ISO 20776-1:2006

Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases

ISO 20776-1:2006 describes one reference method, broth microdilution, for determination of MICs. The MIC reflects the activity of the drug under the described test conditions, and can be interpreted for clinical management purposes by taking into account other factors, such as drug pharmacology or bacterial resistance mechanisms. This allows categorization of bacteria as susceptible (S), intermediate (I), or resistant (R). In addition, MIC distributions can be used to define wild type or non-wild type bacterial populations. Although clinical interpretation of the MIC value is beyond the scope of ISO 20776-1:2006, modifications of the basic method are required for certain antimicrobial agent - bacteria combinations to facilitate clinical interpretation. These modifications are included in a separate table. It is advisable to compare other susceptibility testing methods (e.g. routine methods or diagnostic test devices) with this reference method for validation, in order to ensure comparable and reliable results.

Systèmes d'essais en laboratoire et de diagnostic in vitro — Sensibilité in vitro des agents infectieux et évaluation des performances des dispositifs pour antibiogrammes — Partie 1: Méthode de référence pour la détermination de la sensibilité in vitro aux agents antimicrobiens des bactéries aérobies à croissance rapide impliquées dans les maladies infectieuses

L'ISO 20776-1:2006 décrit une méthode de référence, la microdilution en bouillon, pour déterminer les CMI. La CMI reflète l'activité du médicament dans les conditions d'essai décrites, et peut être interprétée pour des besoins de gestion clinique en tenant compte d'autres facteurs tels que la pharmacologie du médicament ou les mécanismes de résistance bactérienne. Cela permet de classer les bactéries comme étant «sensibles» (S), «intermédiaires» (I), ou «résistantes» (R). En outre, les distributions de CMI peuvent être utilisées pour définir les populations bactériennes de type sauvage ou non sauvage. Bien que l'interprétation clinique de la valeur de la CMI se trouve au-delà du domaine d'application de la présente partie de l'ISO 20776, des modifications de la méthode de base sont nécessaires pour certaines combinaisons agent-bactérie afin de faciliter l'interprétation clinique. Ces modifications sont incluses dans un tableau séparé. Il est préférable de comparer les autres méthodes d'essai de réceptivité (par exemple les méthodes de routine ou les dispositifs d'essais de diagnostic) à cette méthode de référence à des fins de validation et pour garantir des résultats comparables et fiables.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 14-Nov-2006
• Withdrawal Date: 14-Nov-2006
• ICS: 11.100.20 - Biological evaluation of medical devices
• Technical Committee: ISO/TC 212 - Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems
• Drafting Committee: ISO/TC 212 - Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 05-Jun-2019

Relations

• Revised: ISO 20776-1:2019 - Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Broth micro-dilution reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases
• Effective Date: 19-Dec-2015
• Consolidates: ISO 13951:2001 - Plastics piping systems — Test method for the resistance of polyolefin pipe/pipe or pipe/fitting assemblies to tensile loading
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 20776-1
Первое издание
2006-11-15

Клинические лабораторные
испытания и испытательные системы
для диагностики in vitro. Испытания
инфекционных агентов на
чувствительность и оценивание
функционирования приборов для
испытаний на антимикробную
чувствительность.
Часть 1.
Эталонный метод испытания
действия in vitro антимикробных
агентов против быстрорастущих
аэробных бактерий, участвующих в
инфекционных заболеваниях
Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems —
Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of
performance of antimicrobial susceptibility test devices —
Part 1:
Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents
against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases



Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 20776-1:2006(R)
©
ISO 2006

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованные для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.


ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ


© ISO 2006
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2006 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Термины и определения .1
3 Процедуры испытаний.4
3.1 Общие положения .4
3.2 Среда.4
3.3 Антимикробные агенты.4
3.4 Подготовка материала затравки.11
3.5 Внесение материала затравки в подносы микрорастворения .12
3.6 Культивирование на подносах микрорастворения.12
3.7 Рассмотрение результатов .12
3.8 Особенные ситуации при испытаниях, при которых МIC может дать ненадежные
результаты.12
4 Проверка качества .14
Приложение A (нормативное) Требования к питательной среде Миллера-Хинтона (Mueller-
Hinton) .20
Библиография.22

© ISO 2006 – Все права сохраняются iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, то
ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами Директив ISO/IEC,
Часть 2.
Основная задача технических комитетов заключается в подготовке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-
членам на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения
не менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. ISO не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного
или всех патентных прав.
ISO 20776-1 был подготовлен Европейским комитетом по стандартизации (CEN) Техническим
комитетом CEN/TC 140, In vitro диагностические медицинские устройства, в сотрудничестве с
Техническим комитетом ISO/TC 212, Клинические лабораторные испытания и испытательные
системы для диагностики in vitro, в соответствии с Соглашением по техническому сотрудничеству
между ISO и CEN (Венское Соглашение).
ISO 20776 состоит из следующих частей под общим заголовком Клинические лабораторные
испытания и испытательные системы для диагностики in vitro. Испытания инфекционных агентов
на чувствительность и оценивание функционирования приборов для испытаний на антимикробную
чувствительность:
⎯ Часть 1. Эталонный метод испытания действия in vitro антимикробных агентов против
быстрорастущих аэробных бактерий, участвующих в инфекционных заболеваниях
⎯ Часть 2. Оценка функционирования приборов для испытаний на антимикробную
чувствительность
iv © ISO 2006 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
Введение
Испытания на чувствительность in vitro выполняются на микроорганизмах, подозреваемых в
вызывании болезни, особенно если организм, как полагают, принадлежит к разновидности,
демонстрирующей сопротивление часто используемым антибактериальным агентам. Испытания также
важны при наблюдении сопротивляемости, эпидемиологических исследованиях чувствительности и
при сравнениях новых и существующих агентов.
Процедуры растворения используются при определении минимальных запрещающих концентраций
(minimum inhibitory concentration, МIC) антимикробных агентов и являются эталонным методом
испытания на антимикробную чувствительность. Методы MIC используются при наблюдении
сопротивляемости, сравнительного испытания новых агентов, установлении чувствительности
организмов, которые показывают сомнительные результаты при обычных испытания, для испытаний
на организмах, когда обычные испытания могут быть ненадежными и когда количественный результат
требуется для клинического руководства. В испытаниях при растворении, микроорганизмы
проверяются на способность воспроизводить видимый рост на ряду агаровых пластин (агаровое
растворение) или в питательной среде (растворение в питательной среде) содержащих
последовательные растворения антимикробного агента.
Самая низкая концентрация антимикробного агента (в мг/л), в определенных условиях in vitro,
предотвращающая появление видимого роста микроорганизма в пределах определенного промежутка
времени, известна как МIC. МIC является справочным параметром для клинициста при определении
чувствительности организма к антимикробному агенту и помощником в выборе обработки.
Тщательный контроль и стандартизация требуются для внутри- и межлабораторной
воспроизводимости результатов, поскольку результаты могут значительно зависеть от используемого
метода. Общепринято, что испытания на МIC воспроизводимы в пределах одного удваивающегося
растворения истинного момента окончания процесса (т. е. ± одна ячейка или кювета в удваивающемся
ряду растворения).
Растворение в питательной среде - метод, при котором в контейнеры, содержащие одинаковые
объемы питательной среды с растворами антимикробного агента, увеличивающими концентрации в
прогрессии (обычно геометрической), вводят материал затравки с известным числом микроорганизмов.
Микрорастворение в питательной среде обозначает выполнение испытания растворения в
питательной среде в подносах микрорастворения.
Метод, описанный в данной части ISO 20776, предназначен для испытания чистых культур аэробных
бактерий, которые легко выращиваются ночной инкубацией на агаре и хорошо растут в питательной
среде Миллера-Хинтона (Mueller-Hinton), которая может быть добавлена. Метод микрорастворения в
питательной среде, описанный в данной части ISO 20776 по существу тот же самый, что и
[1] [2] [3] [4]
используемый во многих странах, включая Францию , Германию , Швецию , Великобританию , и
[5
Соединенные Штаты ]. Метод также по существу совпадает с методом микрорастворения в
питательной среде, изданным Европейским Комитетом по Испытаниям Антимикробной
[6]
Чувствительности (EUCAST) . Все эти методы основаны на методах, описанных Эриксоном (Ericsson)
[7]
и Шеррисом (Sherris) .
© ISO 2006 – Все права сохраняются v

---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 20776-1:2006(R)

Клинические лабораторные испытания и испытательные
системы для диагностики in vitro. Испытания
инфекционных агентов на чувствительность и оценка
функционирования приборов для испытаний на
антимикробную чувствительность.
Часть 1.
Эталонный метод испытания действия in vitro
антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных
бактерий, участвующих в инфекционных заболеваниях
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — применение данной части ISO 20776 может подразумевать
использование опасных материалов, операций и оборудования. Данная часть ISO 20776 не
ставит целью рассмотрение всех проблем безопасности, связанных с ее использованием.
Установка соответствующей техники безопасности и охраны здоровья и определение
применимости регулирующих ограничений по использованию входят в обязанности
пользователя данной части ISO 20776.
1 Область применения
Данная часть ISO 20776 описывает один эталонный метод микрорастворения в питательной среде для
определения МIC. МIC отражает деятельность препарата при описанных испытательных условиях, и
может интерпретироваться в клинических управляющих целях с учетом других факторов таких как
фармакология препарата или бактериальные механизмы сопротивления. Это позволяет
классифицировать бактерии на "чувствительные" (susceptible, S), "нейтральные" (intermediate, I), или
"стойкие" (resistant, R). Кроме того, распределения МIC могут использоваться для определения
некультивированного или культивированного типов популяций бактерий. Хотя клиническая
интерпретация ценности МIC находится вне области рассмотрения данной части ISO 20776, требуются
модификации основного метода для определенной комбинации антимикробный агент – бактерия для
облегчения клинической интерпретации. Эти модификации включены в отдельную таблицу.
Желательно сравнить другие испытания на чувствительность (например, обычные методы или
диагностические испытательные устройства) с данным эталонным методом для подтверждения
сопоставимости и надежности результатов.
2 Термины и определения
В рамках данного документа приняты следующие термины и определения.
2.1
антимикробный агент
antimicrobial agent
вещество биологического, полусинтетического или синтетического происхождения, которое ингибирует
рост или убивает бактерии, и которое за счет этого потенциально может использоваться при лечении
инфекций
© ISO 2006 – Все права сохраняются 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Дезинфицирующие средства, антисептики и консерванты не включены в данное определение.
2.2 Свойства антимикробных агентов
2.2.1
потенциал
potency
антимикробно активная фракция испытуемого вещества, определенная в биопробе по отношению к
эталонному порошку того же самого вещества
ПРИМЕЧАНИЕ Потенциал выражается как массовая доля фракции в миллиграммах на грамм (мг/г), или как
доля активности в Международных Единицах (IU) на грамм, или как объемная или массовая доля в процентах, или
как концентрация количества вещества (массовая доля) в молях на литрах компонентов в испытательном
веществе.
2.2.2
концентрация
concentration
количество антимикробного агента в определенном объеме жидкости
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Концентрация выражается в мг/л.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 мг/л = мкг/мл, но использовать единицу мкг/мл не рекомендуется.
2.3
исходный раствор
stock solution
начальный раствор, используемый для дальнейших растворений
2.4
минимальная запрещающая концентрация
minimum inhibitory concentration
MIC
самая низкая концентрация, которая при определенных условиях in vitro предотвращает видимый рост
бактерий в пределах определенного промежутка времени
ПРИМЕЧАНИЕ МIC выражается в мг/л.
2.5
контрольная точка
breakpoint
BP
определенные значения параметров, таких как МIC, на основе которых бактерии могут быть разделены
на клинические категории: "чувствительные", "нейтральные" и "стойкие"
ПРИМЕЧАНИЕ Для текущих интерпретирующих контрольных точек, можно отсылаться к последним
публикациям организаций, использующих данный эталонный метод (например, CLSI и EUCAST).
2.5.1
чувствительный
susceptible
S
бактериальный штамм, ингибируемый in vitro концентрацией антимикробного агента, связанной с
высокой вероятностью успешного терапевтического воздействия
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Бактериальный штамм определяется как чувствительный с использованием соответствующих
контрольных точек в определенной фенотипичной испытательной системе.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Эти контрольных точки могут быть изменены при изменении условий (например, изменения в
обычно используемых дозировках препарата, появление новых механизмов сопротивления).
2 © ISO 2006 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
2.5.2
нейтральный
intermediate
I
бактериальный штамм, ингибируемый in vitro концентрацией антимикробного агента, связанной с
неопределенным терапевтическим эффектом
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Бактериальный штамм определяется как нейтральный с использованием соответствующих
контрольных точек в определенной фенотипичной испытательной системе.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Данный класс чувствительности подразумевает, что инфекцию вследствие изолированности
можно соответствующим образом рассматривать в местах локализации на теле, где лекарственные средства
физиологически сконцентрированы или когда может быть использована высокая концентрация препарата.
ПРИМЕЧАНИЕ 3 Данный класс также определяет "буферную зону", которая предотвращает появление
серьезных несоответствий в интерпретациях, вызываемых незначительными, неконтролируемыми, техническими
факторами.
ПРИМЕЧАНИЕ 4 Эти контрольных точки могут быть изменены при изменении условий (например, изменения в
обычно используемых дозировках препарата, появление новых механизмов сопротивления).
2.5.3
стойкий
resistant
R
бактериальный штамм, ингибируемый in vitro концентрацией антимикробного агента, связанной с
высокой вероятностью неудачного терапевтического воздействия
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Бактериальный штамм определяется как стойкий с использованием соответствующих
контрольных точек в определенной фенотипичной испытательной системе.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Эти контрольных точки могут быть изменены при изменении условий (например, изменения в
обычно используемых дозировках препарата, появление новых механизмов сопротивления).
2.6
некультивированный тип
wild type
отсутствие приобретенных механизмов сопротивления антимикробному агенту для данного штамма
2.7
контрольный штамм
reference strain
каталогизируемые, характеризованные бактерии с устойчивыми, определенными фенотипами и/или
генотипами антимикробной чувствительности
ПРИМЕЧАНИЕ Контрольные штаммы сохраняются как исходные штаммы, из которых были получены рабочие
культуры. Они доступны в собрании штаммов и используются для контроля качества.
2.8 Методика испытаний на чувствительность
2.8.1
растворение в питательной среде
broth dilution
техника, при которой контейнеры заполняются соответствующими объемами раствора антимикробного
агента с использованием увеличивающихся концентрации (обычно с двойным приращением)
антимикробного агента и соответствующих объемов питательной среды с определенным материалом
затравки
ПРИМЕЧАНИЕ Целью данного метода является определение МIC.
© ISO 2006 – Все права сохраняются 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
2.8.2
микрорастворение
microdilution
растворение в питательной среде в подносах микрорастворения с вместимостью u 200 мкл на ячейку
2.9
питательная среда
broth
жидкая среда, используемая для in vitro роста бактерий
2.10
материал затравки
inoculum
число бактерий в суспензии, вычисленное относительно конечного объема
ПРИМЕЧАНИЕ Материал затравки выражается в колониеобразующих единицах (colony-forming units) на
миллилитр (CFU/ml).
2.11
эффект материала затравки
inoculum effect
изменения в МIC, связанные с изменениями в затравке
3 Процедуры испытаний
3.1 Общие положения
Испытания выполняются в подносах микрорастворения. Метод основан на подготовке рабочих
растворов антимикробного агента, либо в объемах 50 мкл на ячейку (с дополнением материала
затравки также в объеме 50 мкл), либо в объеме 100 мкл на ячейку (с дополнением максимум 5 мкл
материала затравки).
3.2 Среда
Должна использоваться питательная среда Mueller-Hinton (см. Приложение A для уточнения деталей).
3.3 Антимикробные агенты
3.3.1 Общие положения
Антимикробные агенты должны быть получены непосредственно от изготовителя или из надежных
коммерческих источников; не приемлемы фармацевтические препараты для клинического
использования. Антимикробные агенты должны снабжаться номером партии, потенциалом, сроком
годности и описанием рекомендованных условий хранения. Вещества должны хранится в хорошо
закрытых контейнерах в темноте, при температуре от 4 °C до 8 °C, с влагопоглотителем, если иное не
рекомендовано изготовителем. Влагопоглощающие агенты должны быть разделены в равных
количествах, одно из которых будет использоваться в соответствующей процедуре испытаний.
Перед открытием позвольте контейнерам согреться до комнатной температуры для предотвращения
конденсации.
3.3.2 Подготовка растворов хранения
Для взвешивания антимикробных агентов необходимо использовать калиброванные лабораторные
весы. Для расчета количества вещества антимикробного агента или объема разжижителя,
необходимого для стандартного раствора, необходимо учитывать уровень потенциала порошка при
помощи следующей формулы:
4 © ISO 2006 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
V×ρ
m=
P
          (1)
m× P
V =
ρ
          (2)
где
ρ концентрация раствора хранения, в мг/л;
m масса антимикробного агента (порошка), в г;
P потенциал антимикробного агента (порошка), в мг/г;
V объемом растворителя, в л.
Концентрации растворов хранения должны быть 1 000 мг/л или больше, хотя ограничивающим
фактором является растворимость некоторых агентов. Фактические концентрации растворов хранения
зависят от метода подготовки рабочих растворов (последовательные растворения). Агенты должны
быть растворены и разведены в стерильной дистиллированной воде, если иное не предусмотрено
изготовителем. Некоторые агенты требуют альтернативных растворителей (см. Таблицу 1).
Стерилизация растворов не всегда необходима. Если такая необходимость существует, стерилизация
должна быть проведена мембранной фильтрацией, и образцы до и после стерилизации должны
пройти испытание и сравнение последующих результатов для гарантии отсутствия адсорбции.
Если информация о стабильности растворов хранения при указанных условиях хранения не доступна,
они должны готовиться свежие растворы к каждой группе испытаний.
© ISO 2006 – Все права сохраняются 5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
Таблица 1 — Примеры растворителей и разжижителей для растворов хранения выбранных
антимикробных агентов
Антимикробный агент Растворитель Разжижитель
Амикацин (аmikacin) Вода
Амоксициллин (аmoxicillin) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0
Ампициллин (ampicillin) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 8,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0
Ацитромицин (аzithromycin) Этанол с объемной долей 95 % или Вода
a
безводная уксусная кислота
Ацлоциллин (аzlocillin) Вода
Ацтреонам (аztreonam) Насыщенный раствор бикарбоната Вода
натрия
Карбенициллин (сarbenicillin) Вода
Цефаклор (сefaclor) Вода
Цефамандоль (сefamandole) Вода
Цефазолин (сefazolin) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0
Цефдинир (сefdinir) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода
Цефдиторен (сefditoren) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода
Цефепим (сefepime) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0
Цефетамет (сefetamet) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода
Цефиксимин (сefixime) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 7,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 7,0
Цефметазол (сefmetazole) Вода
Цефоництд (сefonicid) Вода
Цефоперазон (сefoperazone) Вода
Цефотаксим (сefotaxime) Вода
Цефотетан (сefotetan) Сульфоксид этана Вода
Цефокситин (сefoxitin) Вода
Цефподоксимин Раствор бикарбоната натрияс массовой Вода
(сefpodoxime) концентрацией 0,1 %
Цефпрозил (сefprozil) Вода
Цефтазидим (сeftazidime) Насыщенный раствор бикарбоната Вода
натрия
Цефтибутен (сeftibuten) Объем 1/10 сульфоксида этана Вода
Цефтизоксим (сeftizoxime) Вода
Цефтобипрол (сeftobiprole) Сульфоксид этана плюс безводнаяВода, вихрь энергично
b
уксусная кислота
Цефтриаксон (сeftriaxone) Вода
Цефуроксим (сefuroxime) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0
Цефалотин (сephalothin) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Вода
Хлорамфеникол Объемная доля этанола 95 % Вода
(Chloramphenicol)
Циноксацин (сinoxacin) Половина объема воды, минимальный Вода
объем 1 моль/л NaOH для растворения,
затем добавить воды до полного объема
6 © ISO 2006 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
Таблица 1 (продолжение)
Антимикробный агент Растворитель Разжижитель
Ципрофлоксацин Вода
(сiprofloxacin)
Кларитромицин Метанол или безводная уксусная Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,5
a
(сlarithromycin) кислота
Клавиланиковая кислота Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0
(сlavulanic acid)
Клинафлоксацин Вода
(сlinafloxacin)
Клиндамицин (сlindamycin) Вода
c
Колистин (сolistin) Вода Вода
d
Далбованцин (dalbavancin) Сульфоксид этана Вода и сульфоксид этана
Даптомицин (daptomycin) Вода Вода
a
Диритромицин Безводная уксусная кислота Вода
(dirithromycin)
Дорипенем (doripenem) NaCl с объемная долей 0,85 % Объемная доля NaCl 0,85 %
Доксициклин (doxycycline) Вода
Еноксацин (еnoxacin) Половина объема воды, минимальный Вода
объем 0,1 моль/л NaOH для растворения,
затем добавить воды до полного объема
Ертапенем (еrtapenem) Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2
Эритомицин (erythromycin) Этанол с объемной долей 95 % или Вода
a
безводная уксусная кислота
Фаропенем (faropenem) Вода Вода
Флероксацин (fleroxacin) Половина объема воды, минимальный Вода
объем 0,1 моль/л NaOH для растворения,
затем добавить воды до полного объема
Фицидиковая кислота Этанол с объемной долей 95 % Вода
(fusidic acid)
Гатифлоксацин (gatifloxacin) Вода (с перемешиванием)
Гемифлоксацин Вода
(gemifloxacin)
Гентамицин (gentamicin) Вода
Имипенем (imipenem) Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2
Канамуцин (kanamycin) Вода
Левофлоксацин Половина объема воды, минимальный Вода
(levofloxacin) объем 1 моль/л NaOH для растворения,
затем добавить воды до полного объема
Линезолид (linezolid) Вода
Лоракарбеф (loracarbef) Вода
Мециллинам (mecillinam) Вода
Меропенем (meropenem) Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2 Фосфатный буфер 0,01 моль/л, pH 7,2
Метициллин (methicillin) Вода
Мезолциллин (mezlocillin) Вода
© ISO 2006 – Все права сохраняются 7

---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
Таблица 1 (продолжение)
Антимикробный агент Растворитель Разжижитель
Миноциклин (minocycline) Вода
Максалактам (соль 0,04 моль/л HCI (позволить отстояться от Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0
e
диаммониума) (moxalactam 1,5 до 2 ч),
(diammonium solt))
Моксифлоксацин Вода
(moxifloxacin)
Мупироцин (mupirocin) Вода
Нафициллин (nafcillin) Вода
Налидиксиковая кислота Половина объема воды, минимальный Вода
(nalidixic acid) объем 1 моль/л NaOH для растворения,
затем добавить воды до полного объема
Нетилмицин (netilmicin) Вода
Нитрофурантоин Минимальный объем диметилформамида, Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 8,0
(nitrofurantoin) для диссоциации, затем восстановить до
полного объема с буферным раствором
фосфата 0,1 моль/л, pH 8,0
Норфлоксацин (norfloxacin) Половина объема воды, минимальный Вода
объем 1 моль/л NaOH для растворения,
затем добавить воды до полного объема
Офлоксацин (оfloxacin) Половина объема воды, минимальный Вода
объем 1 моль/л NaOH для растворения,
затем добавить воды до полного объема
Оксациллин (оxacillin) Вода
Пенициллин (penicillin) Вода
Пиперациллин (рiperacillin) Вода
Полимиксин В (Polymyxin B) Вода Вода
Куинупристин- Вода
далфопристин (quinupristin-
dalfopristin)
Рифампицин (rifampicin) Метанол Вода
Спарфлоксацин Вода
(sparfloxacin)
Сулбактам (sulbactam) Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH +,0
Сулфонамиды Половина объема воды, минимальный Вода
(sulphonamides) объем 1 моль/л NaOH для растворения,
затем добавить воды до полного объема
Теикопланин (teicoplanin) Вода
Телаванцин (telavancin) Сульфоксид этана Вода
a
Телитромицин (telithromycin) Безводная уксусная кислота Вода
Тетрациклин (tetracycline) Вода
Тикарциллин (ticarcillin) Буфер фосфата 0,1 моль/л, pH фактор 6,0 Фосфатный буфер 0,1 моль/л, pH фактор
6,0
Тигециклин (tigecycline) Вода Вода
Тобрамицин (tobramycin) Вода

8 © ISO 2006 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 20776-1:2006(R)
Таблица 1 (продолжение)
Антимикробный агент Растворитель Разжижитель
Триметоприм (trimethoprim) Половина объема воды, минимальный Вода
объем 0,1 моль/л молочной кислоты
0,1 моль/л NaOH для растворения, затем
добавить воды до полного объема
Триметоприм (если лактат) Вода
(trimethoprim (if lactate))
Троспектомуцин Вода
(trospectomycin)
Ванкомуцин (vancomycin) Вода
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Информация относительно растворителей и разжижителей в Таблице 1 была в значительной
степени получена из документа GLSI M100-S16 (Стандарты качества работы по испытаниям на антимикробную
[7]
чувствительность; Шестнадцатое информационное приложение) (с разрешения авторов). Эта информация
периодически обновляется. Проверьте последнюю версию M100 доступн от CLSI (прежде NCCLS), 940 West
Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087, USA
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Для дальнейшей информации относительно примеров растворителей и разжижителей для
создания растворов хранения отобранных антибактериальных агентов, консультируйтесь с Европейской
Фармакопеей или Американской Фармакопеей.
a
Для создания безводной уксусной кислоты используют половину объема воды, затем добавляют безводную уксусную
кислоту капля по капле до достижения диссоциации, не превышающей 2,5 мг/л; добавляют воду до полного объема. Безводная
уксусная кислота эквивалентна объемной доле уксусной кислоты > 99 %.
b
Для каждых 1,5 мг сефтобипрола (ceftobiprole), добавьте 110 мкл смеси сульфоксида этана и безводной
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20776-1
First edition
2006-11-15

Clinical laboratory testing and in vitro
diagnostic test systems — Susceptibility
testing of infectious agents and
evaluation of performance of
antimicrobial susceptibility test
devices —
Part 1:
Reference method for testing the in vitro
activity of antimicrobial agents against
rapidly growing aerobic bacteria involved
in infectious diseases
Systèmes d'essais en laboratoire et de diagnostic in vitro — Essais de
réceptivité d'agents infectieux et évaluation des performances des
dispositifs de réceptivité antimicrobienne —
Partie 1: Méthode de référence pour la détermination de la sensibilité in
vitro aux agents microbiens des bactéries aérobies à croissance rapide
impliquées dans les maladies infectieuses




Reference number
ISO 20776-1:2006(E)
©
ISO 2006

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.


©  ISO 2006
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland

ii © ISO 2006 – All rights reserved

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Terms and definitions. 1
3 Test procedures . 4
3.1 General. 4
3.2 Medium . 4
3.3 Antimicrobial agents . 4
3.4 Preparation of inoculum . 9
3.5 Inoculation of microdilution trays. 10
3.6 Incubation of microdilution trays. 10
3.7 Reading results . 10
3.8 Special test situations where the MIC result might give unreliable results . 10
4 Quality control. 11
Annex A (normative) Requirements for Mueller-Hinton broth. 16
Bibliography . 18

© ISO 2006 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 20776-1 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 140, In vitro diagnostic medical devices, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 212,
Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
ISO 20776 consists of the following parts, under the general title Clinical laboratory testing and in vitro
diagnostic test systems — Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of
antimicrobial susceptibility test devices:
⎯ Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing
aerobic bacteria involved in infectious diseases
⎯ Part 2: Evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices
iv © ISO 2006 – All rights reserved

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
Introduction
In vitro susceptibility tests are performed on microorganisms suspected of causing disease, particularly if the
organism is thought to belong to a species that may exhibit resistance to frequently used antimicrobial agents.
The tests are also important in resistance surveillance, epidemiological studies of susceptibility and in
comparisons of new and existing agents.
Dilution procedures are used to determine the minimum inhibitory concentrations (MICs) of antimicrobial
agents and are the reference method for antimicrobial susceptibility testing. MIC methods are used in
resistance surveillance, comparative testing of new agents, to establish the susceptibility of organisms that
give equivocal results in routine tests, for tests on organisms where routine tests may be unreliable and when
a quantitative result is required for clinical management. In dilution tests, microorganisms are tested for their
ability to produce visible growth on a series of agar plates (agar dilution) or in broth (broth dilution) containing
serial dilutions of the antimicrobial agent.
The lowest concentration of an antimicrobial agent (in mg/l) that, under defined in vitro conditions, prevents
the appearance of visible growth of a microorganism within a defined period of time is known as the MIC. The
MIC is a guide for the clinician to the susceptibility of the organism to the antimicrobial agent and aids
treatment decisions. Careful control and standardisation is required for intra- and inter-laboratory
reproducibility, as results may be significantly influenced by the method used. It is generally accepted that
broth MIC tests are reproducible to within one doubling dilution of the real end point (i.e. ± one well or tube in
a doubling dilution series).
Broth dilution is a technique in which containers holding identical volumes of broth with antimicrobial agent
solutions in incrementally (usually geometrically) increasing concentrations are inoculated with a known
number of microorganisms.
Broth microdilution denotes the performance of the broth dilution test in microdilution trays.
The method described in this part of ISO 20776 is intended for the testing of pure cultures of aerobic bacteria
that are easily grown by overnight incubation on agar and grow well in Mueller-Hinton broth, which may be
supplemented. The broth microdilution method described in this part of ISO 20776 is essentially the same as
[1] [2] [3] [4]
those used in many countries, including France , Germany , Sweden , the United Kingdom , and the
[5]
United States . The method is also essentially the same as the broth microdilution method published by the
[6]
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) . All these methods are based on
[7]
those described by Ericsson and Sherris .

© ISO 2006 – All rights reserved v

---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 20776-1:2006(E)

Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test
systems — Susceptibility testing of infectious agents and
evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test
devices —
Part 1:
Reference method for testing the in vitro activity of
antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria
involved in infectious diseases
WARNING — The use of this part of ISO 20776 may involve hazardous materials, operations and
equipment. This part of ISO 20776 does not purport to address all of the safety problems associated
with its use. It is the responsibility of the user of this part of ISO 20776 to establish appropriate safety
and health practices and determine the applicability of regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This part of ISO 20776 describes one reference method, broth microdilution, for determination of MICs. The
MIC reflects the activity of the drug under the described test conditions, and can be interpreted for clinical
management purposes by taking into account other factors, such as drug pharmacology or bacterial
resistance mechanisms. This allows categorization of bacteria as “susceptible” (S), “intermediate” (I), or
“resistant” (R). In addition, MIC distributions can be used to define wild type or non-wild type bacterial
populations. Although clinical interpretation of the MIC value is beyond the scope of this part of ISO 20776,
modifications of the basic method are required for certain antimicrobial agent - bacteria combinations to
facilitate clinical interpretation. These modifications are included in a separate table. It is advisable to compare
other susceptibility testing methods (e.g. routine methods or diagnostic test devices) with this reference
method for validation, in order to ensure comparable and reliable results.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
antimicrobial agent
substance of biological, semi-synthetic or synthetic origin that inhibits the growth of or kills bacteria, and is
thus of potential use in the treatment of infections
NOTE Disinfectants, antiseptics and preservatives are not included in this definition.
2.2 Antimicrobial agents — properties
2.2.1
potency
antimicrobially active fraction of a test substance, determined in a bioassay against a reference powder of the
same substance
© ISO 2006 – All rights reserved 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
NOTE The potency is expressed as mass fraction in milligrams per gram (mg/g), or as activity content in International
Units (IU) per gram, or as a volume fraction or mass fraction in percent, or as an amount-of-substance concentration
(mass fraction) in mole per litre of ingredients in the test substance.
2.2.2
concentration
amount of an antimicrobial agent in a defined volume of liquid
NOTE 1 The concentration is expressed as mg/l.
NOTE 2 mg/l ≡ µg/ml but it is not recommended to use the unit µg/ml.
2.3
stock solution
initial solution used for further dilutions
2.4
minimum inhibitory concentration
MIC
lowest concentration that, under defined in vitro conditions, prevents visible growth of bacteria within a defined
period of time
NOTE The MIC is expressed in mg/l.
2.5
breakpoint
BP
specific values of parameters, such as MICs, on the basis of which bacteria can be assigned to the clinical
categories “susceptible”, “intermediate” and “resistant”
NOTE For current interpretive breakpoints, reference can be made to the latest publications of organizations
employing this reference method (e.g. CLSI and EUCAST).
2.5.1
susceptible
S
bacterial strain inhibited in vitro by a concentration of an antimicrobial agent that is associated with a high
likelihood of therapeutic success
NOTE 1 Bacterial strains are categorized as susceptible by applying the appropriate breakpoints in a defined
phenotypic test system.
NOTE 2 This breakpoint can be altered due to changes in circumstances (e.g. changes in commonly used drug
dosages, emergence of new resistance mechanisms).
2.5.2
intermediate
I
bacterial strain inhibited in vitro by a concentration of an antimicrobial agent that is associated with uncertain
therapeutic effect
NOTE 1 Bacterial strains are categorized as intermediate by applying the appropriate breakpoints in a defined
phenotypic test system.
NOTE 2 This class of susceptibility implies that an infection due to the isolate can be appropriately treated in body sites
where the drugs are physiologically concentrated or when a high dosage of drug can be used.
NOTE 3 This class also indicates a “buffer zone”, to prevent small, uncontrolled, technical factors from causing major
discrepancies in interpretations.
NOTE 4 These breakpoints can be altered due to changes in circumstances (e.g. changes in commonly used drug
dosages, emergence of new resistance mechanisms).
2 © ISO 2006 – All rights reserved

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
2.5.3
resistant
R
bacterial strain inhibited in vitro by a concentration of an antimicrobial agent that is associated with a high
likelihood of therapeutic failure
NOTE 1 Bacterial strains are categorized as resistant by applying the appropriate breakpoints in a defined phenotypic
test system.
NOTE 2 This breakpoint can be altered due to changes in circumstances (e.g. changes in commonly used drug
dosages, emergence of new resistance mechanisms).
2.6
wild type
absence of acquired resistance mechanisms to the antimicrobial agent for a given strain
2.7
reference strain
catalogued, characterized bacteria with stable, defined antimicrobial susceptibility phenotypes and/or
genotypes
NOTE Reference strains are kept as stock cultures, from which working cultures are derived. They are obtainable
from culture collections and used for quality control.
2.8 Susceptibility testing method
2.8.1
broth dilution
technique in which containers are filled with appropriate volumes of an antimicrobial solution, employing
incrementally (usually two-fold) increasing concentrations of the antimicrobial agent and appropriate volumes
of broth with a defined inoculum
NOTE The aim of this method is the determination of the MIC.
2.8.2
microdilution
performance of broth dilution in microdilution trays with a capacity of u 200 µl per well
2.9
broth
fluid medium used for the in vitro growth of bacteria
2.10
inoculum
number of bacteria in a suspension, calculated with respect to the final volume
NOTE The inoculum is expressed as colony-forming units per millilitre (CFU/ml).
2.11
inoculum effect
change in MIC related to change in inoculum
© ISO 2006 – All rights reserved 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
3 Test procedures
3.1 General
The tests are performed in microdilution trays. The method is based on the preparation of antimicrobial agent
working solutions, either in 50 µl volumes per well (with the addition of an inoculum also in a volume of 50 µl),
or in a volume of 100 µl per well (with the addition of a maximum of 5 µl inoculum volume).
3.2 Medium
Mueller-Hinton broth shall be used (see Annex A for details).
3.3 Antimicrobial agents
3.3.1 General
Antimicrobial agents shall be obtained directly from the manufacturer or from reliable commercial sources;
pharmaceutical preparations for clinical use are not acceptable. The antimicrobial agents shall be supplied
with a lot number, potency, an expiry date and details of recommended storage conditions. Substances shall
be stored in tightly closed containers in the dark, at 4 °C to 8 °C, with a desiccant unless otherwise
recommended by the manufacturer. Hygroscopic agents should be dispensed into aliquots, one of which is
used on each test occasion.
Allow containers to warm to room temperature before opening them to avoid condensation.
3.3.2 Preparation of stock solutions
The use of a calibrated analytical balance is required to weigh antimicrobial agents. Allowance for the potency
of the powder shall be made by use of the following formula to obtain the amount of antimicrobial agent
substance or the volume of diluent needed for a standard solution:
V×ρ
m= (1)
P
mP×
V= (2)
ρ
where
ρ is the concentration of the stock solution, in mg/l;
m is mass of the antimicrobial agent (powder), in g;
P is the potency of the antimicrobial agent (powder), in mg/g;
V is the volume of diluent, in l.
Concentrations of stock solutions should be 1 000 mg/l or greater, although the solubility of some agents is a
limiting factor. The actual concentrations of stock solutions depend on the method of preparing working
solutions (serial dilutions). Agents should be dissolved and diluted in sterile distilled water unless the
manufacturer states otherwise. Some agents require alternative solvents (see Table 1). Sterilisation of
solutions is not usually necessary. If required, sterilisation should be done by membrane filtration, and
samples before and after sterilisation should be compared by assay to ensure that adsorption has not
occurred.
Unless information is available on stability of stock solutions under specified storage conditions, they should
be prepared fresh for each test batch.
4 © ISO 2006 – All rights reserved

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
Table 1 — Examples of solvents and diluents for making stock solutions of selected
antimicrobial agents
Antimicrobial agent Solvent Diluent
Amikacin Water
Amoxicillin Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0
Ampicillin Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 8,0 Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0
a
Azithromycin Ethanol volume fraction 95 % or glacial acetic acid Water
Azlocillin Water
Aztreonam Saturated sodium bicarbonate solution Water
Carbenicillin Water
Cefaclor Water
Cefamandole Water
Cefazolin Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0
Cefdinir Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Water
Cefditoren Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Water
Cefepime Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0
Cefetamet Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Water
Cefixime Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 7,0 Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 7,0
Cefmetazole Water
Cefonicid Water
Cefoperazone Water
Cefotaxime Water
Cefotetan Dimethyl sulfoxide Water
Cefoxitin Water
Cefpodoxime Mass concentration 0,1 % sodium bicarbonate solution Water
Cefprozil Water
Ceftazidime Saturated sodium bicarbonate solution Water
Ceftibuten 1/10 volume of dimethyl sulfoxide Water
Ceftizoxime Water
b
Ceftobiprole Dimethyl sulfoxide plus glacial acetic acid Water, vortex vigorously
Ceftriaxone Water
Cefuroxime Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0
Cephalothin Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Water
Chloramphenicol Ethanol volume fraction 95 % Water
Cinoxacin Half volume of water, a minimum volume 1 mol/l NaOH Water
to dissolve, then make up to total volume with water
Ciprofloxacin Water
a
Clarithromycin Methanol or glacial acetic acid 0,1 mol/l phosphate buffer, pH 6,5
Clavulanic acid Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0
Clinafloxacin Water
Clindamycin Water
c
Colistin Water Water
d
Dalbavancin Dimethyl sulfoxide Water and dimethyl sulfoxide

© ISO 2006 – All rights reserved 5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
Table 1 (continued)
Antimicrobial agent Solvent Diluent
Daptomycin Water Water
a
Dirithromycin Glacial acetic acid Water
Doripenem NaCl volume fraction 0,85 % NaCl volume fraction 0,85 %
Doxycycline Water
Enoxacin Half volume water, a minimum volume 0,1 mol/l NaOH Water
to dissolve, then make up to total volume with water
Ertapenem Phosphate buffer 0,01 mol/l, pH 7,2 Phosphate buffer 0,01 mol/l, pH 7,2

a
Erythromycin Ethanol volume fraction 95 % or glacial acetic acid Water
Faropenem Water Water
Fleroxacin Half volume water, a minimum volume 0,1 mol/l NaOH Water
to dissolve, then make up to total volume with water
Fusidic acid Ethanol volume fraction 95 % Water
Garenoxacin Water (with stirring)
Gatifloxacin Water (with stirring)
Gemifloxacin Water
Gentamicin Water
Imipenem Phosphate buffer 0,01 mol/l, pH 7,2 Phosphate buffer 0,01 mol/l, pH 7,2
Kanamycin Water
Levofloxacin Half volume water, a minimum volume 1 mol/l NaOH to Water
dissolve, then make up to total volume with water
Linezolid Water
Loracarbef Water
Mecillinam Water
Meropenem Phosphate buffer 0,01 mol/l, pH 7,2 Phosphate buffer 0,01 mol/l, pH 7,2
Methicillin Water
Mezlocillin Water
Minocycline Water
Moxalactam 0,04 mol/l HCI (let sit for 1,5 h to 2 h) Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0

e
(diammonium salt)
Moxifloxacin Water
Mupirocin Water
Nafcillin Water
Nalidixic acid Half volume water, a minimum volume 1 mol/l NaOH to Water
dissolve, then make up to total volume with water
Netilmicin Water
Nitrofurantoin Minimum volume dimethylformamide to dissolve, then Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 8,0
make up to total volume with phosphate buffer 0,1 mol/l,
pH 8,0
Norfloxacin Half volume of water, a minimum volume 1 mol/l NaOH Water
to dissolve, then make up to total volume with water
Ofloxacin Half volume water, a minimum volume 1 mol/l NaOH to Water
dissolve, then make up to total volume with water
Oxacillin Water

6 © ISO 2006 – All rights reserved

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
Table 1 (continued)
Antimicrobial agent Solvent Diluent
Penicillin Water
Piperacillin Water
Polymyxin B Water Water
Quinupristin-Water
dalfopristin
Rifampicin Methanol Water
Sparfloxacin Water
Sulbactam Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0
Sulphonamides Half volume water, a minimum volume 1 mol/l NaOH to Water
dissolve, then make up to total volume with water
Teicoplanin Water
Telavancin Dimethyl sulfoxide Water

a
Telithromycin Glacial acetic acid Water
Tetracycline Water
Ticarcillin Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0 Phosphate buffer 0,1 mol/l, pH 6,0
Tigecycline Water Water
Tobramycin Water
Trimethoprim Half volume water, a minimum volume 0,1 mol/l lactic Water
acid or 0,1 mol/l HCl to dissolve, then make up to total
volume with water
Trimethoprim (if
Water
lactate)
Trospectomycin Water
Vancomycin Water
NOTE 1 The information regarding solvents and diluents in Table 1 was largely obtained from GLSI document M100-S16
[7]
(Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth Informational Supplement) with permission. This
information is subject to periodic updates. Check the latest version of M100 available from CLSI (formerly NCCLS), 940 West Valley

Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087, USA.
NOTE 2 For further information on examples of solvents and diluents for making stock solutions of selected antimicrobial agents,
consult the European Pharmacopoeia or the US Pharmacopoeia.
a
For glacial acetic acid, use half volume of water, then add glacial acetic acid dropwise until dissolved, not to exceed 2,5 mg/l; add
water to full volume. Glacial acetic acid is equivalent to acetic acid volume fraction > 99 %.
b
For each 1,5 mg ceftobiprole, add 110 µl of a 10:1 mixture of dimethyl sulfoxide and glacial acetic acid. Vortex vigorously for 1 min,
then intermittently for 15 min. Dilute to 1,0 ml with distilled water.
c
The formulation of colistin used in antimicrobial susceptibility tests is colistin sulphate and not colistin methane sulfphonate
(sulphomethate).
d
Starting stock solutions of dalbavancin should be prepared at concentrations no higher than 1 600 mg/l. Intermediate 100 ×
concentrations should then be diluted in dimethyl sulfoxide. Final 1:100 dilutions should then be made directly into cation-adjusted
Mueller-Hinton broth (CAMHB) supplemented with polysorbate-80 volume fraction 0,002 % so that the final concentration of dimethyl
sulfoxide in the wells is no greater than 1 %.
e
The diammonium salt of moxalactam is very stable, but it is almost pure R isomer. Moxalactam for clinical use is a 1:1 mixture of R
and S isomers. Therefore, the salt is dissolved in 0,04 mol/l HCl and allowed to react for 1,5 h to 2 h to convert it to equal parts of both
isomers.

© ISO 2006 – All rights reserved 7

---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
3.3.3 Preparation of working solutions
The range of concentrations selected for testing depends on the organisms and antimicrobial agent. The
chosen range shall allow full endpoint MIC determination for appropriate reference strains. A two-fold dilution
series based on 1 mg/l is prepared in Mueller-Hinton broth. Dilutions should not be prepared by serial dilution
steps, but according to the procedure outlined in Table 2. Working solutions shall be used the same day
unless information is available on stability of the solutions under specified storage conditions.
Table 2 — Preparation of working dilutions of antimicrobial agents for use in broth dilution
[8]
susceptibility tests
a
Antimicrobial agent Volume stock solution Antimicrobial agent
Volume broth
concentration in stock solution concentration obtained
mg/l ml ml mg/l
5 120 1 9 512
512 1 1 256
512 1 3 128
512 1 7 64
64 1 1 32
64 1 3 16
64 1 7 8
8 1 1 4
8 1 3 2
8 1 7 1
1 1 1 0,5
1 1 3 0,25
1 1 7 0,125
a
Broth used for dilution is that used in the susceptibility test. Any supplementation shall take place before diluting the antimicrobial
agent to maintain the required concentrations.

3.3.4 Preparation of microdilution trays
Working solutions are dispensed into microdilution trays at 50 µl per well with double the desired final
concentrations of antimicrobial agent, or at 100 µl per well in the desired final concentrations.
At least one well, containing 50 µl or 100 µl of antimicrobial agent-free medium, should be included as a
growth control for each strain tested. Likewise, a well containing 100 µl of antimicrobial agent-free medium
should be included as an uninoculated negative control well for each strain tested.
3.3.5 Storage of microdilution trays
Filled trays may be used immediately or may be stored for up to three months. For storage the filled trays
should be sealed in plastic bags and immediately placed in a freezer at u − 60 °C unless the antimicrobial
agents are known to be stable at higher temperatures.
Although the antimicrobial agents in frozen trays usually remain stable for several months, certain agents (e.g.
clavulanic acid and imipenem) are more labile than others and should be stored at u − 60 °C. Trays shall not
be stored in a self-defrosting freezer, and thawed antimicrobial solutions shall not be refrozen, as repeated
freeze-thaw cycles accelerate the degradation of some antimicrobial agents, particularly β-lactams.
8 © ISO 2006 – All rights reserved

---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 20776-1:2006(E)
3.4 Preparation of inoculum
3.4.1 General
Standardisation of the inoculum is essential for accurate and reproducible broth dilution susceptibility tests.
Therefore purity checks and viable colony counts shall be performed on every isolate tested with this
reference procedure.
The inoculum may be prepared by diluting a broth culture or by suspending colonies from an overnight culture
on non-selective agar medium in broth or saline. For either method, four or five colonies of a pure
non-selective nutritive agar medium a
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20776-1
Première édition
2006-11-15
Version corrigée
2007-02-15

Systèmes d'essais en laboratoire et de
diagnostic in vitro — Sensibilité in vitro
des agents infectieux et évaluation des
performances des dispositifs pour
antibiogrammes —
Partie 1:
Méthode de référence pour la
détermination de la sensibilité in vitro
aux agents antimicrobiens des bactéries
aérobies à croissance rapide impliquées
dans les maladies infectieuses
Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems —
Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance
of antimicrobial susceptibility test devices —
Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial
agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious
diseases




Numéro de référence
ISO 20776-1:2006(F)
©
ISO 2006

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.


©  ISO 2006
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Publié en Suisse

ii © ISO 2006 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Modes opératoires. 4
3.1 Généralités . 4
3.2 Milieu. 4
3.3 Agents antimicrobiens . 4
3.4 Préparation de l'inoculum. 10
3.5 Inoculation des plaques de microdilution.11
3.6 Incubation des plaques de microdilution.11
3.7 Résultats des lectures. 11
3.8 Situations spécifiques pour lesquelles le résultat de la CMI peut donner des résultats peu
fiables. 11
4 Contrôle de qualité . 13
Annexe A (normative) Exigences relatives au bouillon Mueller-Hinton. 17
Bibliographie . 19

© ISO 2006 – Tous droits réservés iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 20776-1 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 140, Dispositifs médicaux de diagnostic in vitro,
du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité technique ISO/TC 212,
Laboratoires d'analyses de biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro, conformément à l'Accord de
coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
L'ISO 20776 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Systèmes d'essais en
laboratoire et de diagnostic in vitro — Sensibilité in vitro des agents infectieux et évaluation des performances
des dispositifs pour antibiogrammes:
⎯ Partie 1: Méthode de référence pour la détermination de la sensiblilté in vitro aux agents antimicrobiens
des bactéries aérobies à croissance rapide impliquées dans les maladies infectieuses
⎯ Partie 2: Évaluation des performances des dispositifs pour antibiogrammes
La présente version corrigée de l'ISO 20776-1:2006 inclut les corrections suivantes:
⎯ page de titre: le titre français a été modifié;
⎯ p. iv, Avant-propos: les titres français des deux parties ont été modifiés;
⎯ Le terme «réceptivité» a été remplacé dans tout le document par le terme «sensibilité» et divers autres
changements de terminologie, d'ordre général, ont été effectués dans le document.

iv © ISO 2006 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
Introduction
Les essais de sensibilité in vitro sont conduits sur les micro-organismes suspectés de provoquer une maladie,
en particulier si l'on pense que l'organisme appartient à une espèce qui peut montrer une résistance aux
agents antimicrobiens fréquemment employés. Les essais sont également importants pour la surveillance de
la résistance, pour les études épidémiologiques de la sensibilité et pour comparer les nouveaux agents
antimicrobiens à ceux déjà existants.
Des méthodes de dilution sont employées pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des
agents antimicrobiens et constituent la référence pour les essais de sensibilité antimicrobienne. Les méthodes
de détermination des CMI sont employées dans la surveillance de la résistance, pour comparer l’activité des
nouveaux agents antimicrobiens, pour établir la sensibilité des organismes qui donnent des résultats
équivoques avec les méthodes de routine, dans le cadre d’essais réalisés sur des organismes pour lesquels
les méthodes de routine peuvent ne pas être fiables et lorsqu'un résultat quantitatif est nécessaire à la
décision clinique. Dans les essais de dilution, les micro-organismes sont soumis à essai afin de déterminer
leur capacité à produire une croissance visible sur une série de boîtes de gélose (dilution en gélose) ou dans
un bouillon (dilution en bouillon) contenant des dilutions en série de l'agent antimicrobien.
La concentration la plus faible d'un agent antimicrobien (en mg/l) qui, dans des conditions in vitro définies,
inhibe l'apparition d'une croissance visible d'un micro-organisme au cours d'une période définie est connue
sous le nom de CMI. Pour le clinicien, la CMI constitue un guide de la sensibilité de l'organisme à l'agent
antimicrobien et facilite les décisions de traitement. Un strict contrôle de la méthode et une normalisation sont
nécessaires à la reproductibilité intralaboratoires et interlaboratoires car les résultats peuvent être
significativement influencés par la méthode utilisée. Il est généralement accepté que les essais de la CMI en
bouillon sont reproductibles à plus ou moins une dilution (c'est-à-dire ± une cupule ou un tube dans une série
de raison 2).
La dilution en bouillon est une technique dans laquelle des conteneurs comportant des volumes identiques
de bouillon avec des solutions d'agent antibactérien à des concentrations augmentant de manière
incrémentielle (généralement de manière géométrique) sont ensemencés avec un nombre connu de
micro-organismes.
La microdilution en bouillon indique une dilution en bouillon sur des plaques de microdilution.
La méthode décrite dans ce document est conçue pour soumettre à essai des cultures pures de bactéries
aérobies qui sont facilement cultivables en bouillon Mueller-Hinton, possiblement enrichi en les incubant une
nuit dans un bouillon gélosé. La méthode de microdilution en bouillon décrite dans ce document est
[1] [2]
essentiellement la même que celles utilisées dans de nombreux pays, y compris la France , l'Allemagne ,
[3] [4] [5]
la Suède , le Royaume-Uni , et les États-Unis . La méthode est également essentiellement la même que
la méthode de microdilution en bouillon publiée par l'EUCAST (European Committee on Antimicrobial
[6] [7]
Susceptibility Testing) . Toutes ces méthodes sont basées sur la méthode décrite par Ericsson et Sherris .
© ISO 2006 – Tous droits réservés v

---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 20776-1:2006(F)

Systèmes d'essais en laboratoire et de diagnostic in vitro —
Sensibilité in vitro des agents infectieux et évaluation des
performances des dispositifs pour antibiogrammes —
Partie 1:
Méthode de référence pour la détermination de la sensibilité
in vitro aux agents antimicrobiens des bactéries aérobies à
croissance rapide impliquées dans les maladies infectieuses
AVERTISSEMENT L'utilisation de la présente partie de l’ISO 20776 peut impliquer des matériaux,
des opérations et des équipement dangereux. La présente partie de l’ISO 20776 n'est pas destinée à
traiter tous les problèmes de sécurité associés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l'utilisateur de cette partie de l’ISO 20776 d'établir les pratiques de santé et de sécurité appropriées et
de déterminer l'applicabilité des limites réglementaires avant utilisation.
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 20776 décrit une méthode de référence, la microdilution en bouillon, pour
déterminer les CMI. La CMI reflète l'activité du médicament dans les conditions d'essai décrites, et peut être
interprétée pour une recommandation clinique en tenant compte d'autres facteurs tels que la pharmacologie
du médicament ou les mécanismes de résistance bactérienne. Cela permet de classer les bactéries comme
étant «sensibles» (S), «intermédiaires» (I), ou «résistantes» (R). En outre, les distributions de CMI peuvent
être utilisées pour définir les populations bactériennes de type sauvage ou non sauvage. Bien que
l'interprétation clinique de la valeur de la CMI se trouve au-delà du domaine d'application de la présente partie
de l’ISO 20776, des modifications de la méthode de base sont nécessaires pour certaines combinaisons
agent antimicrobien-bactérie afin de faciliter l'interprétation clinique. Ces modifications sont incluses dans un
tableau séparé. Il est recommandé de comparer les autres méthodes d'essai de sensibilité (par exemple les
méthodes conduites en routine ou les essais de diagnostic) à cette méthode de référence à des fins de
validation et pour garantir des résultats comparables et fiables.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
agent antimicrobien
substance d'origine biologique, semi-synthétique ou synthétique qui inhibe la croissance d'une bactérie ou
l'élimine, et qui est par conséquent potentiellement utilisée dans le traitement des infections
NOTE Les désinfectants, les antiseptiques et les conservateurs ne sont pas inclus dans cette définition.
© ISO 2006 – Tous droits réservés 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
2.2 Agents antimicrobiens — propriétés
2.2.1
titre
fraction d'une substance d'essai ayant une action antimicrobienne, déterminée dans le cadre d'une analyse
biologique par rapport à une poudre de référence de la même substance
NOTE Le titre est exprimé en fraction massique en milligrammes par gramme (mg/g) ou en activité en unités
internationales (UI) par g ou en fraction volumique ou en fraction massique en pourcentage ou en concentration de
quantité de substance (fraction massique) en mole par litre d'ingrédients dans la substance d'essai.
2.2.2
concentration
quantité d'un agent antimicrobien dans un volume défini de liquide
NOTE 1 La concentration est exprimée en mg/l.
NOTE 2 mg/l ≡ µg/ml mais il n'est pas recommandé d'utiliser l'unité µg/ml.
2.3
solution mère
solution initiale utilisée pour des dilutions ultérieures
2.4
concentration minimale inhibitrice
CMI
concentration la plus faible qui, dans des conditions in vitro définies, empêche la croissance visible de
bactéries pendant une période définie
NOTE La CMI est exprimée en mg/l.
2.5
concentration critique
valeurs spécifiques de CMI sur la base desquelles une bactérie peut être affectée aux catégories cliniques
«sensible», «intermédiaire» et «résistante»
NOTE Pour les concentrations critiques actuelles, se référer aux dernières publications des organisations employant
cette méthode de référence (par exemple le CLSI et l'EUCAST).
2.5.1
sensible
S
souche bactérienne inhibée in vitro par une concentration d'un agent antimicrobien qui est associée à une
forte probabilité de succès thérapeutique
NOTE 1 Les souches bactériennes sont classées «sensibles» en appliquant la concentration critique appropriée dans
un système d'essai phénotypique défini.
NOTE 2 Cette concentration critique peut être modifiée à cause de modifications des circonstances (par exemple
modifications des posologies habituelles des médicaments, émergence de nouveaux mécanismes de résistance).
2.5.2
intermédiaire
I
souche bactérienne inhibée in vitro par une concentration d'un agent antimicrobien qui est associée à un effet
thérapeutique imprévisible
NOTE 1 Les souches bactériennes sont classées «intermédiaires» en appliquant les concentrations critiques
appropriées dans un système d'essai phénotypique défini.
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
NOTE 2 Cette classe de sensibilité implique qu'une infection due à l'isolat peut être traitée de manière appropriée dans
les sites corporels où les médicaments sont physiologiquement concentrés ou lorsqu'une posologie plus importante peut
être utilisée.
NOTE 3 Cette classe indique également une «zone tampon» empêchant tout facteur technique, incontrôlé, de faible
importance, de provoquer des écarts d'interprétation majeurs.
NOTE 4 Ces concentrations critiques peuvent être modifiées à cause de modifications des circonstances (par exemple
modifications des posologies habituelles des médicaments, émergence de nouveaux mécanismes de résistance).
2.5.3
résistante
R
souche bactérienne inhibée in vitro par une concentration d'un agent antimicrobien qui est associée à une
forte probabilité d'échec thérapeutique
NOTE 1 Les souches bactériennes sont classées «résistantes» en appliquant la concentration critique appropriée dans
un système d'essai phénotypique défini.
NOTE 2 Cette concentration critique peut être modifiée à cause de modifications des circonstances (par exemple
modifications des posologies habituelles des médicaments, émergence de nouveaux mécanismes de résistance).
2.6
souche sauvage
absence de mécanisme de résistance acquis par l'agent antimicrobien pour une souche donnée
2.7
souche de référence
bactérie répertoriée, caractérisée avec des phénotypes et/ou des génotypes de sensibilité antimicrobienne
définis
NOTE Les souches de référence sont conservées comme des cultures mères dont les cultures de travail sont issues.
Elles peuvent être obtenues à partir de collections de culture et utilisées pour le contrôle de la qualité.
2.8 Méthode d'essai de sensibilité
2.8.1
dilution en bouillon
technique dans laquelle les conteneurs sont remplis avec les volumes appropriés d'une solution
antimicrobienne, employant des concentrations de l'agent antimicrobien et des volumes appropriés de
bouillon avec un inoculum défini, qui augmentent de façon incrémentielle (en général de raison 2)
NOTE L'objectif de cette méthode est de déterminer la CMI.
2.8.2
microdilution
réalisation de la dilution en bouillon sur des plaques de microdilution ayant une capacité de u 200 µl par
cupule
2.9
bouillon
milieu liquide utilisé pour la croissance in vitro de bactéries
2.10
inoculum
nombre de bactéries dans une suspension, calculé par rapport au volume final
NOTE L'inoculum est exprimé en unités formant colonie par millilitre (UFC/ml).
2.11
effet de l'inoculum
modification de la CMI liée à une modification de l'inoculum
© ISO 2006 – Tous droits réservés 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
3 Modes opératoires
3.1 Généralités
Les essais sont réalisés sur des plaques de microdilution. La méthode est basée sur la préparation de
solutions de travail d'agent antimicrobien dans des volumes de 50 µl (avec l'ajout d'un inoculum également
dans un volume de 50 µl) ou dans un volume de 100 µl (avec l'ajout d'un maximum de 5 µl de volume
d'inoculum) par cupule.
3.2 Milieu
Un bouillon Mueller-Hinton doit être utilisé (voir l'Annexe A pour plus de détails).
3.3 Agents antimicrobiens
3.3.1 Généralités
Les agents antimicrobiens doivent être obtenus directement du fabricant ou de sources commerciales fiables;
les préparations pharmaceutiques à usage clinique ne sont pas acceptables. Les agents antimicrobiens
doivent être fournis avec un numéro de lot, un titre, une date de péremption et des détails concernant les
conditions de stockage recommandées. Sauf recommandation contraire du fabricant, les substances doivent
être conservées dans des conteneurs hermétiquement fermés, dans l'obscurité, à une température de 4 °C
à 8 °C avec un agent hygroscopique. Il convient de préparer les agents hygroscopiques en parties aliquotes,
dont une est utilisée lors de chaque essai.
NOTE Laisser les conteneurs se réchauffer à température ambiante avant de les ouvrir afin d'éviter toute
condensation.
3.3.2 Préparation des solutions mères
L'utilisation d'une balance analytique étalonnée est nécessaire pour peser les agents antimicrobiens. Il doit
être tenu compte du titre de la poudre en utilisant la formule suivante pour obtenir la quantité de substance
d'agent antimicrobien ou le volume de diluant nécessaire pour une solution normalisée:
V×ρ
m= (1)
P
mP×
V= (2)
ρ
où
ρ est la concentration de la solution mère, en mg/l;
m est la masse de l’agent antimicrobien (poudre), en g;
P est le titre de l’agent antimicrobien (poudre), en mg/g;
V est le volume de diluant, en l.
Les concentrations de solutions mères doivent être de 1 000 mg/l ou plus, même si la solubilité de certains
agents est limitée. Les concentrations réelles de solutions mères dépendront de la méthode de préparation de
la solution de travail (dilution en série). Il convient de dissoudre et de diluer les agents dans de l'eau distillée
stérile, sauf indication contraire du fabricant. Certains agents nécessitent d'autres solvants (voir Tableau 1). Il
n'est pas toujours nécessaire de stériliser les solutions. Si nécessaire, la stérilisation doit être effectuée par
filtration sur membrane. Les échantillons avant et après stérilisation doivent être comparés par analyse afin de
garantir qu'aucune adsorption n'est survenue.
4 © ISO 2006 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
Sauf si des informations sur la stabilité des solutions mères dans des conditions de stockage spécifiées sont
disponibles, il convient de les préparer au dernier moment pour chaque lot d'essai.
Tableau 1 — Exemples de solvants et de diluants destinés à fabriquer les solutions mères d'agents
antimicrobiens sélectionnés
Agent antimicrobien Solvant Diluant
Amikacine Eau
Amoxicilline Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0
Ampicilline Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 8,0 Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0
Azithromycine Éthanol à une fraction volumique de 95 % ou acide Eau
a
acétique glacial
Azlocilline Eau
Aztréonam Solution saturée de bicarbonate de sodium Eau
Carbénicilline Eau
Céfaclor Eau
Céfamandole Eau
Céfazoline Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0
Cefdinir Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Eau
Cefditoren Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Eau
Céfépime Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Tampon phosphate 0,1mol/l, pH 6,0
Céfétamet Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Eau
Céfixime Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 7,0 Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 7,0
Cefmétazole Eau
Céfonicide Eau
Céfopérazone Eau
Céfotaxime Eau
Céfotétan Sulfoxyde de diméthyle Eau
Céfoxitine Eau
Céfpodoxime Solution de bicarbonate de sodium à une Eau
concentration massique de 0,1 %
Céfprozile Eau
Céftazidime Solution saturée de bicarbonate de sodium Eau
Céftibuten 1/10 volume de sulfoxyde de diméthyle Eau
Céftizoxime Eau
b
Céftobiprole Eau, à agiter de manière vigoureuse
Sulfoxyde de diméthyle plus acide acétique glacial
Céftriaxone Eau
Céfuroxime Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0
Céphalothine Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Eau
Chloramphénicol Éthanol à une fraction volumique de 95 % Eau
Cinoxacine La moitié d'un volume d'eau, volume minimal Eau
1 mol/l de NaOH pour la dissolution, puis
reconstituer le volume total avec de l'eau
© ISO 2006 – Tous droits réservés 5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
Tableau 1 (suite)
Agent antimicrobien Solvant Diluant
Ciprofloxacine Eau
a
Clarithromycine 0,1 mol/l tampon phosphate, pH 6,5
Méthanol ou acide acétique glacial
Acide clavulanique Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0
Clinafloxacine Eau
Clindamycine Eau
c
Colistine Eau Eau
d
Dalbavancine Sulfoxyde de diméthyle
Eau et sulfoxyde de diméthyle
Daptomycine Eau Eau
a
Dirithromycine Eau
Acide acétique glacial
Doripénème NaCl à une fraction volumique de 0,85 % NaCl à une fraction volumique de 0,85 %
Doxycycline Eau
Énoxacine La moitié d'un volume d'eau, volume minimal Eau
de 0,1 mol/l de NaOH pour la dissolution, puis
reconstituer le volume total avec de l'eau
Értapénème Tampon phosphate 0,01 mol/l, pH 7,2 Tampon phosphate 0,01 mol/l, pH 7,2
Érythromycine Éthanol à une fraction volumique de 95 %) ou acide Eau
a
acétique glacial
Faropénème Eau Eau
Fléroxacine La moitié d'un volume d'eau, volume minimal de Eau
0,1 mol/l de NaOH pour la dissolution, puis
reconstituer le volume total avec de l'eau
Acide fusidique Éthanol à une fraction volumique de 95 % Eau
Garénoxacine Eau (agitation)
Gatifloxacine Eau (agitation)
Gémifloxacine Eau
Gentamicine Eau
Imipénème Tampon phosphate 0,01 mol/l, pH 7,2 Tampon phosphate 0,01 mol/l, pH 7,2
Kanamycine Eau
Lévofloxacine La moitié d'un volume d'eau, volume minimal de Eau
0,1 mol/l de NaOH pour la dissolution, puis
reconstituer le volume total avec de l'eau
Linézolide Eau
Loracarbef Eau
Mécillinam Eau
Méropénème Tampon phosphate 0,01 mol/l, pH 7,2 Tampon phosphate 0,01 mol/l, pH 7,2
Méthicilline Eau
Mezlocilline Eau
Minocycline Eau
6 © ISO 2006 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
Tableau 1 (suite)
Agent antimicrobien Solvant Diluant
Moxalactam 0,04 mol/l HCI (laisser reposer pendant 1,5 h à 2 h) Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0
e
(sel diammonique)
Moxifloxacine Eau
Mupirocine Eau
Nafcilline Eau
Acide nalidixique La moitié d'un volume d'eau, volume minimal de Eau
0,1 mol/l de NaOH pour la dissolution, puis
reconstituer le volume total avec de l'eau
Nétilmicine Eau
Nitrofurantoïne Volume minimal de diméthylformamide pour la Tampon phosphate 0,1mol/l, pH 8,0
dissolution, puis reconstituer le volume total avec
un tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 8,0
Norfloxacine La moitié d'un volume d'eau, volume minimal Eau
1 mol/l de NaOH pour la dissolution, puis
reconstituer le volume total avec de l'eau
Ofloxacine La moitié d'un volume d'eau, volume minimal Eau
1 mol/l de NaOH pour la dissolution, puis
reconstituer le volume total avec de l'eau
Oxacilline Eau
Pénicilline Eau
Pipéracilline Eau
Polymyxine B Eau Eau
Quinupristine- Eau
dalfopristine
Rifampicine Méthanol Eau
Sparfloxacine Eau
Sulbactam Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0
Sulphonamides La moitié d'un volume d'eau, volume minimal de Eau
1 mol/l de NaOH pour la dissolution, puis
reconstituer le volume total avec de l'eau
Téicoplanine Eau
Télavancine Sulfoxyde de diméthyle Eau
a
Télithromycine Eau
Acide acétique glacial
Tétracycline Eau
Ticarcilline Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0 Tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 6,0
Tigécycline Eau Eau
Tobramycine Eau
Triméthoprime La moitié d'un volume d'eau, volume minimal de Eau
0,1 mol/l d'acide lactique ou 0,1 mol/l d'HCl pour la
dissolution, puis reconstituer le volume total avec
de l'eau
Triméthoprime (lactate) Eau
© ISO 2006 – Tous droits réservés 7

---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 20776-1:2006(F)
Tableau 1 (suite)
Agent antimicrobien Solvant Diluant
Trospectomycine Eau
Vancomycine Eau
NOTE 1 Les informations relatives aux solvants et aux diluants indiqués dans le Tableau 1 sont en grande partie issues du document
[7]
M100-S16 du CLSI (Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth Informational Supplement) avec son
autorisation. Ces informations sont soumises à des mises à jour périodiques. Vérifier la dernière version du M100 disponible auprès du
CLSI (anciennement NCCLS), 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087, États-Unis.
NOTE 2 Pour plus d'informations relatives aux exemples de solvants et de diluants pour la préparation de solutions mères d’agents

antimicrobiaux sélectionnés, consulter la pharmacopée européenne ou la pharmacopée des États-Unis.
a
Pour l'acide acétique glacial, utiliser la moitié d'un volume d'eau, puis ajouter l'acide acétique glacial goutte à goutte jusqu'à ce
qu'il soit dissous, pour ne pas dépasser 2,5 mg/l. L'acide acétique glacial équivaut à une fraction de volume d'acide acétique > 99 %.
b
Pour chaque 1,5 mg de ceftobiprole, ajouter 110 µl d'un mélange 10:1 de sulfoxyde de diméthyle et d'acide acétique glacial. Agiter
au vortex vigoureusement pendant 1 min, puis de manière intermittente pendant 15 min. Diluer à 1,0 ml avec de l'eau distillée.
c
La formulation de colistine utilisée dans les essais de sensibilité antimicrobienne est le sulfate de colistine et non pas la colistine
méthane sulfonate (sulphométhate).
d
Il convient de préparer les solutions mères de départ de dalbavancine à des concentrations ne dépassant pas 1 600 mg/l. Il
convient de diluer les concentrations 100× intermédiaires dans du sulfoxyde de diméthyle. Il convient ensuite de réaliser les dilutions
1:100 finales directement dans un bouillon Mueller-Hinton cation-ajusté (BMHCA
...