxydes et de résidus.
AVERTISSEMENT: L'éther diéthylique est hautement inflammable et peut engendrer la formation de
peroxydes explosifs. Les limites d'explosion dans l'air sont comprises entre 1,7 % (V/V) et 48 % (V/V). Des
précautions particulières doivent être prises lors de l'utilisation de cette substance.
5.6  Plaques de chromatographie sur couche mince (CCM) au gel de silice, disponibles dans le commerce,
mesurant 20 cm · 20 cm, l'épaisseur de la couche étant de 0,25 mm.
5.7  Solvant de développement, hexane/éther diéthylique [1:1 (V/V)].
5.8  Solution étalon pour chromatographie sur couche mince, cholestérol = 1,0 mg/ml et bétuline = 5,0 mg/l
dans de l'acétone.
5.9  Réactif de révélation, méthanol.
5.10  Réactif silylant, préparé en ajoutant 50 μl de 1-méthyle imidazole à 1 ml de N-méthyle-N-(triméthylsilyl)-
heptafluorobutyramide (MSHFBA).
NOTE Normalement, il est recommandé de ne pas utiliser d'autres réactifs silylants sauf si l'on prend la précaution
particulière de s'assurer que les deux groupes -OH de la bétuline sont silylés. Dans le cas contraire, la bétuline peut montrer
deux pics lors de la CPG.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1  Ballons à fond rond, de 25 ml et 50 ml de capacité, à col rodé.
6.2  Réfrigérant à reflux, muni d'un joint rodé s'adaptant aux ballons (6.1).
6.3  Colonne en verre, munie d'un robinet en PTFE, d'un verre fritté et d'un réservoir d'une capacité de 100 ml,
mesurant 25 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre interne.
6.4  Évaporateur rotatif, relié à une pompe à vide, avec un bain-marie maintenu à 40 °C.
2

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, en verre, muni d'un couvercle en verre rodé, pouvant être utilisé avec des plaques
6.5 Cuve de développement
de 20 cm · 20 cm.
6.6  Microseringue ou micropipette, de 100 μl de capacité.
6.7  Étuve, maintenue à 105 °C ± 3 °C.
6.8  Dessiccateur, contenant un déshydratant pour la conservation des plaques.
6.9  Tube de réaction, conique, de 0,3 ml de capacité, munie d'un bouchon à vis et d'un joint d'étanchéité en
PTFE, servant à la préparation des dérivés des stérols.
6.10  Chromatographe en phase gazeuse, équipé pour colonnes capillaires, avec injecteur-diviseur, détecteur à
ionisation de flamme et enregistreur adéquat.
6.11  Colonne capillaire, en silice fondue ou en verre, de 25 m à 60 m de longueur, de 0,2 mm à 0,25 mm de
diamètre intérieur, à phase stationnaire SE-54 (ou phase non polaire équivalente, avec une température limite d'au
moins 280 °C à 300 °C); film d'environ 0,1 μm d'épaisseur.
6.12  Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse, destinée à injecter des volumes de 1 μl.
6.13  Balance analytique, capable de peser à 0,001 g près et d'afficher les valeurs à 0,0001 g près.
7 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une méthode
d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 5555 (voir la référence [1]).
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l'entreposage.
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à l'ISO 661.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d'essai
Peser, à 1 mg près, environ 250 mg de l'échantillon pour essai et les introduire dans un ballon de 25 ml (6.1).
Dans le cas des corps gras présentant une teneur en stérols inférieure à 100 mg par 100 g, effectuer la prise
d'essai en utilisant une quantité trois fois plus élevée d'échantillon pour essai. Ajuster les réactifs et l'appareillage en
conséquence.
9.2 Dosage
9.2.1 Préparation de la colonne d’oxyde d'aluminium
Mettre en suspension 10 g d'oxyde d'aluminium (5.4) dans 20 ml d'éthanol (5.3) et verser la bouillie obtenue dans la
colonne en verre (6.3). Laisser reposer l'oxyde d'aluminium et le solvant s'écouler hors de la colonne, jusqu'à ce
que le niveau du solvant atteigne le sommet de la couche d'oxyde d'aluminium.
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9.2.2 Extraction de l'insaponifiable
Ajouter exactement 1,00 ml de solution étalon interne (5.2) à la prise d'essai (9.1).
Ajouter 5 ml de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium (5.1), ainsi que quelques granulés régulateurs
d'ébullition. Relier le réfrigérant à reflux (6.2) au ballon et porter lentement son contenu à ébullition pendant 15 min.
Arrêter de chauffer. Diluer immédiatement le contenu du ballon, pendant qu'il est encore chaud, avec 5 ml
d'éthanol (5.3) et faire tournoyer ou agiter pour obtenir l'homogénéisation.
Prélever, à l'aide d'une pipette, 5 ml de cette solution et les verser dans la colonne d'oxyde d'aluminium (9.2.1)
préparée. Recueillir la substance résultant de l'élution dans un ballon de 50 ml à fond rond (6.1) et laisser reposer la
colonne jusqu'à ce que le niveau du solvant ait atteint la tête de la colonne. Procéder à l'élution de l'insaponifiable,
en utilisant tout d'abord 5 ml d'éthanol (5.3), puis avec 30 ml d'éther diéthylique (5.5), en appliquant un débit
d'environ 2 ml/min. Évaporer les solvants contenus dans le ballon, à l'aide de l'évaporateur rotatif (6.4).
AVERTISSEMENT: L'emploi de la colonne à l'oxyde d'aluminium est fondamental pour ce mode opératoire.
Elle ne peut pas être remplacée par d'autres absorbants ni par d'autres solvants d'extraction.
9.2.3 Chromatographie sur couche mince
Dissoudre l'insaponifiable obtenu en 9.2.2 dans une petite quantité d'éther diéthylique (5.5). Appliquer la solution
sous forme de bande, à une distance de 2 cm du bord inférieur d'une plaque CCM (5.6), en utilisant une
microseringue (6.6). Laisser un espace d'au moins 3 cm de chaque bord de la plaque. Appliquer une goutte de 5 μl
de solution étalon CCM (5.8) à 1,5 cm du bord. Remplir la cuve de développement (6.5) avec environ 100 ml de
solvant de développement (5.7). Mettre la plaque dans la cuve et procéder au développement jusqu'à ce que le
solvant atteigne le bord supérieur. Ôter la plaque de la cuve et laisser le solvant s'évaporer sous une hotte
aspirante.
NOTE Il n'est pas nécessaire, à ce stade, de procéder au transvasement quantitatif du matériau (9.2.2) sur la plaque CCM.
Il est possible d'utiliser un appareillage automatique pour l'application des dépôts d'échantillons. Aucune chambre de saturation
n'est utilisée.
9.2.4 Isolement des stérols
Vaporiser les plaques avec du méthanol (5.9) jusqu'à ce que la couleur blanche des zones stérolique et bétulinique
ressorte sur un fond translucide (plus sombre). La zone de bétuline apparaît légèrement en dessous de la zone des
stérols. Marquer les zones à hauteur des dépôts d’étalon, 2 mm au-dessus et 4 mm au-dessous des zones visibles
(voir figure 1). Gratter entièrement cette partie de la couche à l'aide d'une spatule et recueillir quantitativement la
silice dans un bécher de faible capacité.
NOTE La marge plus grande prise sur le bord inférieur des zones visibles (4 mm contre 2 mm sur le bord supérieur) est
une précaution visant à éviter les pertes partielles de bétuline à ce stade. L'huile de tournesol peut présenter trois bandes
(D5-stérols, D7-stérols et bétuline).
Ajouter 0,5 ml d'éthanol au gel de silice recueilli. Procéder à l'extraction du gel de silice à l'intérieur du bécher, à
trois reprises, en utilisant 5 ml d'éther diéthylique (5.5) et en le filtrant dans un ballon (6.1). Réduire les extraits
d'éther combinés à environ 1 ml à l'aide de l'évaporateur rotatif (6.4) et transvaser la solution restante dans le tube
de réaction (6.9). Éliminer le solvant contenu dans le tube de réaction en appliquant un courant d'azote.
9.2.5 Préparation des triméthylsilyléthers stéroliques
Ajouter 100 μl de réactif silylant (5.10) dans le tube de réaction (6.9) contenant les stérols isolés. Obturer et faire
chauffer le tube pendant 15 min à l'intérieur de l'étuve à 105 °C. Laisser le flacon de réaction refroidir à la
température ambiante et injecter directement la solution dans le chromatographe en phase gazeuse (6.10).
9.2.6 Chromatographie en phase gazeuse
Optimiser le programme de température et le débit du courant gazeux, de façon à obtenir des chromatogrammes
similaires à ceux de la figure 2. Faire un essai de séparation à l'aide des fractions de stérols silylés provenant
d'huiles connues, comme indiqué dans la figure 2.
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© ISO
ISO 12228:1999(F)
NOTE 1 Les paramètres suivants ont fait l'objet d'essais et se sont révélés satisfaisants: colonne de CPG: SE-54, 50 m de
longueur, 0,25 mm de diamètre intérieur; 0,10 μm d'épaisseur de film; gaz vecteur: H ; vélocité du gaz vecteur: 36 cm/s;
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division: 1:20; détecteur/injecteur: 320 °C; programme de température: entre 240 °C et 255 °C à 4 °C/min; volume injecté: 1 μl.
Des colonnes capillaires de qualité équivalente peuvent être utilisées.
NOTE 2 Il est possible d'employer une solution étalon contenant du cholestérol, du campestérol, du stigmastérol et du
sitostérol pour contrôler les temps de rétention. Effectuer un essai à blanc (par exemple cholestérol) afin de dépister une
contamination éventuelle provenant des solvants, parois de verre, filtre, empreintes de doigts, etc.
10 Expression des résultats
10.1 Identification des stérols
Pour identifier les stérols présents dans l'échantillon pour essai, déterminer les temps de rétention relatifs (TRR) en
divisant le temps de rétention (TR) du stérol concerné par le TR du cholestérol et/ou de la bétuline. Le tableau 1
indique les TRR des différents stérols correspondant respectivement au cholestérol (TRRC) et à la bétuline
(TRRB).
NOTE Les TRR mentionnés dans le tableau 1 (déterminés selon les conditions de la note 1 en 9.2.6) ont uniquement pour
but de favoriser l'identification des st
...