ISO 21570:2005/Amd 1:2013

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Status
Published
Publication Date
09-Apr-2013
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
14-Mar-2013
Completion Date
10-Apr-2013
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ISO 21570:2005/Amd 1:2013
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21570
First edition
2005-11-01
AMENDMENT 1
2013-04-15
Foodstuffs — Methods of analysis for
the detection of genetically modified
organisms and derived products —
Quantitative nucleic acid based
methods
AMENDMENT 1
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Reference number
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
ISO 2013
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International

Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.

Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies

casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

Amendment 1 to ISO 21570:2005 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,

Subcommittee SC 16, Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Quantitative nucleic acid based methods
AMENDMENT 1

No attempt has been made in this amendment to update the footnote numbering to fit in with the scheme

adopted in ISO 21570:2005. The footnote numbers given are for use solely within this amendment.

Page 1, Clause 2
Update entries 1 to 3 as follows and delete footnote 1).

ISO 21569:2005 + AM1:2013, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified

organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods

ISO 21571:2005 + AM1:2013, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified

organisms and derived products — Nucleic acid extraction

ISO 24276:2006 + AM1:2013, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified

organisms and derived products — General requirements and definitions

Page 2, 7.1, last paragraph; Page 8, A.1.5.1; Page 15, B.1.5.1; Page 23, C.1.5.1; Page 31, C.2.5.1; Page 38,

C.3.5.1; Page 45, C.4.5.1; Page 53, C.5.5.1; Page 60, C.6.5.1; Page 68, C.7.5.1; Page 75, C.8.5.1; Page 83,

C.9.5.1; Page 90, D.1.5.1; Page 96, D.2.5.1
Delete “ISO 24276:—”, insert “ISO 24276:2006”.
Page 4, Clauses 8–10
Replace the existing text with the following.
8 Interpretation
The PCR result will be either a) or b).
a) Fit for quantification of the target sequence provided:
— the result is positive according to ISO 21569:2005, 8.1;
— the observable inhibition of the reaction is negligible;
— the analysis produces an unambiguous measurement value;
— the target sequence content is within the dynamic range of the method;
— the analysis is calibrated in an acceptable way (see 7.3).

b) Unfit for quantification of the target sequence if any of the conditions listed in a) are not fulfilled.

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Interpretation of ambiguous results within the same test portion: in case of +/− results for the two

replicates, repeat the two PCR for the relevant test portion. If the two novel replicates are tested +/− or

−/−, the test portion is considered as negative.

Interpretation of ambiguous results between two test portions: in case of ± results for the two test

portions of a sample, the extractions and analysis of two new test portions shall be performed. If again

the results are +/−, the sample is considered as negative according to ISO 24276:2006, 6.3.

The measurement uncertainty shall be sufficiently small to enable the laboratory to draw the

relevant conclusions.

Annexes A to D describe the measurement of the target DNA quantities. These quantities can be used

to calculate the GMO content. These calculations usually take into consideration relevant biological

factors, e.g. the homo- or heterozygosity of the target sequences.

If the GM target sequence content or the taxon-specific target sequence content is below the limit of

quantification, the result shall only be expressed qualitatively.

NOTE Stating that the GMO-derived DNA content is below the practical LOQ accompanied by a specification

of that LOQ is considered to be a qualitative expression of the result.
9 Expression of results

The results shall clearly state the quantity of the GM target sequence relative to the target taxon-specific

sequence. The results should also provide values for the measurement uncertainty, such as the standard

deviation or coefficient of variation. Furthermore, the LOD and LOQ of the method and the practical

LOD and LOQ should be reported. The indication that the result refers only to GMO targets should be

reported. In the case of quantitative screening analysis on complex matrices, it is recommended to

specify that the GMO signal can come from non target taxons.

The target sequences can or cannot be detected, or the quantity of at least one of them can be below the

limit of quantification. Table 1 describes the four alternative cases and the corresponding expression of

the result to be included into the test report.

The GMO-derived DNA content can also be reported as being above or below a specific value, taking into

account the measurement uncertainty.
10 Test report

The test report shall be written in accordance with ISO 24276 and ISO 21569 and shall contain at least

the following additional information:
a) the LOQ of the method and the matrix used to establish it;
b) the practical LOQ;
c) a reference to the method which has been used for the extraction of DNA;

d) a reference to the methods used for the amplification of the DNA target sequences;

e) the reference material used;
f) the results expressed according to Clause 9;

g) the PCR target and whether considered “event specific” or “construct specific” or “screening”;

h) the definition of the measurement uncertainty used.

NOTE For g) and h), information can figure in different documents (e.g. contract review, technical data sheets).

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Table 1 — Expression of results
Result Expression of the result
Target taxon-specific sequence “For species X, DNA was not detected.”
is not detected.
Target taxon-specific sequence According to ISO 21569.
is detected but GM target
“For sample X, GM target sequence Y was not detected.
sequence is not detected.
The LOD of the method is x % determined with ABC (identify the reference
material).”
If it cannot be demonstrated that the test sample size and the amount of target

DNA included in the PCR is sufficient for the LOD to be applicable, then the fol-

lowing sentence shall be added:
“However, the amount of the target DNA extracted from species X can be/was
insufficient for the LOD to be applicable for this sample. The LOD of sample is
x %.” (Specify the unit used.)
NOTE The LOD of the sample is determined by the quantity of DNA of the species

included in the analytical reaction (copy number), and the ratio relative to the absolute

LOD of the GM target (copy number), and in the case of grain and seeds, the number of

grain or seeds in the portion that is ground.
The target taxon-specific For each GMO, state:
sequence and the GM target
“GMO (specify the GMO) derived DNA as determined by detection of (specify
sequence are both detected,
target sequence) derived from (specify species) was detected, below the prac-
but the quantity is below the
tical limit of quantification”
LOQ of at least one of the target

sequences. In addition, if applicable: “The practical limit of quantification is x %.” (Specify

the unit used.)
The target taxon-specific For each GMO, state:
sequence and the GM target
“The content of GMO (specify the GMO) derived DNA as determined by detec-
sequence are both detected
tion of (specify target sequence) derived from (specify species) is x ± u %”
meas
and the quantity is above the
where u is the measurement uncertainty. (Specify the unit used.)
meas
LOQ for both target sequences.
Page 11, Annex A
Add A.2 and A.3.
A.2 Target-taxon-specific method for the detection of DNA derived from rice
A.2.1 Principle

Rice SPS gene has been described as being suitable for use as an endogenous reference gene in GM rice

identification and quantification (Reference [59]). The GMO Detection Laboratory of Shanghai Jiao Tong

University (GMDL-SJTU) organized a collaborative trial for validation of the applicability of the rice

sucrose phosphate synthase (SPS) gene as an endogenous gene for quantitative analysis of genetically

modified (GM) or non-GM rice. The study involved 12 laboratories from Spain, Korea, Lithuania, Slovenia,

Japan, Italy, and China.

The operational procedure of the collaborative study comprised the following modules.

Quantitative real-time PCR for quantification of blind rice DNA samples used to construct standard

curves.

Quantitative real-time PCR for the quantification of blind rice DNA samples using the constructed

standard curves.
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The interlaboratory test was carried out in accordance with the following internationally accepted guidelines:

[51]–[56]
— ISO 5725;

— the IUPAC protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies

(Reference [12]).

The results of the collaborative study as well as the related protocol are given in A.2.3.3.

A.2.2 Scope

The method has been optimized for rice grain and its processed products containing mixtures of

rice and other matrices, e.g. maize and soybean. The applicability of the SPS gene was tested through

collaborative trials using DNA samples extracted from rice grains.
A.2.3 Validation status and performance criteria
A.2.3.1 Robustness of the method

The robustness of the SPS gene quantitative real-time PCR system was tested by the method developer on

different temperature–time programmes (i.e. two-step and three step) and on three different DNA samples

containing known amounts of rice DNA (10 ng, 1 ng, 0,1 ng rice genome DNA samples). There were three

repetitions per sample. The quantitative real-time PCR systems had the expected ruggedness and worked

well at different temperature–time programmes and three concentrations of the rice DNA samples.

The quantitative PCR system for the SPS gene was also tested on different real-time PCR instruments

(Rotor gene 3000A, Corbett Research and ABI7700, Applied Biosystems), with three different

reaction volumes (20 µl, 25 µl, and 30 µl; three repetitions per volume). The quantitative real-time PCR

system demonstrated appropriate ruggedness, working well on the different real-time PCR instruments

and with the different reaction volumes.
A.2.3.2 Intralaboratory trial

For sample preparation, all the DNA samples were extracted using the cetyl(trimethyl)ammonium

bromide (CTAB) method adopted from ISO 21571. Spectrometric quantification of the amount of total DNA

extracted was performed using a method adopted from ISO 21571:2005, B.1. After the DNA quantification,

a quantitative real-time PCR run was carried out to provide data about possible PCR inhibition.

The SPS gene PCR system was tested by three researchers using the rice genome DNA, and gave

satisfactory results; in particular, in quantitative PCR, the bias was below 25 % over the dynamic range

(i.e. 0,05 ng to 1,00 ng).
A.2.3.3 Collaborative trial

Standard curves were constructed using serially diluted DNA samples extracted by the GMDL-SJTU

from four rice cultivars by means of quantitative PCR. The PCR efficiency, calculated from the slope of

−1/a

the standard curve as (10 − 1) × 100, where a is the slope, of the SPS gene PCR system ranging from

0,846 3 to 1,223 3, and the linearity (regression coefficient, R ) was on average equal to 0,997.

The results of the eight blind DNA samples are reported in Table A.5. These are evaluated with respect

to the method acceptance criteria and to the method performance requirements, as established by the

European Network of GMO laboratories (ENGL) and adopted by the European Reference Laboratory

for GM Food and Feed (EU-RL GMFF) (Reference [60]). In Table A.5, estimations of both repeatability

and reproducibility for each rice concentration level are reported, after identification and removal of

outliers according to Cochran’s test.

1) Product available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and

does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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Table A.5 — Results of quantitative real-time PCR
Blind samples
Parameter
0,5 ng 0,5 ng 1ng 1 ng 2 ng 5 ng 5 ng 10 ng
Laboratories returning
12 12 12 12 12 12 12 12
results
Samples per laboratory 1 1 1 1 1 1 1 1
Total data no. 108 108 108 108 108 108 108 108
Data excluded 4 2 0 8 0 0 0 0
Cochran’s Cochran’s Cochran’s
Reason for exclusion — — — — —
test test test
Mean value 0,407 8 0,412 1 0,814 6 0,734 4 1,857 5 5,261 0 5,445 7 10,889 6
Repeatability standard
0,058 3 0,071 9 0,143 5 0,111 0,336 2 0,936 4 1,142 7 1,867 7
deviation
Repeatability coefficient
14,29 17,44 17,62 15,11 18,10 17,80 20,98 17,15
of variation, %
Reproducibility standard
0,130 2 0,061 8 0,249 6 0,092 7 0,201 3 0,810 9 0,989 6 1,617 5
deviation
Reproducibility coef-
31,92 14,99 30,65 12,63 10,84 15,41 18,17 14,85
ficient of variation, %

Bias, absolute value 0,092 2 0,087 8 0,185 3 0,265 5 0,142 4 −0,261 0 −0,445 8 −0,889 6

Bias, % −18,44 −17,57 −18,54 −26,53 −7,12 5,22 8,92 8,90
A.2.3.4 Molecular selectivity
A.2.3.4.1 General

The primers and probe targeting the 81 bp SPS gene DNA fragment are listed in Table A.6.

Table A.6 — Oligonucleotide primers and probe sequences
Name Oligonucleotide DNA sequence (5′ to 3′)
Quantitative-real time PCR primer and probe sequence
SPS primer F TTgCgCCTgAACggATAT
SPS primer R CggTTgATCTTTTCgggATg
SPS probe HEX- TCCgAgCCgTCCgTgCgTC -TAMRA
A.2.3.4.2 Experimental

DNA samples extracted from 11 different plant materials (including rice) were analysed using the SPS

gene PCR method. Among the 11 samples, only rice DNA gave positive results. The 10 other samples

(i.e. bamboo, green bristlegrass, barley, wheat, foxtail millet, rapeseed, tomato, potato, soybean and

Arabidopsis) gave negative results.

DNA samples extracted from 12 different rice cultivars were analysed by the specific PCR method

developed for the detection of the SPS gene. All 12 samples gave positive results.

A.2.3.4.3 Theoretical

The theoretical specificity of the SPS gene primers and probe was assessed through a similarity search

using the BLASTN 2.0MP-WashU program (Reference [64], search date: 2010-01-09). The 81 bp sequence

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used as query is part of the NCBI accession number U33175 (nucleotides 1055–1135). The results of the

blast search confirmed the complete identity of the query sequence with rice SPS gene sequence, and no

similarity with other genes and species.
A.2.4 Principle and summary

An 81 bp fragment of the SPS gene is amplified using two rice sps-specific primers. Accumulation

of PCR products is measured at the end of each PCR cycle (real-time) by means of a rice sps-specific

oligonucleotide probe labelled with two fluorescent dyes: FAM as reporter dye and TAMRA as quencher

(see Table A.6). For that purpose, TaqMan® chemistry is employed. The fluorescence signal measured

crosses a user-defined threshold value after a certain number of cycles. This number is called the C

value. For quantification of the amount of rice sps-DNA in an unknown sample, the C value is converted

into a corresponding copy number value by comparison with a calibration curve whose C values are

directly linked with known copy numbers (regression analysis).
A.2.5 Terms and definitions
[51]

For the purposes of this clause, the terms and definitions of ISO 5725-1 and ISO 24276 apply.

A.2.6 Sample type and amounts

DNA samples extracted from the grains of four rice cultivars, were used to construct the standard

curves in this collaborative study. Then, eight blind samples were analysed using the four standard

curves constructed.
The participants received the following samples.

— Four DNA samples from different rice varieties (3M, Indica variety from US; Balilla, Japonica

variety from Italy; Guangluai, Indica variety from Southern China, and Shennong265, Chinese

Japonica variety), 50 ng/μl, 30 μl each. Each rice cultivar DNA was diluted and used to generate the

corresponding standard curve.

— Eight blind rice DNA samples from four different rice varieties with different concentrations (0 ng/µl

to ~50 ng/µl), 50 μl each.
— Negative DNA target control (labelled N): salmon sperm DNA (20 ng/µl).

— Positive DNA target control (labelled P): (Guangluai4) genomic DNA (20 ng/µl). All the DNA samples

were purified using the CTAB method by-GMDL-SJTU. The negative and positive DNA target controls

were used for each PCR plate.

— Primers and probes for the SPS gene PCR system (see Table A.6) and further reaction reagents as

follows:
— real-time PCR master mixture (1 ml × 6);
— DNA dilute solution (0,1× TE, 1,2 ml).
A.2.7 Limit of quantification (LOQ), range of use

According to the developed method, the absolute LOQ of the method is 0,01 ng/μl. The relative LOQ of

quantitative PCR has not been assessed in a collaborative trial.
A.2.8 Estimation of measurement uncertainty

The global uncertainty of the method is given by the results of the collaborative trial (see Table A.5).

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A.2.9 Interferences

The amount and the ability for amplification of the nucleic acid used as template for the real-time PCR

is of major importance for the sensitivity of the method. In addition to this general point, no specific

interferences are known for this method.
A.2.10 Physical and environmental conditions
The procedures require experience of working under sterile conditions.

Maintain strictly separated working areas for DNA extraction, PCR set-up and amplification.

Any residual DNA should be removed from equipment prior to its use.

In order to avoid contamination, filter pipette tips (A.2.11.6) protected against aerosol should be used.

Use only powder-free gloves (A.2.11.8) and change them frequently.

Clean laboratory benches and equipment periodically with sodium hypochlorite (10 % active chloride)

solution (bleach).
Pipettes should be calibrated regularly, if necessary.
A.2.11 Apparatus and equipment
Usual laboratory equipment and in particular the following.
A.2.11.1 Microcentrifuge.
A.2.11.2 Freezer maintained at −20 °C and refrigerator maintained at 4 °C.
A.2.11.3 Micropipettes.
A.2.11.4 Vortex mixer.
A.2.11.5 Tubes, of capacities 0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.
A.2.11.6 Tips and filter tips for micropipettes.
A.2.11.7 Rack for reaction tubes.
A.2.11.8 Vinyl or latex gloves.
A.2.11.9 Vacuum dryer suitable for drying DNA pellets,optional.

A.2.11.10 Real-time PCR system with plastic reaction vials suitable for fluorescence measurement.

1) 1)

A.2.11.11 Software: Sequence Detection System version 1.7 (Applied Biosystems Part No 4311876 )

or equivalent versions.
®1) 1)

A.2.11.12 Optical 96 well reaction plates, MicroAmp (Applied Biosystems Part No N801-0560 ).

®1) 1)

A.2.11.13 Optical adhesive covers, MicroAmp (Applied Biosystems Part No 4311971 ).

®1) 1)
A.2.11.14 Optical caps, MicroAmp (Applied Biosystems Part No. No 801-0935 ).
A.2.12 Reagents and materials
A.2.12.1 General

Unless otherwise stated, use only reagents that conform to the specifications of ISO 24276 and only

sterile distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
A.2.12.2 DNA extraction
A.2.12.2.1 Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), ultrapure grade.

A.2.12.2.2 Tris-(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (tris), molecular biology grade.

A.2.12.2.3 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA), titration 99,9 % mass fraction.

A.2.12.2.4 Ethanol, φ[CH CH OH] at least 96 % volume fraction.
3 2
A.2.12.2.5 Isopropanol, φ[CH CH(OH)CH ] at least 99,7 % volume fraction.
3 3
A.2.12.2.6 Chloroform, φ(CHCl ) at least 99 % volume fraction.
A.2.12.2.7 Sodium chloride, w(NaCl) at least 99 % mass fraction.
A.2.12.2.8 Sodium hydroxide, anhydrous, w(NaOH) at least 98 % mass fraction.
A.2.12.2.9 RNase A solution, 10 mg/ml.
A.2.12.2.10 Proteinase K solution, 20 mg/ml.
A.2.12.2.11 Dilution buffer: tris (A.2.12.2.2), 10 mmol/l, pH 9,0.
A.2.12.2.12 Hydrochloric acid, ρ(HCl) = 370 g/l.
A.2.12.2.13 Herring testes DNA, calf thymus DNA, or Lambda DNA.
A.2.12.3 Quantitative real-time PCR
®1)
TaqMan universal PCR master mix (1×) or suitable equivalent.
A.2.13 Sample collection, transport, preservation and storage

DNA solutions may be stored at 4 °C for a maximum of 1 week, or at −20 °C for long-term storage

(A.2.11.2). For quantitative real-time PCR set up, PCR reagents shall be kept thawed at 1 °C to 4 °C on ice.

A.2.14 Preparation of test sample

Ensure that the test sample is representative of the laboratory sample, e.g. by grinding or homogenization.

Measures and operational steps to be taken into consideration are described in detail in ISO 21571. For

the collaborative study, a total amount of 1 g ground rice noodles was used.
A.2.15 Instrument calibration
[61]

Instruments, e.g. thermocyclers and pipettes shall be calibrated, e.g. according to ISO/IEC 17025.

A.2.16 Analysis steps
A.2.16.1 General
A.2.16.1.1 Preparation of the DNA for standard curve construction

Each of the 50 ng/μl rice DNA samples was diluted to 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl, 0,002 ng/μl

using the DNA dilute solution provided by the method developer, and 5 μl of each of the diluted DNA

samples was used for real-time PCR for the standard curve construction.
For specific requirements, see ISO 21571.
A.2.16.1.2 PCR reagents
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
A.2.16.1.3 PCR master mix
See A.2.12.3.
A.2.16.1.4 Primers and probe
See Table A.6.
A.2.16.2 Procedure
A.2.16.2.1 General

The quantitative PCR for rice SPS gene is developed for a total volume of 25 µl per reaction mixture.

Thaw, mix gently and centrifuge the quantitative real-time PCR master mix and the DNA samples needed

for the run. Keep thawed reagents at 1 °C to 4 °C on ice.

Distribute 20 µl/tube of the master mixture to 200 µl PCR reaction tubes (A.2.11.5). Add 5 µl of DNA

solution samples, rice positive control, negative control, and blank control (H O) to the tubes, respectively.

Mix the PCR tubes gently and centrifuge in the microcentrifuge (A.2.11.1) at 1 000 × g for 10 s.

Place the plate (A.2.11.12) into the instrument.
Run the PCR with quantitative real-time PCR cycling conditions.
A.2.16.2.2 PCR controls
See A.2.6.
A.2.16.2.3 Preparation of standards

Calibration curves are produced by plotting C values against the logarithm of the quantity of target

DNA, in nanograms. This can be done by use of spreadsheet software [e.g. Microsoft Excel ], or directly

by options available with the sequence detection system software (A.2.11.11).

The mass, in nanograms, measured for the unknown sample DNA is obtained by interpolation from the

standard curve.
A.2.16.2.4 Temperature–time programme (PCR)
®1)

The PCR assay has been optimized for use in an ABI Prism 7700 sequence detection system and

a Rotor Gene 3000A real-time PCR system (A.2.11.10). Other systems may be used. In these cases,

thermal cycling conditions may have to be adjusted. The quantitative real-time PCR temperature–time

programme is outlined in Table A.7.
Table A.7 — Quantitative real-time PCR temperature–time programme
T Time
Step Stage Acquisition Cycles
°C s
1 Activation of DNA polymerase and denaturation 95 900 No 1×
2 Denaturation 95 15 No 40×
Amplification
3 Annealing and extension 60 45 Measure
© ISO 2013 – All rights reserved 9
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
A.2.16.2.5 Accept or reject criteria

A.2.16.2.5.1 Acceptance and performance criteria are described in Reference [60].

Method performance requirements used to evaluate the results from the collaborative study are given

in A.2.16.2.5.2 to A.2.16.2.5.4.

A.2.16.2.5.2 The dynamic range of the method should include 1/10 and at least five times the target

concentration. Target concentration should be intended as the threshold relevant for legislative

requirements.

A.2.16.2.5.3 The coefficient of variation of reproducibility should be below 35 % at the target concentration

and over the entire dynamic range. A C < 50 % is acceptable for concentrations below 0,2 %.

V, R

A.2.16.2.5.4 The trueness should be within ±25 % of the accepted reference value over the whole

dynamic range.
A.2.16.2.6 Identification
®1)
The use of a TaqMan probe allows the unambiguous identification of PCR products.
A.2.17 Sample identification
See A.2.6.
A.2.18 Interpretation and calculations of the results

After the quantitative real-time PCR is completed, locate the threshold line in the area where the

amplification profiles are parallel (exponential phase of PCR — logarithmic mode) and where there

is no cross-effect between repetitions of the same sample. Determine the cycle number at which the

threshold line crosses the first amplification curve and set the baseline three cycles before that value.

Export all the data for further calculations.

After having defined a threshold value within the logarithmic phase of amplification as described in

the previous paragraph, C values for each reaction are calculated using the instrument’s software. The

standard curves are constructed according to the C values at the threshold and the decimal logarithms

of the original template DNA quantities.

Thereafter, the standard curves are used to estimate the DNA content in the blind sample DNA by-

interpolation from the standard curves.
A.2.19 Record keeping
[61]
Record keeping shall conform to ISO/IEC 17025 requirements.
A.2.20 Reporting
[61]
Reporting shall conform to ISO 24276 and ISO/IEC 17025 requirements.
A.2.21 Safety measures
No specific requirements. See ISO 24276.
A.2.22 Pollution prevention and waste disposal
No specific requirements. See ISO 24276.
10 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
A.3 Target-taxon-specific method for the detection of components derived from
tomato (Lycopersicon esculentum)
A.3.1 Principle

The LAT52 gene encodes a heat-stable, glycosylated, cysteine-rich protein that is necessary for tomato

pollen development. The LAT52 detection system has been demonstrated to be suitable for use as an

endogenous reference gene in GM tomato identification and quantification (Reference [62]). The GMO

Detection Laboratory of Shanghai Jiao Tong University (GMDL-SJTU) organized the collaborative trial

for validation of the method of detection of the tomato LAT52 gene as tomato endogenous gene for

quantitative analysis of genetically modified (GM) or non-GM tomato. The study involved 13 laboratories

from the USA, Singapore, Korea, Lithuania, Slovenia, Norway, Italy, and China. The results appear in

Reference [63], appendices 1 and 2.

The operational procedure of the collaborative study comprised the following modules:

— Quantitative real-time PCR for the quantitative standard curve construction using tomato DNA

samples from four different tomato cultivars.

— Quantitative real-time PCR for the quantification of blind tomato DNA samples using the constructed

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21570
Première édition
2005-11-01
AMENDEMENT 1
2013-04-15
Produits alimentaires — Méthodes
d’analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Méthodes
quantitatives basées sur l’utilisation
des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid
based methods
AMENDMENT 1
Numéro de référence
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives

ISO/CEI, Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de

Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.

Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités

membres votants.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de

ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L’Amendement 1 à l’ISO 21570:2005 a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,

sous-comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la
détection des organismes génétiquement modifiés et des
produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur
l’utilisation des acides nucléiques
AMENDEMENT 1

Dans le présent amendement, la numérotation des notes de bas de page n’a pas fait l’objet d’une mise à jour

permettant de l’adapter à la numérotation adoptée dans l’ISO 21750:2005. Les renvois de note de bas de

page indiqués sont donnés pour utilisation uniquement comme références au sein du présent amendement.

Page 1, Article 2

Mettre à jour les trois premières références comme suit et supprimer la note de bas de page 1).

ISO 21569:2005 + Amd.1:2013, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des

organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation

des acides nucléiques

ISO 21571:2005 + Amd.1:2013, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des

organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques

ISO 24276:2006 + Amd.1:2013, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des

organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions

Page 3, 7.1, dernier alinéa; Page 9, A.1.5.1; Page 16, B.1.5.1; Page 24, C.1.5.1; Page 32, C.2.5.1; Page 40, C.3.5.1;

Page 48, C.4.5.1; Page 56, C.5.5.1; Page 64, C.6.5.1; Page 72, C.7.5.1; Page 80, C.8.5.1; Page 88, C.9.5.1; Page 96,

D.1.5.1; Page 103, D.2.5.1
Remplacer «ISO 24276» par «ISO 24276:2006».
Pages 4 et 5, Articles 8 à 10
Remplacer le texte existant par le texte suivant.
ͺ Interprétation
Le résultat de la PCR sera soit a) soit b).
a) Approprié pour quantifier la séquence cible fournie si
— le résultat est positif conformément à l’ISO 21569:2005, 8.1;
— l’inhibition de la réaction observée n’est pas significative;
— l’analyse produit des mesures sans équivoque;

— la quantification de la séquence cible se situe dans la gamme dynamique de la méthode;

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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
— l’analyse est étalonnée de façon acceptable (voir 7.3).

b) Inadapté pour quantifier la séquence cible si l’une des conditions indiquées en a) n’est pas remplie.

Interprétation de résultats non cohérents obtenus pour la même prise d’essai: en cas de résultats +/−

pour les deux réplicats, répéter les deux PCR pour la prise d’essai considérée. Si les deux nouveaux

réplicats donnent des résultats +/− ou −/−, le résultat est considéré comme négatif.

Interprétation de résultats non cohérents obtenus entre deux prises d’essai: en cas de résultats +/− pour

les deux prises d’essai d’un échantillon, les extractions et les analyses de deux nouvelles prises d’essai

doivent être refaites. Si ces résultats s’avèrent à nouveau +/−, alors le résultat est considéré comme

négatif conformément à l’ISO 24276:2006, 6.3.

L’incertitude de mesure doit être suffisamment faible pour permettre au laboratoire d’en tirer des

conclusions pertinentes.

Les Annexes A à D décrivent le mesurage des quantités d’ADN cible. Ces quantités peuvent être utilisées

pour déterminer le contenu en OGM. Ces opérations prennent en compte les facteurs biologiques

pertinents tels que l’homozygotie ou l’hétérozygotie des séquences cibles.

Si le contenu en séquences cibles GM ou en séquences cibles basées sur les taxons est inférieur à la limite

de quantification, alors les résultats doivent être seulement exprimés qualitativement.

NOTE L’expression d’un contenu en ADN OGM inférieur à la LQ pratique (accompagné d’une justification de

cette LQ) est considérée comme l’expression d’un résultat positif.
9 Expression des résultats

Les résultats doivent clairement indiquer la quantité de séquence cible GM en fonction de la séquence

spécifique des taxons cibles. Il convient également de fournir les résultats relatifs aux valeurs

d’incertitude de mesure, comme l’écart-type ou le coefficient de variation. En outre, il convient que

la limite de détection (LD) et la limite de quantification (LQ) de la méthode ainsi que la LD et la LQ

pratiques soient consignées. Il convient d’indiquer que le résultat concerne uniquement des cibles OGM.

Pour l’analyse de criblage quantitatif portant sur des matrices complexes, il est recommandé de préciser

si le signal OGM peut venir de taxons qui n’ont pas de lien avec la cible.

Les séquences cibles peuvent être ou non détectées, ou la quantité de l’une d’entre elles peut être

inférieure à la limite de quantification. Le Tableau 1 décrit les quatre cas alternatifs et l’expression du

résultat correspondant à inclure dans le rapport d’essai.

Le contenu en ADN OGM peut être également rapporté comme étant supérieur ou inférieur à une valeur

particulière, tout en prenant en compte l’incertitude de mesure.
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
Tableau 1 — Expression des résultats
Résultat Expression du résultat

La séquence spécifique des taxons cibles «Pour l’espèce X, l’ADN n’a pas été détecté.»

n’est pas détectée.
La séquence spécifique des taxons cibles Conformément à l’ISO 21569.
est détectée alors que la séquence cible
«Pour l’échantillon X, la séquence cible GM Y n’a pas été détectée.
GM ne l’est pas.
La LD de la méthode est de x %, mesurée à partir d’ABC (identifier le
matériel de référence).»
S’il est impossible de prouver que la taille de l’échantillon pour essai et la
quantité d’ADN cible dans la PCR sont suffisantes pour appliquer la LD,
alors la phrase suivante doit être ajoutée:
«Cependant, la quantité de l’ADN cible extrait de l’espèce X peut être/
était insuffisante pour que la LD soit applicable à cet échantillon. La LD
de l’échantillon est de x %.» (Spécifier l’unité de mesure utilisée.)

NOTE La LD de l’échantillon est déterminée par la quantité relative d’ADN de

l’espèce introduite dans la réaction analytique (nombre de copies), et par rapport

à la LD absolue de la cible GM (nombre de copies) et dans le cas des graines et des

semences, le nombre de graines ou de semences dans la portion qui a été broyée.
La séquence spécifique des taxons cibles Pour chaque OGM, indiquer:
et la séquence cible GM sont toutes les
«Le contenu en ADN OGM (spécifier le type d’OGM) tel que déterminé
deux détectées mais la quantité obtenue
par la détection de (spécifier la séquence cible) provenant de (spécifier
est inférieure à la LQ pour au moins une
l’espèce) a été détecté, mais sa valeur était inférieure à la limite de quan-
des séquences cibles.
tification pratique.»
En outre, le cas échéant: «La limite de quantification pratique est de x %.»
(Spécifier l’unité de mesure utilisée.)
La séquence spécifique des taxons cibles et Pour chaque OGM, indiquer:
la séquence cible GM sont toutes les deux
«Le contenu en ADN OGM (spécifier l’OGM) tel que déterminé par la détec-
détectées et leur quantité est supérieure
tion de (spécifier la séquence cible) provenant de (spécifier l’espèce) est
à la LQ des deux séquences cibles.
de x ± u %” où u est l’incertitude de mesure.» (Spécifier l’unité
meas meas
utilisée.)
10 Rapport d’essai

Le rapport d’essai doit être rédigé conformément à l’ISO 24276 et l’ISO 21569 et doit contenir au moins

les informations complémentaires suivantes:
a) la LQ de la méthode et la matrice utilisée pour l’établir;
b) la LQ pratique;
c) une référence à la méthode d’extraction de l’ADN utilisée;

d) une référence aux méthodes employées pour l’amplification des séquences ADN cibles;

e) le matériel de référence utilisé;
f) les résultats exprimés conformément à l’Article 9;

g) la cible PCR, en particulier si cette cible est considérée comme «spécifique de l’événement» ou

«spécifique du construit», ou comme un «criblage»;
h) la définition de l’incertitude de mesure utilisée.
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)

NOTE Pour les points g) et h), les informations peuvent figurer dans différents documents (par exemple

revue de contrat, fiches techniques).
Page 12, Annexe A
Ajouter A.2 et A.3.
A.2 Méthode spécifique du taxon cible pour détecter l’ADN de riz
A.2.1 Principe

Le gène SPS du riz a été décrit comme un gène endogène de référence, parfaitement adapté pour identifier

et quantifier du riz génétiquement modifié (Référence [59]). Le laboratoire de détection des OGM de

l’Université Jiao Tong de Shanghai (GMDL-SJTU) a organisé un essai interlaboratoires pour valider

l’applicabilité du gène codant pour la saccharose phosphate synthase (SPS) du riz comme gène endogène

pour l’analyse quantitative du riz génétiquement modifié (GM) ou non génétiquement modifié (non-GM).

Douze laboratoires situés en Espagne, en Corée, en Lituanie, en Slovénie, au Japon, en Italie et en Chine

ont participé à cet essai.
Le mode opératoire de l’essai interlaboratoires comprenait les modules suivants.

— PCR quantitative en temps réel pour quantifier des échantillons d’ADN de riz sélectionnés en aveugle

pour construire des courbes étalons.

— PCR quantitative en temps réel pour quantifier des échantillons d’ADN de tomate sélectionnés en

aveugle à l’aide des courbes étalons construites.

L’essai interlaboratoires a été réalisé conformément aux lignes directrices suivantes reconnues au

niveau international:
[51]-[56]
— ISO 5725 ;

— protocole pour la conception, la conduite et l’interprétation des études de performance des méthodes

de l’IUPAC (Référence [12]).

Les résultats de cet essai interlaboratoires ainsi que le protocole correspondant sont indiqués en A.2.3.3.

A.2.2 Domaine d’application

La méthode a été optimisée pour les grains de riz et ses produits dérivés contenant des mélanges de

riz et d’autres matrices comme le maïs et le soja. L’applicabilité du gène SPS a été évaluée lors d’essais

interlaboratoires en utilisant des échantillons d’ADN extraits de grains de riz.
A.2.3 Statut de validation et critères de performance
A.2.3.1 Robustesse de la méthode

La robustesse du système de PCR quantitative en temps réel appliqué au gène SPS a été évaluée par

le concepteur de la méthode sur différents programmes d’amplification (c’est-à-dire en deux ou trois

phases) et sur trois échantillons différents d’ADN contenant des quantités connues d’ADN de riz

(échantillons d’ADN génomique de riz de 10 ng, 1 ng et 0,1 ng). Pour chaque échantillon, trois répétitions

ont été effectuées. Les systèmes de PCR quantitative en temps réel ont démontré leur robustesse et

ont parfaitement fonctionné aux différents programmes d’amplification et pour les trois concentrations

utilisées pour les échantillons d’ADN de riz.
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)

Le système de PCR quantitative appliqué au gène SPS a également été soumis à essai sur d’autres

instruments de PCR en temps réel (Rotor gene 3000A , Corbett Research et ABI7700 , Applied

Biosystems), en utilisant trois volumes de réaction différents (20 µl, 25 µl et 30 µl; trois répétitions

par volume). Le système de PCR quantitative en temps réel a démontré sa robustesse et a parfaitement

fonctionné sur les divers instruments de PCR en temps réel et avec les différents volumes de réaction.

A.2.3.2 Essai intralaboratoire

Pour la préparation des échantillons, tous les échantillons d’ADN ont été extraits à l’aide de la

méthode au bromure d’hexadécyltriméthylammonium (CTAB) tirée de l’ISO 21571. La quantification

spectrométrique de la quantité d’ADN total extrait a été effectuée en utilisant la méthode tirée de

l’ISO 21571:2005, B.1. Après la quantification de l’ADN, une analyse PCR quantitative en temps réel a été

réalisée pour déterminer si la réaction PCR pouvait être inhibée.

Trois chercheurs ont soumis à essai le système PCR appliqué au gène SPS en utilisant l’ADN génomique

de riz. Les résultats étaient satisfaisants; en particulier, pour la PCR quantitative, le biais était inférieur

de 25 % par rapport à la gamme dynamique (c’est-à-dire entre 0,05 ng et 1,00 ng).

A.2.3.3 Essai interlaboratoires

La PCR quantitative a été utilisée pour établir des courbes étalons à partir d’échantillons d’ADN dilués

en série extraits de quatre cultivars de riz par le laboratoire GMDL-SJTU. L’efficacité de la réaction PCR

du système de PCR appliqué au gène SPS, calculée à partir de la pente de la courbe étalon à l’aide de la

−1/a

formule (10 − 1) × 100, où a est la pente, comprise entre 0,846 3 et 1,223 3, et du coefficient de

régression de la linéarité, R , était en moyenne égale à 0,997.

Le Tableau A.5 présente les résultats des huit échantillons d’ADN sélectionnés en aveugle. Ces résultats sont

évalués sur la base des critères d’acceptation et des exigences de performance de la méthode, établis par le

Réseau européen de laboratoires sur les OGM (ENGL) et adoptés par le Laboratoire européen de référence

pour les denrées alimentaires et les aliments pour animaux génétiquement modifiés (EU-RL GMFF)

(Référence [60]). Le Tableau A.5 indique les estimations de répétabilité et de reproductivité pour chaque

concentration de riz, après identification et suppression des valeurs aberrantes par l’essai de Cochran.

1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des

utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du

produit ainsi désigné.
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
Tableau A.5 — Résultats obtenus pour la PCR quantitative en temps réel
Échantillons sélectionnés en aveugle
Paramètre
0,5 ng 0,5 ng 1ng 1 ng 2 ng 5 ng 5 ng 10 ng
Laboratoires présen-
12 12 12 12 12 12 12 12
tant des résultats
Échantillons par labo-
1 1 1 1 1 1 1 1
ratoire
Nombre de données
108 108 108 108 108 108 108 108
total
Données exclues 4 2 0 8 0 0 0 0
Raison invoquée pour Essai de Essai de Essai de
— — — — —
l’exclusion Cochran Cochran Cochran
Valeur moyenne 0,407 8 0,412 1 0,814 6 0,734 4 1,857 5 5,261 0 5,445 7 10,889 6
Écart-type de répéta-
0,058 3 0,071 9 0,143 5 0,111 0,336 2 0,936 4 1,142 7 1,867 7
bilité
Coefficient de variation
14,29 17,44 17,62 15,11 18,10 17,80 20,98 17,15
de répétabilité, %
Écart-type de repro-
0,130 2 0,061 8 0,249 6 0,092 7 0,201 3 0,810 9 0,989 6 1,617 5
ductibilité
Coefficient de variation
31,92 14,99 30,65 12,63 10,84 15,41 18,17 14,85
de reproductibilité, %

Biais, valeur absolue 0,092 2 0,087 8 0,185 3 0,265 5 0,142 4 −0,261 0 −0,445 8 −0,889 6

Biais, % −18,44 −17,57 −18,54 −26,53 −7,12 5,22 8,92 8,90
A.2.3.4 Sélectivité moléculaire
A.2.3.4.1 Généralités

Le Tableau A.6 répertorie les amorces et la sonde ciblant le fragment d’ADN du gène SPS de 81 pb.

Tableau A.6 — Séquences des amorces et de la sonde oligonucléotidiques
Nom Séquence ADN des oligonucléotides (sens 5′-3′)
Séquence des amorces et de la sonde pour PCR quantitative en temps réel
Amorce F SPS TTgCgCCTgAACggATAT
Amorce R SPS CggTTgATCTTTTCgggATg
Sonde SPS HEX- TCCgAgCCgTCCgTgCgTC -TAMRA
A.2.3.4.2 Expérience

Les échantillons d’ADN extraits de matériels provenant de onze plantes différentes (dont le riz) ont été

analysés à l’aide de la méthode PCR appliquée au gène SPS. Sur les onze échantillons, seul l’ADN de riz a

donné des résultats positifs. Les dix autres échantillons (c’est-à-dire le bambou, la sétaire verte, l’orge, le

blé, le millet sauvage, le colza, la tomate, la patate, le soja et l’Arabidopsis) se sont révélés négatifs.

Les échantillons d’ADN extraits de douze cultivars de riz différents ont été analysés à l’aide de la méthode

PCR spécifique développée pour détecter le gène SPS. Les douze échantillons ont donné des résultats positifs.

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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
A.2.3.4.3 Théorie

La spécificité théorique des amorces et de la sonde pour le gène SPS a été évaluée par une recherche

de similitude à l’aide du programme BLASTN 2.0MP-WashU (Référence [64], date de la recherche:

2010-01-09). La séquence de 81 pb utilisée comme séquence de recherche est référencée sous le numéro

NCBI U33175 (nucléotides 1055-1135). Les résultats de la recherche avec le programme Blast ont

confirmé l’identité totale de la séquence de recherche avec la séquence du gène SPS du riz, et l’absence de

similitude avec d’autres gènes et espèces.
A.2.4 Principe et résumé

Un fragment de 81 pb du gène SPS est amplifié en utilisant deux amorces spécifiques du gène SPS du riz.

L’accumulation de produits PCR est mesurée à la fin de chaque cycle PCR (en temps réel) à l’aide d’une

sonde oligonucléotidique spécifique du gène SPS du riz marquée avec deux colorants fluorescents: FAM,

utilisé comme rapporteur, et TAMRA, utilisé comme «quencher» (voir le Tableau A.6). À cet effet, la

chimie TaqMan® est utilisée. Le signal de fluorescence mesuré dépasse une valeur seuil définie par

l’utilisateur après un certain nombre de cycles. Ce nombre est appelé valeur C . Pour la quantification de

la quantité d’ADN du gène SPS du riz dans un échantillon inconnu, la valeur C est convertie en une valeur

du nombre de copies correspondante par comparaison avec une courbe d’étalonnage dont les valeurs C

sont directement liées aux nombres de copies connus (analyse de régression).
A.2.5 Termes et définitions
[51]

Pour les besoins du présent article, les termes et définitions donnés dans l’ISO 5725-1 et l’ISO 24276

s’appliquent.
A.2.6 Type et quantités d’échantillon

Pour cet essai interlaboratoires, la construction des courbes étalons a été effectuée en utilisant des

échantillons d’ADN extraits de grains provenant de quatre cultivars de riz. Huit échantillons sélectionnés

en aveugle ont ensuite été analysés en utilisant les quatre courbes étalons construites.

Les participants ont reçu les échantillons suivants.

— Quatre échantillons d’ADN provenant de différentes variétés de riz (3M, variété Indica provenant

des États-Unis; Balilla, variété Japonica provenant d’Italie; Guangluai, variété Indica provenant du

sud de la Chine et Shennong265, variété Japonica d’origine chinoise). Chaque échantillon avait une

concentration de 50 ng/μl pour un volume de 30 μl chacun. Chaque ADN de cultivar de riz a été dilué

et utilisé pour générer la courbe étalon correspondante.

— Huit échantillons d’ADN de riz sélectionnés en aveugle provenant de quatre variétés différentes de

riz (concentrations variant entre 0 ng/µl et ~50 ng/µl), pour un volume de 50 µl chacun.

— Témoin négatif d’ADN cible (étiqueté N): ADN de sperme de saumon (20 ng/µl).

— Témoin positif d’ADN cible (étiqueté P): ADN génomique (Guangluai4) (20 ng/µl). Tous les échantillons

d’ADN ont été purifiés en utilisant la méthode CTAB établie par le GMDL-SJTU. Les témoins négatifs

et positifs d’ADN cible ont été utilisés pour chaque plaque PCR.

— Les amorces et les sondes pour le système PCR appliqué au gène SPS (voir le Tableau A.6) et les

réactifs pour d’autres réactions étaient les suivants:
— solution Master Mix pour PCR en temps réel (1 ml × 6);
— solution pour diluer l’ADN (0,1× TE, 1,2 ml).
A.2.7 Limite de quantification (LQ), domaine d’utilisation

Conformément à la méthode utilisée, la LQ absolue de la méthode est de 0,01 ng/μl. La LQ relative de la

PCR quantitative n’a pas été évaluée lors d’un essai interlaboratoires.
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
A.2.8 Estimation de l’incertitude de mesure

Les résultats de l’essai interlaboratoires permettent d’obtenir l’incertitude globale de la méthode (voir

le Tableau A.5).
A.2.9 Interférences

La quantité et la capacité à amplifier l’acide nucléique utilisé comme matrice pour la PCR en temps réel

sont des paramètres majeurs pour évaluer la sensibilité de la méthode. En outre, on ne connaît aucune

interférence spécifique liée à cette méthode.
A.2.10 Conditions physiques et environnementales
Les modes opératoires nécessitent de travailler dans un environnement stérile.

Les zones de travail utilisées pour l’extraction de l’ADN et pour la réaction et l’amplification PCR doivent

être strictement séparées.
Il convient d’éliminer tout ADN résiduel de l’équipement avant de l’utiliser.

Pour éviter toute contamination, il convient d’équiper les embouts des pipettes (A.2.11.6) de filtres

protecteurs contre les aérosols.

Utiliser uniquement des gants non poudrés (A.2.11.8) et les remplacer régulièrement.

Nettoyer régulièrement les paillasses et les équipements de laboratoire avec une solution d’hypochlorite

de sodium (10 % de chlore actif) (eau de javel).
Si nécessaire, il convient d’étalonner régulièrement les pipettes.
A.2.11 Appareillage et matériel
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.
A.2.11.1 Microcentrifugeuse.
A.2.11.2 Congélateur maintenu à −20 °C et réfrigérateur maintenu à 4 °C.
A.2.11.3 Micropipettes.
A.2.11.4 Mélangeur vortex.
A.2.11.5 Tubes, de capacités 0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.
A.2.11.6 Embouts et embouts de filtre pour micropipettes.
A.2.11.7 Porte-tubes pour tubes à réaction.
A.2.11.8 Gants en vinyle ou en latex.
A.2.11.9 Dessiccateur sous vide pour sécher les culots d’ADN, facultatif.

A.2.11.10 Système de PCR en temps réel avec tubes à réaction en plastique pour mesurer la

fluorescence.

A.2.11.11 Logiciel: Système de détection de séquences version 1.7 (Applied Biosystems,

référence 4311876 ) ou versions équivalentes.
8 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
A.2.11.12 Plaques de réaction optiques 96 puits, MicroAmp® (Applied Biosystems,
référence N801-0560 ).
A.2.11.13 Films adhésifs de protection optique, MicroAmp® (Applied Biosystems,
référence 4311971 ).
1) 1)

A.2.11.14 Bouchons optiques, MicroAmp® (Applied Biosystems, référence 801-0935 ).

A.2.12 Réactifs et matériaux
A.2.12.1 Généralités

Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs conformes aux spécifications de l’ISO 24276

et uniquement de l’eau distillée ou déminéralisée stérile ou de l’eau de pureté équivalente.

A.2.12.2 Extraction d’ADN
A.2.12.2.1 Bromure d’hexadécyltriméthylammonium (CTAB), qualité ultra-pure.

A.2.12.2.2 Chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl) aminométhane (tris), qualité biologie moléculaire.

A.2.12.2.3 Acide éthylènediaminetétraacétique, sel disodique (EDTA), titrage à 99,9 % (fraction

massique).
A.2.12.2.4 Éthanol, φ[CH CH OH] minimum 96 % (fraction volumique).
3 2
A.2.12.2.5 Isopropanol, φ[CH CH(OH)CH ] minimum 99,7 % (fraction volumique).
3 3
A.2.12.2.6 Chloroforme, φ(CHCl ) minimum 99 % (fraction volumique).
A.2.12.2.7 Chlorure de sodium, w(NaCl) minimum 99 % (fraction massique).

A.2.12.2.8 Hydroxyde de sodium, anhydre, w(NaOH) minimum 98 % (fraction massique).

A.2.12.2.9 Solution de ribonucléase A, à 10 mg/ml.
A.2.12.2.10 Solution de protéinase K, à 20 mg/ml.
A.2.12.2.11 Tampon de dilution: tris(A.2.12.2.2), 10 mmol/l, pH 9,0.
A.2.12.2.12 Acide chlorhydrique, ρ(HCl) = 370 g/l.
A.2.12.2.13 ADN de testicules de hareng, ADN de thymus de veau ou ADN lambda.
A.2.12.3 PCR quantitative en temps réel
Solution Master Mix pour PCR TaqMan® Universal (1×) ou équivalent approprié.
A.2.13 Prélèvement, transport, conservation et stockage des échantillons
© ISO 2013 – Tous droits réservés 9
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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
A.2.14 Préparation de l’échantillon pour essai

S’assurer que l’échantillon pour essai est représentatif de l’échantillon pour laboratoire, par exemple

en broyant ou en homogénéisant les échantillons. L’ISO 21571 décrit en détail les mesures et étapes

opérationnelles à prendre en compte. Pour l’essai interlaboratoires, une quantité totale de 1 g de nouilles

de riz broyées a été utilisée.
A.2.15 Étalonnage des instruments

Les instruments, par exemple les thermocycleurs et les pipettes, doivent être étalonnés, par exemple

[61]
conformément à l’ISO/CEI 17025 .
A.2.16 Étapes de l’analyse
A.2.16.1 Généralités
A.2.16.1.1 Préparation de l’ADN pour la construction de courbes étalons

Chaque échantillon d’ADN de riz de 50 ng/µl a été dilué à 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl et 0,002 ng/μl

en utilisant la solution de dilution pour ADN fournie par le concepteur de la méthode, et 5 μl de chaque

échantillon d’ADN dilué ont été utilisés pour la PCR en temps réel pour construire des courbes étalons.

Pour les exigences spécifiques, voir l’ISO 21571.
A.2.16.1.2 Réactifs PCR
A.2.16.1.3 Solution Master Mix pour PCR
Voir A.2.12.3.
A.2.16.1.4 Amorces et sonde
Voir le Tableau A.6.
A.2.16.2 Mode opératoire
A.2.16.2.1 Généralités

La PCR quantitative appliquée au gène SPS de riz est conçue pour un volume total de 25 µl par

mélange réactionnel.

Décongeler, mélanger doucement et centrifuger la solution Master Mix pour PCR quantitative en temps

réel et les échantillons d’ADN nécessaires à l’analyse. Conserver les réactifs décongelés sur de la glace à

une température comprise entre 1 °C et 4 °C.

Verser 20 µl par tube de la solution Master Mix dans des tubes à réaction PCR (A.2.11.5) de 200 µl.

Ajouter dans les tubes 5 µl d’échantillons de solution d’ADN, le témoin positif, le témoin négatif et le

témoin blanc (H O), respectivement.

Mélanger avec précaution les tubes PCR et les centrifuger dans une microcentrifugeuse (A.2.11.1) à

1 000 × g pendant 10 s.
Placer la plaque (A.2.11.12) dans l’appareil.

Démarrer la PCR en utilisant les conditions de cyclage de la PCR quantitative en temps réel.

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ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
A.2.16.2.2 Témoins PCR
Voir A.2.6.
A.2.16.2.3 Préparation des étalons

Les courbes d’étalonnage sont générées en reportant sur un graphe les valeurs C en fonction du

logarithme de la quantité d’ADN cible (en nanogrammes). Ces graphes peuvent être créés par tableur

(par exemple Microsoft Excel ) ou directement en utilisant les options fournies avec le logiciel du

système de détection de séquences. (A.2.11.11).

L’interpolation des courbes étalons permet de mesurer la masse (en nanogrammes) d’un échantillon

d’ADN inconnu.
A.2.16.2.4 Programme d’amplification (PCR)

L’essai PCR a été optimisé pour le système de détection des séquences ABI Prism® 7700 et pour le

système de PCR en temps réel (A.2.11.10) Rotor Gene 3000A . D’autres systèmes peuvent être utilisés.

Dans ce cas, il peut être nécessaire d’ajuster les conditions de cyclage thermique. Le programme

d’amplification utilisé par la PCR quantitative en temps réel est décrit dans le Table

...

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