ISO 11348-3:1998
(Main)Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteria
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteria
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet inhibiteur d'échantillons d'eau sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de bactéries luminescentes) — Partie 3: Méthode utilisant des bactéries lyophilisées
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11348-3
First edition
1998-12-15
Water quality — Determination of the
inhibitory effect of water samples on the
light emission of Vibrio fischeri
(Luminescent bacteria test) —
Part 3:
Method using freeze-dried bacteria
Qualité de l’eau — Détermination de l’effet inhibiteur d’échantillons d’eau
sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de bactéries luminescentes) —
Partie 3: Méthode utilisant des bactéries lyophylisées
A
Reference number
ISO 11348-3:1998(E)
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ISO 11348-3:1998(E)
Contents
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1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Principle . 2
4 Interferences. 2
5 Reagents and materials. 2
6 Apparatus. 3
7 Sampling and sample pretreatment . 3
8 Procedure . 4
9 Evaluation . 5
10 Expression of results. 7
11 Criteria of validity . 8
12 Precision . 8
13 Test report. 8
Annex A Colour-correction method . 9
Annex B Dilution level D — Preparation of the dilution series. 12
Annex C Precision data. 13
© ISO 1998
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
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Printed in Switzerland
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ISO ISO 11348-3:1998(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collab-
orates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on
all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 11348-3 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological methods.
ISO 11348 consists of the following parts, under the general title Water
quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the
light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) :
— Part 1: Method using freshly prepared bacteria
— Part 2: Method using liquid-dried bacteria
— Part 3: Method using freeze-dried bacteria
Annexes A, B and C of this part of ISO 11348 are for information only.
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ISO 11348-3:1998(E) ISO
Introduction
Measurements according to this International Standard can be carried out
using freshly prepared bacteria, as well as freeze-dried or liquid-dried
bacterial preparations.
Standardized work carried out by DIN NAW WI and
ISO/TC 147/SC 5 WG 1 has shown that in special cases these different
techniques may give different results, especially where water samples
contain heavy metals.
Such varying sensitivity is caused by differences in media composition
used in the preparation of freeze-dried or liquid-dried bacteria. These
protective media influence the bioavailability of toxicants and/or the light
emission of luminescent bacteria. This means that the origin and type of
preparation need to be taken into account when interpreting the results.
This can be difficult sometimes, as freeze-dried and liquid-dried bacteria
may be obtained from different suppliers. This in turn can mean that the
composition is not known in detail or cannot be revised by the user.
That is why in this International Standard, in addition to toxicity
measurements with liquid-dried bacteria (ISO 11348-2) and freeze-dried
bacteria (ISO 11348-3), a procedure with freshly prepared bacteria is
described (ISO 11348-1), the performance of which can be revised by the
user in every detail.
The laboratories responsible for the results have the opportunity to select
the most suitable technique based on expert judgement and information
about the water sample to be tested.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO ISO 11348-3:1998(E)
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water
Vibrio fischeri
samples on the light emission of (Luminescent
bacteria test) —
Part 3:
Method using freeze-dried bacteria
1 Scope
ISO 11348 describes three methods for determining the inhibition of the luminescence emitted by the marine
bacterium Vibrio fischeri (NRRL B-11177). This part of ISO 11348 specifies a method using freeze-dried bacteria.
This method is applicable to:
— waste water,
— aqueous extracts and leachates,
— fresh waters (surface or ground waters) or salt and brackish waters, especially the monitoring of changes in
inhibition towards bacteria,
— pore water.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this part of
ISO 11348. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision, and
parties to agreements based on this part of ISO 11348 are encouraged to investigate the possibility of applying the
most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain registers of currently valid
International Standards.
ISO 5667-16:1998, Water quality — Guidance on biotesting of samples.
1)
ISO 7027: — , Water quality — Determination of turbidity.
1) To be published. (Revision of ISO 7027:1990)
1
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ISO
ISO 11348-3:1998(E)
3 Principle
The inhibition of light emission by cultures of Vibrio fischeri is determined by means of a batch test. This is
accomplished by combining specified volumes of the test sample or the diluted sample with the luminescent
bacteria suspension in a cuvette. The test criterion is the decrease of the luminescence, measured after a contact of
15 min and 30 min, or optionally 5 min, taking into account a correction factor (f ), which is a measure of intensity
kt
changes of control samples during the exposure time. The inhibitory effect of the water sample can be determined
as LID (see annex B) or as EC and/or EC values by means of a dilution series.
20 50
The dilution level resulting in < 20 % of inhibition of light emission is determined. For higher levels of inhibition the
dilution-effect relationship can be determined graphically or by statistical analysis. The inhibition by a sample is
expressed as the dilutions which result in 20 % and 50 % light reduction compared to the blank (EC and EC ).
20 50
These values are interpolated within the dilution series.
4 Interferences
Insoluble, slightly soluble or volatile substances or substances which react with the dilution water or the test
suspension, or alter their state during the test period, may affect the result or impair the reproducibility of the test
results.
Losses of luminescence caused by light absorption or light scattering may occur in the case of strongly coloured or
turbid waters. This interference sometimes can be compensated, e.g. by using a double-chambered absorption
correction cuvette (see annex A).
Since oxygen at . 0,5 mg/l is required for the bioluminescence, samples with a high oxygen demand (and/or a low
oxygen concentration) may cause a deficiency of oxygen and be inhibitory.
An organic contamination of the sample by readily biodegradable nutrients (e.g. urea, peptone, yeast extract,
usually > 100 mg/l) may cause a pollutant-independent reduction in bioluminescence.
Salt concentrations in the initial sample exceeding 30 g/l NaCl or contents of other compounds giving equal
osmolarity may lead, together with the salt spiking required by the test, to hyperosmotic effects. If the sample
contains between 20 g/l and 50 g/l NaCl-equivalents, no salt shall be added. The resulting concentration in the test
samples shall not exceed the osmolarity of a 35 g/l sodium chloride solution.
5 Reagents and materials
Chemicals of recognized analytical grade quality shall be used. Water shall be distilled or of equivalent purity.
5.1 Test bacteria
Strain of luminescent bacteria belonging to the species Vibrio fischeri NRRL B-11177. The bacterial suspensions
used for toxicity measurements are prepared from commercially available freeze-dried reagents which can be
stored in a freezer at 218 °C to 220 °C. The bacteria start glowing immediately after reconstitution and are ready to
be used for the test.
5.2 Sodium chloride solution, as diluent
Dissolve 20 g of sodium chloride (NaCl) in water and make up to 1 litre with water.
5.3 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 1 mol/l
5.4 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1 mol/l
NOTE For the adjustment of the pH it may be necessary to use acids or bases of lower or higher concentration.
2
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ISO 11348-3:1998(E)
5.5 Solution for freeze-dried bacteria
— 20,0 g Sodium chloride (NaCl)
— 2,035 g Magnesium chloride hexahydrate (MgCl ·6H O)
2 2
— 0,30 g Potassium chloride (KCl)
Dissolve in water and make up to 1 litre with water. The solution can be stored in a freezer at 220 °C.
5.6 Reference substances
— Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO ·7H O)
4 2
— 3,5-Dichlorophenol (CHOCl)
6 4 2
— Potassium dichromate (K Cr O )
2 2 7
6 Apparatus
6.1 Freezer for the storage of preserved bacteria.
6.2 Refrigerator to maintain the stock suspension at a temperature of 3 °C – 3 °C.
6.3 Thermostatically controlled thermoblock to maintain the test samples at a temperature of 15 °C – 1 °C.
Within one test the temperature deviation shall be at most – 0,2 °C.
6.4 Luminometer, measuring cell maintained at 15 °C – 1 °C, equipped with suitable cuvettes.
6.5 Test tubes (vials), made of a chemically inert material, appropriate for the selected luminometer and having a
capacity which facilitates the taking of a reading over the largest possible surface area.
6.6 pH-meter.
6.7 Chronometer.
6.8 Piston pipettes for plastic syringes, nominal capacity 10 μl, 500 μl and 1 000 μl.
6.9 Piston pipettes with variable volume, 10 ml to 200 ml and 200 μl to 5 000 μl.
6.10 Refrigerated centrifuge.
6.11 Conductometer.
7 Sampling and sample pretreatment
7.1 Sampling
Sampling shall be conducted in chemically inert, clean containers in accordance with ISO 5667-16. Fill the
containers completely and seal them. Test the samples as soon as possible after collection. Where necessary,
store samples at a temperature of 2 °C to 5 °C in the dark in glass for not longer than 48 h. For periods up to two
weeks, store at 20 °C. Do not use chemicals to preserve the samples. Perform the necessary pH adjustment and
2
salt addition just before testing.
3
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7.2 Sample preparation
Measure the pH of all samples. If the pH lies between 6 and 8,5 there is generally no adjustment necessary. pH-
adjustment, however, may alter the nature of the sample. On the other hand, the pH of the sample and the pH of the
test batch may differ because of the buffer capacity of the test medium. It may be necessary to carry out tests on
both the pH-adjusted and the non-pH-adjusted samples.
If necessary, adjust the pH of the samples to 7,0 – 0,2 by adding either hydrochloric acid (5.4) or sodium hydroxide
(5.3); choose the concentration of the hydrochloric acid or the sodium hydroxide to restrict the volume added to not
more than 5 % of total volume.
Add 20 g of sodium chloride per litre to the water sample or to the neutralized water sample. For brackish and saline
waters, measure the salinity and calculate the amount of NaCl (if any) required to adjust the osmolarity (clause 4).
Strongly turbid samples should be allowed to sediment for 1 h or centrifuged, for example for 10 min at 5 000 g, or
should be filtered.
8 Procedure
8.1 Preparation of stock suspensions
8.1.1 Initial preparations
Prepare the samples according to 7.2.
Prepare the dilution series required (see annex B).
For control samples, maintain the NaCl solution (5.2) at 15 °C – 1 °C.
Maintain the test tubes containing controls, the samples of the dilution series and the diluent (5.2) at 15 °C – 1 °C.
Remove the vial of the freeze-dried culture from the -20 °C freezer immediately before reconstitution in water. For
the reconstitution, cool 1 ml of distilled water in a glass test tube to 3 °C – 3 °C.
Pour this volume of cooled water all at once into the lyophilized bacteria in the vial, thereby minimizing cell damage
during the rehydration process.
Since it is important that water is added quickly to allow the bacteria to come into contact with the water suddenly,
do not use a pipette. The exact volume of water is not critical.
This reconstituted luminescent bacteria suspension serves as a stock suspension; it shall be stored at 3 °C – 3 °C.
The stock suspension can be used for testing purposes as long as the validity criteria stated in clause 11 are met.
Refrozen, rehydrated bacteria can be used for preliminary tests only.
After a waiting time of at least 5 min, prepare the test suspensions from the stock suspension.
8.1.2 Variant A
Prepare the test suspensions directly in the test tubes.
Add 10 μl aliquots of the stock suspension to 500 μl of the solution (5.5), contained in cuvettes maintained at
15 °C – 1 °C, at the same intervals as for later intensity measurements. Shake the mixtures by hand.
8.1.2 Variant B
Prepare the test suspensions outside the test tube in a conical flask (of volume e.g. 250 ml).
Add 1 volume of the stock suspension to 50 volumes of solution (5.5) maintained at 3 °C – 3 °C and mix the
resultant suspension thoroughly.
4
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ISO 11348-3:1998(E)
Pipette 500 μl of test suspension into the test tubes, maintained at 15 °C – 1 °C in the incubator, at the same time
intervals as used for later intensity measurements.
8.2 Test procedure
Carry out, if possible, duplicate determinations per dilution level at a test temperature of 15 °C – 1 °C.
NOTE All samples should be measured, as differing luminescence may be expected due to possible inhomogeneities of the
test suspension.
Adjust the luminometer instrument to a convenient near-maximum setting.
After a conditioning time of at least 15 min, determine and
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11348-3
Première édition
1998-12-15
Qualité de l’eau — Détermination de l’effet
inhibiteur d’échantillons d’eau sur la
luminescence de Vibrio fischeri (Essai de
bactéries luminescentes) —
Partie 3:
Méthode utilisant des bactéries lyophilisées
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on
the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) —
Part 3: Method using freeze-dried bacteria
A
Numéro de référence
ISO 11348-3:1998(F)
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ISO 11348-3:1998(F)
Sommaire
Page
Domaine d'application.
1 1
2 Références normatives. 1
3 Principe. 1
4 Interférences. 2
5 Réactifs et matériaux. 2
6 Appareillage. 3
7 Échantillonnage et prétraitement des échantillons . 3
8 Mode opératoire. 4
9 Évaluation . 5
10 Expression des résultats. 7
11 Critères de validité . 9
12 Fidélité . 9
13 Rapport d'essai. 9
Annexe A Méthode de correction de la couleur. 10
Annexe B Niveau de dilution D — Préparation des séries de dilution 13
Annexe C Données de fidélité. 14
© ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet iso@iso.ch
Imprimé en Suisse
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ISO ISO 11348-3:1998(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 11348-3 a été élaborée par le comité
technique ISO/TC 147, , sous-comité SC 5,
Qualité de l’eau Méthodes
.
biologiques
L’ISO 11348 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre
général Qualité de l’eau — Détermination de l’effet inhibiteur d’échantillons
d’eau sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de bactéries
luminescentes):
— Partie 1: Méthode utilisant des bactéries fraîchement préparées
— Partie 2: Méthode utilisant des bactéries déshydratées
— Partie 3: Méthode utilisant des bactéries lyophilisées
Les annexes A, B et C de la présente partie de l’ISO 11348 sont données
uniquement à titre d’information.
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ISO 11348-3:1998(F) ISO
Introduction
Les mesurages effectués conformément à la présente partie de
l’ISO 11348 peuvent être réalisés au moyen de bactéries fraîchement
préparées, de même qu'avec des préparations bactériennes lyophilisées
ou déshydratées.
Les travaux de normalisation menés par le DIN NAW WI et
l'ISO/TC 147/SC 5 WG 1 ont montré que, dans certains cas particuliers,
ces différentes techniques pouvaient donner des résultats différents,
notamment lorsque les échantillons contiennent des métaux lourds.
Une telle variété dans la sensibilité résulte des différences de composition
des milieux utilisés pour la préparation de bactéries lyophilisées ou
déshydratées. Ces milieux protecteurs influent sur la biodisponibilité des
produits toxiques et/ou sur l’émission de lumière des bactéries
luminescentes. Cela signifie que l'origine et le type de préparation doivent
être pris en considération lors de l'interprétation des résultats. Cette prise
en compte s'avère parfois difficile, du fait que les bactéries lyophilisées et
déshydratées peuvent être obtenues auprès de fournisseurs différents. Il
peut donc en résulter une méconnaissance des détails de la composition
ou l'impossibilité que celle-ci puisse être modifiée par l'utilisateur.
Pour cette raison, la présente Norme internationale comprend, en
complément des mesurages de toxicité à l'aide de bactéries déshydratées
(ISO 11348-2) et de bactéries lyophilisées (ISO 11348-3), la description
d'un mode opératoire utilisant des bactéries fraîchement préparées
(ISO 11348-1), dont les performances peuvent être modifiées par
l'utilisateur dans les moindres détails.
Les laboratoires responsables des résultats ont l'opportunité de
sélectionner la technique la mieux adaptée, en se fondant sur des
jugements d'experts et des informations relatives aux échantillons d’eau
soumis à l'essai.
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NORME INTERNATIONALE ISO ISO 11348-3:1998(F)
Qualité de l’eau — Détermination de l’effet inhibiteur d’échantillons
d’eau sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de bactéries
luminescentes) —
Partie 3:
Méthode utilisant des bactéries lyophilisées
1 Domaine d'application
L’ISO 11348 décrit trois méthodes de détermination de l'inhibition de la luminescence émise par la bactérie marine
Vibrio fischeri (NRRL B-11177). La présente partie de l’ISO 11348 spécifie une méthode utilisant des bactéries
lyophilisées.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux usées;
— aux extraits et lixiviats aqueux;
— aux eaux douces (eaux de surface ou souterraines) ou aux eaux salées et saumâtres, notamment pour la
surveillance des modifications de l'inhibition vis-à-vis des bactéries;
— aux eaux interstitielles.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de l’ISO 11348. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de l’ISO 11348 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 5667-16:1998, Qualité de l'eau — Guide général pour les essais biologiques des échantillons.
1)
ISO 7027:— , Qualité de l'eau — Détermination de la turbidité.
3 Principe
L'inhibition de la luminescence produite par des cultures de Vibrio fischeri est déterminée au moyen d'un essai par
lots. Celui-ci est mis en œuvre par mélange de volumes spécifiés de l'échantillon à analyser, ou de l'échantillon
dilué, et de bactéries luminescentes mises en suspension dans une cuve de mesure.
1) À publier. (Révision de l’ISO 7027:1990)
1
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ISO
ISO 11348-3:1998(F)
Le critère d'essai est la diminution de la luminescence, mesurée après 15 min et 30 min d’incubation, ou en option,
de 5 min, par rapport à un facteur de correction ( ), qui représente la même mesure réalisée parallèlement sur un
f
kt
témoin. L'effet inhibiteur de l'échantillon d'eau peut être déterminé sous forme des valeurs de DMSE (voir annexe B)
ou des valeurs de CE et/ou CE , au moyen d’une suite de dilutions.
20 50
Le niveau de dilution se traduisant par moins de 20 % d'inhibition de la luminescence est déterminé au moyen d'un
essai aux limites. Pour les niveaux d'inhibition plus élevés, la relation entre la dilution et l'effet inhibiteur peut être
déterminée de façon graphique ou par analyse statistique. L'inhibition provoquée par un échantillon est exprimée
par les valeurs de dilution qui provoquent une diminution de la luminescence de 20 % et 50 % par rapport au témoin
(CE et CE ). Ces valeurs sont interpolées à partir de la suite de dilutions.
20 50
4 Interférences
Des substances insolubles, faiblement solubles ou volatiles, ou des substances qui réagissent avec l'eau de dilution
ou avec la suspension d'essai, ou qui altèrent ces dernières au cours de la période d'essai, sont susceptibles
d'influer sur les résultats ou de nuire à la reproductibilité des résultats d'essai.
Les pertes de luminescence, provoquées par l'absorption ou la diffusion de lumière, peuvent se produire en
présence d'eaux fortement colorées ou turbides. Cette interférence peut parfois être compensée, par exemple, en
utilisant une cuve de mesure de correction de l'absorption à double compartiment (voir annexe A).
La bioluminescence nécessitant plus de 0,5 mg/l d'oxygène, les échantillons ayant une consommation d'oxygène
élevée (et/ou une faible concentration en oxygène) peuvent provoquer un déficit en oxygène et être inhibiteurs.
Une contamination organique de l'échantillon par des substances nutritives à biodégradabilité rapide (telles que
l'urée, la peptone, l'extrait de levure, environ > 100 mg/l) est susceptible de provoquer une réduction de la
bioluminescence indépendante de la pollution.
Les concentrations en sel de l'échantillon initial supérieures à 30 mg/l de NaCl, ou les teneurs en composés autres
produisant une osmolarité équivalente peuvent conduire, en association avec l'adjonction de sel requis pour l'essai,
à des effets hyperosmotiques. Si l'échantillon contient entre 20 g/l et 50 g/l d'équivalents NaCl, il convient de ne pas
ajouter de sel. La concentration résultante dans les échantillons pour essai ne doit pas excéder l'osmolarité d'une
solution de chlorure de sodium à 35 g/l.
5 Réactifs et matériaux
Utiliser des substances chimiques de qualité analytique reconnue. L'eau doit être distillée ou présenter une pureté
équivalente.
5.1 Bactéries d'essai
Souche de bactéries luminescentes appartenant à l'espèce Vibrio fischeri NRRL B-11177. Les suspensions de
bactéries utilisées pour les mesurages de la toxicité sont fraîchement préparées à partir de réactifs déshydratés
disponibles dans le commerce, pouvant être conservées au congélateur entre 218 °C et 220 °C. Les bactéries
commencent à émettre de la lumière immédiatement après leur réhydratation et sont prêtes à être utilisées pour
l’essai.
5.2 Solution de chlorure de sodium, utilisé comme diluant
Dissoudre 20 g de chlorure de sodium, (NaCl), dans de l'eau, et compléter à 1 litre avec de l'eau.
5.3 Solution d’hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.4 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.
NOTE Il peut être nécessaire, pour l'ajustement du pH, d'utiliser des acides ou des bases de concentrations supérieures ou
inférieures.
2
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ISO 11348-3:1998(F)
5.5 Solution destinée aux bactéries lyophilisées
— 20,0 g de chlorure de sodium (NaCl)
— 2,035 g de chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl ,6H O)
2 2
— 0,30 g de chlorure de potassium (KCl)
Dissoudre dans de l'eau, et compléter à 1 litre avec de l'eau. Cette solution peut être conservée au congélateur à
220 °C.
5.6 Substances de référence
— Sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO ,7H O)
4 2
— 3,5-Dichlorophénol (C H OCl )
6 4 2
— Dichromate de potassium (K Cr O )
2 2 7
6 Appareillage
6.1 Congélateur, destiné à la conservation des bactéries préservées.
6.2 Réfrigérateur, destiné à maintenir la suspension mère à une température de 3 °C – 3 °C.
6.3 Thermostat, destiné à maintenir les échantillons pour essai à une température de 15 °C – 1 °C. Au sein d'un
essai, l'écart de température doit être au plus de – 0,2 °C.
, dont la cellule de mesure est maintenue à 15 °C – 1 °C, équipé de cuves de mesure
6.4 Luminomètre
appropriées.
, fabriqués à partir d'un matériau chimiquement inerte, adaptés au luminomètre
6.5 Tubes à essais (flacons)
choisi et ayant une capacité suffisante pour favoriser la lecture sur la plus grande surface possible.
6.6 pH-mètre.
6.7 Chronomètre.
, pour seringues en plastique, de 10 μl, 500 μl et 1 000 μl de capacité nominale.
6.8 Pipettes à piston
, de volume variable, 10 ml à 200 ml, 200 μl à 5 000 μl.
6.9 Pipettes à piston
6.10 Centrifugeuse réfrigérée.
6.11 Conductimètre.
7 Échantillonnage et prétraitement des échantillons
7.1 Échantillonnage
L'échantillonnage doit être réalisé dans des récipients chimiquement inertes et propres, conformément à
l’ISO 5667-16. Remplir complètement les récipients et les fermer hermétiquement. Soumettre les échantillons à
l'essai dès que possible après avoir effectué le prélèvement. Si nécessaire, conserver les échantillons à une
température comprise entre 2 °C et 5 °C à l'obscurité, dans du verre, pendant une durée inférieure à 48 h. En cas
de période s'étendant jusqu'à deux semaines, les conserver à 220 °C. Ne pas employer de substances chimiques
pour la conservation des échantillons. Réaliser l'ajustement nécessaire du pH, ainsi que l'ajout de sel,
immédiatement avant l'essai.
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7.2 Préparation de l'échantillon
Mesurer le pH de tous les échantillons. Si le pH se situe entre 6 et 8,5, aucun ajustement n'est généralement
nécessaire. L'ajustement du pH est toutefois susceptible d'altérer la nature de l'échantillon. En revanche, le pH de
l'échantillon et le pH du lot soumis à l'essai peuvent être différents en raison du pouvoir tampon du milieu d'essai.
Parfois, il peut s'avérer nécessaire d'effectuer les essais tant sur des échantillons dont le pH est ajusté que sur
ceux dont le pH n'est pas ajusté.
Si nécessaire, ajuster le pH des échantillons à 7,0 – 0,2 en ajoutant soit de l'acide chlorhydrique (5.4), soit de
l'hydroxyde de sodium (5.3); choisir la concentration d'acide chlorhydrique ou d'hydroxyde de sodium qui permet de
réduire le volume ajouté afin que celui-ci n'excède pas 5 % du volume total.
Ajouter 20 g de chlorure de sodium par litre dans l'échantillon d'eau ou dans l'échantillon d'eau neutralisé. Dans le
cas des eaux saumâtres et salines, mesurer la salinité et calculer la quantité de NaCl requise (le cas échéant) afin
d'ajuster l'osmolarité (voir article 4).
Il convient de laisser décanter pendant 1 h les échantillons présentant une forte turbidité, ou bien de les centrifuger,
par exemple pendant 10 min à 5 000 g, ou encore de les filtrer.
8 Mode opératoire
8.1 Préparation des suspensions mères
8.1.1 Préparations initiales
Préparer les échantillons conformément à 7.2.
Préparer les séries de dilution nécessaires (voir annexe B).
Dans le cas des échantillons témoins, maintenir la solution de NaCl (5.2) à 15 °C – 1 °C.
Maintenir les tubes à essais contenant les échantillons témoins, les échantillons des séries de dilution ainsi que le
diluant (5.2) à 15 °C – 1 °C.
Retirer le flacon contenant la culture lyophilisée du congélateur à 220 °C immédiatement avant reconstitution dans
l'eau. Pour la reconstitution, faire refroidir 1 ml d'eau distillée dans un tube en verre à 3 °C – 3 °C.
Verser en une fois ce volume d'eau refroidie dans le flacon contenant les bactéries lyophilisées, en réduisant ainsi
au minimum la détérioration des cellules durant le processus de réhydratation.
Il est primordial d'ajouter l'eau très rapidement afin de permettre aux bactéries d'entrer instantanément au contact
de l'eau, ne pas utiliser de pipette pour cette opération. Le volume exact d'eau n'est pas déterminant.
La suspension de bactéries luminescentes reconstituée sert de suspension mère; elle doit être conservée à
3 °C – 3 °C. La suspension mère peut être utilisée pour les besoins de l'essai aussi longtemps que les critères de
validité définis à l'article 11 sont satisfaits. Les bactéries lyophilisées recongelées ne peuvent être utilisées que pour
des essais préliminaires.
Après un temps de repos d'au moins 5 min, préparer les supensions d'essai à partir de la suspension mère.
8.1.2 Variante A
Préparer les suspensions d'essai directement dans les tubes à essai.
Ajouter des portions aliquotes de 10 μl de suspension mère à 500 μl de la solution (5.5) contenus dans des cuvettes
maintenues à 15 °C – 1 °C, selon des intervalles de temps équivalents à ceux qui seront employés ultérieurement
pour les mesurages de l'intensité. Agiter le mélange manuellement.
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8.1.3 Variante B
Préparer les suspensions d'essai à l'extérieur des tubes à essai, dans une fiole conique (de 250 ml, par exemple).
Ajouter un volume de suspension mère à 50 volumes de la solution (5.5) maintenue à 3 °C – 3 °C et mélanger
soigneusement la suspension obtenue.
Introduire, à l'aide d'une pipette, 500 μl de suspension d'essai dans les tubes à essais maintenus à 15 °C – 1 °C à
l'intérieur de l'incubateur, selon des intervalles de temps équivalents à ceux qui seront employés ultérieurement
pour les mesurages de l'intensité.
8.2 Mode opératoire d’essai
Réaliser, si possible, les déterminations en double par niveau de dilution, à une température d'essai de
15 °C – 1 °C.
NOTE Il convient que tous les échantillons soient mesurés, car des luminescences différentes peuvent être obtenues en
raison d’un éventuel manque d'homogénéité de la suspension d'essai.
Ajuster le luminomètre à un niveau approprié, proche du maximum.
Après un temps de conditionnement d'au moins 15 min, déterminer et noter l'intensité de la luminescence I des
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suspensions d'essai, au moyen d'un luminomètre, à intervalles de 20 s.
La durée de contact devant être égale pour tous les échantillons, utiliser un chronomèt
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Questions, Comments and Discussion
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