ISO 12966-2:2011
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
ISO 12966-2:2011 specifies methods of preparing the methyl esters of fatty acids. It includes methods for preparing fatty acid methyl esters from animal and vegetable fats and oils, fatty acids and soaps. To cover different requirements four methylation methods are specified, namely: a) a "rapid" transmethylation procedure under alkaline conditions; b) a "general" transmethylation/methylation procedure under sequential alkaline and acid conditions; c) a BF3 transmethylation procedure; d) an alternative procedure using acid-catalysed transmethylation of glycerides. Methyl esters so produced are used in various analytical procedures requiring such derivatives, e.g. gas-liquid chromatography (GC), thin-layer chromatography (TLC), and infrared spectrometry (IR).
Corps gras d'origines animale et végétale — Chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras — Partie 2: Préparation des esters méthyliques d'acides gras
L'ISO 12966-2:2011 spécifie des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras. Elle comprend des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras à partir de corps gras d'origines animale et végétale, d'acides gras et de savons. Afin de répondre à différentes exigences, quatre méthodes de méthylation sont spécifiées, à savoir: a) une méthode de transméthylation «rapide» en conditions alcalines; b) une méthode de transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles; c) une méthode de transméthylation au BF3; d) une méthode alternative reposant sur la transméthylation par catalyse acide de glycérides. Les esters méthyliques ainsi obtenus sont utilisés dans diverses méthodes d'analyse exigeant des produits dérivés de ce type, par exemple la chromatographie en phase gazeuse, la chromatographie sur couche mince et la spectrométrie infrarouge.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 12966-2
Первое издание
2011-02-15
Жиры и масла животные и
растительные. Газовая хроматография
метиловых эфиров жирных кислот.
Часть 2.
Получение метиловых эфиров жирных
кислот
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid
methyl asters —
Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 12966-2:2011(R)
©
ISO 2011
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на установку интегрированных шрифтов в компьютере, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe – торговый знак Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все меры
предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами – членами ISO. В
редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просим информировать Центральный секретариат
по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2011
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO по адресу ниже или членов ISO в стране регистрации пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2011– Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
Содержание Страница
Предисловие. iv
Введение . v
1 Область применения . 1
2 Нормативные ссылки . 1
3 Реакции . 1
4 Методология . 2
4.1 Подготовка пробы для анализа . 2
4.2 Экспресс-метод . 2
4.3 Общий метод . 4
4.4 Переметилирование с помощью катализатора трифторида бора (BF ) . 6
3
4.5 Переметилирование глицеридов с кислым катализатором . 9
Приложение А (информативное) Метод тонкослойнойя хроматографии для определения
завершения образования производных . 11
Библиография . 15
© ISO 2011– Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, то
ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами Директив ISO/IEC,
Часть 2.
Основной задачей технических комитетов является подготовка международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения не менее
75% комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. Международная организация по стандартизации не может нести
ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных прав.
ISO 12966-2 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом
SC 11, Животные и растительные жиры и масла.
Настоящее первое издание ISO 12966-2 отменяет и заменяет ISO 5509:2000 после технического
пересмотра.
ISO 12966 состоит из следующих частей под общим заголовком Жиры и масла животные и
растительные. Газовая хроматография метиловых эфиров жирных кислот:
Часть 2. Получение метиловых эфиров жирных кислот
Часть 3. Получение метиловых эфиров с помощью гидроксида триметилсульфония (TMSH)
Следующие части находятся в стадии разработки:
Часть 4. Определение цис-, транс-, насыщенных, моно- и полинасыщенных жирных кислот в
растительных жирах и маслах и в жирах и маслах нежвачных животных
Планируется разработка следующей части:
Часть 1. Руководство по газовой хроматографии
iv © ISO 2011– Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
Введение
Общие положения
В состав жиров и масел (т.е. жидкие и твердые липиды) входят преимущественно сложные эфиры
жирных кислот и глицерина (триацилглицерины, ТАГ = TAG), с небольшим количеством стероидных
эфиров жирных кислот и алифатических спиртов с длинной цепочкой. Ввиду высокой молекулярной
массы ТАГ и, следовательно, их низкой летучести, триацилглицерины сложно анализировать напрямую
методом газовой хроматографии (ГХ), особенно если требуется подробный анализ ненасыщенных
жирных кислот. Сами жирные кислоты плохо разделяются хроматографически (за исключением жирных
кислот с короткой цепочкой, например, масляная (бутановая) кислота и валериановая (пентановая)
кислоты). Поэтому наилучшим способом является получение перед хроматографическим анализом
сложных эфиров жирных кислот, обычно метиловых эфиров (МЭЖК = FAME).
Анализ масел и жиров подробно рассмотрен в ссылке [9].
Получение МЭЖК является критической стадией в анализе жирных кислот. Неколичественное
превращение жирных кислот в МЭЖК, изменение структуры жирных кислот (например, изменения в
присутствующих позиционных и геометрических изомерах) и образование мешающих соединений,
которые не являются МЭЖК, могут повлиять на количественное определение состава жирных кислот.
Межмолекулярная переэтерификация является одним из механизмов, который может быть применен
для образования МЭЖК из сложных эфиров жирных кислот в жирах (т.е. триацилглицерина). Методы
межмолекулярной переэтерификации с щелочным или кислотным катализатором можно использовать
для получения МЭЖК в среде метанола; этот метод можно назвать переметилированием.
Переметилдирование является обратимым процессом, и метанол требуется в большом избытке,
чтобы поддерживать равновесие, смещенное в сторону преимущественного образования МЭЖК.
Присутствие воды может помешать завершению реакции, поэтому необходимо свести это присутствие
к минимуму. Методики с щелочным катализатором не дают МЭЖК из жирных кислот в свободном
состоянии за счет образования мыла.
Этерификация является механизмом, использующим кислотный катализатор, который можно
применять для получения МЭЖК из жирных кислот. Жирные кислоты могут естественным образом
присутствовать в пробе анализируемого жира. Получение МЭЖК с помощью этого механизма обычно
называют метилирование. И здесь избыток метанола и отсутствие воды являются непременным
условием количественного образования МЭЖК.
В настоящей части ISO 12966 представлено руководство по приготовлению метиловых эфиров жирных
кислот. В руководстве установлен ряд методов по приготовлению метиловых эфиров жирных кислот.
Среди них:
a) “быстрый” метод переметилирования в щелочных условиях;
b) “общий” метод переметилирования/метилирования в последовательных щелочных и кислотных
условиях;
c) метод переметилирования/метилирования трифторидом бора (BF ).
3
Метод “быстрого” переметилирования в условиях применения щелочного
катализатора
Этот метод применяется для повседневного анализа пищевых жиров и масел, содержащих жирные
кислоты вниз до масляной кислоты (C4:0), и/или для определения масляной или капроновой (гексановой)
кислоты (C6:0) методом газовой хроматографии с использованием внутреннего стандарта.
© ISO 2011– Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
Щелочные катализаторы переэтерифицируют нейтральные липиды в присутствии безводного
метанола (переметилирование) гораздо быстрее, чем кислотные катализаторы. Недостаток таких
методик с щелочными катализаторами заключается в том, что невозможно этерифицировать
свободные жирные кислоты, а присутствие воды может помешать полному переметилированию
(гидролиз МЭЖК до свободных жирных кислот). Наиболее часто используемыми реактивами являются
гидроксиды калия или натрия и метилат натрия в присутствии безводного метанола.
“Общий” метод переметилирования/метилирования в последовательных щелочных и
кислотных условиях
Этот метод предусматривает последовательное применение щелочных и кислотных катализаторов и
применяется ко всем маслам и жирам, включая дистиллятные и кислые масла, однако, не
рекомендуется для лауриновых масел. Метиловые эфиры жирных кислот с короткой цепочкой легко
теряются в процессе конденсации с обратным холодильником. Для масел на основе лауриновой
кислоты рекомендуется метод “быстрого” переметилирования.
В процессе метилирования вещества, содержащие следующие конфигурации, могут разложиться
полностью или частично:
a) кетонные, эпоксидные, гидроксильные, гидроэпоксидные группы;
b) циклопропильные и циклопропенильные группы;
c) ацетиленовые жирные кислоты.
Переметилирование/метилирование трифторидом бора (BF )
3
Ввиду токсичности BF этот метод рекомендуется использовать только в крайних случаях.
3
Метод, использующий BF , применяется к большинству масел, жиров и их производных (жирные
3
кислоты, мыла), за исключением молочных жиров и жиров, содержащих жирные кислоты со
специфическими группами.
В процессе метилирования вещества, содержащие следующие конфигурации, могут полностью или
частично разложиться:
a) кетонные, эпоксидные, гидроксильные, гидроэпоксидные группы;
b) циклопропильные и циклопропенильные группы;
c) ацетиленовые жирные кислоты.
Если жиры содержат такие вещества в очень незначительных количествах (например, хлопковое
масло), этот метод применять можно, в противном случае рекомендуется применять “быстрый” или
“общий” метод переметилирования/метилирования.
Для ГХ, оптимальное восстановление метиловых эфиров из реакционной смеси получают, применяя
изооктан (2,2,4-триметилпентан). В то же время, только порядка 75 % метилового эфира капроновой
кислоты восстанавливается из присутствующего.
Трифторид бора является сильной кислотой Льюиса (Lewis) в форме комплекса с координационными
связями с метанолом, и в условиях нагревания с обратным холодильником он может быстро
метилировать жирные кислоты. Именно трифторид бора в метаноле переметилирует сложные эфиры
жирных кислот (например, триглицерид), но скорость реакции медленнее, чем метилирование жирных
кислот. Раствор трифторида бора в метаноле имеется в продаже, что повышает привлекательность
этого кислого катализатора, однако имеются потенциальные недостатки, связанные с применением
этого реактива.
vi © ISO 2011– Все права сохраняются
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
a) Сообщается, что при высоких концентрациях трифторида бора (50 % по массе) из ненасыщенных
жирных кислот получаются мешающие метоксильные соединения.
b) Реактив ограничен сроком годности при температуре окружающей среды и его следует хранить в
холодильнике.
c) Старый реактив может давать мешающие соединения и поэтому рекомендуется, испытывать
каждую новую закупленную партию перед применением и периодически во время его срока
службы.
d) Раствор трифторид бора в метаноле является кислым реактивом и поэтому может давать
производные жирных кислот, содержащих подвижные группы, которые могут способствовать
появлению паразитных пиков на хроматограммах МЭЖК.
Дополнительная информация
Много внимания уделяется получению и анализу сложных эфиров жирных кислот с короткой цепочкой
методом газовой хроматографии, главным образом, ввиду их присутствия в молочных жирах. Жирные
кислоты с короткой цепочкой в свободном состоянии или этерифицированные глицерином можно
преобразовать в метиловые эфиры полностью любым из реактивов, описанных в предшествующих
абзацах, но количественного восстановления из реакционной среды можно не достичь, если не
принять специальных мер предосторожности. Потери могут произойти на нескольких этапах любой
методики. Сложные эфиры жирных кислот с короткой цепочкой (особенно метиловые) летучи и могут
быть потеряны избирательно при нагревании этерификационной среды с обратным холодильником,
они лучше растворимы в воде, чем сложные эфиры с длинной цепочкой и могут быть потеряны на
этапе водной экстракции или могут выкипеть при перегонке вместе с экстрагирующим растворителем.
Избирательные потери могут также произойти, если необходимо удалить неомыляемые примеси
посредством сублимации или очистки с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ = TLC).
Наилучшими методами этерификации для жирных кислот с короткой цепочкой являются методы, в
которых исключены нагревание реактивов и этапы, включающие водную экстракцию и удаление
растворителя.
Контроль реакционных сред, содержащих основные и кислотные катализаторы этерификации
непосредственно на колонках ГХ, сокращает их срок годности. Верхние несколько сантиметров
набивных колонок можно периодически пополнять, тогда как отрезки деактивированной трубки или
“предколонки” перед капиллярными колонками защищают их. Это небольшая плата за скорость,
простоту и точность таких методов.
Кроме того, в данной части ISO 12966 приводится простой метод ТСХ для проверки эффективности
переметилирования/метилирования. Этот метод можно также использовать для проверки родового
состава масла или жира до осуществления переметилирования/метилирования.
© ISO 2011– Все права сохраняются vii
---------------------- Page: 7 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 12966-2:2011(R)
Жиры и масла животные и растительные. Газовая
хроматография метиловых эфиров жирных кислот.
Часть 2.
Получение метиловых эфиров жирных кислот
1 Область применения
Настоящая часть ISO 12966 устанавливает методы получения метиловых эфиров жирных кислот.
Сюда входят методы получения метиловых эфиров жирных кислот из растительных и животных жиров
и масел, жирных кислот и мыла. Чтобы охватить различные требования, установлено четыре метода
метилирования, а именно:
а) “быстрый” метод (экспресс-метод) переметилирования в щелочных условиях;
b) “общий” метод переметилирования/метилирования в последовательных щелочных и кислотных
условиях;
c) метод переметилирования/метилированиятрифторидом бора (BF );
3
d) альтернативный метод с использованием переметилирования глицеридов с кислотным
катализатором.
Метиловые эфиры, полученные таким образом, используются в различных методах анализа, в которых
требуются такие производные, например, газо-жидкостная хроматография (ГЖХ = GLC), тонкослойная
хроматография (ТСХ = TLC), и инфракрасная спектрометрия (ИК-спектрометрия = IR).
2 Нормативные ссылки
Следующие документы являются обязательными при использовании данного стандарта. Для
датированных документов, допускаются к использованию только указанное издание. Для
недатированных документов — последнее издание указанного документа (включая любые поправки).
ISO 661, Жиры и масла растительные и животные. Подготовка пробы для анализа
3 Реакции
Определение состава жирных кислот в маслах и жирах является одним из фундаментальных анализов
в области жиров и масел и подробно рассматривается в Ссылке [9]. С этой целью жирные кислоты в
составе липидов обычно преобразуют в метиловые эфиры с последующим анализом методом ГХ.
“Быстрый” метод (4.2) не дает производных свободных жирных кислот (СЖК = СЖК), содержащихся в
масле, в виде метиловых эфиров (МЭЖК). Если присутствуют свободные жирные кислоты, обычно
принимают, что они имеют такое же распределение жирных кислот, как триглицериды. Обычно это
справедливо для сырых (неочищенных) масел, и в меньшей степени для фракционированных или
рафинированных масел. За исключением некоторых масел, полученных прессованием на холоде
© ISO 2011– Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
(холодный отжим), как правило, масла с массовой долей свободных жирных кислот <0,5 % вероятно
являются рафинированными; масла, указанные выше, можно считать сырыми. Допустимая
концентрация СЖК в масле зависит от конкретного анализируемого масла а также от предполагаемого
использования полученных данных МЭЖК. Присутствие СЖК в масле может стать причиной
появления дополнительных пиков на конечной хроматограмме и сделать проблематичной
идентификацию синтезированных МЭЖК методом “быстрого” переметилирования.
“Общий”метод (4.3) дает производные как СЖК, так и сложных эфиров глицерина в МЭЖК (см. 4.3.1).
Аналитик , исходя из свойств анализируемого масла, самостоятельно решает, какой метод, “быстрый”
или “общий” лучше подходит. Несмотря на это, как правило, применение “быстрого” метода
рекомендуется только, если содержание СЖК ≤ 0,5 % по массе. “Общий” метод (4.3) предлагается
использовать для масел с содержанием СЖК >0,5 % по массе. В другом варианте, если необходимо
преобразовать частично гидролизованный жир в МЭЖК, можно использовать метод
переметилирования с кислотным катализатором, установленный в 4.5.
Ввиду токсичности BF , рекомендуется использовать метод с применением BF (4.4) только в крайнем
3 3
случае.
4 Методология
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Установленный метод включает применение потенциально опасных
реактивов. Необходимо предпринять обычные меры предосторожности для защиты глаз и
защиты от опасности получения химических ожогов. Раствор гидроксида калия в метаноле
является ядовитым.
4.1 Подготовка пробы для анализа
Проба для анализа должна быть жидкой, сухой и чистой. Поступают в соответствии с ISO 661, но
нагревают пробу до температуры, слегка превышающей температуру плавления.
4.2 Экспресс-метод
4.2.1 Применимость
Данный экспресс-метод переметилирования, в условиях щелочного катализатора, применяется как
повседневный анализ к пищевым жирам и маслам, содержащим жирные кислоты до масляной кислоты
(C4:0) и/или для определения масляной или капроновой кислоты (C6:0) методом газовой
хроматографии с использованием внутреннего стандарта.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Данным методом невозможно преобразовать СЖК в МЭЖК. Аналитику следует отметить, что
присутствие свободных жирных кислот в конечном растворе влияет на качество последующей газовой
хролматографии.
[8]
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Согласно документу COI/T.20/Doc. No. 24:2001 , аналогичный метод можно применять
непосредственно к пробам следующих категорий масел:
a) оливковое масло первого прессования, кислотность менее 3,3 %;
b) рафинированное оливковое масло;
c) оливковое масло (смесь оливкового масла первого прессования с рафинированным);
d) рафинированное оливковое из жмыхов;
e) оливковое из жмыхов (смесь оливкового масла первого прессования с рафинированным оливковым маслом
из жмыхов).
4.2.2 Сущность метода
Метиловые эфиры образуются при переметилировании с раствором гидроксида калия в метаноле.
Свободные жирные кислоты данным методом не этерифицируются.
2 © ISO 2011– Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
4.2.3 Реактивы
Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний.
Реактивы не должны давать пиков, которые мешают определить метиловые эфиры жирных кислот в
процессе ГХ. Всякую новую партию реактива или растворителя следует проверить, используя его для
приготовления метилового эфира чистой олеиновой кислоты. Если появляются дополнительные,
неожиданные пики при итоговом газохроматографическом анализе, то реактив следует забраковать.
4.2.3.1 Метанол, содержащий не более, чем 0,5 % воды по массе.
[3]
4.2.3.2 Вода, соответствующая ISO 3696 , класс 3.
4.2.3.3 Гидросульфат натрия, безводный.
4.2.3.4 Изооктан (2,2,4-триметилпентан), для хроматографического анализа.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Изооктан является легко-воспламеняемым и представляет опасность
возникновения пожара. Предельная взрывоопасная объемная концентрация в воздухе
составляет от 1,1 % до 6,0 %. Он токсичен для вдыхания и проглатывания. Необходимо
пользоваться хорошо вентилируемым вытяжным шкафом при работе с этим растворителем.
4.2.3.5 Гидроксид калия, раствор в метаноле, концентрация c ≈ 2 моль/л.
Растворяют при незначительном нагревании 13,1 г гидроксида калия (массовая доля w = 85 г/100 г) в
100 мл абсолютного метанола.
4.2.3.6 Исходный раствор внутреннего стандарта, Только для определения масляной и/или
капроновой кислоты.
Взвешивают 250 мг (с точностью 0,1 мг) метиловый эфир валериановой кислоты (метилпентаноат) и
помещают в мерную колбу с одной меткой 50 мл (4.2.4.4). Для растворения пробы используют
изооктан и доводят до метки тем же растворителем.
4.2.3.7 Контрольный раствор внутреннего стандарта, только для определения масляной и/или
капроновой кислоты.
Добавляют (4.2.4.2) 10 мл исходного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл (4.2.4.4) и
доводят до метки изооктаном. Рассчитывают концентрацию полученного раствора.
4.2.3.8 Раствор хлорида натрия. Растворяют 40 г хлорида натрия в 100 мл воды.
4.2.4 Аппаратура
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
4.2.4.1 Пробирки с завинчивающейся крышкой, 10 мл, с крышкой, оснащенной ПТФЭ-соединением.
[6]
4.2.4.2 Пипетки, вместимостью 0,1 мл, 2 мл и 10 мл, ISO 8655-2 .
4.2.4.3 Стеклянные пробирки для проб, 3 мл.
[2]
4.2.4.4 Мерные колбы с одной меткой, вместимостью 50 мл и 100 мл, ISO 1042 класс A.
4.2.5 Проведение испытания
В пробирку с завинчивающейся крышкой вместимостью 10 мл (4.2.4.1), берут навеску приблизительно
0,1 г пробы (4.1). Если жирные кислоты требуется определить количественно методом ГХ, используя
внутренний стандарт(ы), важно точно взвесить пробу для анализа; т.е. с точностью до 0,1 мг. Затем
результаты выражают в процентах по массе жирных кислот в жире или масле. Эти результаты не
обязательно согласуются с результатами, полученными с помощью внутренней нормализацией.
© ISO 2011– Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
Добавляют пипеткой (4.2.4.2) 2 мл изооктана (4.2.3.4), и встряхивают. В определенных примерах
невозможно использовать установленную массу пробы 0,1 г, в таких случаях объем добавляемого в
пробу изооктана следует пропорционально изменить.
Для определения масляной и/или капроновой кислоты, пипеткой (4.2.4.2) добавляют 2 мл стандартного
раствора (4.2.3.7) вместо изооктана. В определенных примерах может потребоваться
проанализировать жиры и масла, которые содержат небольшие количества жирных кислот. В этом
примере объем контрольного раствора, добавленного в пробу, может быть пропорционально уменьшен.
Пипеткой (4.2.4.2) добавляют 0,1 мл раствора гидрокисда калия в метаноле концентрацией 2 моль/л
(4.2.3.5), сразу же закрывают крышкой с ПТФЭ-соединением, закручивают крышку и энергично
встряхивают в течение 1 мин. Раствор становится прозрачным, а затем быстро мутнеет по мере
отделения глицерина. Дают отстояться приблизительно в течение 2 мин. Добавляют приблизительно
2 мл раствора хлорида натрия и коротко встряхивают. Извлекают изооктановый слой и переносят в
пробирку с пробой (4.2.4.3). Добавляют приблизительно 1 г гидросульфата натрия (4.2.3.3) и
встряхивают раствор.
Раствор изооктана подходит для анализа с помощью газовой хроматографии в соответствии с
ISO 12966-4.
ПРИМЕЧАНИЕ Эффективность получения производных с помощью экспресс-метода можно определить
методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в соответствии с Приложением A.
4.3 Общий метод
4.3.1 Применимость
Этот общий метод переметилирования/метилирования, проводимый в условиях последовательного
щелочного и кислотного катализа, применяется ко всем маслам и жирам, включая дистиллятные и
кислые масла, но не рекомендуется для лауриновых масел. Метиловые эфиры жирных кислот с
короткой цепочкой легко уходят в потери при нагревании с обратным холодильником. Для лауриновых
масел рекомендуется метод, установленный в 4.2.
В процессе метилирования вещества, содержащие следующие структурные группы, могут полностью
или частично разлагаться:
a) кетонные, эпоксидные, гидроксильные, гидроэпоксидные группы;
b) циклопропильные и циклопропенильные группы;
c) ацетиленовые жирные кислоты.
[8]
ПРИМЕЧАНИЕ Согласно документу COI/T.20/Doc. No. 24:2001 , данный метод можно применять
непосредственно к пробам следующих категорий масел:
a) оливковое масло первого прессования, кислотность выше 3,3 %;
b) неочищенное оливковое масло из жмыхов.
4.3.2 Сущность метода
Щелочной реактив вызывает переметилирование глицериновых эфиров в метиловые эфиры жирных
кислот; свободные жирные кислоты превращаются в мыла. Кислый катализатор преобразует мыла в
метиловые эфиры жирных кислот.
ВНИМАНИЕ! — Метилирование необходимо проводить в вытяжном шкафу.
4.3.3 Реактивы
Используют реактивы только признанной аналитической чистоты. Эти реактивы не должны давать
пиков, которые мешают определить пики метиловых эфиров жирных кислот в процессе
газохроматографического анализа. Всякую новую партию реактива или растворителя следует
4 © ISO 2011– Все права сохраняются
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
проверить, используя его для приготовления метилового эфира чистой олеиновой кислоты. Если
появляются дополнительные, неожиданные пики при итоговом газохроматографическом анализе, то
реактив следует забраковать.
4.3.3.1 Изооктан (2,2,4-триметилпентан), для хроматографического анализа.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Изооктан является легко-воспламеняемым и представляет опасность
возникновения пожара. Предельная взрывоопасная объемная концентрация в воздухе
составляет от 1,1 % до 6,0 %. Он токсичен для вдыхания и проглатывания. Необходимо
пользоваться хорошо вентилируемым вытяжным шкафом при работе с этим растворителем.
4.3.3.2 Метанол, содержащий не более 0,05 % по массе воды.
4.3.3.3 Метилат натрия, раствор в метаноле, 0,2 моль/л.
Растворяют 8 г гидроксида натрия в 1 000 мл метанола. Реактив можно приготовить из имеющихся а
продаже растворов.
4.3.3.4 Фенолфталеин, раствор в метаноле, 0,2 % по массе.
4.3.3.5 Серная кислота, раствор в метаноле, 1 моль/л.
Добавляют 3 мл 96 %-ной серной кислоты в 100 мл метанола.
4.3.3.6 Раствор хлорида натрия.
Растворяют 40 г хлорида натрия в 100 мл воды.
[3]
4.3.3.7 Вода, соответствующая ISO 3696 , класс 3.
4.3.4 Аппаратура и материалы
Обычное лабораторное оборудование, и, в частности, следующее.
4.3.4.1 Мерные колбы с одной меткой, вместимостью 10 мл с длинным узкой горловиной на
[2]
шлифе и с притертой пробкой, по ISO 1042 класс A.
[4]
4.3.4.2 Обратный холодильник, по ISO 4799 , с соединением на шлифе, подходящим к
горловине колбы.
4.3.4.3 Кипелки, обезжиренные.
4.3.4.4 Стеклянная воронка.
[6]
4.3.4.5 Пипетки, вместимостью 0,2 мл, 1 мл, и 4 мл, по ISO 8655-2 .
4.3.5 Проведение испытания
Переносят примерно 50 мг пробы (4.1) в мерную колбу одной меткой и горловиной на шлифе
вместимостью 10 мл (4.3.4.1).
С помощью воронки (4.3.4.4), добавляют в нее 2 мл раствора метилата натрия в метаноле
концентрацией 0,2 моль/л (4.3.3.3) и кипелки (4.3.4.3).
Присоединяют обратный холодильник (4.3.4.2), встряхивают, и доводят до кипения. Кипятят смесь с
обратным холодильником, пока раствор не станет прозрачным. Для большинства масел это
происходит примерно через 5 мин, Но для более тяжелых масел и насыщенных масел с длинной
цепочкой этот процесс может занять до 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Эфиры стерола также омыляются.
© ISO 2011– Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 12966-2:2011(R)
Убирают колбу от источника нагревания, выдерживают, по
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 12966-2
First edition
2011-02-15
Animal and vegetable fats and oils — Gas
chromatography of fatty acid methyl
esters —
Part 2:
Preparation of methyl esters of fatty acids
Corps gras d'origines animale et végétale — Chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras —
Partie 2: Préparation des esters méthyliques d'acides gras
Reference number
ISO 12966-2:2011(E)
©
ISO 2011
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2011
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction.v
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Reactions .1
4 Methodology .2
4.1 Preparation of test sample .2
4.2 Rapid method.2
4.3 General method .4
4.4 Transmethylation using boron trifluoride (BF ) catalyst .6
3
4.5 Acid-catalysed transmethylation of glycerides.9
Annex A (informative) Thin-layer chromatography method for testing the completeness of
derivatization .11
Bibliography.15
© ISO 2011 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 12966-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
This first edition of ISO 12966-2 cancels and replaces ISO 5509:2000, of which it constitutes a technical
revision.
ISO 12966 consists of the following parts, under the general title Animal and vegetable fats and oils — Gas
chromatography of fatty acid methyl esters:
⎯ Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
⎯ Part 3: Preparation of methyl esters using trimethylsulfonium hydroxide (TMSH)
The following part is under preparation:
⎯ Part 4: Determination of cis-, trans-, saturated, mono- and polyunsaturated fatty acids in vegetable or
non-ruminant oils and fats
The following part is planned:
⎯ Part 1: Guidelines on gas chromatography
iv © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
Introduction
General
Oils and fats (i.e. liquid and solid lipids) are predominantly composed of fatty acid esters of glycerol
(triacylglycerols, TAGs), with smaller amounts of fatty acid esters of sterols and long chain aliphatic alcohols.
Due to the high molecular mass of the TAGs and their consequent low volatility, they are difficult to analyse
directly by gas chromatography (GC), especially if a detailed analysis of unsaturated fatty acids is required.
Fatty acids themselves do not chromatograph well (except for short-chain-length fatty acids, e.g. butanoic and
pentanoic acids). It is therefore better practice to form fatty acid esters, usually the fatty acid methyl esters
(FAMEs), prior to GC.
The analysis of oils and fats has been extensively reviewed in Reference [9].
The formation of FAMEs is a critical stage in the analysis of fatty acids. Non-quantitative conversion of fatty
acids to FAMEs, modification of the structure of fatty acids (e.g. changes in positional and geometric isomers
present) and formation of non-FAME artefacts may all affect the quantitative determination of fatty acid
composition.
Transesterification is one mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acid esters in fats (i.e.
triacylglycerol). Alkali- or acid-catalysed transesterification procedures can be used to form FAMEs in a
methanolic medium; the procedure can be termed transmethylation. Transmethylation is a reversible process
and a large excess of methanol is required to maintain an equilibrium position which favours formation of the
FAMEs. Water can prevent the reaction going to completion, and its presence should therefore be minimized.
Alkali-catalysed procedures do not produce FAMEs from free fatty acids, due to the formation of soaps.
Esterification is an acid-catalysed mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acids. It is
possible that the fatty acids are naturally present in the sample of fat under examination. Formation of FAMEs
by this mechanism is commonly termed methylation. Again, an excess of methanol and the absence of water
are preconditions for the quantitative formation of FAMEs.
This part of ISO 12966 provides guidelines for the preparation of fatty acid methyl esters. In support of these
guidelines, various procedures to prepare fatty acid methyl esters are specified. These include:
a) “rapid” transmethylation under alkaline conditions;
b) “general” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions;
c) boron trifluoride (BF ) transmethylation/methylation.
3
“Rapid” transmethylation method under alkali-catalysed conditions
This method is applicable to the routine analysis of edible fats and oils containing fatty acids down to butanoic
acid (C4:0) and/or for the determination of butanoic acid or hexanoic acid (C6:0) by GC using an internal
standard.
Alkaline catalysts transesterify neutral lipids in the presence of anhydrous methanol (transmethylation) more
rapidly than acid catalysts. The disadvantages of such alkali-catalysed procedures are that free fatty acids are
not esterified, and the presence of water may prevent the transmethylation going to completion (hydrolysis of
the FAMEs to free fatty acids). The most commonly used reagents are potassium and sodium hydroxide and
sodium methoxide in the presence of anhydrous methanol.
© ISO 2011 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
“General” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions
This method under sequential alkali- and acid-catalysed conditions is applicable to all oils and fats including
distillate and acid oils, but is not recommended for lauric oils. Short-chain fatty acid methyl esters are easily
lost during reflux. For lauric acid oils, the “rapid” transmethylation method is recommended.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially decomposed:
a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
c) acetylenic fatty acids.
Boron trifluoride (BF ) transmethylation/methylation
3
Owing to the toxicity of BF it is recommended that this method only be used in extremis.
3
The BF method is applicable for most oils, fats and derivatives (fatty acids, soaps) with the exception of milk
3
fats and fats containing fatty acids with specific groups.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially decomposed:
a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
c) acetylenic fatty acids.
If the fatty matter contains such substances in only very small amounts (e.g. cottonseed oil), the method can
be applied, otherwise the “rapid” or “general” transmethylation/methylation methods should be followed.
For GC, the optimum recovery of the methyl esters from the reaction mixture is obtained by using isooctane
(2,2,4-trimethylpentane). However, only about 75 % of the methyl caproate present is recovered.
Boron trifluoride is a strong Lewis acid, and in the form of its coordination complex with methanol, under reflux
conditions, it can rapidly methylate fatty acids. Methanolic boron trifluoride does transmethylate fatty acid
esters (e.g. triglyceride), but the rate of reaction is slower than the methylation of fatty acids. Methanolic boron
trifluoride solution is commercially available, which enhances the attractiveness of this acid catalyst, but there
are potential disadvantages associated with the use of this reagent.
a) It has been reported that high concentrations of boron trifluoride (50 % mass fraction) produce methoxy
artefacts from unsaturated fatty acids.
b) The reagent has a limited shelf-life at ambient temperature and should be kept refrigerated.
c) Aged reagent may produce artefacts and therefore it is recommended that each new batch purchased be
tested before use and periodically during its lifetime.
d) Methanolic boron trifluoride is an acidic reagent and therefore may produce derivatives of fatty acids
containing labile groups which may give rise to spurious peaks on FAME chromatograms.
vi © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
Additional information
Much attention has been given to the preparation and analysis of esters of short-chain fatty acids by GC,
largely because of their occurrence in milk fats. Short-chain fatty acids, in the free state or esterified to
glycerol, can be converted completely to methyl esters by any of the reagents described in the preceding
paragraphs, but quantitative recovery from the reaction medium may not be achieved unless special
precautions are taken. Losses can occur at several stages in any procedure. Short-chain fatty acid esters
(methyl especially) are volatile and may be lost selectively on refluxing the esterification medium, they are
more soluble in water than longer-chain esters and can be lost in an aqueous extraction step or they may be
distilled off when the extracting solvent is evaporated. Selective losses can also occur if non-saponifiable
impurities have to be removed by sublimation or thin-layer chromatography (TLC) purification. The best
esterification procedures for short-chain fatty acids are those in which heating of the reagents is avoided and
in which stages involving aqueous extraction and solvent removal are absent.
Injection of reaction media containing basic and acidic esterification catalysts directly on to GC columns
shortens their working lives. The top few centimetres of packed columns can be replenished periodically, while
lengths of deactivated tubing or “retention gaps” ahead of capillary columns protect them. This can be a small
price to pay for the speed, simplicity, and accuracy of these procedures.
Additionally, this part of ISO 12966 gives a simple TLC procedure to check the effectiveness of the
transmethylation/methylation. This procedure may also be used to check the generic composition of an oil or
fat before transmethylation/methylation is undertaken.
© ISO 2011 – All rights reserved vii
---------------------- Page: 7 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 12966-2:2011(E)
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of
fatty acid methyl esters —
Part 2:
Preparation of methyl esters of fatty acids
1 Scope
This part of ISO 12966 specifies methods of preparing the methyl esters of fatty acids.
It includes methods for preparing fatty acid methyl esters from animal and vegetable fats and oils, fatty acids
and soaps. To cover different requirements four methylation methods are specified, namely:
a) a “rapid” transmethylation procedure under alkaline conditions;
b) a “general” transmethylation/methylation procedure under sequential alkaline and acid conditions;
c) a BF transmethylation procedure;
3
d) an alternative procedure using acid-catalysed transmethylation of glycerides.
Methyl esters so produced are used in various analytical procedures requiring such derivatives, e.g. gas-liquid
chromatography (GLC), thin-layer chromatography (TLC), and infrared spectrometry (IR).
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Reactions
The determination of the fatty acid composition of oils and fats is one of the fundamental analyses within the
fats and oils sector and has been extensively reviewed in Reference [9]. For this purpose, the fatty acid
components of lipids are usually converted to methyl esters followed by GC analysis.
The “rapid” method (4.2) does not derivatize free fatty acids (FFAs) present in oil to fatty acid methyl esters
(FAMEs). If FFAs are present, the assumption is usually made that the FFAs have the same fatty acid
distribution as the triglycerides. This is usually true for crude oils, but less so for fractionated or refined oils.
Except for some cold-pressed oils, as a general rule oils with <0,5 % mass fraction FFAs have probably been
refined; oils above can be assumed to be crude. The tolerable concentration of FFAs in oil depends on the
particular oil being analysed and also the intended use of the FAME data generated. The presence of FFAs in
© ISO 2011 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
oil might introduce additional peaks on the final gas chromatogram and make the identification of FAMEs
synthesized using the “rapid” transmethylation procedure problematic.
The “general” (4.3) procedure derivatizes both FFAs and glyceryl esters to FAMEs (see 4.3.1).
It is up to the analyst to decide whether the use of either the “rapid” or “general” procedure is appropriate
based on the nature of the oil being analysed. This notwithstanding, as a general rule, use of the “rapid”
method is suggested only if the FFA content is u0,5 % mass fraction. The “general” method (4.3) is suggested
for oils with an FFA content >0,5 % mass fraction. Alternatively, if a partially hydrolysed fat is to be converted
to FAMEs, the acid-catalysed transmethylation procedure specified in 4.5 may be used.
Owing to the toxicity of BF , it is recommended that the BF method (4.4) be used only in extremis.
3 3
4 Methodology
WARNING — The method specified involves the use of potentially hazardous reagents. Normal
precautions shall be taken for eye protection and for protection from the dangers of corrosive
chemical burns. Methanolic potassium hydroxide solution is poisonous.
4.1 Preparation of test sample
The test sample shall be liquid, dry, and clear. Proceed in accordance with ISO 661, but heat the sample to
just above the melting point.
4.2 Rapid method
4.2.1 Applicability
This rapid transmethylation method, under alkali-catalysed conditions, is applicable to the routine analysis of
edible fats and oils containing fatty acids down to butanoic acid (C4:0) and/or for the determination of butanoic
acid or hexanoic acid (C6:0) by GC using an internal standard.
NOTE 1 This procedure does not derivatize FFAs to FAMEs. The analyst should note that the presence of FFAs in the
final solution can affect the quality of subsequent gas chromatography.
[8]
NOTE 2 According to COI/T.20/Doc. No. 24:2001 , a similar procedure can be applied directly to samples of the
following oil categories:
a) virgin olive oil with an acidity less than 3,3 %;
b) refined olive oil;
c) olive oil (blend of virgin and refined olive oil);
d) refined olive-pomace oil;
e) olive-pomace oil (blend of virgin olive oil and refined olive-pomace oil).
4.2.2 Principle
Methyl esters are formed by transmethylation with methanolic potassium hydroxide. Free fatty acids are not
esterified by this procedure.
4.2.3 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
2 © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
The reagents shall not produce peaks which interfere with those of the fatty acid methyl esters during GC. Any
new batch of reagent or solvent should be checked by using it to prepare the methyl ester of pure oleic acid. If
any extra, unexpected, peaks appear during the final GC analysis the reagent should be rejected.
4.2.3.1 Methanol, containing not more than 0,5 % mass fraction water.
[3]
4.2.3.2 Water, complying with ISO 3696 , grade 3.
4.2.3.3 Sodium hydrogensulfate, anhydrous.
4.2.3.4 Isooctane (2,2,4-trimethylpentane), chromatographic quality.
WARNING — Isooctane is flammable and a fire risk. Explosive volume fraction limits in air are 1,1 % to
6,0 %. It is toxic by ingestion and inhalation. Use a properly operating ventilated hood when working
with this solvent.
4.2.3.5 Potassium hydroxide, methanolic solution, amount of substance concentration c ≈ 2 mol/l.
Dissolve, with gentle heating, 13,1 g of potassium hydroxide (mass fraction w = 85 g/100 g) in 100 ml of
absolute methanol.
4.2.3.6 Internal standard stock solution, for butanoic and/or hexanoic acid determination only.
Weigh 250 mg (to the nearest 0,1 mg) of valeric acid methyl ester (methyl pentanoate) into a 50 ml one-mark
volumetric flask (4.2.4.4). Use isooctane to dissolve the sample and make up to the mark with the same
solvent.
4.2.3.7 Internal standard reference solution, for butanoic and/or hexanoic acid determination only.
Add (4.2.4.2) 10 ml of stock solution to a 100 ml volumetric flask (4.2.4.4) and make up to the mark with
isooctane. Calculate the concentration of this reference solution.
4.2.3.8 Sodium chloride solution. Dissolve 40 g of sodium chloride in 100 ml of water.
4.2.4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
4.2.4.1 Screw-top test tubes, 10 ml, with cap fitted with a PTFE-joint.
[6]
4.2.4.2 Pipettes, capacities 0,1 ml, 2 ml and 10 ml, ISO 8655-2 .
4.2.4.3 Glass sample vials, 3 ml.
[2]
4.2.4.4 One-mark volumetric flasks, capacities 50 ml and 100 ml, ISO 1042 class A.
4.2.5 Procedure
In a 10 ml screw-top test tube (4.2.4.1), weigh approximately 0,1 g of the test sample (4.1). If fatty acids are to
be determined quantitatively by GC using internal standard(s), it is essential to weigh the test portion
accurately; i.e. to the nearest 0,1 mg. The results are then expressed as percentage mass fractions of the
fatty acid in the fat or oil. These results do not necessarily agree with results obtained by internal
normalization.
Add (4.2.4.2) 2 ml of isooctane (4.2.3.4), and shake. In certain instances, it may not be possible to use the
specified 0,1 g sample size, in which case the amount of isooctane added to the test portion should be
changed proportionately.
© ISO 2011 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
For butanoic and/or hexanoic acid determination, pipette (4.2.4.2) 2 ml of reference solution (4.2.3.7) instead
of isooctane. In certain instances, it may be necessary to analyse fats and oils that contain low amounts of
these fatty acids. In this instance, the volume of reference solution added to the test sample may be reduced
proportionately.
Add (4.2.4.2) 0,1 ml of 2 mol/l methanolic potassium hydroxide solution (4.2.3.5), immediately put on the cap
fitted with a PTFE-joint, tighten the cap, and shake vigorously for 1 min. The solution becomes clear and then
shortly afterwards becomes cloudy again as glycerol separates. Allow to stand for approximately 2 min. Add
approximately 2 ml of sodium chloride solution and shake briefly. Draw off the isooctane layer and transfer to
a sample vial (4.2.4.3). Add approximately 1 g of sodium hydrogensulfate (4.2.3.3) and shake the solution.
The isooctane solution is suitable for analysis using GC in accordance with ISO 12966-4.
NOTE The effectiveness of derivatization using the “rapid” procedure can be determined by TLC as described in
Annex A.
4.3 General method
4.3.1 Applicability
This general transmethylation/methylation method, under sequential alkali- and acid-catalysed conditions, is
applicable to all oils and fats including distillate and acid oils, but not recommended for lauric oils. Short-chain
fatty acid methyl esters are easily lost during reflux. For lauric oils, the method specified in 4.2 is
recommended.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially decomposed:
a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
c) acetylenic fatty acids.
[8]
NOTE According to COI/T.20/Doc. No. 24:2001 , this method can be applied directly to samples of the following oil
categories:
a) virgin olive oil with an acidity greater than 3,3 %;
b) crude olive-pomace oil.
4.3.2 Principle
The alkaline reagent causes transmethylation of glyceryl esters to fatty acid methyl esters; free fatty acids are
converted to soaps. The acid catalyst converts the soaps to fatty acid methyl esters.
CAUTION — Methylation shall be done under a ventilated hood.
4.3.3 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade. The reagents shall not produce peaks which interfere with
those of the fatty acid methyl esters during GC. Any new batch of reagent or solvent should be checked by
using it to prepare the methyl esters of pure oleic acid. If any extra, unexpected, peaks appear during the final
GC analysis the reagent should be rejected.
4.3.3.1 Isooctane (2,2,4-trimethylpentane), chromatographic quality.
WARNING — Isooctane is flammable and a fire risk. Explosive volume fraction limits in air are 1,1 % to
6,0 %. It is toxic by ingestion and inhalation. Use a properly operating ventilated hood when working
with this solvent.
4 © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
4.3.3.2 Methanol, containing not more than 0,05 % mass fraction water.
4.3.3.3 Sodium methoxide, methanolic solution, 0,2 mol/l.
Dissolve 8 g of sodium hydroxide in 1 000 ml of methanol. This may be prepared from commercial solutions.
4.3.3.4 Phenolphthalein, methanolic solution, 0,2 % mass fraction.
4.3.3.5 Sulfuric acid, methanolic solution, 1 mol/l.
Add 3 ml of 96 % sulfuric acid to 100 ml of methanol.
4.3.3.6 Sodium chloride solution.
Dissolve 40 g of sodium chloride in 100 ml of water.
[3]
4.3.3.7 Water, complying with ISO 3696 , grade 3.
4.3.4 Apparatus and materials
Usual laboratory equipment, and in particular, the following.
4.3.4.1 One-mark volumetric flasks, capacity 10 ml with long, narrow, ground neck with a ground-glass
[2]
stopper, ISO 1042 class A.
[4]
4.3.4.2 Reflux condenser, ISO 4799 , with ground-glass joint to fit the neck of the flask.
4.3.4.3 Boiling chips, fat free.
4.3.4.4 Glass funnel.
[6]
4.3.4.5 Pipettes, capacities 0,2 ml, 1 ml, and 4 ml, ISO 8655-2 .
4.3.5 Procedure
Transfer about 50 mg of the test sample (4.1) into a 10 ml ground-glass necked one-mark volumetric flask
(4.3.4.1).
With the aid of a funnel (4.3.4.4), add 2 ml of 0,2 mol/l sodium methoxide in methanol (4.3.3.3) and the boiling
chips (4.3.4.3).
Fit a reflux condenser (4.3.4.2), shake, and bring to the boil. Reflux the mixture until the solution becomes
clear. For most oils this takes about 5 min, but for harder or long-chain saturated oils, it can take as long as
20 min.
NOTE 1 Sterol esters are also saponified.
Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two
drops of phenolphthalein solution (4.3.3.4). Add sufficient 1 mol/l sulfuric acid in methanol solution (4.3.3.5)
until the solution becomes colourless and then add (4.3.4.5) 0,2 ml in excess.
Fit the condenser and boil again for 5 min. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running
water. Remove the condenser, add (4.3.4.5) 4 ml of sodium chloride solution (4.3.3.6), and shake.
NOTE 2 Long reflux times under acidic conditions can exacerbate losses of dodecanoic acid.
© ISO 2011 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 12966-2:2011(E)
Add (4.3.4.5) 1 ml of isooctane, plug the flask, and shake vigorously for 15 s. Leave to settle until the two
phases have separated. Add sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of
the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck.
The upper isooctane layer is suitable for analysis using GC according to ISO 12966-4.
NOTE 3 The effectiveness of derivatization using the “general” procedure can be determined by TLC as described in
Annex A.
4.4 Transmethylation using boron trifluoride (BF ) catalyst
3
WARNING — The method described involves the use of potentially hazardous reagents. Normal
precautions shall be taken for eye protection and for protection from the dangers of corrosive
chemical burns.
IMPORTANT — Boron trifluoride is poisonous. For this reason, it is not recommended that the analyst
prepare the methanolic solution of boron trifluoride from methanol and boron trifluoride.
4.4.1 Principle
In the first, alkali-catalysed, step, the TAGs are transmethylated with methanolic sodium hydroxide to form
FAMEs. Any FFAs present are converted to soaps. In the second, acid-catalysed, step, the soaps are
converted into methyl esters by reaction with a boron trifluoride-methanol complex.
Consequently, for analysis of pure fatty acids and soaps, the first, alkali-catalysed, step is unnecessary and
FAMEs can be prepared directly by reaction with boron trifluoride.
4.4.2 Applicability
This method is applicable for most oils, fats and derivatives (fatty acids, soaps) with the exception of milk fats
and of fats containing fatty acids with specific groups.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially decomposed:
a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
c) acetylenic fatty acids.
If the fatty matter contains such substances in only very small amounts (e.g. cottonsee
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 12966-2
Première édition
2011-02-15
Corps gras d'origines animale
et végétale — Chromatographie en phase
gazeuse des esters méthyliques d'acides
gras —
Partie 2:
Préparation des esters méthyliques
d'acides gras
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid
methyl esters —
Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
Numéro de référence
ISO 12966-2:2011(F)
©
ISO 2011
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2011
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Réactions.1
4 Méthodologie .2
4.1 Préparation de l'échantillon pour essai .2
4.2 Méthode rapide .2
4.3 Méthode générale .4
4.4 Transméthylation à l'aide d'un catalyseur au trifluorure de bore (BF ).6
3
4.5 Transméthylation par catalyse acide des glycérides .10
Annexe A (informative) Méthode de chromatographie sur couche mince pour vérifier l'état
complet de la dérivatisation .12
Bibliographie.16
© ISO 2011 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 12966-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,
Corps gras d'origines animale et végétale.
Cette première édition de l'ISO 12966-2 annule et remplace l'ISO 5509:2000, dont elle constitue une révision
technique.
L'ISO 12966 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Corps gras d'origines animale et
végétale — Chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras:
⎯ Partie 2: Préparation des esters méthyliques d'acides gras
⎯ Partie 3: Préparation des esters méthyliques à l'aide d'hydroxyde de triméthylsulfonium (TMSH)
La partie suivante est en cours d'élaboration:
⎯ Partie 4: Détermination des acides gras saturés, mono- et poly-insaturés, cis ou trans, dans les corps
gras d'origines végétale ou animale (non ruminant)
La partie suivante est prévue:
⎯ Partie 1: Lignes directrices pour la chromatographie en phase gazeuse
iv © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
Introduction
Généralités
Les corps gras (c'est-à-dire les lipides liquides et solides) sont essentiellement composés d'esters d'acides
gras de glycérol (triacylglycérols, ou TAG), avec des quantités moindres d'esters d'acides gras de stérols et
d'alcools aliphatiques à longue chaîne. Du fait de leur masse moléculaire élevée et leur très faible volatilité,
les TAG sont difficiles à analyser directement par chromatographie en phase gazeuse (CG), en particulier si
une analyse détaillée des acides gras insaturés est requise. Les acides gras eux-mêmes ne réagissent pas
bien à la chromatographie (à l'exception des acides gras à chaîne courte tels que les acides butyrique et
valérique). La pratique recommandée consiste donc à former des esters d'acides gras, généralement des
esters méthyliques d'acides gras (EMAG), avant la CG.
L'analyse des corps gras a été étudiée de manière approfondie dans la Référence [9].
La formation d'EMAG constitue une phase essentielle de l'analyse des acides gras. La conversion non
quantitative des acides gras en EMAG, la modification de la structure des acides gras (par exemple les
changements dans les isomères géométriques et de position présents) et la formation d'artéfacts non-EMAG
peuvent toutes affecter la détermination quantitative de la composition en acides gras.
La transestérification est l'un des mécanismes qui peuvent être employés pour former des EMAG à partir des
esters d'acides gras présents dans des corps gras (triacylglycérol, par exemple). Des méthodes de
transestérification par catalyse alcaline ou acide peuvent être utilisées pour former des EMAG dans un milieu
méthanolique — cette méthode porte le nom de transméthylation. La transméthylation est un processus
réversible et de grandes quantités de méthanol sont nécessaires pour maintenir un état d'équilibre favorisant
la formation d'EMAG. La présence d'eau peut empêcher la réaction d'aller à son terme, et il convient donc de
la réduire au minimum. Les méthodes par catalyse alcaline ne produisent pas d'EMAG à partir d'acides gras,
en raison de la formation de savons.
L'estérification est un mécanisme à catalyse acide qu'il est possible d'employer pour former des EMAG à
partir d'acides gras. Les acides gras peuvent être naturellement présents dans l'échantillon de corps gras
analysé. La formation d'EMAG à l'aide de ce mécanisme est communément appelée méthylation. À nouveau,
une grande quantité de méthanol et l'absence d'eau sont des conditions préalables à la formation quantitative
d'EMAG.
La présente partie de l'ISO 12966 fournit des lignes directrices pour la préparation d'esters méthyliques
d'acides gras. Diverses méthodes de préparation d'esters méthyliques d'acides gras sont spécifiées en
complément de ces lignes directrices. Celles-ci comprennent:
a) la transméthylation «rapide» en conditions alcalines;
b) la transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles;
c) la transméthylation/méthylation au trifluorure de bore (BF ).
3
Transméthylation «rapide» en conditions de catalyse alcalines
Cette méthode s'applique à l'analyse de routine des matières grasses alimentaires contenant des acides gras
à partir de l'acide butyrique (C4:0) et/ou pour la détermination de l'acide butyrique ou de l'acide hexanoïque
(C6:0) par CG à l'aide d'un étalon interne.
© ISO 2011 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
Les catalyseurs alcalins transestérifient les lipides neutres en présence de méthanol anhydre
(transméthylation) plus rapidement que les catalyseurs acides. Les inconvénients liés à ces méthodes par
catalyse alcaline tiennent au fait que les acides gras libres ne sont pas estérifiés et que la présence d'eau
peut empêcher la transméthylation d'aller jusqu'à son terme (hydrolyse des EMAG en acides gras libres). Les
réactifs les plus couramment utilisés sont l'hydroxyde de potassium et de sodium, ainsi que le méthoxyde de
sodium en présence de méthanol anhydre.
Transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles
Cette méthode en conditions de catalyse alcaline et acide séquentielles est applicable à tous les corps gras, y
compris les huiles distillées et acides, mais n'est pas recommandée pour les huiles lauriques. Les esters
méthyliques d'acides gras à chaîne courte sont facilement perdus lors du reflux. Pour les huiles lauriques, la
méthode de transméthylation «rapide» est recommandée.
Au cours de la méthylation, les substances contenant les configurations suivantes peuvent être totalement ou
partiellement décomposées:
a) les groupes cétone, époxy, hydroxyle, hydroperoxy;
b) les groupes cyclopropyle et cyclopropényle;
c) les acides gras acétyléniques.
Transméthylation/méthylation au trifluorure de bore (BF3)
En raison de la toxicité du BF , il est recommandé de n'utiliser cette méthode qu'en dernier recours.
3
La méthode au BF est applicable à la plupart des huiles, graisses et substances dérivées (acides gras,
3
savons) à l'exception des matières grasses laitières et des graisses contenant des acides gras de types
spécifiques.
Au cours de la méthylation, les substances contenant les configurations suivantes peuvent être totalement ou
partiellement décomposées:
a) les groupes cétone, époxy, hydroxyle, hydroperoxy;
b) les groupes cyclopropyle et cyclopropényle;
c) les acides gras acétyléniques.
La méthode peut s'appliquer si la matière grasse contient des substances de ce type en très petites quantités
seulement (huile de coton, par exemple); sinon, il convient de suivre la méthode de
transméthylation/méthylation «rapide» ou «générale».
Pour la CG, la récupération optimale des esters méthyliques du mélange réactionnel est obtenue en utilisant
de l'isooctane (2,2,4-triméthylpentane). Cependant, seulement 75 % environ du caproate de méthyle présent
sont récupérés.
Le trifluorure de bore est un acide de Lewis fort et, sous la forme de son complexe de coordination avec le
méthanol, il peut méthyler rapidement les acides gras en conditions de reflux. Le trifluorure de bore
méthanolique transméthyle bien les esters d'acides gras (triglécyride, par exemple), mais la vitesse de
réaction est plus lente que la méthylation des acides gras. Une solution méthanolique de trifluorure de bore
est disponible dans le commerce, ce qui renforce l'attrait de ce catalyseur acide, mais son utilisation présente
des inconvénients potentiels.
a) Il a été signalé que de fortes concentrations de trifluorure de bore (50 % fraction massique) produisent
des artéfacts méthoxy à partir d'acides gras insaturés.
b) Le réactif a une durée de conservation limitée à température ambiante et il convient de le conserver au
frais.
vi © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
c) Un réactif vieilli peut produire des artéfacts, c'est pourquoi il est recommandé d'essayer chaque nouveau
lot acheté avant utilisation, ainsi que périodiquement sur la durée de vie.
d) Le trifluorure de bore méthanolique est un réactif acide et peut donc produire des dérivés d'acides gras
contenant des groupes labiles pouvant entraîner l'apparition de pics parasites sur les chromatogrammes
d'EMAG.
Informations complémentaires
Une attention particulière a été portée à la préparation et l'analyse des esters d'acides gras à chaîne courte
par CG, en grande partie en raison de leur occurrence dans les matières grasses laitières. Les acides gras à
chaîne courte, à l'état libre ou estérifié en glycérol, peuvent être convertis complètement en esters
méthyliques par n'importe lequel des réactifs décrits dans les alinéas précédents, mais la récupération
quantitative à partir du milieu réactionnel ne peut être réalisée sans prendre de précautions spéciales. Des
pertes peuvent se produire à plusieurs stades dans toute méthode. Les esters d'acides gras à chaîne courte
(méthyle notamment) sont volatils et peuvent subir des pertes sélectives lors du reflux du milieu
d'estérification; ils sont plus solubles dans l'eau que les esters à plus longue chaîne et peuvent être perdus
lors d'une phase d'extraction aqueuse; ou ils peuvent être éliminés par distillation lors de l'évaporation du
solvant d'extraction. Des pertes sélectives peuvent également se produire lorsque des impuretés non
saponifiables doivent être éliminées par sublimation ou purification par chromatographie sur couche mince
(CCM). Les meilleures méthodes d'estérification pour les acides gras à chaîne courte sont celles où le
chauffage des réactifs est évité et où les phases d'extraction aqueuse ou d'élimination de solvant sont
absentes.
L'injection de milieux réactionnels contenant des catalyseurs d'estérification basiques et acides directement
sur les colonnes de CG réduit leur durée de vie. Les quelques centimètres supérieurs des colonnes remplies
peuvent être regarnis périodiquement, tandis que l'utilisation de longueurs de tubes désactivés ou
«précolonnes de rétention» à l'avant des colonnes capillaires les protège. Il s'agit là de bien peu de choses
pour assurer vitesse, simplicité et précision de ces méthodes.
En outre, la présente partie de l'ISO 12966 décrit une méthode simple de CCM pour vérifier l'efficacité de la
transméthylation/méthylation. Cette méthode peut également être utilisée pour vérifier la composition
générique d'un corps gras avant d'entreprendre la transméthylation/méthylation.
© ISO 2011 – Tous droits réservés vii
---------------------- Page: 7 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 12966-2:2011(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Chromatographie
en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras —
Partie 2:
Préparation des esters méthyliques d'acides gras
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 12966 spécifie des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras.
Elle comprend des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras à partir de corps gras
d'origines animale et végétale, d'acides gras et de savons. Afin de répondre à différentes exigences, quatre
méthodes de méthylation sont spécifiées, à savoir:
a) une méthode de transméthylation «rapide» en conditions alcalines;
b) une méthode de transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles;
c) une méthode de transméthylation au BF ;
3
d) une méthode alternative reposant sur la transméthylation par catalyse acide de glycérides.
Les esters méthyliques ainsi obtenus sont utilisés dans diverses méthodes d'analyse exigeant des produits
dérivés de ce type, par exemple la chromatographie gaz-liquide (CGL), la chromatographie sur couche mince
(CCM) et la spectrométrie infrarouge (IR).
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application de la présente norme. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s'applique.
ISO 661, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai
3 Réactions
La détermination de la composition en acides gras des huiles et des graisses est l'une des analyses
fondamentales dans le secteur des corps gras et a été étudiée de manière approfondie dans la Référence [9].
À cette fin, les composants acides gras des lipides sont généralement convertis en esters méthyliques avant
analyse par CG.
La méthode «rapide» (4.2) ne dérive pas les acides gras libres (AGL) présents dans l'huile en esters
méthyliques d'acides gras (EMAG). Si des AGL sont présents, il est généralement supposé que ces AGL ont
la même distribution d'acides gras que les triglycérides. Cela est généralement vrai pour les huiles brutes,
mais moins pour les huiles fractionnées ou raffinées. À l'exception de certaines huiles de pression à froid, la
règle générale est que les huiles avec moins de 0,5 % (fraction massique) d'AGL ont probablement été
© ISO 2011 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
raffinées; les huiles se situant au-delà peuvent être considérées comme étant brutes. La concentration
acceptable d'AGL dans l'huile dépend de l'huile particulière analysée, ainsi que de l'utilisation prévue des
données EMAG générées. La présence d'AGL dans l'huile peut introduire des pics supplémentaires sur le
chromatogramme final et rendre problématique l'identification des EMAG synthétisés à l'aide de la méthode
de transméthylation «rapide».
La méthode «générale» (4.3) dérive à la fois les AGL et les esters glycériques en EMAG (voir 4.3.1).
Il revient à l'analyste de décider s'il est préférable d'utiliser la méthode «rapide» ou «générale» selon la nature
de l'huile analysée. Il n'en demeure pas moins, en règle générale, que l'utilisation de la méthode «rapide» est
envisagée uniquement si la teneur en AGL est inférieure ou égale à 0,5 % (fraction massique). La méthode
«générale» (4.3) est conseillée pour les huiles dont la teneur en AGL est supérieure à 0,5 % (fraction
massique). En alternative, la méthode de transméthylation par catalyse spécifiée en 4.5 peut être utilisée si un
corps gras partiellement hydrolysé doit être converti en EMAG.
En raison de la toxicité du BF , il est recommandé de n'utiliser la méthode au BF (4.4) qu'en dernier recours.
3 3
4 Méthodologie
AVERTISSEMENT — La méthode spécifiée implique l'utilisation de réactifs potentiellement dangereux.
Des précautions d'usage doivent être prises pour la protection des yeux et contre les risques de
brûlures chimiques corrosives. La solution méthanolique d'hydroxyde de potassium est toxique.
4.1 Préparation de l'échantillon pour essai
L'échantillon pour essai doit être liquide, sec et limpide. Procéder conformément à l'ISO 661, mais en
chauffant l'échantillon juste au-dessus du point de fusion.
4.2 Méthode rapide
4.2.1 Applicabilité
La méthode de transméthylation rapide en conditions de catalyse alcalines peut s'employer pour l'analyse de
routine des matières grasses alimentaires contenant des acides gras à partir de l'acide butyrique (C4:0) et/ou
pour la détermination de l'acide butyrique ou de l'acide hexanoïque (C6:0) par CG à l'aide d'un étalon interne.
NOTE 1 Cette méthode ne dérive pas les AGL en EMAG. L'analyste doit noter que la présence d'AGL dans la solution
finale pourrait affecter la qualité de la chromatographie en phase gazeuse qui s'ensuit.
[8]
NOTE 2 Selon le COI/T.20/Doc. N° 24:2001 , une méthode similaire peut être appliquée directement sur des
échantillons des catégories d'huile suivantes:
a) huile d'olive vierge avec une acidité inférieure à 3,3 %;
b) huile d'olive raffinée;
c) huile d'olive (mélange d'huile d'olive vierge et raffinée);
d) huile de grignons d'olive raffinée;
e) huile de grignons d'olive (mélange d'huile d'olive vierge et d'huile de grignons d'olive raffinée).
4.2.2 Principe
Les esters méthyliques sont formés par transméthylation avec de l'hydroxyde de potassium méthanolique.
Les acides gras libres ne sont pas estérifiés par cette méthode.
2 © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
4.2.3 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
Les réactifs ne doivent pas produire de pics qui interfèrent avec ceux des esters méthyliques d'acides gras
pendant la CG. Il convient de vérifier tout nouveau lot de réactif ou de solvant en l'utilisant pour préparer
l'ester méthylique de l'acide oléique pur. Si des pics supplémentaires apparaissent de façon intempestive au
cours de l'analyse CG finale, il convient de rejeter le réactif concerné.
4.2.3.1 Méthanol, ne contenant pas plus de 0,5 % d'eau (fraction massique).
[3]
4.2.3.2 Eau, conforme à la qualité 3 de l'ISO 3696 .
4.2.3.3 Hydrogénosulfate de sodium, anhydre.
4.2.3.4 Isooctane (2,2,4-triméthylpentane), de qualité chromatographique.
AVERTISSEMENT — L'isooctane est un liquide inflammable qui présente des risques d'incendie. Les
limites d'explosivité dans l'air sont de 1,1 % à 6,0 % (fraction volumique). Il est toxique par ingestion et
inhalation. Utiliser une hotte ventilée en bon état de marche pour travailler avec ce solvant.
4.2.3.5 Hydroxyde de potassium en solution méthanolique, concentration en quantité de matière
c ≈ 2 mol/l.
Dissoudre en réchauffant lentement 13,1 g d'hydroxyde de potassium (fraction massique w = 85 g/100 g)
dans 100 ml de méthanol absolu.
4.2.3.6 Solution mère d'étalon interne, pour la détermination de l'acide butyrique et/ou hexanoïque
uniquement.
Peser 250 mg (à 0,1 mg près) d'ester méthylique de l'acide valérique (pentanoate de méthyle) dans une fiole
jaugée de 50 ml (4.2.4.4). Utiliser de l'isooctane pour dissoudre l'échantillon et compléter jusqu'au trait avec le
même solvant.
4.2.3.7 Solution de référence d'étalon interne, pour la détermination de l'acide butyrique et/ou
hexanoïque uniquement.
Introduire (4.2.4.2) 10 ml de solution mère dans une fiole jaugée de 100 ml (4.2.4.4) et compléter jusqu'au
trait avec de l'isooctane. Calculer la concentration de cette solution de référence.
4.2.3.8 Solution de chlorure de sodium. Dissoudre 40 g de chlorure de sodium dans 100 ml d'eau.
4.2.4 Appareillage
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.
4.2.4.1 Tubes à essai à bouchon à vis, 10 ml, avec bouchon muni d'un joint en
polytétrafluororéthylène (PTFE).
[6]
4.2.4.2 Pipettes, de capacité 0,1 ml, 2 ml et 10 ml, ISO 8655-2 .
4.2.4.3 Flacons à échantillon en verre, 3 ml.
[2]
4.2.4.4 Fioles jaugées à un trait, de capacité 50 ml et 100 ml, ISO 1042 classe A.
© ISO 2011 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
4.2.5 Mode opératoire
Peser environ 0,1 g de l'échantillon pour essai (4.1) dans un tube à essai à bouchon à vis de 10 ml (4.2.4.1).
Dans le cas où la détermination quantitative des acides gras par CG doit se faire en utilisant un ou des
étalons internes, il est impératif de peser la prise d'essai avec précision, c'est-à-dire à 0,1 mg près. Les
résultats sont ensuite exprimés en pourcentage, sous forme de fractions massiques d'acides gras dans la
graisse ou l'huile. Ces résultats ne sont pas nécessairement en accord avec les résultats obtenus par
normalisation interne.
Ajouter (4.2.4.2) 2 ml d'isooctane (4.2.3.4) et agiter. Dans certains cas, il peut ne pas être possible d'utiliser la
taille d'échantillon de 0,1 g spécifiée, auquel cas il convient de modifier proportionnellement la quantité
d'isooctane ajoutée à la prise d'essai.
Pour la détermination de l'acide butyrique et/ou hexanoïque, utiliser une pipette (4.2.4.2) pour ajouter 2 ml de
la solution de référence (4.2.3.7) au lieu de l'isooctane. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'analyser
des corps gras contenant de faibles quantités de ces acides gras. Dans ce cas, le volume de solution de
référence ajouté à l'échantillon pour essai peut être réduit proportionnellement.
Ajouter (4.2.4.2) 0,1 ml de solution méthanolique d'hydroxyde de potassium à 2 mol/l (4.2.3.5), mettre
immédiatement le bouchon muni d'un joint en PTFE, serrer le bouchon et agiter vigoureusement pendant
1 min. La solution s'éclaircit avant de se troubler à nouveau sous l'effet de la séparation du glycérol. Laisser
reposer pendant environ 2 min. Ajouter environ 2 ml de solution de chlorure de sodium et agiter brièvement.
Prélever la phase d'isooctane et la transférer dans un flacon à échantillon (4.2.4.3). Ajouter environ 1 g
d'hydrogénosulfate de sodium (4.2.3.3) et agiter la solution.
La solution d'isooctane est adaptée à une analyse par CG conformément à l'ISO 12966-4.
NOTE L'efficacité de la dérivatisation à l'aide de la méthode «rapide» peut être déterminée par CCM, comme décrit
en Annexe A.
4.3 Méthode générale
4.3.1 Applicabilité
Cette méthode de transméthylation/méthylation générale en conditions de catalyse alcalines et acides
séquentielles est applicable à tous les corps gras, y compris les huiles distillées et acides, mais n'est pas
recommandée pour les huiles lauriques. Les esters méthyliques d'acides gras à chaîne courte sont facilement
perdus lors du reflux. Pour les huiles lauriques, il est recommandé d'utiliser la méthode spécifiée en 4.2.
Au cours de la méthylation, les substances contenant les configurations suivantes peuvent être totalement ou
partiellement décomposées:
a) les groupes cétone, époxy, hydroxyle, hydroperoxy;
b) les groupes cyclopropyle et cyclopropényle;
c) les acides gras acétyléniques.
[8]
NOTE Selon le COI/T.20/Doc. N° 24:2001 , cette méthode peut être appliquée directement sur des échantillons des
catégories d'huile suivantes:
a) huile d'olive vierge avec une acidité supérieure à 3,3 %;
b) huile de grignons d'olive brute.
4 © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
4.3.2 Principe
Le réactif alcalin entraîne la transméthylation des esters glycériques en esters méthyliques d'acides gras; les
acides gras libres sont convertis en savons. Le catalyseur acide convertit les savons en esters méthyliques
d'acides gras.
ATTENTION — La méthylation doit s'effectuer sous une hotte ventilée.
4.3.3 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue. Les réactifs ne doivent pas produire de pics
qui interfèrent avec ceux des esters méthyliques d'acides gras pendant la CG. Il convient de vérifier tout
nouveau lot de réactif ou de solvant en l'utilisant pour préparer les esters méthyliques de l'acide oléique pur.
Si des pics supplémentaires apparaissent de façon intempestive au cours de l'analyse CG finale, il convient
de rejeter le réactif concerné.
4.3.3.1 Isooctane (2,2,4-triméthylpentane), de qualité chromatographique.
AVERTISSEMENT — L'isooctane est un liquide inflammable qui présente des risques d'incendie. Les
limites d'explosivité dans l'air sont de 1,1 % à 6,0 % (fraction volumique). Il est toxique par ingestion et
inhalation. Utiliser une hotte ventilée en bon état de marche pour travailler avec ce solvant.
4.3.3.2 Méthanol, ne contenant pas plus de 0,05 % d'eau (fraction massique).
4.3.3.3 Méthoxyde de sodium, en solution méthanolique, 0,2 mol/l.
Dissoudre 8 g d'hydroxyde de sodium dans 1 000 ml de méthanol. Cette solution peut être préparée à partir
de solutions du commerce.
4.3.3.4 Phénolphtaléine, en solution méthanolique, 0,2 % (fraction massique).
4.3.3.5 Acide sulfurique, en solution méthanolique, 1 mol/l.
Ajouter 3 ml d'acide sulfurique à 96 % à 100 ml de méthanol.
4.3.3.6 Solution de chlorure de sodium.
Dissoudre 40 g de chlorure de sodium dans 100 ml d'eau.
[3]
4.3.3.7 Eau, conforme à la qualité 3 de l'ISO 3696 .
4.3.4 Appareillage et matériaux
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.
4.3.4.1 Fioles jaugées à un trait, de capacité 10 ml, à col rodé long et étroit, munies d'un bouchon en
[2]
verre rodé, ISO 1042 classe A.
[4]
4.3.4.2 Réfrigérant à reflux, ISO 4799 , avec joint rodé adapté au col de la fiole.
4.3.4.3 Billes pour réguler l'ébullition, exemptes de matière grasse.
4.3.4.4 Entonnoir en verre.
[6]
4.3.4.5 Pipettes, de capacité 0,2 ml, 1 ml et 4 ml, ISO 8655-2 .
© ISO 2011 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 12966-2:2011(F)
4.3.5 Mode opératoire
Transférer environ 50 mg de l'échantillon pour essai (4.1) dans une fiole à col rodé de 10 ml (4.3.4.1).
À l'aide d'un entonnoir (4.3.4.4), ajouter 2 ml de la solution de méthoxyde de sodium à 0,2 mol/l dans du
méthanol (4.3.3.3) et les billes pour réguler l'ébullition (4.3.4.3).
Raccorder un réfrigérant à reflux (4.3.4.2), agiter et porter à ébullition. Porter le mélange à reflux jusqu'à
obtention d'une solution limpide. Pour la plupart
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.